專利名稱：：地衣芽孢桿菌中的氯霉素抗性選擇的制作方法地衣芽孢桿菌中的氯霉素抗性選褲，序列表本發(fā)明包含序列表。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及修飾的地衣芽孢桿菌(Sac///^//c/2em/om^)宿主細(xì)胞，其中已將天然存在的染色體氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因CW失活。染色體CW基因的失活允許將氯霉素作為有效的選擇劑用于將DNA引入所述修飾的細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
：在多肽的工業(yè)生產(chǎn)中，感興趣的是實(shí)現(xiàn)盡可能高的產(chǎn)物收率(productyield)。增加產(chǎn)量(yield)的一種方式是增加編碼感興趣多肽的基因的拷貝數(shù)。這能通過將基因置于高拷貝數(shù)質(zhì)粒上來完成，但是質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，并且如果在宿主細(xì)胞的培養(yǎng)過程中沒有選4奪壓力，則質(zhì)粒常常從宿主細(xì)胞丟失。增加感興趣基因的拷貝數(shù)的另一種方式是將該基因以多個拷貝整合入宿主細(xì)胞染色體中。來自質(zhì)#立pC194的caf基因(chloramphenicolacetyltransferase;氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)在芽孢桿菌屬轉(zhuǎn)化中常規(guī)地用作選擇標(biāo)記。然而，地衣芽孢桿菌展現(xiàn)的氯霉素抗性程度阻礙了將氯霉素抗性基因用于選擇轉(zhuǎn)化體，無論是通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、接合(conjugation)或電穿孔。基因組測序揭示了幾種不同的地衣芽孢桿菌菌抹在染色體中含有與已知氯霉素抗性基因具有一些同源性的序列。所述同源序列位于EMBL地衣芽孢桿菌ATCC14580序列條目，登錄號cp000002的位置2720850-2721500。發(fā)明概述在EMBL地衣芽孢桿菌ATCC14580條目，登錄號cp000002中鑒定了推定的cW基因連同側(cè)翼DNA。示意圖示于圖1。我們想要研究的是，從地衣芽孢桿菌的染色體缺失這種推定的ca/基因是否將會使氯霉素能夠用于將DNA引入這樣的CW缺失型菌林的選擇。在來自多種來源的許多不同的地衣芽孢桿菌菌林中鑒定了CW基因的同源物，將那些菌抹的染色體中的這些同源物失活以提供修飾的C^敏感型菌抹。本發(fā)明涉及將包含氯霉素抗性標(biāo)記的遺傳材料引入修飾的地衣芽孢桿菌宿主細(xì)胞的方法，在所述宿主細(xì)胞中已將天然存在的染色體氯霉素抗性基因cW失活。此基因以其活性形式的存在以其它方式(otherwise)阻礙氯霉素用于選擇的目的。在工業(yè)生產(chǎn)宿主細(xì)胞中具有天然抗生素抗性編碼基因也可能在某些應(yīng)用，例如，用于調(diào)節(jié)目的的應(yīng)用中引起擔(dān)憂(concern)。因此，在第一方面，本發(fā)明涉及用于將重組DNA構(gòu)建體引入修飾的地衣芽孢桿菌宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括a)提供修飾的地衣芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其中已將一個或多個內(nèi)源基因組氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因失活；b)將重組DNA構(gòu)建體引入所述修飾的宿主細(xì)胞，所述構(gòu)建體包含編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的選#^示記；c)在包含抑制濃度的氯霉素的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(b)的宿主細(xì)胞；和d)選擇能夠在步驟(c)的培養(yǎng)基中生長的包含所述DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。在第二方面，本發(fā)明涉及修飾的地衣芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其中已將一個或多個基因組氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因失活，所述宿主細(xì)胞包含攜帶編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的選擇標(biāo)記的重組DNA構(gòu)建體。附圖筒述圖1顯示來自地衣芽孢桿菌ATCC14580的ca/基因區(qū)的示意圖，指明了本文使用的引物。圖2顯示來自地衣芽孢桿菌PL1980的c^基因區(qū)的示意圖，指明了本文使用的引物。定義根據(jù)本發(fā)明，可以采用本領(lǐng)域的技術(shù)之內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整說明。參見，例如，Sambrook,Fritsch&Maniatis，MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition(分5子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第二版)(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork(本文的"Sambrook等，1989，，);DNACloning:APracticalApproach,VolumesIandII(DNA克隆實(shí)用方法，巻I和II)(D.N.Glover編著1985);OligonucleotideSynthesis(寡核普酸合成)(M丄Gait編著，1984);NucleicAcidHybridization(核酸雜交)(B.D.Hames和S丄Higgins編著(1985));TranscriptionAndTranslation(4爭錄禾口翁3譯)(B.D.Hames禾口S丄Higgins編著(1984));AnimalCellCulture(動物細(xì)胞培養(yǎng))(r.lFreshney編著(1986));ImmobilizedCellsAndEnzymes(固定化細(xì)胞和酶)(irlPress,(1986));B.Perbal，APracticalGuideToMolecularCloning(分子克隆實(shí)用指南)(1984)。"