專利名稱：?；蚪M假attP位點及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于?；蚪M中能被鏈霉菌噬菌體cDC31整合酶識別的假attP位點及其應用。
背景技術(shù)：
哺乳動物細胞中導入外源基因的方法有很多種，物理方法主要有受精卵原核顯微注射法、電穿孔法；化學方法主要有磷酸鈣-DNA共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂質(zhì)體介導法及生物學的病毒介導方法等等，但所有的外源基因?qū)敕椒ň婕暗酵庠椿虻碾S機整合及表達的問題，外源基因整合位點的隨機性將給目的基因及宿主細胞帶來不可預知的后果1、外源基因的隨機整合可能會造成位置效應影響，導致目的基因表達水平的不穩(wěn)定甚至不表達；2、對宿主細胞的基因組而言，外源基因的隨機性插入可能激活或抑制某些內(nèi)源基因，改變其原先正常有序的基因表達調(diào)控模式，致使細胞癌變甚至死亡。
位點特異性重組是自然界中實現(xiàn)遺傳物質(zhì)重組的另一種形式，指在噬菌體整合酶的作用下，噬菌體基因組與細菌基因組在約幾十個特定的堿基之間發(fā)生的重組反應。人們利用這一特定的整合方式而實現(xiàn)外源基因在哺乳動物基因組中進行定點修飾。Cre酶及Flp酶是目前在哺乳動物基因組修飾中較為常用的兩種酶。盡管存在著一些局限如外源基因在整合后還可能解離反應，即已整合的外源基因在重組酶的作用下從染色體上切除等，這兩種酶廣泛地被運用于基因組的精確修飾(Nagy A， Genesis. 2000 Feb; 26 (2): 99-109) (Nagy A,Methods Mol Biol. 2001; 158: 95-106) (Kolb AF, Cloning Stem Cells. 2002; 4(1): 65-80)。
一種來源于①C31鏈霉菌(S"e/ tom;;cM)噬菌體的整合酶即①C31整合酶，由于它是以單向整合方式，重組過程無須其他輔助因子，而且整合率高的特點，所以近年來越來越多地被用來介導外源基因與宿主基因組的特異性整合。在自然界中OC31整合酶介導噬菌體基因組中39bp的attP位點(attachment site in phage genome)與細菌基因組中34bp的attB位點(attachment site in bacteria genome)發(fā)生特異性整合，OC31整合酶分別切斷attP位點及attB位點的核心序列，在鏈發(fā)生交換后，四條鏈的末端重新連接，這樣噬菌體基因組被穩(wěn)定整合入細菌基因組中，噬菌體基因組的左右兩端分別是兩個雜合的短序列attL、attR (Thorpe HM， Proc Natl Acad Sci USA. 1998 May 12; 95(10): 5505-10) (Groth AC, ProcNatl Acad Sci USA. 2000 May 23; 97(11): 5995-6000)。因為與其他的重組酶如Cre酶及Flp酶不同，①C31整合酶介導的整合是單向性，它不會發(fā)生回復切除，即當attB、 attP兩序 列發(fā)生特異性重組后，所產(chǎn)生的attL和attR不會被①C31整合酶識別而被再次介導重組(Thorpe HM， Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998 May 12; 95(10): 5505-10) (Groth AC, Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 2000 May 23; 97(11): 5995-6000)，這樣的整合顯得有效、穩(wěn)定。而 且，①C31整合酶介導的重組過程中無需其他輔助因子，這些優(yōu)點使OC31整合酶在生物 工程上具有重要的利用價值，有研究發(fā)現(xiàn)，①C31整合酶在哺乳動物中能有效介導攜帶有 attB序列的外源基因與哺乳動物基因組發(fā)生高效重組反應，實現(xiàn)位點特異性整合(Thyagarajan B, Mol. Cell Biol. 2001 Jun; 21(12): 3926-34)。事實上，OC31整合酶介導的 重組反應，廣泛地被運用于諸多領(lǐng)域，包括轉(zhuǎn)基因動物制備、基因治療、基因組修飾等(Nimmo D D, Mol. Biol. 2006 Apr; 15(2): 129-36) (Allen BQ Nat. Protoc. 2006; 1(3): 1248-57) (Bertoni C, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006 Jan 10; 103(2): 419-24) (Bateman J R, Genetics. 2006 Jun; 173(2): 769-77) (Ehrhardt A, Mol Ther. 2007 Jan; 15(1): 146-56)。當攜帶attB序列的質(zhì)粒在巾C31整合酶的介導下，在attB序列的核心位點斷裂并與 哺乳動物基因組的某些位點發(fā)生特異性重組時，其基因組上的整合位點被稱為假attP位點(Thyagarajan B， Mol Cell Biol. 2001 Jun; 21(12): 3926-34)。假attP位點與噬菌體中的attP 位點有著部分同源性，廣泛存在于多種物種的動物基因組中，而且研究發(fā)現(xiàn)每種物種往往 存在著多個假attP位點。人們分別從人、小鼠、大鼠、兔、果蠅基因組中檢測到31、 57、 3、 3、 3個假attP位點(Thyagarajan B, Mol Cell Biol. 2001 Jun; 21(12): 3926-34) (Chalberg T W， Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 Jun; 46(6): 2140-6) (Keravala A, J Gene Med. 2006 Aug; 8(8): 1008-17) (Groth AC, Genetics. 2004 Apr; 166(4): 1775-82)。多假attP位點的現(xiàn)象使外 源基因的整合變得非特異性。這對于利用該重組系統(tǒng)進行遺傳操作帶來一定的麻煩。