專利名稱：：固定化α-氨基酸酯水解酶及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酶法合成氨基頭孢菌素和氨基青霉素的非均相生物催化劑的制備方法。
背景技術(shù)：
：a-氨基酸酯水解酶(a-aminoacidesterhydrolases,AEHs)是一類酶，它們能催化水解a-氨基酸酯和各種頭孢菌素和青霉素的酰胺鍵，也能經(jīng)cc-氨基酸衍生物(酯或酰胺)對(duì)7-氨基頭孢垸類和6-氨基青霉烷類進(jìn)行N-酰化反應(yīng)。相似的底物特點(diǎn)使得這類酶可用于側(cè)鏈a-位含氨基的頭孢菌素和青霉素類(即氨基頭孢菌素類和氨基青霉素類)合成的生物催化劑(biocatalysts)。對(duì)a-氨基酸酯水解酶結(jié)構(gòu)的研究表明，這類酶屬于a/p-折疊水解酶，在活性位點(diǎn)上含有絲氨酸-組氨酸-天冬氨酸(Ser-His-Asp)三元催化組合。a-氨基酸酯水解酶在酶的結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)的組成、底物特點(diǎn)和催化性能方面均不同于P-內(nèi)酰胺?；?例如青霉素G酰化酶)。p-內(nèi)酰胺酰化酶在結(jié)構(gòu)上屬于N-末端水解酶，P-鏈的N-末端是活性位點(diǎn)，在催化時(shí)扮演親核劑的作用。關(guān)于假單胞菌屬(尸wwfo/nomwfoceae/am辦)菌種產(chǎn)生a-氨基酸酯水解酶類用于a-氨基P-內(nèi)酰胺抗生素的合成的描述可參見如下文獻(xiàn)Pat.GB1382255(1975);TakahashiT.,KatoK.，YamazakiY.，etal.Jpn.J.AntibiotSuppl.30S:230(1977);WillnerD.,CrastL.B.Pat.CA1044627(1978);KocropaC.r.,BefiTJi膽ay.riar.RU2136759(1999);GeunC.T.JunP.H.Pat.KR20010069097(2001)。幾種菌產(chǎn)生的a-氨基酸酯水解酶的生化、理化性質(zhì)和催化性能如下混濁醋桿菌04ceto6fl"er/w6/由AW)參見(RyuY.W.，RyuD.D.Y.EnzymeMicrob.Technol.9:339(1987));柑桔黃單孢菌(Jfaw^iowowosc"n')參見(KatoK.，KawaharaK.，TakahashiT.etal.Agric.Biol.Chem.44:1069(1980);KatoK.,KakinumaA.Agric.Biol.Chem.44:1663(1980));紅紋黃單胞菌(Zcm^io附onosrw6"7i"ec("s)參見(KpecTb冊(cè)O(shè)BaRH.，YBapoBH.H.，Py諷HCKaar.H.h早Ehox腹朋55(12):2226(1990);BlinkovskyA.M.，MarkaryanA.N.EnzymeMicrob.Technol.15:965(1993));對(duì)黑色極毛桿菌(尸semfo附omwme/anogemw)的研究最為廣泛(KimD丄，ByunS.M.BBA-ProteinStruct.&Molecul.Enzymol.1040(1):12(19卯))。這些酶的亞結(jié)構(gòu)己經(jīng)得到證明。黑色極毛桿菌(i^e"cfo/mwoswe/a"ogewM/w)產(chǎn)生的酶由兩個(gè)分子量為70000-72000的亞基組成，混濁醋桿菌、柑桔黃單孢菌和紅紋黃單胞菌產(chǎn)生的酶則由四個(gè)具有類似分子質(zhì)量的亞基構(gòu)成。不同來(lái)源的a-氨基酸酯水解酶在生化和催化性能上是相似的。己經(jīng)確定柑桔黃單孢菌和混濁醋桿菌產(chǎn)生的酶的晶體結(jié)構(gòu)以及酶活性位點(diǎn)的組成，并已克隆出酶的基因柑桔黃單孢菌見[LaanVanDerM.，Polderman-TijmesJ丄，BarendsT.R.M.Int.Pat.Appl.WO02086111(2002);BarendsT.R.M.，Polderman-TijmesJ丄，JekelP.A.etal.J.Biol.Chem.278:23076(2003);OkuboA"NagaokaT.,YokotaS.etal.Int.Pat.Appl.WO02086127(2002)];混濁醋桿菌見[LaanVanDerM,Polderman-TijmesJ丄，BarendsT.R.M.Int.Pat.Appl.W002086111(2002);Polderman-TijmesJ丄，JekelP.A.，Jeronimus-StratinghC.M.etal.J.Biol.Chem.277:28474(2002)]。利用a-氨基酸酯水解酶進(jìn)行抗生素酶法合成研究需要?jiǎng)?chuàng)立非均相生物催化劑技術(shù)，例如，需解決從細(xì)胞生物量中分離酶和制備固定化酶的方法。從or氨基酸酯水解酶制備生物催化劑由三個(gè)主要步驟組成(1)通過(guò)破碎細(xì)胞把酶從細(xì)胞生物量中分離出來(lái)，從水相中提取酶獲得無(wú)細(xì)胞提取物；(2)制成一定純度的酶樣品；(3)把酶固定于載體上。破碎含OC-氨基酸酯水解酶的細(xì)菌細(xì)胞的方法如下變壓破碎法(FrenchPress):(HanpnMep，BlinkovskyA.M.，MarkaryanA.N.EnzymeMicrob.Technol.15:965(1993):Hernandez-J"ustiz0.,TerreniM.,PaganiG.etal.EnzymeMicrob.Technol.25:336(1999));均漿破碎法(Manton-Gaulin):見[KimD.J.,ByunS.M.BBA-ProteinStruct.&Molecul.Enzymol.1040(1):12(1990)]。這兩種方法都可完全破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，把目標(biāo)酶從被破壞的細(xì)胞生物量中全部提取出來(lái)，所制取的無(wú)細(xì)胞提取物活性收率高(可達(dá)到100%);但是蛋白質(zhì)和其它水溶性物質(zhì)也能從被完全破壞了的細(xì)胞中進(jìn)入到水相中，因此獲得的無(wú)細(xì)胞提取物含有很多的雜質(zhì)，導(dǎo)致酶的比活性低。