多核苷酸"是脫氧核糖核苷酸或核糖核苦酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物，多核苷酸的序列是從聚合物5，到3，端讀取的堿基的實(shí)際順序。多核苦酸包括RNA和DNA,并且可以從天然來源分離、體外合成、或從天然和合成分子的組合制備。"核酸分子"或"核苷酸序列"指單鏈形式或雙鏈螺旋的核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；"rna分子")或脫氧核糖核苷(脫氧腺香、脫氧鳥苷、脫氧胸苷或脫氧胞苷；"DNA分子")的磷酸酯聚合形式。雙鏈的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。術(shù)語核酸分子，特別是DNA或RNA分子，僅指分子的初級和二級結(jié)構(gòu)，并且不將其限于特定的三級或四級形式。因此，該術(shù)語包括尤其是以線性或環(huán)狀DNA分子(例如，限制片段)、質(zhì)粒和染色體等(interalia)存在的雙鏈DNA。在討論具體雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時，在本文中可以根據(jù)常規(guī)描述序列，即僅給出沿著DNA的非轉(zhuǎn)錄鏈的5，至3'方向的序列(即，具有與mRNA同源的序列的鏈)。"重組DNA分子"是經(jīng)過分子生物學(xué)操作的DNA分子。DNA"編碼序列"或"開讀框(ORF)"是雙鏈DNA序列，當(dāng)置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列控制下時，其在體內(nèi)或體外于細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽。ORF"編碼"多肽。編碼序列的邊界由5'(氨基)末端的起始密碼子和3'(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可包括，但不限于原核序列，來自真核mRNA的cDNA，來自真核動物(例如，哺乳動物)DNA的基因組DNA序列，和甚至合成的DNA序列。如果意欲在真核細(xì)胞中表達(dá)編碼序列，通常將聚腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列置于編碼序列的3，。表達(dá)載體是線性或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼感興趣的多肽的區(qū)段，該區(qū)段與提供用于其轉(zhuǎn)錄的其它區(qū)段可操作地連接。這些其它區(qū)段可以包括啟動子和終止子序列，以及任選的一個或多個復(fù)制起點(diǎn)、一個或多個選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號等。表達(dá)載體通常源自質(zhì)?；虿《綝NA,或者可以含有這二者的元件。轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列是DNA調(diào)節(jié)序列，如啟動子、增強(qiáng)子、終止子等，其提供編碼序列在宿主細(xì)胞中(例如在真核細(xì)胞中)的表達(dá)，聚腺苷酸化信號是調(diào)控序列。"分泌信號序列"是編碼多肽("分泌肽")的DNA序列，所述多肽(作為較大多肽的組分)指導(dǎo)較大多肽通過細(xì)胞分泌途徑，所述較大多肽在所述細(xì)胞中合成。在通過分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)(tmnsit)的過程中通常對較大多肽進(jìn)行切割以去除分泌肽。術(shù)語"啟動子"在本文中用作其本領(lǐng)域公認(rèn)的意思，表示含有提供用于結(jié)合RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)(initiationoftranscription)的DNA序列的基因的部分。啟動子序列通常，但并非總是，存在于基因的5'非編碼區(qū)。如果一個基因編碼的多肽不再能以有功能的形式表達(dá)，則使該染色體基因成為"非功能性"的。這種基因的非功能性能夠由本領(lǐng)域中已知的多種遺傳操作或改變來誘導(dǎo)，其中的一些在Sambrook等(見上文)中描述。基因ORF中的部分缺失將通常使該基因成為非功能性的，正如突變例如取代、插入、移碼等一樣。"可操作地連接"，當(dāng)涉及DNA區(qū)段時，意思是安排區(qū)段而使它們協(xié)調(diào)地(inconcert)發(fā)揮功能，例如轉(zhuǎn)錄過程通過如下發(fā)生RNA聚合酶與啟動子區(qū)段結(jié)合，并且在編碼區(qū)段中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，直至聚合酶在遭遇轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)段時停止。宿主細(xì)胞中的"異源"DNA在本上下文中指并非來源于所述細(xì)胞的外源DNA。如用于本文，術(shù)語"核酸構(gòu)建體，，或"DNA構(gòu)建體"意指cDNA、基因組DNA、合成DNA或RNA來源的任何核酸分子。術(shù)語"構(gòu)建體"意指這樣的核酸區(qū)段，其可以是單鏈或雙鏈的，并且可以是基于編碼感興趣多肽的天然存在的核苷酸序列的整體或部分。構(gòu)建體可以任選地包含其它核酸區(qū)段。編碼本發(fā)明多肽的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以合適地為基因組或cDNA來源的，例如通過制備基因組或cDNA文庫并且通過雜交篩選編碼全部或部分所述多肽的DNA序列來獲得，所述雜交依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使用合成寡核苷酸探針進(jìn)行(參照Sambrook等，同上)。本發(fā)明編碼多肽的核酸構(gòu)建體也可以通過已經(jīng)確立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備，例如由Beaucage和Caruthers,TetrahedronLetters22(1981)，1859-1869描述的亞磷酰胺方法(phosphoamiditemethod),或由Matthes等，EMBOJournal3(1984),801-805描述的方法。纟艮據(jù)亞磷酰胺方法，將寡核苦酸例如在自動DNA合成儀中合成，純化，退火，連接，以及克隆到合適的載體中。此外，核酸構(gòu)建體可以是按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(適當(dāng)?shù)?