然而， 進一步的研究結(jié)果表明在諸多的假attP位點中其整合頻率往往不是均等的，存在著若干優(yōu) 先整合位點(熱點)。據(jù)報道，在小鼠基因組中發(fā)現(xiàn)了一個高頻整合位點mpsLl，位于2 號染色體上，處在編碼序列以外。與己發(fā)現(xiàn)的其他的假attP位點相比，mpsLl位點被整合 的頻率明顯最高，在所有的受試小鼠中均能檢測到該位點(Olivares E C， Nat Biotechnol. 2002 Nov; 20(11): 1124-8) (Held P K， Mol Ther. 2005 Mar; 11(3): 399-408)。而且，更為重 要的是整合入該位點的外源基因均能得到持續(xù)高效地表達(Olivares E C， Nat Biotechnol. 2002 Nov; 20(11): 1124-8)。在人基因組中人們同樣也檢測到了一個熱點，命名為假attP位 點A。體內(nèi)實驗的結(jié)果表明，外源基因在該位點的整合率高達40%，在該位點整合的外源 基因可保持穩(wěn)定、高水平地表達，而且所表達的蛋白功能正常(Thyagarajan B， Mol Cell Biol. 2001 Jun; 21(12): 3926-34) (Ortiz-Urda S， Nat Med. 2002 Oct; 8(10): 1166-70)。最近，本申請的發(fā)明人通過研究證實①C31整合酶同樣能介導attB序列與牛基因組中的某些特定序列發(fā)生位點特異性重組，并且首次在?；蚪M中發(fā)現(xiàn)了兩個假attP位點BpsFl、 BpsMl (中國發(fā)明專利申請，申請?zhí)?00510111476.3)，他們均不存在于編碼區(qū)，其中，BpsFl位于28號染色體上，BpsMl位于19號染色體上(Ma Q W， Biochem BiophysRes Commun. 2006 Jul 7; 345(3): 984-8)。

發(fā)明內(nèi)容
本申請的發(fā)明人在已有研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，繼續(xù)對?；蚪M中假attP位點進行檢測，在牛耳皮膚成纖維細胞中又發(fā)現(xiàn)一個新的假attP位點，該位點能以較高頻率地被整合，然后利用同源重組的機制，使目的基因能更高頻率地整合于該位點，而且整合于該位點的目的基因能高效穩(wěn)定地表達。
因此，本發(fā)明的首要目的在于提供一個新的?；蚪M中鏈霉菌噬菌體①C31整合酶可識別的假attP位點。
本發(fā)明的第二個目的在于提供一種利用該假attP位點的旁側(cè)序列構(gòu)建的定向整合載體。
本發(fā)明的第三個目的在于提供一種所述定向整合載體的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的第四個目的在于提供一種所述的牛基因組假attP位點的應用。
本發(fā)明的假attP位點位于牛基因組的第4號染色體上，其核心序列具有如SEQ ID
NO.l所示的DNA序列；含所述假attP位點的旁側(cè)序列具有如SEQ ID NO.2所示的DNA序列。
本發(fā)明的定向整合?；蚪M假attP位點的載體，包括目的基因，假attP位點旁側(cè)序列，attB位點核心序列。
其中，所述目的基因包括綠色熒光蛋白、人第九凝血因子、人血清白蛋白、人轉(zhuǎn)鐵蛋白。
本發(fā)明的定向整合?；蚪M假attP位點的載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟
a、 構(gòu)建含目的基因和attB位點的質(zhì)粒載體；
b、 構(gòu)建含假attP位點旁側(cè)序列的質(zhì)粒載體；
c、 將步驟b所得載體中含假attP位點核心序列的片段替換為含attB位點核心序列的片段，回收含attB位點核心序列的假attP位點旁側(cè)序列的片段；
d、 將步驟c所回收的片段與含目的基因的載體連接。本發(fā)明的牛基因組假attP位點的應用，用于在牛細胞中整合目的基因。所述的整合目的基因的步驟包括將所述載體和含鏈霉菌噬菌體①C31整合酶基因的質(zhì)粒按一定比例混合后轉(zhuǎn)染牛細胞，然后篩選陽性克隆細胞株。利用本發(fā)明的假attP位點構(gòu)建定向整合載體，將該載體與表達①C31整合酶的質(zhì)粒 pCMV-INT共轉(zhuǎn)染牛耳皮膚成纖維細胞(FC)，可將目的基因以較高的整合率整合于?；?因組中，并且目的基因能得到較高水平地表達。本發(fā)明大大提高了目的基因的定向整合率， 極大地減少篩選工作，并且目的基因還能高效表達，使獲得的轉(zhuǎn)基因細胞能在較短時間內(nèi) 用于下游的生產(chǎn)，如作為轉(zhuǎn)基因克隆牛的供體細胞，促進目的基因的定向整合技術(shù)在轉(zhuǎn)基 因牛制備中的進一步應用。


圖1是半巢式反向PCR —擴產(chǎn)物電泳圖泳道l一泳道6依次為退火溫度51.4°C、 53.2°C、 55.7°C、 57.1°C、 59.6°C、 61.2。C的PCR擴增產(chǎn)物；泳道7為空白對照(水)；泳 道8為1KbDNAMarker。圖2是半巢式反向PCR 二擴產(chǎn)物電泳圖泳道1為1Kb DNA Marker,泳道2 — 6依 次為退火溫度50.4"、 52.2°C、 54.7°C、 56.1°C、 58.6°C、 60.2'C的PCR擴增產(chǎn)物。圖3是pEGFP-Nl-P4B載體的構(gòu)建過程流程圖。
具體實施方式
發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)在牛基因組中有一個能在。C31整合酶介導下與目的基因高頻 率整合并高效表達的假attP位點(BF4),通過對BF4的旁側(cè)序列進行擴增，進而將該片段 轉(zhuǎn)入目的基因載體中attB序列兩側(cè)的方法，使目的基因高效定向整合于該位點，并能穩(wěn)定 高效表達。以下結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步說明。需要指出的是，本實施例僅用于 解釋本發(fā)明而不是對本發(fā)明范圍的限制。本發(fā)明的實施例中所用到的含目的基因綠色熒光蛋白(EGFP)和attB位點的質(zhì)粒 pEGFP-Nl-attB、以及含鏈霉菌噬菌體①C31整合酶基因的質(zhì)粒pCMVInt的構(gòu)建參考申請 號為20051011476.3的中國發(fā)明專利申請。以下實施例中，所使用的限制性內(nèi)切酶購自TakaRa公司；培養(yǎng)基購自吉諾生物公司； 抗體購自KPL公司。實驗所用的牛耳皮膚成纖維細胞(FC)取自上海醫(yī)學遺傳研究所松江科研基地的奶牛。實施例l、細胞轉(zhuǎn)染、篩選