超聲波破碎法在有表面活性物質(zhì)存在時(shí)利用超聲波處理菌體來(lái)破碎細(xì)胞，見[ChoiW.G.，LeeS.B.,RyuD.D.Y.Biotechnol.Bioeng.23(2):361(1981)]。本法相當(dāng)溫和，細(xì)胞破壞不完全，缺點(diǎn)是酶提取收率有所降低，優(yōu)點(diǎn)是能得到更高純度的無(wú)細(xì)胞提取物。溶劑處理破碎法通過(guò)與水不混溶的有機(jī)溶劑乙酸丁酯處理微生物菌體來(lái)破碎細(xì)胞，見[KpecTbiiHOBaM.H.,yBapoBH.H.,PyfleHCKaflr.H.nap.BnoxMMMfl55(12):2226(1990);ZaslavskayaP丄，ChekalinaLV.,IgansD.N.etal.Biotechnol.Appl.Biochem.18:299(1993)]。比較而言，本法選擇性好，但酶活收率不高。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>用不同破碎方法從黃單孢菌族(/朋"oto朋sfa肌7力細(xì)胞中提取or氨基酸酯水解酶的比較見前述表1。無(wú)細(xì)胞提取物的酶活力采用與毫克蛋白重量相關(guān)的國(guó)際單位U來(lái)表示(國(guó)際單位(U)是指在選定條件下，1分鐘內(nèi)催化轉(zhuǎn)化1Pmole的底物或形成1ymole產(chǎn)物所需的酶量)。各例中，酶活性值為頭孢氨芐合成試驗(yàn)中水解酶活性和合成酶活性的比值。文獻(xiàn)報(bào)道，可從不同微生物的a-氨基酸酯水解酶的水溶性形式獲得高純度的酶樣品，甚至可達(dá)到單一蛋白質(zhì)，其制備方法參見[RyuY.W.,RyuD.D.Y.EnzymeMicrob.Technol.9:339(1987);KimD.J.，ByunS.M.BBA-ProteinStruct.&Molecul.Enzymol.1040(1):12(1990);KpecTfcflHOBaM.H.,yBapoBH.H.，PyaeHCKaflr.H.Mflp.BnoxnMMfl55(12):2226(1990);BlinkovskyA.M.,MarkaryanA.N.EnzymeMicrob.TechnoL15:965(1993)]。這些方法需使用不同吸附劑連續(xù)多次對(duì)酶進(jìn)行層析純化，整個(gè)提取勞動(dòng)強(qiáng)度大，延續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，酶活較低，因此并不適用于工業(yè)制備。以下是非均相生物催化劑若干已知的制備方法自混濁醋桿菌(Acetobacte:rturbidans)細(xì)胞生物量分離cc-氨基酸酯水解酶，經(jīng)部分純化，再行固定化，從而制得非均相生物催化劑。a-氨基酸酯水解酶的分離步驟是在壓力下破壞菌體，酶提取進(jìn)入水相，用鏈霉素處理水提取物使其部分純化，接著進(jìn)行透析，參見[Hernandez-Justiz0.，TerreniM.,PaganiG.etal.EnzymeMicrob.Technol.25:336(1999)]。就流程的活性收率來(lái)講，這一方法并無(wú)特色。所得到的初步純化的a-氨基酸酯水解酶制劑比活性很低，其水解芐青霉素的比活性僅為0.06U/mg蛋白。部分純化酶以戊二醛改性瓊脂糖共價(jià)固定化，參見[Hernandez-JustizO.,TerreniM.,PaganiG.etal.EnzymeMicrob.Technol.25:336(1999)]。一個(gè)改進(jìn)的固定化方法是用葡聚糖對(duì)固定在瓊脂糖上的酶做進(jìn)一步的修飾，參見[Fernandez-LafoenteR.，Hernandez-JustizO.，MateoC.etal.J.Mol.Catal.B:Enzym.11:633(2001)]。這樣的固定化過(guò)程工作量大，并且還需要制備專用的載體。上述方法從固定化操作程序的活性收率以及就合成某種抗生素的絕對(duì)活性(合成酶活性)來(lái)講，并無(wú)什么特別之處。此外，將來(lái)自混濁醋桿菌(//cetotecter"/力io^w)純度更高的or氨基酸酯水解酶用瓊脂糖以共價(jià)固定化，再用葡聚糖進(jìn)行固定化的方法也是已知的，見[Fernandez-LafoenteR.,Hernandez-JustizO.，MateoC.etal.Biomacro-molecules2(1):95(2001)]。相對(duì)于D-苯甘氨酸甲酯(methylesterD-phenylglicine,MEPhGl)的水解，水粗提取物酶活性僅為0.1U/mg蛋白，需要用CM-52和苯基瓊脂糖進(jìn)行兩個(gè)步驟的層析純化，相對(duì)于粗取物的純化收率為62%，但生物量的總收率不詳。通過(guò)以上步驟，oc-氨基酸酯水解酶純度與粗提物比較提高了420倍，比活性可達(dá)到42U/mg蛋白。但該法工作量大，效率不高，從活性收率和產(chǎn)品的合成酶活來(lái)看，此法并無(wú)特色。以上制取生物催化劑的已知方法需在固定化之前對(duì)酶進(jìn)行深度的純化程序，固定化過(guò)程復(fù)雜，需經(jīng)歷多個(gè)步驟，是勞動(dòng)密集型的，效率低下。本發(fā)明方法制備的非均相生物催化劑源自黃單孢菌族a朋t力湖o朋sge/7era"朋)菌胞內(nèi)a-氨基酸酯水解酶，與此最接近的文獻(xiàn)制備方法則基于同族的柑桔黃單孢菌U朋t/咖o臘cj'W)產(chǎn)生的酶[ChoiW.G.,LeeS.B.，RyuD.D.Y.Biotechnol.Bioeng.723(2):361(1981)]。這個(gè)類似于本發(fā)明的文獻(xiàn)原型給出了一個(gè)從細(xì)胞生物量開始到非均相生物催化劑制備的完整操作程序(圖1)。固定在高嶺土上的柑桔黃單孢菌(Ja"t力o歷朋asa-氨基酸酯水解酶是非均相生物催化劑，其制備方法參見[ChoiW.G.,LeeS.B.,RyuD.D.Y.Biotechnol.Bioeng.23(2):361(1981)]，以此作為相對(duì)于本發(fā)明制備方法的原型。該原型中基于黃單孢菌族(j朋f/w歷朋as《e/era"o/7)菌胞內(nèi)a-氨基酸酯水解酶的生物催化劑的蛋白含量不大于0.8g/g(干重)，合成酶活性僅為510U/g(干重)。在來(lái)自柑桔黃單孢菌(/a/7t/w歷朋asci^')a-氨基酸酯水解酶的生物催化劑影響下利用D-苯甘氨酸甲酯?