連接合成來源、基因組來源或cDNA來源的片段而制備的合成與基因組混合來源的、合成與cDNA混合來源的、或基因組和cDNA混合來源的，所述片段對應(yīng)于完整核酸構(gòu)建體的多個部分。核酸構(gòu)建體也可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用特異性引物制備，例如US4，683,202或Saiki等，Science239(1988),487-491中所述。當(dāng)核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所必需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體可與術(shù)i吾"表達(dá)盒(expressioncassette)"同義。術(shù)語"調(diào)控序列，，在本文定義為包括對核酸序列的編碼序列表達(dá)是必需的或有利的所有成分。每種調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核酸序列而言可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列(propeptidesequence),啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少，調(diào)控序列包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。提供的調(diào)控序列可以具有用于引入特異性限制位點(diǎn)的接頭，所述特異性限制位點(diǎn)^^進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核S吏序列編碼區(qū)的連接。調(diào)控序列可以是適當(dāng)?shù)膯幼有蛄?，即由宿主?xì)胞識別的用于表達(dá)核酸序列的核酸序列。啟動子序列包含介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列。啟與所述宿主細(xì)胞同源或異源的編碼胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，即由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核酸序列的3'末端可操作地連接。在本發(fā)明中可以使用在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，即與核酸序列的3，末端可操作地連接并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時由宿主細(xì)胞識別為向轉(zhuǎn)錄的mRNA添加聚腺苦殘基的信號的序列。在本發(fā)明中可以使用在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。調(diào)控序列也可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端連接的氨基酸序列，該氨基酸序列能夠指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞分泌途徑。核酸序列的編碼序列的5'端可以天然地(inherently)含有信號肽編碼區(qū)，其與編碼序列的5'端可以含有信號肽編碼區(qū)，其對于編碼分泌性多肽的編碼序列部分是外源的。在編碼序列未正常含有信號肽編碼區(qū)的情況下，外源信號肽編碼區(qū)可能是需要的。或者，外源信號肽編碼區(qū)可以簡單地替代天然信號肽編碼區(qū)，從而獲得相對于與編碼序列通常相連的天然信號肽編碼區(qū)而言增強(qiáng)的多肽分泌。信號肽編碼區(qū)可以獲得自來自曲霉屬菌種(Aspergillusspecies)的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因，來自根毛霉屬菌種(Rhizomucorspecies)的脂肪酶或蛋白酶基因，來自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的a-因子的基因，來自芽孢桿菌屬菌種(Bacillusspecies)的淀粉酶或蛋白酶基因，或小牛前凝乳酶原(calfpreprochymosin)基因。然而，能夠指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)均可以在本發(fā)明中使用。調(diào)控序列還可以是前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的，并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化成成熟的活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)堿性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因(叩rT)、酉良酒酵母a因子基因、或嗜熱毀絲霉(Myceli叩hthoratherm叩hilum)漆酶基因(WO95/33836)獲得前肽編碼區(qū)。也可為理想的是添加允許相對于宿主細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是導(dǎo)致基因表達(dá)響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)性化合物的存在，而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在曱氨蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和隨重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，可將編碼多肽的核酸序列與調(diào)節(jié)序列串接(intandem)放置。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌lac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)a-淀粉酶基因(amyQ)、解淀粉芽孢桿菌BANAMYLASEGENE(BAN淀粉酶基因)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xy舊基因和原核P-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)，以及tac啟動子(DeBoer等，1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另外的啟動子在ScientificAmerican,1980，242:74-94的"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"沐自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì))中；和在Sambrook等，1989,同上文中描述。