轉(zhuǎn)染的前一天，接種0.5-2X10S個牛耳皮膚成纖維細胞于25cr^細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)以保證在轉(zhuǎn)染時候細胞的豐度達到90%-95%。轉(zhuǎn)染包括如下步驟
(1) 在EP管中加入2)tig的pEGFP-Nl-attB及6pg的pCMV-INT質(zhì)粒DNA，用500pl無血清的D/F12培養(yǎng)基稀釋DNA，并輕輕混勻，室溫下靜置5分鐘。
(2) 在另一個EP管中加入20^1 LipofectamineTM 2000 (invitrogen公司)，用50(^1無血清的D/F12培養(yǎng)基稀釋，室溫下靜置5分鐘。
(3) 將LipofectamineTM 2000稀釋液和DNA的稀釋液(總體積為1000pl)輕輕混勻并在室溫下靜置20分鐘。
(4) 將lml的混合液加入待轉(zhuǎn)染的細胞中，混勻，置37°C、 5%<:02條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
(5) 4-6小時后，對細胞進行換液，換成含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。
(6) 轉(zhuǎn)染24小時后將細胞以1: 10 (或更高的稀釋度)稀釋度轉(zhuǎn)移到12孔板中。篩選l一2天后，換成選擇培養(yǎng)基(300ng/pl G418+10。/。胎牛血清+D/F12培養(yǎng)基)
對細胞進行選擇培養(yǎng)。選擇培養(yǎng)持續(xù)2周之后，在顯微鏡下，可見到一個個獨立的細胞克隆。
G418抗性細胞的擴增對在紫外燈下能發(fā)出綠色熒光的細胞克隆進行挑取。吸去培養(yǎng)液，用無鈣鎂的PBS洗1一2遍，并于顯微鏡下，在細胞克隆處加10—20W 0.25%的胰酶溶液，待細胞逐漸變圓時，用20pl的槍吸出，轉(zhuǎn)移到12孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。
實施例2、牛基因組假attP位點的克隆
(1) 牛耳皮膚成纖維細胞基因組DNA的提取選取實施例1中GFP表達水平最高(綠色熒光最強)的細胞克隆，按常規(guī)方法抽提取牛耳皮膚成纖維細胞基因組DNA。
(2) 反向PCR模板的制備取步驟(1)的1嗎牛耳皮膚成纖維細胞基因組DNA，用EcoRI、 BanHI、 BglII進行酶解。酶解體系10XBuffer(K)， 20nl; EcoRI， 5.5^1; BanHI，5.5pl; BglII, 6^1; DNA， 18^1; ddH20， 145^1。共200^1反應體積，37。C過夜。
分別對酶解產(chǎn)物進行酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，最后用20plTE溶解后進行自連接，體系10xBuffer， 15^1;酶解產(chǎn)物，9^1; T4DNAligase(TaKaRa)，6pl; ddH20， 120pl，共150^1。16。C過夜。對連接產(chǎn)物進行酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，TE溶解后即可作為模板DNA用于反向PCR(3)半巢式反向PCR (iPCR): 設計正向引物attB-Fl、 attB-F2位于attB核心序列的上游，EGFP為反向引物，位于 attB-Fl、 attB-F2上游。EGFP: TCG TCC ATG CCG AGA GTG ATG C attB-Fl: CTA GTA CTT CTC GAG GTC G attB-F2: ATG TAG GTC ACG GTC TCGPCR反應體系10xBuffer (Mg2plug)， dNTP mixture (各2.5mM), 4pl;引物EGFP (lOpmol), 1^1;引物attB-Fl (lOpmol)， l^il;模板DNAl^il; LATaqE (TaKaRa) (5U/nl), ddH20， 15.2^1;共25pl。PCR反應條件94°C預變性5min，進入循環(huán)；循環(huán)條件為94°C 45s， 50—60。C 45s， 72°C 5min， 31個循環(huán)；最后72°C延伸10min。將一擴PCR產(chǎn)物走電泳，電泳結(jié)果如圖l所示。取上述退火溫度為57.rC的產(chǎn)物1^1，用引物EGFP、 attB-F2進行二擴，反應體系及 擴增條件均同上，電泳結(jié)果如圖2所示，其中1.8Kb處有條帶。實施例3、假attP位點旁側(cè)序列的測定和分析對假attP位點旁側(cè)序列的分析，是通過將半巢式反向PCR擴增產(chǎn)物克隆進T載體后 進行測序，然后將測序結(jié)果進行兩次比對，第一次是與NCBI網(wǎng)站公布的牛基因組序列進 行比對，第二次是與pEGFP-Nl-attB載體序列進行比對。如果擴出的序列經(jīng)兩次比對之后， 發(fā)現(xiàn)該序列含有一段pEGFP-Nl-attB序歹ij，并且在attB核心序列之后與pEGFP-Nl-attB序 列不一樣，而是?；蚪M的序列，則認為牛基因組中的該位點為假attP位點，具體測定和 分析步驟如下將實施例2所得半巢式反向PCR產(chǎn)物進行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，并對片段用瓊脂 糖凝膠DNA回收試劑盒(天根公司)進行回收，操作步驟同說明書。將回收片段與pMD19-T (TaKaRa)載體連接，體系PCR片段，3^1; T載體， ligation mix(TaKaRa),5nl; ddH20 1^1。共IOW。 