；?-氨基去乙酰氧基頭孢菌素酸(7-ADCA)可合成頭孢氨芐[ChoiW.G.,LeeS.B.，RyuD.D.Y.Biotechnol.Bioeng.23(2):361(1981)]。把此法作為本發(fā)明酶合成氨基頭孢菌素和氨基青霉素用途的原型。制備非均相生物催化劑的原型方法由以下幾點(diǎn)構(gòu)成含頭孢氨芐合成酶的細(xì)胞生物量在表面活性劑存在下對(duì)菌體懸浮液用超聲波破碎，酶進(jìn)入水相，無(wú)細(xì)胞提取物的比活為2U/mg蛋白(按合成頭孢氨芐計(jì)算)。無(wú)細(xì)胞提取物生產(chǎn)階段的酶活收率(Tl提取)達(dá)到79%。無(wú)細(xì)胞提取物中的a-氨基酸酯水解酶用硫酸銨鹽分次沉淀，沉淀物溶解后透析脫鹽，再依次用纖維素(DEAECellulose)和凝膠(C印harose4-B)層析純化。在每一次層析完成之后，用冷凍干燥法制備酶。多步a-氨基酸酯水解酶濃縮純化的合成酶活性收率(Ti純化)為2896，酶純度提高30倍。這套適宜于固定化酶制劑生產(chǎn)過(guò)程的酶收率(T1制備)為22%，由提取酶活收率(T1提取)乘以純化收率(T1純化)而得。部分純化的a-氨基酸酯水解酶制劑(按合成頭孢氨芐計(jì)算，比活性為60U/mg蛋白)采用硅藻土或高嶺土進(jìn)行吸附固定化。固定過(guò)程的活性收率(Ti商定)為71-92%，視載體不同有所變化。原型方法中相對(duì)于細(xì)胞生物量的非均相生物催化劑生產(chǎn)過(guò)程的總收率為16-20%，完整生產(chǎn)過(guò)程耗時(shí)不少于70小時(shí)。按照原型制得的最好的生物催化劑是把a(bǔ)-氨基酸酯水解酶固定在高嶺土上得到的，其蛋白含量不大于0.08g/g(干重)，相對(duì)于頭孢氨芐的合成酶活性為510U/g(干重)。以低的初始濃度(4mg/m1)7-氨基脫乙酰氧基頭孢垸酸(7-ADCA)合成頭孢氨芐的實(shí)際操作結(jié)果揭示，生物催化劑循環(huán)使用10次的剩余活性是初始活性的85%。以操作穩(wěn)定性對(duì)酶循環(huán)次數(shù)作圖顯示生物催化劑的失活不遵守一級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，酶失活速度在最初5次循環(huán)比隨后5次循環(huán)要快4-5倍。這個(gè)事實(shí)說(shuō)明在催化合成過(guò)程中，有部分固定化酶從載體上脫落下來(lái)，甚至在很低的初始底物濃度下也是如此。該生物催化劑3(TC時(shí)經(jīng)10次合成循環(huán)所估計(jì)的半衰期11/2為42次，但把反應(yīng)溫度提升至35'C時(shí)，固定在高嶺土上的a-氨基酸酯水解酶的操作穩(wěn)定性會(huì)降低8倍(11/2=5次循環(huán))。氨基頭孢菌素抗生素頭孢氨芐原型合成方法D-苯甘氨酸甲酯(MEPhGl)初始濃度4mg/ml，與7-ADCA發(fā)生?；磻?yīng)，MEPhGl和7-ADCA化合物的初始濃度之比為13。反應(yīng)在水性介質(zhì)中進(jìn)行，35°C，pH6.2，反應(yīng)時(shí)間2-3小時(shí)，非均相生物催化劑為固定于高嶺土上的基于柑桔黃單孢菌Ofe/7^o/^/7as""力的a-氨基酸酯水解酶。頭孢氨芐最佳收率為85%(按7-ADCA計(jì))，MEPhGl和7-ADCA之比為3:1。原型未見任何其它的氨基頭孢菌素和氨基青霉素的合成資料。非均相生物催化劑及其制備的原型方法的主要缺點(diǎn)是1.酶的分離和純化工藝復(fù)雜，程序繁多，造成酶活大量損失，總收率不高。2.由于使用的固定化載體為高嶺土，生物催化劑的制劑蛋白含量低，不大于0.08mg/g(干重)。3.作為終產(chǎn)物的非均相生物催化劑活性低。4.由于采用吸附方式來(lái)固定酶，故生物催化劑操作穩(wěn)定性水平低，不能保證酶與載體的結(jié)合是多位點(diǎn)的、牢固的和不可逆的，使得固定化酶的熱穩(wěn)定性差，在反應(yīng)過(guò)程中易受底物(尤其對(duì)于高濃度底物)溶液的影響，發(fā)生酶和其它蛋白的解吸附。圖1來(lái)自a-氨基酸酯水解酶的非均相生物催化劑的制備方法圖2頭孢氨芐合成中生物催化劑的操作穩(wěn)定性(按表4中數(shù)據(jù)繪制)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在解決下列問(wèn)題*簡(jiǎn)化制備工藝，增加酶(合成酶)活性收率，提高a-氨基酸酯水解酶非均相生物催化劑制備方法的效率；*增加所生產(chǎn)的生物催化劑的活性和穩(wěn)定性；*利用生產(chǎn)的生物催化劑開發(fā)酶法合成氨基頭孢菌素和氨基青霉素的方法。9這些問(wèn)題的解決歸功于累積應(yīng)用了許多技術(shù)，并進(jìn)行了條件優(yōu)選。a-氨基酸酯水解酶的細(xì)胞生物量分離自紅紋黃單胞菌。含有酶的細(xì)胞在溫和條件下分步破碎，開始用低溫效應(yīng)破壞細(xì)胞的完整性，接著用乙酸丁酯處理懸浮解凍細(xì)胞的水溶液，破碎細(xì)胞生物量進(jìn)入水相，把酶分離出來(lái)，除去固體，得到的無(wú)細(xì)胞提取物，可無(wú)需任何純化而用于酶的固定化。為著生成直接用于固定化的無(wú)細(xì)胞提取物，細(xì)胞生物量的破碎和酶的提取在溫和的優(yōu)化條件下迸行，如采用懸浮生物量的濃度、乙酸丁酯濃度、溫度、pH值和抽提時(shí)間。發(fā)酵液在開始提取酶時(shí)為自然pH，隨后通過(guò)滴加氨水溶液來(lái)保持恒定的pH值，同時(shí)記錄氨水液消耗量。根據(jù)滴加氨水溶液的消耗速度來(lái)決定何時(shí)終止酶提取反應(yīng)。當(dāng)?shù)味ㄒ后w消耗速度相對(duì)于初始值降低至臨界倍數(shù)時(shí)，即起始消耗速度2.5±0.3倍時(shí)達(dá)到酶分離工藝的終點(diǎn)?？杀Ｕ厦阜蛛x工藝的活性收率達(dá)(100±5)%，得到所需純度的無(wú)細(xì)胞提取物制劑。滴定劑減少的最佳值Kopt取決于使用的柑桔黃單孢菌菌株以及生物合成的培養(yǎng)條件。Kopt從一系列初步實(shí)驗(yàn)測(cè)得(見例3之表2)。