本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的核酸序列、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻"^終止信號。上文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包含一個或多個方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的核酸序列?；蛘?，可以通過在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入所述核酸序列或包含所述序列的核酸構(gòu)建體來表達(dá)本發(fā)明的核酸序列。在制備表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，以使該編碼序列與適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)(和可能用于分泌)的調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠引起核酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實(shí)體(entity)存在，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘?，載體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。載體系統(tǒng)可以是單一的載體或質(zhì)粒，或共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的總DNA(totalDNA)的兩個或更多個載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有一個或多個"選擇性標(biāo)記"，其允許容易地選4奪被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供對于殺生物劑、抗生素或病毒的抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。10條件性必需基因(conditionallyessentialgene)可以作為"非抗生素選擇性標(biāo)記"發(fā)揮作用。細(xì)菌條件性必需選擇性標(biāo)記的非限制性例子是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，這些基因僅當(dāng)在缺乏D-丙氨酸條件下培養(yǎng)細(xì)菌時是必需的。當(dāng)將細(xì)胞在存在半乳糖的條件下培養(yǎng)或在導(dǎo)致半乳糖存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，編碼UDP-半乳糖周轉(zhuǎn)(tumover)中涉及的酶的基因同樣能夠在細(xì)胞中發(fā)揮條件性必需標(biāo)記的功能。這些基因的非限定性實(shí)例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌編碼UTP依賴性磷酸化酶(EC2.7.7.10)、UDP-葡萄糖依賴性尿苦?；D(zhuǎn)移酶(UDP-glucose-dependenturidylyltransferase)(EC2.7.7.12)或UDP-半乳糖差向異構(gòu)酶(EC5丄3.2)的那些基因。在以木糖為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中，芽孢桿菌(Bacilli)的木糖異構(gòu)酶基因如xylA同樣能夠用作選擇性標(biāo)記。在以葡糖酸為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中，利用葡糖酸所必需的基因gntK和gntP也能夠用作選擇性標(biāo)記。條件性必需基因的其它非限制性實(shí)例在下文提供?？股剡x擇性標(biāo)記賦予對抗生素如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、新霉素、潮霉素或曱氨喋呤的抗生素抗性。此外，選4奪可以通過共轉(zhuǎn)化完成，例如，如WO91/17243中所述，其中選擇標(biāo)記在單獨(dú)的載體上。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有允許載體(或載體的較小部分)穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞基因組或允許載體在細(xì)胞中獨(dú)立于細(xì)胞基因組自主復(fù)制的元件。當(dāng)引入宿主細(xì)胞中時，可將載體或載體的較小部分整合入宿主細(xì)胞基因組中。對于染色體整合，載體可以依賴于編碼多肽的核酸序列或用于將載體通過同源或非同源重組穩(wěn)定整合入基因組中的任何其它載體元件?；蛘撸d體可以含有額外的核酸序列，該核酸序列用于指導(dǎo)通過同源重組來整合入宿主細(xì)胞的基因組中。額外的核酸序列使得載體能夠在染色體中的精確位置整合入宿主細(xì)胞基因組。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的與對應(yīng)的靶序列具有高同源性的核酸，如100至1,500個堿基對，優(yōu)選400至1,500個》威基對，并且最優(yōu)選800至1,500個堿基對，以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源。此外，整合元件可為非編碼或編碼核酸序列。載體、表達(dá)盒、擴(kuò)增單元、基因或?qū)嶋H上任何確定的核苷酸序列的拷貝數(shù)是在任何時間存在于宿主細(xì)胞中的相同拷貝的數(shù)目?；蚧蛄硪环N確定的染色體核苷酸序列可以以一個、兩個或更多個拷貝存在于染色體上。自主復(fù)制的載體可以以每個宿主細(xì)胞一個或幾百個拷貝存在。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060和pAM卩l(xiāng)的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是一種具有突變的復(fù)制起點(diǎn)，所述突變使其在宿主細(xì)胞中發(fā)揮溫度敏感性(參見，例如，Ehrlich,1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1433)。