專利名稱：花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)以及克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于脂肪酸代謝工程領(lǐng)域，具體涉及一種花生磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)以及克隆方法。
技術(shù)背景磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是高等植物、細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、 綠藻中廣泛存在的一種胞質(zhì)酶(Chollet R,Vidal J，O ， Leary M H.Phosphoenolpyruvate carboxylases ubiquitous,highly regulated enzyme in plants[J].Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1996)，它能催化C02和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)形成草酰乙酸(OAA)，是C4 植物光合固定C02的關(guān)鍵酶。同時，PEPCase在檸檬酸循環(huán)、調(diào)控細(xì) 胞內(nèi)pH值及陽離子平衡等方面也具有重要作用(潘瑞熾，董愚得. 植物生理學(xué).第三版[M]北京:高等教育出版社，1995)。 1999年，陳錦清 等利用PCR技術(shù)克隆了油菜PEP基因片段，并構(gòu)建了帶PEP反義基 因的雙元載體，以利用反義RNA抑制油菜PEP基因表達(dá)量，從而使 油菜油脂/蛋白質(zhì)含量比率向高油脂變化。2005年，張銀波等利用 RT-PCR技術(shù)克隆到了油菜PEP基因片段，并構(gòu)建了對應(yīng)于PEPCase 基因的RNAi載體，以利用RNAi技術(shù)抑制油菜PEPCase基因的表達(dá)， 使代謝流偏向油脂合成，從而提高油菜籽粒中的油脂含量。2006年，吳關(guān)庭等采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將反義磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase ， PEPCase)基因?qū)刖?稻品種秀水ll，獲得一批轉(zhuǎn)基因植株，T2代測定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因 水稻株系的稻米脂肪含量比對照高出0.37士0.12個百分點，其差異大 部分達(dá)到極顯著水平。在反義PEP基因表達(dá)技術(shù)提出之前，世界上 基因工程提高植物種子含油量主要有兩條技術(shù)途徑， 一是使外源乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase, ACCase)基因在籽粒中 表達(dá)，從而正向提高脂肪酸生物合成限速酶ACCase活性，通過這一 途徑，曾將油菜種子含油量提高了 5% (Roesler K, Shintani D, Savage L Boddupalli S， Ohlrogge J.Targeting of the爿raZ 油戸^ homomeric acetyl-coenzyme a carboxylasetoplastidsofrapeseeds. PlantPhysiol, 1997)。 二是導(dǎo)入酵母溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAAT)基因，提高脂肪酸合成酯類的速度，減輕脂肪 酸合成中的反饋抑制(Zou J， Katavic V， Giblin EM,et al. Modification of seed oil content and acyl composition in the Brassicaceae by expressionofayeastsn-2acyl-transferasegene. PlantCell， 1997)。 目前應(yīng)用 的反義PEP基因表達(dá)技術(shù)是在油脂生物合成的上游對該代謝途徑進 行調(diào)控，即通過反義抑制PEPCase活性，將更多的碳源用于脂肪酸 合成，提高種子含油量?；ㄉ讶屎?0%左右的脂肪和24%~36%的蛋白質(zhì)。研究表明， 花生脂肪含量與蛋白質(zhì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(廖小妹等.珍珠豆型花生 脂肪蛋白質(zhì)含量與農(nóng)藝性狀相關(guān)與通徑分析.萊西:花生科技,1992)。80年代末，日本學(xué)者杉本博士發(fā)現(xiàn)籽粒蛋白質(zhì)含量與丙酮酸羧化酶 (PEPCase )活性密切相關(guān)(陳錦清，黃銳之，郎春秀等.油菜PEP基因 的克隆及PEP反義基因的構(gòu)建.浙江大學(xué)學(xué)報，1999)。本發(fā)明首次從 花生中分離克隆了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(JW^PC)，并研究 了不同脂肪含量的花生品種間該基因的表達(dá)差異，提出利用^/^戶C 的基因工程來提高花生油份含量的方法。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于公開一種花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因 的核苷酸序列。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是調(diào)控花生籽 粒蛋白質(zhì)/油脂含量比例的關(guān)鍵酶，該酶活性的降低可使花生中脂肪 含量增加。