通過(guò)a-氨基酸酯水解酶的沉淀進(jìn)行酶固定化反應(yīng)，在能使目標(biāo)酶完全沉淀的一定分子量的多聚乙二醇影響下無(wú)細(xì)胞提取物為酶聚集體形式，隨后聚集體以戊二醛交叉連接，戊二醛最佳濃度根據(jù)無(wú)細(xì)胞提取物中的蛋白質(zhì)含量來(lái)確定(見例4和表3之No.14)。保證固定化工藝的標(biāo)準(zhǔn)初始原料，優(yōu)化各菌株的條件，制備無(wú)細(xì)胞提取物，比較見例4表3之No.2，3和No.5。本發(fā)明非均相生物催化劑的制備方法圖示介紹見圖1，其構(gòu)成如下將含有a-氨基酸酯水解酶的紅紋黃單胞菌細(xì)胞生物量置于-25'C或-25'C以下的冷凍箱，最佳溫度在-25'C到-30'C之間，保持適當(dāng)時(shí)間至全部?jī)鼋Y(jié)。然后置室溫下解凍，將其懸浮于0.05MpH7.8的Tris-HCl緩沖液中，細(xì)胞生物量濃度為20-100mg(干重))/ml，最好為40-50mg(干重))/ml。向前述懸液中添加乙酸丁酯，使乙酸丁酯終濃度為2-6%(V/V)，最好控制為4.5%。細(xì)胞生物量破碎及酶提取過(guò)程要強(qiáng)烈攪拌，溫度控制為25。C-35°C，最好是3(TC。酶抽提過(guò)程最初為自然pH,之后通過(guò)滴加氨水溶液維持提取液恒定pH值。從初始pH8.0降到pH6.8時(shí)，滴加氨水溶液維持反應(yīng)液pH值恒定，同時(shí)紀(jì)錄所消耗的氨水量。pH優(yōu)化范圍依使用的紅紋黃單胞菌菌株和生物合成培養(yǎng)條件而決定，經(jīng)一系列初步實(shí)驗(yàn)而測(cè)得。當(dāng)氨水溶液的消耗速度降低至起始速度的Kcpt倍數(shù)時(shí)，酶的提取反應(yīng)即行停止。Kopt值是細(xì)胞生物量破碎和酶提取工藝的持續(xù)時(shí)間，是未被標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)，其值37小時(shí)之間，取決于初始的細(xì)胞生物量的生化參數(shù)，以及工藝所選擇的條件諸如溫度、細(xì)胞生物量和乙酸丁酯的濃度。把破碎菌體與無(wú)細(xì)胞提取物分離的方法頗多，比如離心沉淀法，或用0.01mo1/1，pH6.5含0.005molA乙酸鈣的乙酸鈉緩沖液洗滌等。緩沖液用量為初始細(xì)胞懸浮液體積的20%。棄去破碎的細(xì)胞生物量，洗液收集，并入先前制備的無(wú)細(xì)胞提取物，得到澄明的無(wú)細(xì)胞提取物，相對(duì)于頭孢氨芐合成的比活性為2.54.5U/mg蛋白。相對(duì)于初始細(xì)胞生物量的活性而言，酶提取階段的酶活性收率為(100±5)%，這是一個(gè)在實(shí)驗(yàn)誤差范圍以內(nèi)定量收率。當(dāng)氨溶液消耗的速度降至初始速度的K。pt時(shí)間點(diǎn)時(shí)酶提取程序即行終止，可以保障所選擇的提取條件能制得的無(wú)細(xì)胞提取物酶比活性高，保障酶分離階段酶活性總收率高(參見例3表2)。通過(guò)以上的簡(jiǎn)單純化過(guò)程，所得的無(wú)細(xì)胞提取物無(wú)需再純化，可直接用于酶聚集體生產(chǎn)和交聯(lián)固定化。故本法適宜于固定化的酶制劑生產(chǎn)工藝的收率(Ti^)等于分離工藝的酶收率(Ti艦)，艮Pti制備-ri提取-(100±5)%。對(duì)無(wú)細(xì)胞提取物中的酶進(jìn)行聚集沉淀時(shí)需要添加分子質(zhì)量為400010000道爾頓，最好是60008000道爾頓的聚乙二醇，其用量應(yīng)以能完全沉淀目標(biāo)酶為準(zhǔn)，每毫升無(wú)細(xì)胞提取物使用0.250.30g聚乙二醇(視分子量而定)。該步驟在2-4'C溫度條件下進(jìn)行，同時(shí)攪拌15-30分鐘，便于聚乙二醇完全溶解。隨后向反應(yīng)混合溶液中加入戊二醛使酶聚集體交聯(lián)，其添加濃度為lxl()J5xl(^mol/mg蛋白。蛋白質(zhì)的修飾和交聯(lián)在溫和的條件下進(jìn)行，在24"C下持續(xù)2小時(shí)。交聯(lián)的酶聚集體形式的非均相生物催化劑經(jīng)真空抽濾分出，在多孔濾器上用乙酸鈉緩沖液(0.1mol/l，pH6.5，含0.005mol/l乙酸鈣)洗滌至洗液澄明。a-氨基酸酯水解酶固定化程序的酶活性收率為4870%。由于在酶的提取分離步驟中酶活性不受損失，因此本發(fā)明工藝方法制備非均相生物催化劑的總收率為4870%，全過(guò)程持續(xù)時(shí)長(zhǎng)為12~15小時(shí)。本發(fā)明生物催化劑的特性非均相生物催化劑即固定化a-氨基酸酯水解酶，不含未結(jié)合酶的空白載體，它主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成(干重蛋白質(zhì)含量高達(dá)0.95g/g)。相對(duì)于干燥空白載體，固定化cc-氨基酸酯水解酶活性為13002200U/g(干重)(以頭孢氨芐合成計(jì))。反應(yīng)混合物中進(jìn)行酶聚集體交聯(lián)的戊二醛相對(duì)濃度范圍為1x10'25x10'2mol/mg蛋白，能使固定化酶制劑的合成酶活性水平與操作穩(wěn)定性結(jié)合起來(lái)，其特征是該固定化酶完成10次頭孢氨芐合成循環(huán)后仍保留有95%的初始酶活力(參見例4之表3)。在30°C、7-ADCA的初始濃度為20mg/ml條件下，采用頭孢氨芐合成工藝進(jìn)行了多次連續(xù)操作的生物催化劑的試驗(yàn)，結(jié)果顯示固定化酶的失活遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)律。這就證實(shí)了a-氨基酸酯水解酶不會(huì)從固定化酶上流失，即使在使用較高的底物濃度時(shí)(比原型方法高出5倍)。根據(jù)生物催化劑固定化酶35次循環(huán)合成頭孢氨節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推算出此此固定化酶半衰期為^-200個(gè)循環(huán)(參見例10和圖2)。氨基頭孢菌素和氨基青霉素合成的本發(fā)明方法一般如下構(gòu)成-利用制得的生物催化劑來(lái)合成不同的氨基青霉素(如氨芐青霉素、阿莫西林)和氨基頭孢菌素(如頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢克洛、頭孢拉定和頭孢來(lái)星)。合成方法包括使用D-苯甘氨酸衍生物進(jìn)行關(guān)鍵p-內(nèi)酰胺化合物在濃度540mg/ml時(shí)的?