專利名稱：：生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種利用生物酶催化法提取拉肖皂苷元(laxogenin)的方法，屬于天然產(chǎn)物領(lǐng)域。技術(shù)背景拉肖皂苷元[(25R)-3/5-Hydroxy-5a-spirostan-6-one]，英文名為Laxogenin，是一種具有多種用途的甾體皂苷元。具有強烈的抑制磷酸二脂酶、血小板聚集、癌發(fā)促進劑的活性和促進植物生長和種子萌發(fā)的作用(MimakiY等，phytochemistry，1993,34:799;何祥久等，藥學(xué)學(xué)報，2003,38(6):433-437;松田匡由等，日木生藥學(xué)會第41回年會講演要旨集，2A-5，1994，日本扎幌；MartfnA等.J.Chem.Soc.PerkinTrans.1，2001,261-266;K.Wada等，Agric.Biol.Chem.,1984,48,719.);同時還是一種合成薤白皂苷l和合成油菜素甾醇類植物激素類似物的原料(BiaoYu等，J.Org.Chem.,2002,67(25),9099-9102;MartinA等.J.Chem.Soc.,PerkinTrans.1,2001,261—266)。目前，報道了一種從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元的方法，其首先提取植物中的總皂苷，然后加入稀酸水解，再萃取純化得到拉肖皂苷元(從黑刺菝葜植物中制備拉肖皂苷元的方法，申請?zhí)枮?00710199224.X)。這種方法提取皂苷元不徹底，損失較大，而且有一定環(huán)境污染。中草藥成分復(fù)雜，有活性成分，也有如蛋白質(zhì)、果膠、淀粉、植物纖維等非活性成分，這些成分影響植物細(xì)胞中活性成分的浸出。選用恰當(dāng)?shù)拿?，在常溫、常壓條件下就能起催化作用，可通過酶反應(yīng)較溫和地將植物組織中的淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等雜質(zhì)分解去除，能有效的提高拉肖皂苷元的提取率，還可以保護皂苷元的結(jié)構(gòu)不變，且減少了污染物的排放，實現(xiàn)了"綠色工業(yè)"。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用生物酶催化法提取黑刺菝葜植物中拉肖皂苷元的方法，以該法生產(chǎn)拉肖皂苷元成本低，能有效的提高提取率，并保護皂苷元的結(jié)構(gòu)不變，且減少了污染物的排放。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是首先將中藥黑刺菝葜根莖、塊根、須根、莖、葉、巻須等部位材料，千燥，粉碎成20120目的粉末；按照一定的固液比，將粉末和水置于生物反應(yīng)器中，攪拌成勻漿，調(diào)節(jié)pH值和溫度，分別加入纖維素酶、果膠酶或纖維素果膠復(fù)合酶，淀粉酶，糖化酶等其中一種酶或其中兩種或三種酶組成的復(fù)合酶，或依次加入其中的兩種或三種、四種酶，進行酶生物催化反應(yīng)；酶催化反應(yīng)結(jié)束后，加入一定量的硫酸、鹽酸、磷酸、甲酸或醋酸等有機酸配成濃度在0.58mol/L酸水解液，2010(TC水浴水解0.56h;過濾，濾渣用110%的堿性水溶液洗劑至中性；采用弱極性或中等極性的有機溶劑并按水解產(chǎn)物質(zhì)量與溶劑體積的比值為l:1560的溶劑量提取210h，最后蒸發(fā)濃縮，結(jié)晶得到產(chǎn)叩o在使用這些方法進行制備時，一般包括以下幾個步驟(1)原料處理隨著材料粉末粒徑的減少，皂苷元的提取率會相應(yīng)的有所提高。這是因為皂苷和淀粉顆粒大量存在于薄層細(xì)胞中，外部被很薄的細(xì)胞壁皮層組織包裹。減少粒徑可以使皂苷裸露出來，和催化劑充分接觸，因此原料粒徑的減少，在一定程度上可以提高收率。但是粒徑過小的顆粒，會大量吸收水分而形成糊劑，這使得處理懸浮液十分困難。