本發(fā)明的第二個目的還提供一種花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 編碼的蛋白質(zhì)。同時，本發(fā)明還要提供該磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆方法。本發(fā)明所提供的花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，它來自花生(Jrac/b:y Ay/wgae")，命名為^A/^戶C基因，核苷酸序列如SEQ ID NO: l所示。上述一種花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因編碼的蛋白質(zhì)，它來 自花生(Jrac/^/^/wgfl^)，命名為AhPEPC蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如 SEQIDNO: 2所示。上述花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(J/ii^戶C)的克隆方法，包括如下步驟(1) 選用Ell花生種子置于研缽中，室溫下加入0.5ml植物RNA 提取試劑(可使用天根生化科技(北京)有限公司的RNAplant試劑)， 充分研磨后，轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中，振蕩至徹底混勻，抽提總RNA， 用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA(2) 根據(jù)已經(jīng)擴增的花生JA/^戶C部分序列(1331bp)，設(shè)計引物GSP1:5-GGAGTTCATCAGCACGAACACGAGGC-3 GSP2:5-CAGAGGAGGGACTGTTGGAAGAGGAG-3 以獲得的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成5'-RACE-Ready cDNA 和3'-RACE-Ready cDNA，用高保真Taq酶進行PCR擴增。5'-RACE的PCR程序如下94。C預(yù)變性4min， 94。C變性30s， 65。C復(fù)性30s， 72。C延伸2min， 30個循環(huán)后，72°C 15min;3'-RACE的PCR程序如下94。C預(yù)變性2min， 94。C變性30s，65。C復(fù)性30s， 72。C延伸2min， 27個循環(huán)后，72°C 15min;PCR產(chǎn)物回收后克隆至pMD18-T載體，委托上海英駿公司測序后獲得JA7^戶C的5'端序列和3'端序列。(3)根據(jù)已經(jīng)獲得的^Ai^戶C基因的5，端序列和3，端序列，設(shè)計兩端引物fPEPC5: 5'-AGTTTTTTGTGAGGAAGGAC-3'fPEPC3: 5'畫CAGCAGACATCATAGAATAG畫3'以步驟(2)獲得的5'-RACE-Ready cDNA為模板，用高保真Taq 酶進行PCR擴增，PCR程序如下94"預(yù)變性4min， 94'C變性45s， 57。C復(fù)性50s， 72。C延伸3min20s， 30個循環(huán)后，72°C 15min，最終 將PCR產(chǎn)物進行克隆、測序獲得了花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基 因的全長cDNA序列，。本發(fā)明公開了一種花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(J/^￡P(guān)C)的核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)。磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶是調(diào)控花生籽粒蛋白質(zhì)/油脂含量比例的關(guān)鍵酶，該酶活性的降 低可能使花生中脂肪含量增加?；ㄉ姿嵯┐际奖狒然富駽4/^五尸C基因)，來自花生"rac/^ ; ogaea)，該基因沉默，可 提高花生脂肪酸含量，以進行花生品質(zhì)改良。本發(fā)明提供的J/^五尸C 基因來自花生，在不同脂肪含量的花生品種中，在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)差 異明顯，具有適合于花生等雙子葉植物表達(dá)的優(yōu)化密碼子，其基因工 程受體植物除了單子葉植物，如水稻、玉米、小麥等之外更加適合于 大豆、棉花、煙草等雙子葉植物。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述。 實施例l花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因J/^五戶C的分子克隆選用花生品種Ell的種子(不多于O.l克)于研缽中，室溫下加入0.5ml植物RNA提取試劑(天根生化科技(北京)有限公司的 RNAplant試劑)，充分研磨，轉(zhuǎn)移至1.5mL EP管中，振蕩至徹底混 勻，抽提總RNA，用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光 光度計上測定RNA含量。以獲得的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成 5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA，利用RACE技術(shù)獲 得了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的5'端序列和3'端序列。