；磻?yīng)。衍生物可以是D-苯甘氨酸甲酯、D-對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯和D-2,5二羥基苯甘氨酸甲酯，摩爾過(guò)量1.5~4.0倍。反應(yīng)進(jìn)行的條件pH6.0~6.2，溫度1~40°C,水性介質(zhì)或者水與聚乙二醇的混合物，初始混合物聚乙二醇的含量為30~50%。反應(yīng)混合物中非均相生物催化劑的含量在5-10u/ml之間變化，反應(yīng)的條件取值應(yīng)滿足反應(yīng)過(guò)程持續(xù)的時(shí)間不超過(guò)3小時(shí)為限。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與文獻(xiàn)原型方法(參見圖l)比較，本發(fā)明方法具有如下的優(yōu)越性1.本發(fā)明方法以最簡(jiǎn)便可行的方案(見圖l)來(lái)制備非均相生物催化劑，包括從細(xì)胞生物量分離酶和直接用無(wú)細(xì)胞提取物進(jìn)行酶固定化數(shù)步構(gòu)成，制備周期縮短至12-15小時(shí)；而原型方法純化酶的制備步驟多，制備周期至少需要70小時(shí)。2.采用本發(fā)明方法制備的生物催化劑時(shí)，總酶活性收率達(dá)到48-70%,比原型方法提高3倍多；原型方法僅為16-20%。3.無(wú)載體生物催化劑的制備，它主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成(本發(fā)明催化劑蛋白含量高達(dá)0.95g/g(干重)，但原型的蛋白含量不大于0.08g/g(干重)4.提高生物催化劑合成酶活性(相對(duì)于頭孢氨芐合成)3.3-4.3倍本發(fā)明方法固定化酶的活性為13002200U/g(干重)，原型方法固定化酶活性僅為3卯-510U/g(干重)。5.提高生物催化劑操作穩(wěn)定性至少5倍本發(fā)明方法30'C時(shí)酶的半衰期^a為200次循環(huán)；原型酶3(TC時(shí)的半衰期^2則不超過(guò)42次循環(huán)。6.在超過(guò)原型試驗(yàn)使用的初始底物濃度5倍時(shí)，本生物催化劑上的酶也不會(huì)流失。7.氨基青霉素和氨基頭孢菌素酶法合成的生物催化劑應(yīng)用可能性本酶使用的溫度和底物濃度的范圍寬，能在水性介質(zhì)或者水與聚乙二醇混合介質(zhì)中使用，可獲得比原型法收率更高的目標(biāo)化合物(收率高達(dá)98%，見例6)。具體實(shí)施例方式非均相生物催化劑的制備過(guò)程用以下的實(shí)例和酶產(chǎn)品的用法來(lái)具體說(shuō)明。在下述實(shí)例中，酶制劑的活性相對(duì)于頭孢氨芐合成來(lái)計(jì)算。目標(biāo)產(chǎn)品形成的初速度在如下條件下測(cè)定pH6.0-6.2，40±1。C，7-ADCA濃度0.040±0.002mole/1，苯甘氨酸甲酉旨(MethylEsterPhenylGlycine，MEPhGl)0.080土0.004mole/1。制劑中含有的干物質(zhì)的量是將制劑在105土rc干燥至恒重后測(cè)定的。實(shí)施例1以紅紋黃單胞菌菌株VKPMB-9915制備生物催化劑方法
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：本發(fā)明采用的同一菌株先后分別向《中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)》和《全俄工業(yè)微生物保藏部(VKPM)》提交保藏，獲得了CGMCC和VKPM分別給與的菌種編號(hào)CGMCCJVs.2339和VKPMB-9915,建議的分類命名分另U為紅紋黃單胞菌Xanthomonasrubrilineans禾QXanthomonasrubrilineansK40。取273g(濕重)紅紋黃單胞菌菌株VKPMB-9915細(xì)胞生物量作為非均相生物催化劑的起始物，其含量為18.5%(干重)，合成酶活性83.3U/g(濕重)，450U/g(干重)。將細(xì)胞生物量放入塑料容器內(nèi)，在-28'C溫度下進(jìn)行冷凍3小時(shí)，取出凍結(jié)的塑料容器，令細(xì)胞生物量在室溫下解凍，然后解凍的細(xì)胞生物量移至2.5升反應(yīng)器中，反應(yīng)器具有夾套、自動(dòng)控溫、pH在線檢測(cè)和機(jī)械攪拌等配套裝置。用乙酸丁酯處理細(xì)胞把酶提取到水相的過(guò)程在反應(yīng)器中進(jìn)行，其條件為懸浮液中生物量的濃度40mg(干重)/ml，乙酸丁酯的濃度4.5。/。(V/V)，3(TC，pH梯度，連續(xù)攪拌。解凍的細(xì)胞生物量用0.05MpH7.8的Tris-HCl緩沖液配制成適宜濃度的懸浮液，Tris-HCl緩沖液的用量要考慮到濕細(xì)胞生物量中的水分。本例用1040ml緩沖液制得1260ml懸浮液。在把解凍的細(xì)胞生物量懸浮于緩沖液中時(shí)的溫度不高于2(TC，加入150ul硫基乙醇來(lái)穩(wěn)定酶，然后加入57ml乙酸丁酯，此時(shí)視作開始提取過(guò)程。將反應(yīng)器加熱到3(TC，開始時(shí)需控制pH不超過(guò)8.0，隨著反應(yīng)的繼續(xù)，提取液的pH自然下降，當(dāng)反應(yīng)液pH值降至pH6.8時(shí)，向反應(yīng)混合液中滴加12.5%濃度的氨水溶液來(lái)保持pH值恒定為6.8土0.1,記錄整個(gè)進(jìn)程中滴加氨水溶液的數(shù)量。當(dāng)氨溶液消耗速度下降至初始速度的2.5倍時(shí)酶提取過(guò)程即終止。將反應(yīng)混合液迅速降溫至15-2(TC,用絮凝劑處理破碎細(xì)胞生物量以除掉菌絲體。絮凝劑是含有季銨堿基的水溶性多聚陰離子，比如FlocatonPPS-400。離心分離，破碎的細(xì)胞生物量用250ml0.1M,pH6.5，含乙酸鈣0.005M的乙酸鈉緩沖液洗錄，洗滌液并入無(wú)細(xì)胞提取物，控制至pH6.8-7.2。經(jīng)前述處理，得1440ml無(wú)細(xì)胞提取物的透明溶液，合成酶活性為16.0U/ml,蛋白含量為4.2mg/ml，比活性為3.8U/mg蛋白。從細(xì)胞生物量提取分離的酶活性收率ri提取=101%。