本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的核酸序列，將其有利地用于多肽的重組生產(chǎn)中。術(shù)語"宿主細(xì)胞"包含親本細(xì)胞的任何子代，它們由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞。優(yōu)選將細(xì)胞用包含本發(fā)明的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化，其后載體整合至宿主染色體中。"轉(zhuǎn)化"的意思是向宿主細(xì)胞中引入包含本發(fā)明的核酸序列的載體，從而將載體作為染色體整合體或作為自復(fù)制染色體外載體保留。通常認(rèn)為整合是有利的，因?yàn)楹怂嵝蛄懈锌赡芊€(wěn)定地保留在細(xì)胞中。將載體整合入宿主染色體可以通過同源或非同源重組發(fā)生，如上所述。細(xì)菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以，例如，通過如下進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen,1979,MolecularGeneralGenetics168:111-115)、使用感受態(tài)細(xì)月包(參見，例如，Young和Spizizin,1961，JournalofBacteriology81:823-829，或Dubnar和Davidoff-Abelson,1971,JournalofMolecularBiology56:209-221)、電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-75l)或接合(參見，例如，Koehler和Thome,1987,JournalofBacteriology169:5771-5278)。將上述轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞在允許表達(dá)期望的多肽的條件下在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其后從細(xì)胞或培養(yǎng)液中回收所得多肽。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適合于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基，如含有適當(dāng)補(bǔ)充物的基本或復(fù)合培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得，或者可根據(jù)公開的配方(例如在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)的目錄中)制備。培養(yǎng)基使用本領(lǐng)域已知的方法制^(參見，例如有關(guān)纟田菌禾口酵母的參考文件(referencesforbacteriaandyeast);Bennett,J.W.和LaSure，L.,editors,MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA,1991)。如果多肽分泌至營養(yǎng)培養(yǎng)基中，則可以從所述培養(yǎng)基中直接回收該多肽。如果多肽未分泌，則將其從細(xì)胞裂解物回收。通過常規(guī)方法從培養(yǎng)基回收多肽，所述常規(guī)方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基分離宿主細(xì)胞，通過鹽(例如硫酸銨)的方法沉淀上清或?yàn)V出液中的蛋白成分，依賴于所述多肽的類型通過多種層析方法(例如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等)純化?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對于多肽有特異性的方法檢測多肽。這些檢測方法可以包括特異性抗體的^_用，酶產(chǎn)物的形成，或酶底物的消失。例如，酶觀'J定法可以用于測定多肽的活性?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的多種方法來純化本發(fā)明的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)，電泳方法(例如，制備型等電聚焦(正F))，差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)，或提取(參見，1"列長口，ProteinPurification,J.-C.Janson禾口LarsRyden纟扁,VCHPublishers,NewYork,1989)。發(fā)明詳述如上所述，在第一方面本發(fā)明涉及用于向修飾的地衣芽孢桿菌宿主細(xì)胞引入重組DNA構(gòu)建體的方法，所述方法包括a)提供修飾的地衣芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其中已將一個或多個外源基因組氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因失活；b)向所述修飾的宿主細(xì)胞中引入重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的選擇標(biāo)記；c)在包含抑制濃度的氯霉素的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(b)的宿主細(xì)胞；和d)選擇能夠在步驟(c)的培養(yǎng)基中生長的包含所述DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面涉及修飾的地衣芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其中已將一個或多個基因組氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因失活，所述宿主細(xì)胞包含重組DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體攜帶編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的選擇標(biāo)記。