根據(jù)磷酸 烯醇式丙酮酸羧化酶基因的5'端序列和3'端序列設(shè)計兩端引物 fPEPC5: 5'-AGTTTTTTGTGAGGAAGGAC畫3'fPEPC3: 5'國CAGCAGACATCATAGAATAG-3'采用RT-PCR方法進行cDNA克隆，PCR反應(yīng)程序為94。C預(yù)變性4分鐘，94。C變性45s， 57。C復(fù)性50s， 72。C延伸3min20s， 30個循環(huán)后，72°C 15min，最終將PCR產(chǎn)物進行克隆、測序獲得了花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的全長cDNA序列。 實施例2的序列信息與特性分析 本發(fā)明的^i尸五尸C全長3151bp，其核苷酸序列如SEQIDNO: 1 所示，其第一個開放閱讀框位于25-2931處。DNAssist軟件分析表明 乂/i/^尸C共編碼968個氨基酸,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。 利用MOTIFSCAN軟件分析，其氨基酸序列含有兩個大的PEPC活性位點，分別位于171 182氨基酸位點和594 606氨基酸位點。 實施例3J/i/^PC的表達(dá)研究利用花生v4A戶五PC基因部分序列設(shè)計引物，采用半定量RT-PCR 技術(shù)，分析不同脂肪含量花生品種間的表達(dá)差異。以18SrRNA基因 (A.S.Bhagwat，T.G.Krishna，N.Jawali，R.K.Mitra. Cloning and characterisation of a ribosomal RNA gene repeat unit fromgroundnut,2001)的表達(dá)作為內(nèi)參，結(jié)果表明，j/lP￡P(guān)C基因在轉(zhuǎn)錄水平上在花生脂肪含量不同品種間表達(dá)差異明顯，高油花生品種中該基因表達(dá)水平低。上述實施例表明本發(fā)明中克隆的花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(力A/^戶C)，是首次從雙子葉植物花生(」rac力^Ay/wg^力中分離獲得。mRNA表達(dá)分析表明在檢測的不同脂肪含量花生品種間表達(dá)差異明顯，高油花生品種中該基因表達(dá)水平低，因此可利用基因工程進行花生品質(zhì)改良。 本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1) SEQIDNO. 1的信息(i)序列特征(A) 長度3151bp(B) 類型核苷酸(C) 鏈性單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii) 分子類型核苷酸(iii) 序列描述SEQIDNO. 1(2) SEQ ID NO. 2的信息 (i)序列特征(A) 長度968 a.a(B) 類型氨基酸(C) 鏈性單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)序列描述SEQIDNO. 2序列表 <110>山東省花生研究所<120>花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)以及克隆方法<160>2<210>1 <211>3151 <212>DNA <213>花生<400>1agttttttgtgctactagtaggaacattgag3卿tggct60tcaattg3tgctcagctg兆gttgctggcsccaaggaaggtttctgatgatgac犯gctt120gttgagtatgatgctttgttgcttgatcgattccttgacattcttcaggatttgcatggt180ggC3認(rèn)ggttcasgattgttatgagctttcagctga<gta_tg卿gg犯g240卿6Lgttgg3ggaacttgggaatatgctaactggtcttgatgctggggat300tctattgtcattgccaaatcattttcccacatgcttaatttggctaactt360cctaccg肌gctattaaagaagggcgattttgctgat鵬420aaccctgccatcactgaatctgacattg犯gaaaccttca卿ggcttgtgactg犯ctg480gtttgatgccttgaagaacc肌ax;tgt3g3tttggtccta540actgctcatcccactcagtcC3ttCgtCg3tctctgctgc,ggt33gg600肌ctgtctgacacagttgtatgcaaaagacataacaccggatgataagcaggaacttgat660gaggctctcctcaagctgcatttcgcacagatgaaattcgaagg￡Lgtcct720ccgax:acc3caaga_tga_g￡Ltg郷gC兆g8Latgetgctactttcatg兆ac780ggtgtaccaaagtttttgcgccgtgttgacacagctctgaagaacatcgg840cgtgtcccatacaatgcccctcttattcaattctcttcttggatggg鄉(xiāng)agatcgtgat900ggtaaccctagggt肌cccctg犯gttaca鄉(xiāng)gatgtgtgtttgctggctag犯tgatg960gctgctaatttatacttctctcagatagaagatctcatgtttgagctgtctatgtggcgc1020tgc肌tgatgagcttcgtgttcgtgctgatgaactccatgtgtcctcaaggag卿tgca1080aaacattacattgaattttgg￡L￡Lgca<gattcctccaaatgagccatatcgtgttattctt1140ggtgal:gtgagggaca犯ctcgcg犯cgtgctcgccagttattagcc犯t1200ggaacctctgacatccccgaagagacaaxxttcacaaatgttgagcagttcctggagccc1260ctcgaactctgctatagatcactctgcgcatgtggtg織卿tggtagc1320cttcttgatttCttgCggC3tttggactctcaatggt犯gactcgacatt1380cgtcaagagtcagaccggcaCELCtgatgtCatggatgccatteLCc犯eLcacttggagatt1440ggatcataccg卿gtggtctgagg肌cgcggcttctgtcagagctcagt1500ggaaagcgccctctgttcggccctgatcttcccaac3gaagagstcgccgatgttctg1560gaaaccttccatgtcattgcagaacttccctcagacaactttggtgcctet1620atggc^C3gcaccgtctgatgtgcttgctgttg3gctcttaccgggaatgccatgtg1680aagcaaccgctggttgtgccattgtttga^3gcttgctgatcttgagtctgctcct1740gctgcagtggcgcggcttttctctattgattggtac8gaaaccgELatceieLtgggaggCELEL1800gaagttstgataggatactcagactcaggaa_a^g3tgccggtcgtctttctgcggcttgg1860gcgctgtaca3ggCtCg3ggagctcata肌ggttgcgaaggatttcggtgttaagctg1920acaatgttccatggcgggactgttggaagaggaggcggccccactcaccttgct1980atattatctcagccaccagaaaccattcatggctcacttcgggtgacagttcaaggtga_a2040gttattgcaatcctttggttgtgctttsgaactctccagcgattcact2100gctgctacacttcacggaatgcaccctcccgtgtcaccca犯ccggaatggcgagtg2160ctgctagatgtggctgtcattgcaacgagiggagtatcgctccattgttttccaggaa2220ccccgttttgttgaatacttccgatgtgctacccctgagttggagtatggacg犯tg^c2280attggaagtcgtccatcaaag卿肌gccgtcgaatcactgcgtgctatt2340ccatggatttttgcttggaca^ca^c犯ggtttcatttgccagtgtggcttggctttggt2400tctgcatttaagcatgcaattg卿卿3tccaaagaatctcctaatgcttcaggatatg2460tacaaccagtggcctttcttcagggtcaccctgga_cttgatcgagatggtgttcgccaag2520gg卿cccggggatcgcttccctgtacgacaaactcctaggctgttgcca2580ttcgg卿gcgcttgaggacgaaacc朋g3gttttctccttaaggttgct2640gggC3C娜gatcttcttgaaggtgacccctacttgaagcaaaggcttcgtctccgcgat2700caaccctgaatgtgtt3C犯gcctacacgtccgcgacccc2760gactaccatgtcaagttgaggccax:atttgtcaaaggaattcatggaatcaaacaagcca2820gctgcag過3cttgtt朋3Ctcaacccaaaaagtgagtatgctcctggtttggaggacaca2880cttatcttgac犯tg犯gggtattgctgctggc3tgcaB8acacaggtta2940aaaaattggcattttttUttggttatgtcagtgg自tgtaa^cattgtataacctatt3000ctatgatgtctgctggatatttagatcagctgtgtcgctaatactattgt3060ataagactttgatcctttatgatggcatatttggttaaaa3120tgcgttg3tac3151<210〉2 <211〉968 <212〉PRT <213〉<400〉2Met Ala Ala Thr Ser Arg Asn lie Glu Lys Met Ala Ser lie Asp Ala 15 10 15Gin Leu Arg Leu Leu Ala Pro Arg Lys Val Ser Asp Asp Asp Lys Leu 20 25 30Val Glu Tyr Asp Ala Leu Leu Leu Asp Arg Phe Leu Asp lie Leu Gin 35 40 45His Gly Glu Asp lie Arg Gin Thr Val Gin Asp Cys Tyr Glu60Lys His Lys Thr Glu Lys LeuAsp Leu His Gly Glu Asp lie50 55 Leu Ser Ala Giu Tyr Glu Gly 65Levi Gly Asn MetGlu 70Thr Gly Leu AspLeu 85Ser His Met LeuThr75Gly Asp Ser lieAla Lys Ser Phe 100Val Gin lie Ala Tyr Arg Arg Arg 115 120 Phe Ala Asp Glu Asn Pro Ala lieAs ii 105 lieAla 90Leu Ala Asn LeuGlu Glu 80Val lie 95Glu GluAla 130Lys Arg Leu ValPhe 145Asp Ala Leu LysAla 135 GluLys Leu Leu GluAla 110Lys Gly AspThr Glu Ser125lie Glu Glu ThrThr 150Gin Thr ValLeu Lys LysAsn 165Arg Arg Ser LeuLys AspAsp 140Pro Gin GluSer 155Val Uu Thr