酶固定化過(guò)程是在帶有機(jī)械攪拌冰浴裝置的2L反應(yīng)器中進(jìn)行的。將1440ml無(wú)細(xì)胞提取物移入反應(yīng)器中，降溫至2-4'C，添加403g分子質(zhì)量為6000的聚乙二醇(相當(dāng)于每毫升無(wú)細(xì)胞提取物加入0.288聚乙二醇)以確保能完全沉淀目標(biāo)酶。反應(yīng)混合物攪拌15分鐘至沉淀全部溶解，再加入25。/。戊二醛水溶液84.7ml(3.5x1(^mmol/mg蛋白)，在2-4t:下緩慢攪拌孵化2小時(shí)。固體顆粒物用玻砂漏斗過(guò)濾分離，先用水洗至無(wú)色，再用0.1M1500ml乙酸鈉緩沖液(pH6.5，每升內(nèi)含0.005M乙酸鈣)洗滌。至此，得固定化a-氨基酸酯水解酶交聯(lián)酶聚集體形式的生物催化劑38.6g(濕重)，其干重含量20.4%,合成酶活性370U/g(濕重)，或1680U/g(干重)。a-氨基酸酯水解酶固定化收率為tl鵬59.1%，相對(duì)于細(xì)胞生物量而言的非均相生物催化劑制劑的總活性收率為r^59.8%。在頭孢氨芐合成中循環(huán)使用35次測(cè)得的非均相生物催化劑的半衰期t1/2=200次循環(huán)(參見例10)。實(shí)施例2以紅紋黃單胞菌菌株CGMCC制備生物催化劑的方法取91.2g(濕重)紅紋黃單胞菌菌株CGMCCJVs.2339細(xì)胞生物量作為非均相生物催化劑的起始物，其干重含量19.5%，合成酶活性70.2U/g(濕重)，360U/g(干重)。細(xì)胞生物量按照例1程序處理，在-30'C下保持5小時(shí)。14乙酸丁酯處理細(xì)胞、把酶提取到水相的過(guò)程按照例1方法進(jìn)行，條件為懸浮的細(xì)胞生物量濃度50mg(干重)/ml，乙酸丁酯濃度4.0%(以體積計(jì))，28'C，pH梯度，連續(xù)攪拌。所使用的試劑量緩沖液50ml，巰基乙醇50ml，乙酸丁酯14ml,混合得懸浮液355ml。酶提取過(guò)程需時(shí)6小時(shí)10分鐘，氨溶液消耗速度與初始值比較下降2.8倍時(shí)酶提取過(guò)程即終止。按例1方法制備無(wú)細(xì)胞提取物反應(yīng)混合物用絮凝劑處理，得澄明無(wú)細(xì)胞提取物420ml。其特征為酶活性157u/ml,蛋白含量3.5mg/ml，比活性4.5u/mg蛋白。從細(xì)胞生物量起分離的酶活性收率ri柳-103%。酶固定化工藝按例1方法進(jìn)行，區(qū)別僅在于無(wú)細(xì)胞提取物420ml，分子量8000的聚乙二醇1058(即每毫升無(wú)細(xì)胞提取物投聚乙二醇0.258)，25%戊二醛水溶液8.8ml(1.5X10-5mmol/mg蛋白)。制得a-氨基酸酯水解酶交聯(lián)聚集體形式的非均相生物催化劑ll.lg，它具有如下特性干重含量20.2%,合成酶活性380U/g(濕重)或1880u/g(干重)。a-氨基酸酯水解酶固定化工藝的活性總收率(從細(xì)胞生物量起計(jì)算)r^=65%。生物催化劑在頭孢氨芐合成中循環(huán)使用10次后相對(duì)剩余活性為96.3%(參見例10)。實(shí)施例3酶提取過(guò)程的終止點(diǎn)變化時(shí)的方法使用紅紋黃單胞菌菌株VKPMB-9915獲得的數(shù)據(jù)見表2之1-3試驗(yàn)。細(xì)胞生物量的低溫效應(yīng)過(guò)程，用乙酸丁酯處理和酶提取進(jìn)入水相的過(guò)程均按例l方法進(jìn)行，差別只在于與氨溶液消耗的速度相關(guān)的酶提取終止點(diǎn)有變化。制備的無(wú)細(xì)胞提取液參照例1的方法進(jìn)行酶的固定化。進(jìn)入水相諸過(guò)程均按例1方法進(jìn)行，差別只在于與氨溶液消耗的速度相關(guān)的酶提取終止點(diǎn)有變化。制備的無(wú)細(xì)胞提取液參照例1的方法進(jìn)行酶的固定化。表2.酶的提取時(shí)間對(duì)無(wú)細(xì)胞提取物和非均相生物催化劑性能以及提取效率的影響試驗(yàn)序號(hào)紅紋黃單胞菌菌株工藝時(shí)長(zhǎng)無(wú)細(xì)麿提取物非均相生物催化荊總瞎活收率瞎活U/ml蛋白質(zhì)含量mg/ml籌比活性U/mg蛋白活性收率酶活性U/g(干重)活性收率1VKPMB-9915200分14.13.14.5卯145049.044.12(見例1)VKPMB-9915270分16.04.23.8101腦59.159.83VKPMB-9915370分16.27.52.2102122065.967.24(見例2)CGMCCJft.2339370分15.73.54.5103漏64.065.915以上結(jié)果說(shuō)明酶提取終止點(diǎn)影響到無(wú)細(xì)胞提取物和生物催化劑的性質(zhì)，也影響到酶的分離和固定化的效率。例2中從紅紋黃單胞菌菌株CGMCCJVs.2339細(xì)胞生物量制備生物催化劑的數(shù)據(jù)與所用菌株最佳酶提取終止點(diǎn)間有依從關(guān)系，詳見表2之4號(hào)試驗(yàn)。實(shí)施例4在不同戊二醛濃度下本發(fā)明方法的實(shí)施使用全俄工業(yè)微生物保藏部之紅紋黃單胞菌菌株VKPMB-9915獲得的數(shù)據(jù)見表2之1-4號(hào)試驗(yàn)。細(xì)胞生物量的低溫效應(yīng)過(guò)程和用乙酸丁酯處理把酶提取進(jìn)入水相的過(guò)程均在例1中指定菌株的最佳條件下進(jìn)行。參照例1的方法對(duì)制得的無(wú)細(xì)胞提取液進(jìn)行酶固定化，差別只在于反應(yīng)混合物中酶聚集體交聯(lián)用的乙二醛的相對(duì)濃度的變化。把生物催化劑經(jīng)頭孢氨芐合成的10次循環(huán)后相對(duì)的酶活性(實(shí)施見例IO)作為在不同條件下固化化酶的穩(wěn)定性比較的判據(jù)。所獲得的結(jié)果證明反應(yīng)混合物中戊二醛濃度影響生物催化劑的性質(zhì)和酶固定化工藝的效率。表3.反應(yīng)混合物中戊二醛相對(duì)濃度對(duì)非均相生物催化劑性能和固定工藝效率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>例2中，從紅紋黃單胞菌菌株CGMCCJVs.2339細(xì)胞生物量生成的生物催化劑的特征列入表3之5號(hào)試驗(yàn)。