應(yīng)該理解的是下文列出的優(yōu)選實(shí)施方案絕非窮舉，它們可以以多種方式組合，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員會立即認(rèn)識到的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將充分意識到將這些優(yōu)選實(shí)施方案與其它技術(shù)特征組合的可能性，這些其它技術(shù)特征是向芽孢桿菌屬細(xì)胞中引入遺傳材料的領(lǐng)域中熟知的，而未在本文明確列出，如在多篇專利公開中描述的，例如，WO2002/000卯7、WO2001/090393、WO1993/010249、WO1999/043835、WO1994/019471、WO2003/055996、WO1991/009129、WO1994/014968和/或WO1996/023073，將其全部通過題述并入本文。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，重組DNA構(gòu)建體是質(zhì)?；蚓€性化的質(zhì)粒，優(yōu)選是線性化和多聯(lián)體化(concatamerized)質(zhì)粒。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體還包含編碼感興趣的多肽的多核苷酸，所述感興趣的多肽優(yōu)選酶，更優(yōu)選淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶(cellulyticenzyme)、氧化還原酶或植物細(xì)胞壁降解酶，甚至更優(yōu)選具有選自下組的活性的酶氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶(cutinase)、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextringlycosyltransferase)、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、(3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苦酶、卣過氧化物酶(haloperoxidase)、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。另一優(yōu)選的實(shí)施方案涉及第一和第二方面，其中一個或多個基因組氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因編碼包含氨基酸序列的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2、SEQIDNO:13、SEQIDNO:22或SEQIDNO:24中所示序列是至少80%同一的、85%同一的、90%同一的、92%同一的、94%同一的、96%同一的、98%同一的或至少99%同一的。優(yōu)選的實(shí)施方案涉及第一和第二方面，其中一個或多個基因組氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因包含多核苷酸序列，所述多核普酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:12、SEQIDNO:21或SEQIDNO:23中所示序列是至少80%同一的、85%同一的、90%同一的、92%同一的、94%同一的、96%同一的、98%同一的或至少99%同一的。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA構(gòu)建體的選4奪標(biāo)記編碼包含氨基酸序列的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2、SEQIDNO:13、SEQIDNO:22或SEQIDNO:24中所示序列是至少80%同一的、85%同一的、90%同一的、92%同一的、94%同一的、96%同一的、98%同一14的或至少99%同一的。切下DNA的部分的解離酶或特異性限制酶(如果該DNA的兩側(cè)均側(cè)接稱為解離酶位點(diǎn)或限制位點(diǎn)的特定識別序列)是本領(lǐng)域熟知的，參見例如WO96/23073(NovoNordiskA/S)，將其通過引用包括在本文內(nèi)。優(yōu)選DNA構(gòu)建體的選擇標(biāo)記的側(cè)翼有解離酶位點(diǎn)，優(yōu)選解離酶位點(diǎn)是ws。在第一方面優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA構(gòu)建體的選擇標(biāo)記的側(cè)翼有由特異性解離酶識別的核普酸序列，優(yōu)選所述核苷酸序列是ms,甚至更優(yōu)選在選擇在選擇性條件下生長的宿主細(xì)胞之后，通過解離酶的作用將至少一個標(biāo)記基因從DNA構(gòu)建體切除。優(yōu)選地，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體還包含與宿主細(xì)胞的基因組DNA區(qū)充分同源的多核苷酸區(qū)，從而通過同源重組實(shí)現(xiàn)將所述DNA構(gòu)建體整合入基因組中。如下文所示例，同樣優(yōu)選的是生長培養(yǎng)基中氯霉素的抑制濃度是至少1微克/毫升，優(yōu)選至少2微克/毫升，更優(yōu)選至少3微克/毫升，6微克/毫升，9微克/毫升或至少12微克/毫升。實(shí)施例實(shí)施例1.地衣芽孢桿菌PL1980中的oi,缺失構(gòu)建缺失質(zhì)粒基于ATCC14580基因組序列設(shè)計了引物，從而允許PCR擴(kuò)增c.W基因5，的0.5kb區(qū)段和c^基因3'的另一個0.5kb區(qū)段。地衣芽孢桿菌ATCC14580的cW基因區(qū)的DNA序列在SEQIDNO:1中顯示，并且在SEQIDNO:2中顯示了編碼的蛋白質(zhì)。使用來自地衣芽孢桿菌PL1980的DNA作為模板，并且如供應(yīng)商所述使用來自AmershamPharmaciaBiotech,Inc.的READY-TO-GOTMPCR珠，在MJResearch的PTC-200PCR機(jī)上按照以下程序進(jìn)行了PCR擴(kuò)增l個循環(huán)95°C2分鐘30個循環(huán)94°C30秒退火X°Cl分鐘(在此步中使用了不同的溫度)72°C2分鐘，然后是1個循環(huán)的72'C5分鐘，其后將反應(yīng)物冷卻至10。C。15使用了以下引物SEQIDNO:3(#449000):5，cagtgaattcgtttaaccggcaattcttcSEQIDNO:4(#449001):5，cagtgtcgacgtctcttaacatctctcacSEQIDNO:5(#448309):5，cagtgtcgacctgcttcactgattccgSEQIDNO:6(#448315):5，cagtaagcttaagattcctcgatgatttc最初的PCR擴(kuò)增沒有成功，使用兩引物組合#449000+#449001或#448309+#448315中的任一種均未獲得正確大小的片段。