同時，粉碎粒度過小，細(xì)胞中的天然色素等雜質(zhì)會大量進入溶液中，這會導(dǎo)致提取的皂苷元純度下降。綜合產(chǎn)品的收率和純度兩個因素，黑刺菝葜原材料的粉碎粒度以20120目的粉碎粒徑提取效果最佳。(2)酶生物催化反應(yīng)纖維素酶和果膠酶可以促進"-D-葡萄糖苷鍵的水解而破壞植物的細(xì)胞壁，可以使果膠質(zhì)等連接細(xì)胞的中層等充分分解掉，有利于有效成分的析出；淀粉酶可部分分解淀粉使粘稠的原料液粘度降低，進一步使皂苷裸露出來；糖化酶可使皂苷元連接的糖鏈部分?jǐn)嗔眩瑴p少催化劑進攻皂苷時的位阻，使反應(yīng)皂苷的水解條件更易進行。按照固液比1:11:20(原料的質(zhì)量克數(shù)和水的體積毫升比)將原料粉末和水置于生物反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)pH值，按照原料的質(zhì)量克數(shù)與酶液的毫升體積比10000:11000:5，分別加入纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、糖化酶等其中一種酶或其中兩種或三種酶組成的復(fù)合酶，或依次加入其中的兩種或三種、四種酶，按照下表所示控制最適酶解溫度和pH值，酶解l5h。酶催化反應(yīng)的pH值和溫度<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(3)酸水解反應(yīng)生物酶法催化降解皂苷側(cè)鏈的作用只能將皂苷降解為次級苷，而不能完全的脫去糖鏈成為皂苷元，所以生物催化反應(yīng)必須和水解法協(xié)同作用，才能提高提取收率。酶催化反應(yīng)結(jié)束后，加入一定量的硫酸、鹽酸、磷酸、甲酸或醋酸等有機酸配成濃度在0.58mol/L酸水解液，2010(TC水浴水解0.56h。(4)中和反應(yīng)過濾，濾渣用110%的堿性水溶液洗劑至中性，干燥，研磨得粉狀提取物。堿性水溶液為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鈉、磷酸氫鈉、磷酸氫鉀等的水溶液。(5)皂苷元的提取采用弱極性或中等極性的有機溶劑并按水解產(chǎn)物質(zhì)量與溶劑體積的比值為l:1560的溶劑量回流浸取210h，最后蒸發(fā)濃縮，結(jié)晶干燥得到拉肖皂苷元產(chǎn)品。用弱極性或中等極性的有機溶劑如汽油、環(huán)己垸、正己烷、氯仿或乙酸乙酯等作為萃取劑萃取本發(fā)明提供的方法環(huán)境污染小，提取率高，生產(chǎn)成本低。生產(chǎn)的拉肖皂苷元可用于開發(fā)治療心血管和抗腫瘤等藥物及植物激素產(chǎn)品，也可作為化學(xué)合成的原料?？赏ㄟ^物理化學(xué)性質(zhì)及質(zhì)譜或波譜數(shù)據(jù)鑒定拉肖皂苷元。性狀白色晶體(CHClrMeOH)，可溶于氯仿、丙酮等有機溶劑。紫外燈下顯淡蘭色熒光。質(zhì)譜EI-MSw/z(rel.int.):430[M]+(8)，358(23)，316(45)，301(25)，287(55)，139(100)，122(8)，115(41)。氫波譜數(shù)據(jù)0.77(3H，s,H-18),0.77(3H，s,H-19)，0.79(3H,d,J6.3,H-27),0.97(3H,d，J6.7,H-21),2.20(1H，dd,J3.0，J12.8,5-H),3.35(1H,t,J10.4,26-Hax),3.48(1H,m,26-Heq),3.56(1H,m,3-H),4.41(1H，m,16-H)。碳波譜數(shù)據(jù)36.6(C-1)，30.6(C-2)，70.5(C-3)，30.0(C-4)，56.8(C-5)，210.6(C-6)，46.7(C-7)，37.3(C-8)，53.9(C-9)，40.9(C-10)，21.3(C-11)，39,5(C-12)，40.9(C-13)，56.5(C-14)，31.5(C-15)，80.4(C-16),62.0(C-17)，16.4(C-18)，13.2(C-19)，41.6(C-20),14.4(C-21)，109.3(C-22)，31.3(C-23)，28.7(C-24)，30.2(025)，66.8(C-26)，17.1(C-27)。