AlaThr Gin Ser lie 180Thr Gin Leu TyrLeu 170Gin Lys His GlyAsn Cys Leu 195Gin Glu Leu Asp Glu AlaLeu 185Lys Asp lie ThrGlu 210Asp Glu lie ArgAla 200Gin Arg Glu lieThr 225Ala Gly Met SerLeu 215Ser Pro Pro ThrArg 230Phe His Glu ThrTyr 245Val Asp Thr AlaPhe Leu Arg Arg 260Tyr Asn Ala Prolie 250 LysPro 235 TrpGin 220 GinPro 205 AlaAsp GlyAsn lie GlyArg 190 AspAlaGluLys Gly ValArg GlyValPro 275Arg Asp Gly Asnleu 265lie Gin Phe SerAsp 290Cys Leu Leu AlaLeu 280Arg Val Thr ProVal 305lie Glu Asp LeuProMet Met Ala AlaArg 310Phe Glu Leu SerMet 325Ala Asp Glu LeuAsn 315 TrpGlu 300 LeuSer 285 Vallie 270 TrpThrPheVal Phe 160 His Pro 175Val ArgAsp LysPhe ArgMet Arg 240 Pro Lys 255Asn Glu Met Gly Arg AspLeu Arg Val Arg 340lie Glu Phe TrpArgHisVal 370Tyr 355lie Leu Gly AspHis 345 GinMet 330Val Ser SerTyr Phe Ser Gin 320Arg Cys Asn Asp Glu 335Arg Arg Asp AlaVal 375Lys 360Arg Asp Lys Leulie Pro Pro Asn 365 AsnTyr 380Arg 350 GluThrPro Tyr Arg GluArg Ala Arg Gin Leu Leu Ala Asn Gly Thr Ser Asp lie Pro Glu 385 390 395Thr Thr Phe Thr Asn Val Glu Gin Phe Leu Glu Pro Leu GluAsn 405Cys Als Cys GlyTyr Arg Ser Leu 420Leu Leu Asp Phe Leu Arg Gin Val 435 440 Asp lie Arg Gin Glu SerLeu 410Arg Pro lieAsp 425Ser Thr Phe GlyLeu 415GlyGlu 400 CysSerArg Leu Asp lie Arg Gin Glu 450 455 Ala lie Thr Lys His Leu Glu 465Glu Arg Arg Ginlie Gly SerArg Phe GlyLeu 470Trp Leu Leu SerAsp Arg His GlyGlu 485Asp Leu Pro LysTyr 475 LeuThr 柳 ArgSerAla Asp 430Leu Ser Met Val 445Asp Val Met AspPro 500His Val lie AlaGlu Thr Phe 515lie Ser Met AlaThr 505 LeuGlu 490Glu Glu lieGlu Trp Gly LysSerArg 艦 ValGlu 480 ProLeuTyr lie 530Leu Leu Gin Arg Glu 545Leu PheGlu 520Ala Pro Ser AspGinArgArg Leu Phe Ser 580 lieLeu 565 lieCys 550 AlaAspTyrThr535His Val Lys GinAlei Asp 510Pro Ser Asp Asn Phe Gly Ala 525Leu Ala Val GluVal 540Leu Arg Val ValAsp Leu Glu TrpTyrGly Tyr SerGlu Val Met 595Ala Trp Ala Leu585 SerSer 570 AsnPro 555Ala Pro Ala AlaArg lie Asn Gly 590Gly Lys Asp Ala Gly 605Leu lielieSer Ma 610 Ala Lys 625Thr ValAsp 600Lys Ala Gin GluAsp GlyPhe Gly Val 630 Gly"Tyr 615Lys Leu Thr MetVal 575 ArgGlu 620 HisArg 匕ysGly Arg GlyPro Pro Glu Thr 660 GinGly 645 lieVal lie Glu 675Phe Thr Ala AlaGly Pro Thr GlySer Phe GlyPhe 635Leu Ala lie LeuHis Gly SerLeu 665His 650Arg Val ThrSer 655 GlyPro 560 AlaGinLeuValGly 640 GinGluGin Arg 690 Ser Pro 705Ala ThrGlu 680Leu Glu His GlyLys Pro GluLys Glu Tyr 725Thr 695Arg Val Leu LeuVal Gin 670His Leu Cys Phe Arg Thr I_eu 685His Pro Pro ValTrp 710Arg Ser lie ValMet 700Glu Met Ala ValPhe 73(3Asp 715Gin Glu Pro ArgPhe 735lie 720 ValGlu Tyr Phe Arg Cys Ala Thr Pro Glu Leu Glu 丁yr lie GlyLeuArg 770 ProSer 755 AlaArg 740Arg Pro Ser LysGlu 