按照例2方法，以對(duì)該菌株而言的最佳條件來(lái)制備無(wú)細(xì)胞提取物，接著沉淀得到酶聚集體，再在VKPMB-9915菌株交聯(lián)時(shí)使用的最佳戊二醛濃度范圍內(nèi)進(jìn)行交聯(lián)，從而最終得到特征相似的生物催化劑。實(shí)施例5水性介質(zhì)中酶法合成頭孢氨芐(C印halexin)頭孢氨芐酶合成在裝有溫控裝置、機(jī)械攪拌、pH儀和pH狀態(tài)系統(tǒng)儀的100ml有夾層的玻璃反應(yīng)器中進(jìn)行，工藝條件如下水性介質(zhì)，2°C，pH6.0-6.2，酶含量25土1U/ml，7-ADCA的初始濃度為25mg/ml;苯甘氨酸甲酯(MEPhGl)與7-ADCA的摩爾比為3.0:1。初始反應(yīng)混合物中反應(yīng)物濃度要計(jì)算生物催化劑和水的體積。底物溶液制備將1.25g(5.84mmol)7-ADCA和40ml蒸餾水加入100ml裝有磁力攪拌的玻璃燒杯中制成懸浮液，攪拌下加入12.5%氨水使7-ADCA溶解，控制pH不大于8.2。再將3.53g(17.52mmol)苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽攪拌下分次加入，并加入12.5%的氨水防止pH小于6。在苯甘氨酸甲酯溶解后溶液定量地轉(zhuǎn)移至量筒，用水調(diào)節(jié)體積至50ml。將以上底物溶液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器,調(diào)節(jié)到2'C,強(qiáng)烈攪拌,加入例1法生產(chǎn)的生物催化劑，其活性370U/g(濕重)，干物質(zhì)含量20.4n/。。生物催化劑的加入之時(shí)合成反應(yīng)的開始。這個(gè)過(guò)程在2'C、pH6.0-6,2時(shí)需70分鐘，用自動(dòng)滴定系統(tǒng)滴加12.5%的氨水溶液維持pH穩(wěn)定。反應(yīng)完成后，生物催化劑用真空過(guò)濾從反應(yīng)混合物中分出，10ml水洗漆，洗液并入濾液。合并液中頭孢氨芐的含量用HPLC法測(cè)定。以7-ADCA計(jì)，頭孢氨芐的收率為85.7%。實(shí)施例6在水與乙二醇混合物中酶法合成頭孢氨芐(C印halexin)在反應(yīng)器中進(jìn)行的頭孢氨芐酶法合成見例5描述，工藝條件為乙二醇在初始反應(yīng)混合物的濃度5(W(v/v)，5°C，pH6.0-6.2，酶含量40土1U/ml，7-ADCA初始濃度30mg/ml，初始反應(yīng)混合物中苯甘氨酸甲酯與7-ADCA摩爾比為2.5:1。將1.5Og(7.01mmol)7-ADCA和3.53g(17.52mmol)苯甘氨酸甲酯鹽酸按例5描述的方法制成底物溶液，不同的是把溶解7-ADCA的40ml蒸餾水換成15ml蒸餾水和25ml乙二醇。按照例5方法進(jìn)行頭孢氨芐合成的另一些不同之處是在5'C下反應(yīng)180分鐘，使用按照例1法生產(chǎn)的生物催化劑5.41g，酶活性370U/g(濕重)，干物質(zhì)含量20.4%。從7-ADCA計(jì)，頭孢氨芐的收率為98.3%。實(shí)施例7頭孢克洛(Cefaclor)的酶法合成在反應(yīng)器中進(jìn)行的頭孢克洛酶法合成工藝見例5描述，條件為乙二醇在初始反應(yīng)混合物的濃度4596(v/v),10°C，pH6.0-6.2，酶含量40±1U/ml，初始反應(yīng)混合物中3-氯-7-氨基頭孢菌素酸(7-ACCA)濃度15mg/ml，苯甘氨酸甲酯與7-ACCA摩爾比為4:1。將0.75g(3.20mmol)7-ACCA和2.58g(12.80mmol)苯甘氨酸甲酯鹽酸按例5描述的方法制成底物溶液，不同的是把溶解7-ADCA的40ml蒸餾水換成17.5ml蒸餾水和22.5ml乙二醇。按照例5方法進(jìn)行頭孢克洛合成，但溫度和時(shí)間略異，即在IO'C下反應(yīng)100分鐘，使用按照例1法生產(chǎn)的生物催化劑5.41g，酶活性370U/g(濕重)，干物質(zhì)含量20.4%。從7-ACCA計(jì)，頭孢克洛收率為92.4%。實(shí)施例8氨芐西林(AmpidHin)的酶法合成在反應(yīng)器中進(jìn)行的氨芐西林酶法合成工藝見例5描述，條件為乙二醇在初始反應(yīng)混合物的濃度3(^(v/v)，20°C，pH6.0-6.2，酶含量30±1U/ml,初始反應(yīng)混合物中6-氨基青霉素酸(6-APA)濃度40mg/ml，苯甘氨酸甲酯與6-APA摩爾比為3:1。將2.00g(9.26mmol)7-APA和5.60g(27.7mmol)苯甘氨酸甲酯鹽酸按例5描述的方法制成底物溶液，不同的是把溶解7-APA的40ml蒸餾水換成25ml蒸餾水和15ml乙二醇，pH不超過(guò)7.5。按照例5方法進(jìn)行氨芐西林合成，但溫度和時(shí)間略異，即在20'C下反應(yīng)75分鐘，使用例1方法生產(chǎn)的生物催化劑3.97g，酶活性370U/g(濕重)，干物質(zhì)含量20.4%。以6-APA計(jì)，氨芐西林的收率為88.6%。實(shí)施例9阿莫西林(AmoxiciHin)的酶法合成在反應(yīng)器中進(jìn)行的阿莫西林酶法合成工藝見例5描述，條件為水性介質(zhì)，40'C，pH6.0-6.2，酶含量6.5±0.5U/ml，初始反應(yīng)混合物中6-APA濃度10mg/ml，D-對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯(MEHPhGl)與6-APA摩爾比為1.7:1。在磁力攪拌的100ml燒杯中加入0.72g(3.97mmol)MEHPhGl和40ml蒸餾水制成底物溶液，攪拌下向其中加入20%鹽酸使MEHPhGl溶解，以12.5%氨水溶液調(diào)節(jié)至pH6，立即加入0.5g(2.34mmo1)6-APA，攪拌下向懸浮液中加入12.5%氨水溶液控制pH至6-APA溶解，在此過(guò)程中pH須不大于6.5。在6-APA溶解后把溶液定量轉(zhuǎn)移至量筒，用水把體積調(diào)節(jié)到50ml。按照例5方法進(jìn)行阿莫西林合成，但溫度和時(shí)間略異，即在40'C下反應(yīng)60分鐘，使用例2方法生產(chǎn)的生物催化劑0.86g，酶活性380U/g(濕重)，干物質(zhì)含量20.2%。以6-APA計(jì)，阿莫西林的收率為72.8%。