具體實施方式實施例1黑刺菝葜干燥根莖25g，粉碎成100目，加入蒸餾水120mL，調(diào)節(jié)pH值為6.0,加入活力為15000U/g的纖維素酶0.04mL、活力為1000U/g的果膠酶0.05mL，升溫至5(TC，酶解130min;調(diào)節(jié)溫度75。C，反應(yīng)液pH值為5.5，加入活力為2000U/g的淀粉酶0.05mL，進行淀粉酶催化反應(yīng)，其催化反應(yīng)終點根據(jù)碘試劑的顯色反應(yīng)來確定，當(dāng)?shù)庠噭┯龇磻?yīng)液不再顯藍(lán)色時視為催化終點；然后降溫至6(TC，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為5.5，加入活力為100000U/g的糖化酶0.02mL，酶解120min;過濾后加入一定量的濃H2S04配成硫酸濃度2mol/L的水解液，于10(TC酸水解4h。過濾，濾渣用10%的NaOH溶液洗滌至中性，干燥，研磨得到粉狀提取物。提取物置于索式提取器中，200mL氯仿回流提取6h后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮提取液并將產(chǎn)物結(jié)晶，抽濾，最后在真空干燥箱8(TC10(rC中干燥后得拉肖皂苷元0.53g，提取率95%。實施例2將25g黑刺菝葜干燥根莖，粉碎成50目，加入蒸餾水100mL，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為5.5，在溫度7(TC下加入活力為2000U/g的淀粉酶0.03mL處理lh;調(diào)節(jié)料液溫度55°C，加入活力為15000U/g的果膠酶0.05mL處理2h;調(diào)節(jié)料液溫度65'C，加入活力為100000U/g的糖化酶0.02mL，酶解2h;過濾后加入一定量的濃HCI配成鹽酸濃度3mol/L的水解液，于5(TC進行酸水解4h。過濾，濾渣用3%的碳酸鈉水溶液洗滌至中性，干燥，研磨得到粉狀提取物。將千燥的粉狀水解物置于提取罐中，用200mL汽油回流提取6h后，減壓回收溶劑并將產(chǎn)物結(jié)晶，抽濾，最后在真空干燥箱80'C中干燥后得拉肖皂苷元0.55g，提取率96%。實施例3將25g黑刺菝葜干燥塊根，粉碎成90目，加入蒸餾水100mL，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為6.0，反應(yīng)溫度5(TC，加入活力為20000U/g的纖維素酶果膠酶復(fù)合酶制劑0.05mL酶解2h;加入活力為2000U/g的淀粉酶0.04mL處理lh;調(diào)節(jié)料液溫度65。C，加入活力為100000U/g的糖化酶0.02mL，酶解2h;過濾后加入一定量的濃HCI配成鹽酸濃度3mol/L的水解液，于50°C進行酸水解4h。過濾，濾渣用3%的碳酸鈉水溶液洗滌至中性，干燥，研磨得到粉狀提取物。將干燥的粉狀水解物置于提取罐中，用150mL乙酸乙酯回流提取5h后，減壓回收溶劑并將產(chǎn)物結(jié)晶，抽濾，最后在真空干燥箱9(TC中干燥后得拉肖皂苷元0.65g，提取率95%。權(quán)利要求1.生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法，其特征在于首先將中藥黑刺菝葜根莖、塊根、須根、莖、葉、卷須等材料，干燥，粉碎成20～120目的粉末；按照一定的固液比，將粉末和水置于生物反應(yīng)器中，攪拌成勻漿，調(diào)節(jié)pH值和溫度，分別加入纖維素酶、果膠酶或纖維素果膠復(fù)合酶，淀粉酶，糖化酶等其中一種酶或其中兩種或三種酶組成的復(fù)合酶，或依次加入其中的兩種或三種、四種酶，進行酶生物催化反應(yīng)；酶催化反應(yīng)結(jié)束后，加入一定量的硫酸、鹽酸、磷酸、甲酸或醋酸等有機酸配成濃度在0.5～8mol/L酸水解液，20～100℃水浴水解0.5～6h；過濾，濾渣用1～10％的堿性水溶液洗劑至中性；采用弱極性或中等極性的有機溶劑并按水解產(chǎn)物質(zhì)量與溶劑體積的比值為1∶15～60的溶劑量提取2～10h，最后蒸發(fā)濃縮，結(jié)晶得到產(chǎn)品。