于是設(shè)計了更長的引物SEQIDNO:7(#450168):5,cagtgaattcgtttaaccggcaattcttcaaacgtcSEQIDNO:8(#450169):5，cagtgtcgacgtctcttaacatctctcactgctgtgSEQIDNO:9(#450170):5，cagtgtcgaccgcttcactgattccggcaatattcSEQIDNO:10(#450171):5,cagtaagcttaagattcctcgatgatttccaccacacSEQIDNO:11(#455882):5，cagtgaattccgctttcgtttcaaatgacgg在PCR反應(yīng)中使用了這些引物，所述PCR反應(yīng)的退火溫度以每步rc從62。C斜線下降(rampdown)至53°C，然后保持在57。C再進(jìn)行20個循環(huán)。#450170+#450171反應(yīng)得到了0.5kb片段,將該片段用五coRI+5W/I消化并且連接至用￡coRI+消化的pUC19(Yanisch-Perron等，1985,Gene"(1):103-119)。將連接混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)化入大腸桿菌SJ2(Diderichsen等，1990,J.Bacteriol.172(8):4315-4321)中，然后選擇氨千青霉素抗性。分離了具有序列的克隆，發(fā)現(xiàn)所述序列與ATCC14580序列相比包含23處差異，將這種克隆保留并命名為SJ7905(SJ2/pSJ7905)。地衣芽孢桿菌PL1980的cW基因區(qū)的DNA序列在SEQIDNO:12中顯示，并且在SEQIDNO:13中顯示了編碼的蛋白質(zhì)。使用#450168+#450169的PCR沒有成功。然后使用上述引物和新引物#455882的組合嘗試了橫跨整個caf基因區(qū)的更多的PCR反應(yīng)，使用與上述反應(yīng)中相同的退火溫度方案。引物組合#450171+#44卯00產(chǎn)生了約1.8kb片段；#450171+#450168產(chǎn)生了分別約1.7kb和1.1kb的兩個片段；和#450171+#455882產(chǎn)生了約l.Okb的片段。對這四個片段進(jìn)行了純化，并且將每一個片段都在使用引物#450170+#450171的反應(yīng)中用作模板，采用如上的退火溫度方案。所有反應(yīng)均產(chǎn)生了0.5kb片段，當(dāng)直接使用這種引物組合以染色體DNA作為模板時也有同樣的發(fā)現(xiàn)，說明所述四個片段確實(shí)是來自CW基因區(qū)的片段。對四個長片段進(jìn)行了DNA測序。示意圖在圖2中提供?；谒鲂蛄校瑸?，-片段設(shè)計了新的引物:SEQIDNO:14(#457708):5，cagtgtcgacctgcttagcggtcttactg(對應(yīng)于ATCC14580cat2kb位置606-588，但含有幾個錯配)。將引物組合糾57708+#450168用來進(jìn)行擴(kuò)增，使用與上文中相同的退火溫度方案。將獲得的0.5kb片段用5"a/1+五coRI消化，并且克隆至經(jīng)5WI+&'oRI消化的pUC19載體中，再將所述載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。分離了兩個正確的大腸桿菌SJ2轉(zhuǎn)化體并且命名為SJ8003(SJ2/pSJ8003)和SJ8004(SJ2/pSJ8004)。通過如下制備含有裝配的上游和下游片段的基于pUC19的質(zhì)粒從pSJ7905切下0.5kb&/I+///"dill片段并將這個片段插入經(jīng)&/I+/^"dlll消化的pSJ8003。分離了獲得的大腸桿菌SJ2的轉(zhuǎn)化體并命名為SJ8011(SJ2/pSJ8011)和SJ8012(SJ2/pSJ8012)。然后通過從pSJ8011切下0.9kb￡coRI-//^dIII片段，并且將這個片段與pSJ2739(美國專利6，100,063)的4.3kbEcoRI-HindIII片段連接，由此將5'cat-3，cat區(qū)段轉(zhuǎn)移至溫度敏感的、可遷移的整合載體上，從而提供所謂的缺失質(zhì)粒(deletionplasmid)。分離了包含所述缺失質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen等，1990,J.Bacteriol.172(8)，4315-4321)的正確轉(zhuǎn)化體，并且命名為SJ8017(DN1885/pSJ8017)和SJ8018(DN1885/pSJ8018)。構(gòu)建在c^基因中具有缺失的地衣芽孢桿菌PL1980衍生菌林用所述缺失質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌接合供體菌抹PP289-5(PP289-5(美國專利6,066,473),得到了SJ8039和SJ8040(含pS腿7),以及SJ8041和SJ8042(含pSJ8018)。地衣芽孢桿菌菌抹PP1897-3是地衣芽孢桿菌PL1980的衍生物，其在堿性蛋白酶(alcalase)基因中具有內(nèi)部缺失(internaldeletion)、大部分C-組分蛋白酶編碼區(qū)的缺失和在amyZ、x_yW和g"W基因座人工插入的啟動子。使用該菌林作為受體與上述兩個供體菌抹SJ8039和SJ8040接合。接合基本上如美國專利6,066,473中所述的進(jìn)行，選擇紅霉素抗性。分17離了四環(huán)素敏感性的轉(zhuǎn)移接合子(transconjugant)，在整合和切除所述缺失質(zhì)粒之后分離了氯霉素和紅霉素敏感性菌林。將轉(zhuǎn)移接合子劃線接種(streak)至含紅霉素(5微克/毫升)的LBPSG平板上，將平板在5(TC溫育過夜。在高溫選擇紅霉素抗性，這確保形成的菌落是因缺失質(zhì)粒通過在5，c^或3，cW序列處的同源重組整合到地衣芽孢桿菌宿主菌林染色體中而產(chǎn)生的，因?yàn)樗鲑|(zhì)粒在該溫度不能作為游離質(zhì)粒復(fù)制。將菌落接種到TY液體培養(yǎng)基(TYliquidculture)中，并且在30。C溫育過夜。這個溫度使得整合的質(zhì)粒能夠復(fù)制，這促使該質(zhì)粒從染色體切除，并最終從細(xì)胞中缺失(由紅霉素敏感性說明)?？山?jīng)由與用于整合的同源性區(qū)相同的同源性區(qū)來切除質(zhì)粒，在這種情況下所得細(xì)胞與宿主菌抹相同?；蛘呖梢越?jīng)由其它同源性區(qū)來切除質(zhì)粒(例如經(jīng)由5，caf整合，并經(jīng)由3，ca/切除，或者反過來)，在這種情況下使caf基因從染色體缺失。將過夜培養(yǎng)物的等分試樣用于接種新鮮的TY培養(yǎng)基，并且鋪于LBPSG平板上。