745Lys Pro SerArg 760Phe Ala Trp Thr丁y]GlyLeu 785Lys Asp Prolie Pro Trp lie Phe Ala Trp Thr Gin 775 780 Phe Gly Ser Ala Phe Lys His AlaGly Arg Met Asn 750Gly lie Glu Ser 765Thr Arg Phe HisVal Trp LeuTrpGly 790Leu Leu Met LeuAsn 805Val 丁hr Leu AspPhe 795Asp Met Tyr AsnPro Phe Phe Arg 820Gly Asp Pro Gly lie Ala Ser Leu 835 840 Glu Leu Leu Pro Phe Gly Glu ArgGin 810lie Glu MetLeu 850Ser Phe Leu Leu865Asp Pro Tyr LeuGlu 855 ValLeu 825 Tyrlie Glu 800 Gin Trp 815Ala LysVal Phe 830Asp Lys Leu Leu Val Ser Glu 845Leu Arg Thr Lys Tyr Glu Glu ThrLys 870Gin Arg LeuAla Gly His885Leu Gin Ala TyrThr Leu Asn Vai 900Val Lys Leu ArgAsp Tyr His 915Ser Asn Lys Pro Ala AlaGlyArgThr 905 HisLeu 890 LeuArg 875 ArgLys 860Asp !>eu LeuAsp ArgLeu Ser LysAsn 930Ala Pro Gly LeuPro 920Leu Val Lys LeuTyr 945Ala Ala Gly Met935Asp Thr Leu lieGin 965Glu 950Asn Thr GlyLeu 955Glu Gly 880Ser Tyr lie 丁hr 895lie Arg Asp Pro 910Glu Phe Met Glu 925Pro Lys Ser GluAsn 940Thr Met LysGly lie 960
權(quán)利要求
1.一種花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其核苷酸序列如SEQID NO1所示。
2. —種花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨 基酸序列如SEQIDNO: 2所示。
3. —種花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆方法，包括如 下步驟(1 )選用Ell花生種子置于研缽中，室溫下加入0.5ml植物RNA 提取試劑，充分研磨后，轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中，振蕩至徹底混勻， 抽提總RNA，用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度 計上測定RNA含量；(2) 根據(jù)已經(jīng)擴增的花生J/^五PC部分序列，設(shè)計引物 GSP1:5-GGAGTTCATCAGCACGAACACGAGGC-3 GSP2:5-CAGAGGAGGGACTGTTGGAAGAGGAG-3以獲得的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成5'-RACE-Ready cDNA 和3'-RACE-Ready cDNA，用高保真Taq酶進行PCR擴增；5'-RACE的PCR程序如下94'C預(yù)變性4min， 94"C變性30s， 65。C復(fù)性30s， 72。C延伸2min， 30個循環(huán)后，72°C 15min;3'-RACE的PCR程序如下94'C預(yù)變性2min， 94。C變性30s， 65。C復(fù)性30s， 72。C延伸2min， 27個循環(huán)后，72°C 15min;PCR產(chǎn)物回收后克隆至pMD18-T載體，測序后獲得J/^五PC的5'端序列和3'端序列；(3) 根據(jù)已經(jīng)獲得的J^P五戶C基因的5'端序列和3'端序列，設(shè) 計兩端引物fPEPC5: 5'-AGTTTTTTGTGAGGAAGGAC-3' fPEPC3: 5'-CAGCAGACATCATAGAATAG畫3'以步驟(2)獲得的5'-RACE-Ready cDNA為模板，用高保真Taq 酶進行PCR擴增，PCR程序如下..94。C預(yù)變性4分鐘，94t:變性45s， 57。C復(fù)性50s， 72。C延伸3min20s， 30個循環(huán)后，72°C 15min，最終 將PCR產(chǎn)物進行克隆、測序獲得了花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基 因的全長cDNA序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了調(diào)控花生籽粒蛋白質(zhì)/油脂含量比例的一個關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列及所編碼的蛋白質(zhì)序列。本發(fā)明還提供了該花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆方法。本發(fā)明基因AhPEPC的mRNA表達(dá)分析表明該基因在脂肪含量不同的花生品種間表達(dá)差異明顯。
文檔編號C12N9/00GK101230353SQ20081000279
公開日2008年7月30日 申請日期2008年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日
發(fā)明者曹玉良, 楊慶利, 燕 江, 潘麗娟, 禹山林, 平 閔 申請人:山東省花生研究所