16°C過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)質(zhì)粒抽提，電泳檢測后，將較大質(zhì)粒的克隆 送出測序。在NCBI網(wǎng)站上，將測序的結(jié)果首先與公布的?；蚪M的序列進行比對(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BtaBlast.html)，然后和pEGFP-Nl-attB載體序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目的基因EGFP質(zhì)粒載體中attB的核心序列發(fā)生斷裂，表明目的基因與牛基因組發(fā)生了位點特異性重組，在該細胞克隆中目的基因整合于牛基因組的4號染色體上，將其命名為BF4假attP位點，該假attP位點核心的序列約39bp，其序列如SEQ ID NO.l所示，與噬菌體attP位點的核心序列具有35%的同源性；包含該假attP核心位點的旁側(cè)序列約4.7kb，其序列如SEQ ID N0.2所示。
進一步對該位點進行分析，發(fā)現(xiàn)該假attP位點在Gli蛋白家族3 (Hedgehog—Gli信號通路中的信號分子)基因的下游3'的UTR區(qū)，附近序列富含A-T堿基，與下游的一個功能未知的蛋白的基因相距17K多。
實施例4、 pEGFP-Nl-P4B載體的構(gòu)建過程
從假attP位點兩邊旁側(cè)序列擴增4.7kb的片段，經(jīng)切除假attP的核心序列之后，連上attB G38bp)序列。將該片段與目的基因(綠色熒光蛋白，GFP)相連，構(gòu)建攜帶有attB序列、BF4假attP位點的旁側(cè)序列以及GFP基因的表達載體pEGFP-Nl-P4B載體，具體構(gòu)建過程見圖3。
第一步，pcDNA3.1-(-)-neo-Pl的構(gòu)建
(1) 、假attP旁側(cè)序列的PCR擴增
根據(jù)實施例3所得的位于牛4號染色體上的假attP位點的序列設計引物，用正常牛全
基因組作為模板，對假attP位點BF4的旁側(cè)序列進行擴增。上下游引物的5'分別加上Mlul
和NheI酶切位點。
引物1: NFIX-1L: TCA ACG CGT CAC CTG CGA AGG AGC TTA AC引物2: NFIX-1R: TCA GCT AGC GTG CAG GAG GAG GAA GAC AGPCR反應體系10xBuffer， 2.5^1; dNTP mixture (各2.5mM)， 2pl;引物NFIX-1L(lOpmol)， 1^1;引物NFIX-1R (lOpmol) lfil;牛基因組DNA2pl (300ng); TaKaRaTaqE(5U爾1) 0.2nl; ddH20 16.3nl;共25pl。
PCR反應條件94°C預變性5min，進入循環(huán)；循環(huán)條件為94°C 45s， 57—67。C 45s,
72°C lm30s， 35個循環(huán)；最后72°C延伸10 min。 PCR產(chǎn)物走0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，
并對4.7kb片段進行回收。
(2) 將PCR的片段連入pMD19-T載體，連接體系PCR片段，3^1; T載體，1^1;ligation mix (TaKaRa)， 5^1; ddH20 1^1，共10^1， 16°C過夜。
(3) 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑斑，搖菌，并抽提質(zhì)粒，將陽性質(zhì)粒命名為TPl。(4) 載體酶切載體TP1及pcDNA3.1-(-)-neo (購自Invitrogen公司)分別用Mlul和NheI雙酶切。先進行NheI酶切，體系載體，12pl; 10xBuffer， lOpl; Nhel， 2.5pl;ddH20， 75.5nl。共100W， 37°C， 2hr。乙醇沉淀，再用MluI酶切，體系載體，O[il; 10XBuffer, 5pl; Mlul， 1.5jil; ddH20， 43.5^1。共5(HU， 37°C, 2hr。酶切產(chǎn)物走0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，并分別對載體TP1及pcDNA3.1-(-)-neo的4.7k左右的片段進行回收。
(5) 將回收的片段進行連接，體系TP1的回收片段，12pl(0.6嗎)；pcDNA3.1-(-)-neo4^1 (0.2嗎)；10xBuffer， 2pl; T4DNA ligase (TaKaRa)， 1.5|al; ddH20 0.5pl。共10pl。16°C過夜。
(6) 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑斑，搖菌，并抽提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后送出測序，將陽性質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-(-)-neo-Pl 。
第二步，pcDNA3.1-(-)-neo-PlB載體構(gòu)建
(1) 載體酶切對pcDNA3.1-(-)-neo-Pl用Agel， PshAI雙酶切，先進行AgeI酶切，體系載體，90nl (15嗎);10xBuffer， 15^1; Agel (NEB)， 3^1; ddH20， 42^1。共150(^1，37°C， 2hr。乙醇沉淀，再用PshAI酶切，體系10XBuffer， 15|_d; PshAI， 3^1;載體DNA;ddH20， 132^1。共150nl， 37°C， 2hr。同時對pEGFP-Nl-attB進行Aflll酶切，體系載體，7pl(15嗎);10xBuffer， 15— 100xBSA， 1.5^1; Aflll (NEB)， 3pl; ddH20， 123，。共150nl， 37°C， 2hr。分別對酶切產(chǎn)物進行乙醇沉淀。