實(shí)施例IO在3(TC下合成頭孢氨芐的固定化酶的操作穩(wěn)定性利用同一非均相生物催化劑合成頭孢氨芐的多次連續(xù)循環(huán)來(lái)研究固定化酶的操作穩(wěn)定性，其工藝條件如下初始反應(yīng)混合物中乙二醇濃度40%(v/v)，反應(yīng)溫度3(TC，pH6.0-6.2，酶初始濃度15±1U/ml，7-ADCA初始濃度20mg/ml;MEPhGl與7-ADCA的摩爾比為2.5:1。頭孢氨芐合成的第一次循環(huán)按例5的方法進(jìn)行，反應(yīng)溫度為3(TC，反應(yīng)混合物體積為100ml。待反應(yīng)完全后，真空過(guò)濾，收集固定化酶用10ml水洗滌，并將此酶用于下一個(gè)合成反應(yīng)。洗液和濾液合并，用HPLC法檢測(cè)并計(jì)算7-ADCA的轉(zhuǎn)化率。頭孢氨芐合成的第二次循環(huán)以類似的方法進(jìn)行。在5次循環(huán)之后測(cè)定酶的剩余活性及其干物質(zhì)的含量。由于生物催化劑活性隨循環(huán)使用次數(shù)增加而下降，同時(shí)每次取樣分析的損耗使得酶重量減少，為了讓選定的生物催化劑濃度和循環(huán)反應(yīng)混合物體積等標(biāo)準(zhǔn)工藝條件有可重復(fù)性，需要根據(jù)具體情況對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工藝條件進(jìn)行修正。業(yè)已完成必要數(shù)量的連續(xù)循環(huán)的頭孢氨芐合成研究。利用例1方法產(chǎn)生的生物催化劑的試驗(yàn)結(jié)果見表4所列。表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明頭孢氨芐合成中生物催化劑的失活符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，半衰期11/2=200個(gè)循環(huán)(見圖2)。表4.按例1法生產(chǎn)的生物催化劑于3(TC下在頭孢氨芐合成時(shí)的操作穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>:LogA^是指剩余活性百分?jǐn)?shù)的對(duì)數(shù)函數(shù)值。權(quán)利要求1、一種把紅紋黃單孢菌(Xanthomonasrubrilineans)胞內(nèi)αid="icf0001"file="A2008100448810002C1.tif"wi="2"he="3"top="32"left="148"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>氨基酸酯水解酶制成非均相生物催化劑的制備方法，包括破裂細(xì)胞生物量、把酶提取到水相，繼而進(jìn)行酶固定化。2、如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于使用的是紅紋黃單孢菌的細(xì)胞生物量，分步法破碎細(xì)胞，即先用低溫效應(yīng)破壞細(xì)胞的完整性，再用乙酸丁酯處理解凍細(xì)胞的水懸浮溶液；細(xì)胞懸浮液的加熱處理先在自發(fā)pH梯度再在恒定pH下進(jìn)行；恒定pH靠加入滴定溶液來(lái)維持，滴定溶液消耗速度的變化水平是選擇滴定終止點(diǎn)的判據(jù)；分離掉破碎的細(xì)胞生物量的無(wú)細(xì)胞提取液無(wú)需任何純化，經(jīng)由酶聚集體形式的沉淀和其后的交聯(lián)化而直接用于酶的固定化過(guò)程序。3、如權(quán)利要求l或2所述的制備方法，其特征在于進(jìn)行細(xì)胞的低溫效應(yīng)，將細(xì)胞生物量冷凍至-25。C或以下，最好為-25。C-3(TC。4、如權(quán)利要求1-3所述的制備方法，其特征在于用乙酸丁酯處理細(xì)胞，所使用的細(xì)胞生物量水性懸浮液的濃度為20100。/。mg(干重)/ml。5、如權(quán)利要求l-4所述的制備方法，其特征在于使用乙酸丁酯濃度為26%(v/v)。6、如權(quán)利要求1-5所述的制備方法，其特征在于酶提取過(guò)程的溫度范圍為25~35°C。7、如權(quán)利要求l-6所述的制備方法，其特征在于使用必要量的分子量4000~1O，OOO的聚乙二醇從無(wú)細(xì)胞提取物中把酶聚集體沉淀出來(lái)。8、如權(quán)利要求l-7所述的制備方法，其特征在于酶聚集體交聯(lián)使用的戊二醛的相對(duì)濃度為1x1(T25xIO-2mmol/mg蛋白。9、如權(quán)利要求l-7所述的制備方法，其特征在于基于黃單孢菌族(」&"Aomo"wge"erato力胞內(nèi)a-氨基酸酯水解酶的非均相生物催化劑能按權(quán)利要求l-8所述的任一方法來(lái)生產(chǎn)，生物催化劑含量達(dá)0.95g蛋白/g(干重)，合成酶活性達(dá)2200U/g(干重)。10、如權(quán)利要求l-7所述的制備方法，其特征在于用D-氨基苯乙酸酯衍生物對(duì)關(guān)鍵(3-內(nèi)酰胺化合物進(jìn)行酰化反應(yīng)的酶促合成氨基頭孢菌素和氨基青霉素類的方法，酶促反應(yīng)在非均相生物催化劑的影響下進(jìn)行，非均相生物催化劑則按權(quán)利要求1-8所述的任一方法來(lái)生產(chǎn)。全文摘要本發(fā)明公開了一組以α-氨基酸酯水解酶為基礎(chǔ)的非均相生物催化劑及其制備方法與合成氨基β-內(nèi)酰胺類的用途；該催化劑合成酶活性2200U/g干重，蛋白質(zhì)含量0.95g/g干重，由紅紋黃單孢菌細(xì)胞生物量經(jīng)低溫效應(yīng)，pH梯度下有機(jī)溶劑處理提取酶，沉淀酶聚集體，交聯(lián)等步制得；它作為催化劑可在水中或水與有機(jī)溶劑混合介質(zhì)中通過(guò)D-苯甘氨酸甲酯衍生物對(duì)β-內(nèi)酰胺化合物的?；饔煤铣砂被嗝顾睾桶被^孢菌素類藥物。文檔編號(hào)C12P35/00GK101525603SQ20081004488公開日2009年9月9日申請(qǐng)日期2008年3月4日優(yōu)先權(quán)日2008年3月4日發(fā)明者克列斯季安洛瓦·伊琳娜,庫(kù)偌什金娜·瓦連金娜,斯克利亞仁科·安娜,輝熊,王明蓉,胡遠(yuǎn)輝,薩塔偌娃·熱尼,用蔣申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司四川抗菌素工業(yè)研究所;俄羅斯聯(lián)邦國(guó)營(yíng)企業(yè)工業(yè)微生物遺傳育種國(guó)家研究所