2.如權(quán)利要求l所述的生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法，其特征在于在使用這些方法進行制備時，一般包括以下幾個步驟-原料處理黑刺菝葜材料干燥、粉碎成20120目粉末。酶生物催化反應(yīng)按照固液比1:11:20(原料的質(zhì)量克數(shù)和水的體積毫升比)將原料粉末和水置于生物反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)pH值和溫度，按照原料的質(zhì)量克數(shù)與酶液的毫升體積比10000:l1000:5，分別加入纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、糖化酶等其中一種酶或其中兩種或三種酶組成的復(fù)合酶，或階梯法加入各種酶，即依次加入其中的兩種或三種、四種酶，酶解15h。酸水解反應(yīng)酶催化反應(yīng)結(jié)束后，加入一定量的硫酸、鹽酸、磷酸、甲酸或醋酸等有機酸配成濃度在0.58mol/L酸水解液，20100。C水浴水解0.56h。中和反應(yīng)過濾，濾渣用110%的堿性水溶液洗劑至中性，干燥，研磨得粉狀提取物。皂苷元的提取:采用弱極性或中等極性的有機溶劑并按水解產(chǎn)物質(zhì)量與溶劑體積的比值為l:1560的溶劑量回流浸取210h，最后蒸發(fā)濃縮，結(jié)晶干燥得到拉肖皂苷元產(chǎn)品。3.如權(quán)利要求2所述的生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法，其特征在于加入的各種生物酶最適酶解溫度和pH值如下表所示酶催化反應(yīng)的最適pH值和溫度<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>4.如權(quán)利要求2所述的生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法，其特征在于中和反應(yīng)所需的堿性水溶液為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鈉、磷酸氫鈉、磷酸氫鉀等的水溶液。5.如權(quán)利要求2所述的生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法，其特征在于拉肖皂苷元的提取采用弱極性或中等極性的有機溶劑如汽油、環(huán)己烷、正己垸、氯仿或乙酸乙酯等作為萃取劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法。該方法包括將植物黑刺菝葜材料，干燥粉碎成粉末；將其和水置于生物反應(yīng)器中，調(diào)節(jié)pH值和溫度，分別加入纖維素酶、果膠酶或纖維素果膠復(fù)合酶，淀粉酶，糖化酶等其中一種酶或其中兩種或三種酶組成的復(fù)合酶，或依次加入其中的兩種或三種、四種酶進行酶生物催化反應(yīng)；酶反應(yīng)結(jié)束后，加入一定濃度的酸水溶液進行水解；然后過濾，濾渣用堿性水溶液洗劑至中性；采用弱極性或中等極性的有機溶劑浸取一定時間，最后蒸發(fā)濃縮，結(jié)晶得到產(chǎn)品。本發(fā)明的優(yōu)點是皂苷元的提取率高，生產(chǎn)成本低，污染物少。文檔編號C12P33/00GK101230378SQ20081001753公開日2008年7月30日申請日期2008年2月22日優(yōu)先權(quán)日2008年2月22日發(fā)明者孟賢靜,張存莉,瑋朱,婷杜,金玉鑫申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)