(2) 對酶切片段補平體系10xT4po舊uffer， 5^1; 0.1%BSA， 5^1; dNTP， 5^1;酶切產(chǎn)物；ddH20， 33nl，總體積48pl。 70"C水浴，5 — 10min;在37"C水浴中加入T4Po1酶，2nl，溫浴5—10min;振蕩，使酶失活。對pEGFP-Nl-attB的AflII酶切產(chǎn)物走0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，并回收338bp的片段。對pcDNA3.1-(-)-neo-Pl的酶切產(chǎn)物進行酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后去磷酸化處理，體系10xCIAPBuffer， 5^1;堿性磷酸酶CIAP， 2^1;乙醇沉淀酶切后的載體DNA; ddH20, 43pl?？傮w積50^1。 37。C水浴，45min。之后走回收膠，對8633bp的片段進行回收。
(3) 將回收的片段進行連接，體系attB的回收片段，4nK212ng); pcDNA3.1-(-)-pl,2^1 (112ng); 10xBuffer， T4DNAligase (TaKaRa)， 1^1; ddH20， 2^1。共10pl。 16'C過夜。
(4) 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑斑，搖菌，并抽提質(zhì)粒，經(jīng)Pmad酶切鑒定后送出測序，將陽性質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-(-)-neo-PlB。第三步，pEGFP-Nl-P4B載體的構(gòu)建
(1) 對pcDNA3.1-(-)-neo-PlB用Mlul，載體TP1及pcDNA3.1-(-)-neo分別用Mlul和Nhel雙酶切。先進行NheI酶切，體系載體，20^1; 10xBuffer， 15^1; Nhel， 3^1; ddH20，120^1。共150pl， 37°C， 2hr。乙醇沉淀，再用MluI酶切，體系10XBuffer， 15^1; Mlul，3^1;載體；ddH20， 132ul。共150W， 37°C， 2hr。酶切產(chǎn)物進行乙醇沉淀；同時對pEGFP-Nl-attB進行AflII酶切，體系載體，7pl (15嗎)；10xBuffer， 15^1; 100xBSA，1.5^1; AflII (NEB)， 3pl; ddH20， 123.5^1。共150^1， 37°C， 2hr。對酶切產(chǎn)物進行乙醇沉淀。
(2) 對酶切片段補平，體系10xT4polBuffer， 5^1; 0.1%BSA， 5^1; dNTP， 5|^1;酶切產(chǎn)物；ddH20， 33^1，總體積48pl。 70。C水浴，5—10min;在37。C水浴中加入T4Po1酶，2^1，溫浴5 — 10min;振蕩，使酶失活。對pcDNA3.1-(-)-neo-PlB的酶切產(chǎn)物走0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，并回收4207bp的片段。對pEGFP-Nl-attB的酶切產(chǎn)物經(jīng)酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后去磷酸化處理，體系10xCIAPBuffer， 5^1;堿性磷酸酶CIAP， 2^1;乙醇沉淀酶切后的載體DNA; ddH20， 43^1?？傮w積50pl。 37'C水浴，45min。之后走回收膠，對4733bp的片段進行回收。
(3) 將回收的片段進行連接，體系10xBuffer， l|il; P1B的回收片段，2pl (88ng);pEGFP-Nl， 4^1 (88ng); T4DNA ligase (TaKaRa)， ddH20， 2^1。共lOpl。 16。C過夜。
(4) 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑斑，搖菌，并抽提質(zhì)粒，經(jīng)BanHI酶切鑒定后送出測序，將陽性質(zhì)粒命名為pEGFP-Nl-P4B。
容易理解，本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過類似的分子生物學方法，利用載體中的多克隆位點可以將人第九凝血因子、人血清白蛋白、人轉(zhuǎn)鐵蛋白等目的基因構(gòu)建到pEGFP-Nl-P4B表達載體中，進一步構(gòu)建表達目的基因的載體。
實施例5、目的基因在?；蚪M假attP位點(BF4)處整合的檢測將載體pEGFP-Nl-P4B與表達①C31整合酶的質(zhì)粒pCMV-INT共轉(zhuǎn)染牛耳皮膚成纖維細胞(FC)，經(jīng)克隆篩選，檢測整合位點，同時以不加旁側(cè)序列載體作為對照，分析其整合率，具體步驟如下
(1)按實施例1所述方法，將pEGFP-Nl-P4B與pCMV-INT (質(zhì)量比10: 1)共轉(zhuǎn)染牛耳皮膚成纖維細胞，經(jīng)G418篩選獲得各細胞克隆。(2) 按常規(guī)方法抽提各細胞克隆基因組DNA。
(3) PCR檢測根據(jù)該假attP位點和載體上的attB序列設計引物5L: GCT GGA CGT GTA ACC CCT TA
5R: GGA TCA ACT ACC GCC ACC T
PCR反應體系:10xBuffer (Mg2plug)， 2 1; dNTP mixture (各2.5mM)， 2^1;引物5L(l(Himo1)， 1^1;引物5R (l(Himol)， lpl;模板DNA， 1^1; LATaqE (TaKaRa) (5U爾1)，0.3^1; ddH20， 16，。共25pl。
PCR反應條件94°C預變性5min，進入循環(huán)；循環(huán)條件為94°C 45sec， 65°C 45sec，72°C 30s， 32個循環(huán)；最后72'C延伸10 min。 PCR產(chǎn)物進行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增條帶，302bp的條帶為陽性，表明該細胞克隆中目的基因整合于BF4位點。
經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染GFP載體的細胞克隆中整合在BF4假attP位點的細胞克隆數(shù)占93%(55/59)，比不加旁側(cè)序列載體的整合率(42/57， 74%)提高19%。
實施例6、雙夾心ELISA法測定目的基因(GFP)的表達水平
樣品的制備將實施例5中整合在假attP位點(BF4)的細胞用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒(碧云天生物公司)抽提蛋白，作為待測樣品進行檢測，具體步驟如下
1、 將鼠抗GFP抗體用0.2M碳酸鹽緩沖液(PH 9.6) 1:4000稀釋，酶標板中每孔加入120^d上述稀釋的抗體，37°C， 2hr。傾去包被抗體，用含0.5%Tween20的PBS室溫洗漆5次。
2、 每孔加入150^1含2XBSA的PBS， 4'C封閉過夜，傾去封閉液，洗漆4次。
3、 酶標板上每孔依次加入100plPBS (空白對照)、GFP濃度為100ng/ml、 50ng/ml、25 ng/ml、 12.5 ng/ml、 6.25 ng/ml、 3.13 ng/ml、 1.56ng/ml的標準品，以及待測的GFP樣品。37'C溫育2hr，倒去樣品，洗滌5次。
4、 每孔中均加入100^1用含2%BSA的PBS 1: 32000稀釋的生物素標記的羊抗GFP抗體，37'C溫育2hr。倒去一抗，洗漆5次。
5、 每孔中均加入lOOjal用含2%BSA的PBS h 4000稀釋的羊抗生物素HRP抗體(abeam公司，UK)， 37'C溫育2hr。倒去二抗，洗滌5次。
6、 每孔中均加入100plTMB顯色，待標準品顯色梯度明顯后加入lOOpl 1MH2S04,止反應。
7、 用酶標儀上測定每孔的OD值，讀取數(shù)據(jù)。經(jīng)過計算，結(jié)果顯示整合在BF4位點的GFP基因的表達水平可高達280ng/ml左右。 結(jié)果表明目的基因依然能得到較高水平地表達，比整合于別的位點如位于IO號染色體上 的位點高四倍左右。
通過本發(fā)明的策略，大大提高了目的基因的定向整合率，極大地減少篩選工作，并且 目的基因還能高效表達，使獲得的轉(zhuǎn)基因細胞能在較短時間內(nèi)用于下游的生產(chǎn)。序列表
<110>上海市兒童醫(yī)院
〈120>?；蚪M假attP位點及其應用
〈130> P5081034
〈160〉 2
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211> 39
〈212〉 DNA
<213〉 Bos taurus
<220>
〈221〉 gene
<222> (1)..(39)
<400〉 1
aaggactctg aaaaacccta aagtattcta gggagaaac 39
〈210〉 2
〈211〉 4684
〈212〉 腿
〈213〉 Bos taurus
<220>
〈221〉 gene
<222> (1)..(4684)
<400〉 2
cacctgcgaa ggagcttaac tcatccaggg tccaccactg cagcctgcca cctgctcacc cattgcaggg caggggtggg tcaccgtgac ttggtttcgg gccccagaac ctgtgttgtc gtctctgcag gcacgcagcc cagtaccagc
agttgttact gctttgttta agccagggaa 60
caccccctta cttcatcact ggcccttcga 120
c卿ctggtc atggtttggt ttggtttggt 180
atcccgaggt aaacccgtgt ctcccacgct 240
tgcagtctgg gcgggcccat gcccctcctc 300ccg犯cag犯gcgacctgtc tggggtggac atcaccatgt tg犯catgct caaccggagg 360
gacagcagca ccagcaccgt cagctccgcc tacctgagca gccgccgctc ctctggcatc 420
tcgccctgct tctccagccg ccggtccagc g鄉(xiāng)cgtccc aggccgaggg gcgaccccag 480
aacgtgagcg tggccgactc ttacgacccc atctccaccg acgcctctcg caggtccagc 540
gaggccagcc agggcgscgg tctgcccagc ctgctcagcc tcactcccgc ccagcagtac 600
cgcctgaaag ccaagtacgc tgccgccacg ggcggccccc cgcccacccc gctgcccaac 660
atggagagga tgagcctcaa gacccggatg gccctgttgg g卿tggcag ggagccggcg 720
gggaccctgc ctcccgtgca tcctxctcgg agatgcagcg acggcggggc ccacggttac 780
agccggcgcc cactgctgcc ccaggstgcg ctgggc犯cg gcgtgagsag agccagcgac 840
ccggtgagga cggtttcgga gagcctctct ctgccccggg tacagcggtt c犯cagcctt 900
aacagcttca accctccggt gttgcctcca tccctggaaa agcgcaacct cgtgcttcag %0
aactacacgc ggcccgatgg gggccaggcc cgccacttcc actcctctcc ctgtcccccg 1020
agcatcactg agaatgtcac cctggagtcc ctgaccatgg acgccgacgt gagcctg犯c 1080
gatgaggacc tcctgcctga tgacgtggtg cagtatttaa attcccag犯cccagccggg 1140
tatgagcagc acttcccagg caccttctct gatgacagca aagtgcccca tggcttaggg 1200
agtggacccg gggactttga cccactgggg ctgcccgaca gccacgccag ccacaccggc 1260
agccagcagt accgcagcct ggagcagccc tgccccgatg ccagtaaatc cgacctgccc 1320
attcagtgga acgaagtcag ctccggcagc gcggacctgt cctcctccaa gctgaaatgt 1380
ggccagcggt ccatggggca gcaggcccgg gccttcgggt cgtacagcca catgggtgtt 1440
cacccacaga atccattgag gagtggggct ggcccagctg gggggtatcc gacccttggg 1500
gagcatgcca gctccttcgg gggcccggaa cacttagtga gccacggtgg cggagctggc 1560
accaatggga atgccttcca tgaaccaccc tataaggccc agcagtatgg gaactgcctc 1620
aac已ggcagc ctggtgcccc caccttactc gatggggcct gtggccctgg gatccaggcg 1680
gcaaagctga aaagcatcac catgcaaggg agcgggagcc atctggattt tggcctgtcg 1740
gtggtgccga atgagtcaac cggcagcacg gtgaatggca tacccacccc agaccccaca 1800ggacaggggt acctggctca gcagctcctc ggtgacagca cscacaccca gggggcaggc 賜0
cgctccgggc ag犯cctgct ggggcaggct agtgctacct cacacatcta tcaagggccg 1920
gagagcagcc tgcccgggcc tcccagcatc agcgtgcagc cgccaaacgt ggcagccgtc 1980
aggggctacc agccatgtgt tggctacggg ggcagccggc gccaggctgg gccgaggggt 2040
ggtctcgctc tgcagccagg acagtttagt gacccgagtc agacctgcag ggtg犯tggc 2100
atcaagatgg agatgccagg acagccccat cagctctgtt cg犯tgtgca gagttactct 2160
ggtcagttct atgaccaaac tgttggcttc ggtcagcaag acatgaaaac tggttccttc 2220
tccatgtcag aagccaBctg cctgctccag ggggccggcg ccgaaaactc tgaattactc 2280
tccccaggtg ctaaccaggt gacaagcaca gttgacagcc tcgacagcca tgacctggaa 2340
ggggtgcaga ttgatttcga cgctatcata gacgacgggg accacgccag cctgatgtca 2400
ggagccctga gcccaagcat tattcagaac ctttctcata gctcctcccg actcaccacg 2460
ccgcgagccg cccttccgtt cccgcctctg tctttgagca ccaccaacat ggcaatcggg 2520
gacatgagct ctctgctgac ctccctcgcg gaagaaagca aattccttgc ggttatgcag 2580
taagcattag gggaaaaaaa cgactgccaa gagacctgaa actttaggag tttaaaagat 2640
taaattgacc cttttttgtt tggctgagtt tttttagttc tgtatgtatt ttagcgatct 2700
catctcacct aactgggatg tgtttcaagt atattccttt tatggaaaag gactctgaaa 2760
aaccctaaag tsttctaggg agaaactgtc ttccatttca gttttgaatc sgtattgtta 2820
cactcaaaac atcctcttaa aaaaaaaaag aaaactgtaa gcctattcct ccctccccct 2880
tctttttttt agtaaaccgg tgtaaatggt gatgtgcgcg ttctttcttt tcagagagag 2940
ggcaagtgaa aggatttgac gtgtctctcc gttattccaa ggaactagga agttggtgtg 3000
cttgtgacta aggggttaca cgtccagcgt ttttccattt tcctttacat atgctcaatg 3060
tttgtttttg tgttttgttt cttttgtttt tgaattccca cactgggctc aggagtcgga 3120
agttgg聊g tgagtttggg犯tctcttgt gggtgtsctg tsgccgaggt犯c鄉(xiāng)cttt 3180
tgagaagctc ccaacccccg ttcagtttgg ggaatgcttc agacagatac acacaagtgg 3240
aaattcaggg ctcctgtgca gaggagatac aactttgccc acagttgggg gttaaaatcc 3300ttcctgtcca tacgtgtgct ggacaggaag atcgaccctg cctcccctct ctgtctgtcc c鄉(xiāng)g郷ag tgttgggcga cgcccacaca ggtagatatg ttataga tta aagctattgc atatgattag ttccatctct cgccccattt tatatctsgt tttgagtata taggtactta tattaattcc actatagcaa aagagtattt stgsa^tttg gttgt犯a3g aa朋gctcat 犯c8ttttC3 gt3ttta犯a sctctaaggg taacactcta ttacattatg cagccgttta taaggtggac tta^gctaga ctttcagatg actccccatg tgtacagttg ctacacataa gact已tccag cattttscct tta已aaagta gcagtcgaca tgttgtattc tgccccattc catgagtccg ttatgtgttt tttctccttt caaataaaag tatgagataa tggaatatta ctcttatttg gaccaagaat ctcacgtggg gggactUag ctg卿cagt tgggtUgct ggtcctcccg ctgttcccca tgtgcagcac tgg犯cag3g cccc犯3tc3 a犯gscaagc atcatctcttc agtgga犯犯tcgaggcctt gtcscagaat cggcagtcca attcgctgaB ggtcctggtc tgagctcgcc tgctcttgtg gcac
gtgggcacat ctatatgtca gttctcagtt 3360
鄉(xiāng)agtgttc agcgctgttc caggggg卿 3420
cactgttact tccatctgtt ctggtaagaa 3480
atagaatttg ggaaatattt gtgggttggc 3540
tcat3gataa cagagt犯ct gagaattgat 3600
atcccacagc tggctatgtt atcaacaata 3660
ctattctaag tgccctattt taggggactc 3720
agaccaagat atttgg犯ta犯ttgcttca 3780
cacagtttca tagctgtgtg gatacattct 3840
agaagctaag tcttctatgc agtttgtcct 3900
aa犯ggttta aagactt犯a aagtgcagct 3960
犯gacatacc atgtgtgcac agggtatgtg 4020
tgtaaactat ga犯atac犯catcagcact 4080
atcttggagt tagatttatc caaagtgatt 4140
ctgccattta aattagtagt agaca犯aat 4200
ggaccagctc atttttctca ggtttatgtt 4260
gtaaaattcc cctctg犯tt ttagactttt 4320
ttcaactaga tgaBagC3ga ggggtattga 4380
cttcttttaa atcaaaggaa gcatcccctt 4440
agtgatctga gctagtagag ttgagtctct 4500
ttctgtattc ttcaaacggg tcatgatctg 4560
tctcgtctct aggtg犯ctc aaagtcccaa 4620
gcttaaccgc ctttctgtct tcctcctcct 4680
468權(quán)利要求
1、一個?；蚪M中假attP位點，其特征在于，所述假attP位點位于?；蚪M的第4號染色體上，其核心序列具有如SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
2、 如權(quán)利要求l所述的?；蚪M假attP位點，其特征在于，含所述假attP位點的旁 側(cè)序列具有如SEQ ID N0.2所示的DNA序列。
3、 一種定向整合?；蚪M假attP位點的載體，其特征在于，所述載體包括目的基因， 假attP位點旁側(cè)序列，attB位點核心序列。
4、 如權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于，所述目的基因包括綠色熒光蛋白、人第 九凝血因子、人血清白蛋白、人轉(zhuǎn)鐵蛋白。
5、 一種如權(quán)利要求3所述載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟-a、 構(gòu)建含目的基因和attB位點的質(zhì)粒載體；b、 構(gòu)建含假attP位點旁側(cè)序列的質(zhì)粒載體；c、 將步驟b所得載體中含假attP位點核心序列的片段替換為含attB位點核心序列的 片段，回收含attB位點核心序列的假attP位點旁側(cè)序列的片段；d、 將步驟c所回收的片段與含目的基因的載體連接。
6、 如權(quán)利要求1所述?；蚪M假attP位點的應用，其特征在于，用于在牛細胞中整 合目的基因。
7、 如權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，所述在牛細胞中整合目的基因的步驟包 括將權(quán)利要求3所述載體和含鏈霉菌噬菌體①C31整合酶基因的質(zhì)粒按一定比例混合后 轉(zhuǎn)染牛細胞，然后篩選陽性克隆細胞株。
8、 如權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述步驟中權(quán)利要求3所述載體和含鏈 霉菌噬菌體OC31整合酶基因的質(zhì)粒的質(zhì)量比為10: 1。
9、 如權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述步驟采用脂質(zhì)體介導的細胞轉(zhuǎn)染法。
10、 如權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述牛細胞為牛耳皮膚成纖維細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個新的?；蚪M中鏈霉菌噬菌體ΦC31整合酶可識別的假attP位點，本發(fā)明還提供一種利用該假attP位點的旁側(cè)序列構(gòu)建的定向整合載體及其構(gòu)建方法。本發(fā)明首先從?；蚪M中分離了一個能被高頻率整合并高效表達外源基因的假attP位點，該位點位于牛4號染色體。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建含有該假attP位點旁側(cè)序列的特異定向整合載體，使外源基因以90％以上的概率整合于該假attP位點上，并且外源目的基因也能獲得高效表達。
文檔編號C12N15/11GK101624592SQ20081004047
公開日2010年1月13日 申請日期2008年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日
發(fā)明者曾溢滔, 歐海龍, 英 黃, 黃淑幀 申請人:上海市兒童醫(yī)院;上海滔滔轉(zhuǎn)基因工程股份有限公司