將平板在30。C溫育過夜，其后將平板平板復(fù)制(replicaplate)到含有和不含紅霉素或氯霉素的平板上。將2個紅霉素敏感性和氯霉素敏感性菌抹作為SJ8071(來自供體SJ8039)和SJ8072(來自供體SJ8041)保留。當(dāng)在含有10微克/毫升氯霉素的LPBSG平板上重新分離(reisolate)時，這些缺失型菌^^朱完全沒有生長，而在相同的平板上重新分離的對照菌株則有一些生長。實(shí)施例2.ATCC14580菌林中的ai/基因缺失進(jìn)行了幾次嘗試來將caf缺失引入ATCC14580染色體，如上文進(jìn)行的一樣，通過整合和切除經(jīng)由接合引入的來自SJ8039-SJ8042的缺失質(zhì)粒。我們獲得了轉(zhuǎn)移接合子和具有整合的質(zhì)粒的后續(xù)菌抹，但是無法分離攜帶cat缺失的期望的切除衍生林。由于這可能是因?yàn)閮煞N不同的地衣芽孢桿菌菌抹之間c^基因區(qū)中的序列差異，所以構(gòu)建了新的缺失載體。構(gòu)建缺失質(zhì)粒在PCR反應(yīng)中使用ATCCI4580經(jīng)煮沸的細(xì)胞懸液(boiledcellsuspension)作為模板，使用引物組合弁450168+弁450169(以產(chǎn)生cW的3，的片段)，以及引物組合斜50170+弁450171(以產(chǎn)生ca/的5，的片段)，使用57。C作為退火溫度。將3'片段用￡coRI+消化并連接至經(jīng)五coRI+Sa/I消化的pUC19載體中，再通過電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SJ2中。將具有正確的克隆DNA序列的轉(zhuǎn)化體作為SJ8151(SJ2/pSJ8151)和SJ8152(SJ2/pSJ8152)保留。將5，片段用&/I+///wdlll消化并連接至經(jīng)+/f/"din消化的pUC19載體中，再通過電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SJ2中。將具有正確的克隆DNA序列的轉(zhuǎn)化體作為SJ8153(SJ2/pSJ8153)和SJ8154(SJ2/pSJ8154)保留。通過從pSJ8151切下0.5kb五coRI-Sa/1片段，并且從pSJ8153切下0.5kb^/I-歷"din片段，再將這兩個片段與pSJ2739的4.4kb五caRI-歷wdIII片段連接，由此將5，ca"，c"f區(qū)段裝配至溫度敏感的、可遷移的整合載體中。將枯草芽孢桿菌DN1885的正確轉(zhuǎn)化體作為SJ8209(DN1885/pSJ8209)和SJ8210(DN1885/pSJ8210)保留。構(gòu)建在caf基因中具有缺失的地衣芽孢桿菌ATCC14580用整合載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌接合供體菌抹PP289-5，產(chǎn)生了SJ8221和SJ8222(含pSJ8209),以及SJ8223和SJ8224(含pSJ8210)。使用地衣芽孢桿菌菌抹ATCC14580作為受體與上述供體菌林接合。如先前所述進(jìn)行接合，選擇紅霉素抗性。如先前所述，分離了四環(huán)素敏感性轉(zhuǎn)移接合子，并且在整合并切除所述質(zhì)粒后分離了氯霉素和紅霉素敏感性菌抹。將兩個這樣的菌林作為SJ8343(來自供體SJ8222)和SJ8344(來自供體SJ8223)保留。實(shí)施例3.氯霉素抗性的測試使菌株P(guān)P1897-3、SJ8071(=PP1897-3△c^)、ATCC14580和SJ8344(=ATCC14580Ac^)在補(bǔ)充了0.5%葡萄糖的10mlTY(WO94/14968，第16頁)中在3(TC在搖動的條件下過夜增殖。使用50微升等分試樣接種另外的10mlTY+葡萄糖培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充了以下濃度的氯霉素(cam):1微克/毫升、2微克/毫升、3微克/毫升、6微克/毫升、9微克/毫升或12微克/毫升，并且繼續(xù)在30。C搖動溫育。在約7小時后通過視覺觀察渾濁度(turbidity)來對生長進(jìn)行評分(表1)，并且在過夜溫育后再進(jìn)行一次(表2)。表l.在7小時溫育之后++)良好生長，十)不良(weak)生長，-)無生長<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2.過夜溫育之后++)良好生長，+)不良生長，-)無生長<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>顯然，如在菌抹SJ8071和SJ8344中所進(jìn)行的，推定的氯霉素抗性基因的缺失，顯著降低了菌^f朱的氯霉素抗性。實(shí)施例4.氯霉素抗性用于轉(zhuǎn)移接合子選"^的用途構(gòu)建具有氯霉素和紅霉素抗性基因的測試質(zhì)粒為了研究氯霉素用于轉(zhuǎn)移接合子選擇的潛在用途，使用了質(zhì)粒pSJ7976。這種質(zhì)粒是基于先前提到的可轉(zhuǎn)移的、溫度敏感的載體骨架pSJ2739，并且含有來自pE194的紅霉素抗性基因。此外，其含有插入?yún)^(qū)段之間的pC194c^基因的編碼序列，所述區(qū)段在地衣芽孢桿菌C-組分蛋白酶(美國專利No.5,459,064，登錄號D10060,Kakudo等，1992,所o/.C/zem.267:23782)基因5，和3，側(cè)翼。該質(zhì)粒如下構(gòu)建使用來自PL1980的染色體DNA作為才莫板和57。C的退火溫度，用以下引物通過PCR擴(kuò)增制備了C組分蛋白酶基因的片段5，SEQIDNO:15(#448697):5，gactaagcttagatcttcacttccttattttgttgtaagtaSEQIDNO:16(#448698):5，gactgaattcgtcgatcactttctgccactc將PCR擴(kuò)增出的片段用五coRI+歷'"dl11消化，與經(jīng)五coRI+歷"dm消化的pUC19連接，并且將連接混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)化入大腸桿菌SJ2中。將兩個正確的轉(zhuǎn)化體作為SJ7867(SJ2/pSJ7867)和SJ7868(SJ2/pSJ7868)保留。使用來自PL1980的染色體DNA作為模板和57。C的退火溫度，用以下引物通過PCR擴(kuò)增制備了C組分蛋白酶基因的片段3，SEQIDNO:17(#448699):5'gactgaattcagatctgctagcacgcgtgcggccgcacgaagacagcccgcttcSEQIDNO:18(#448700):5，gactaagcttcataaattctcggatacaacac將PCR擴(kuò)增出的片段用EcoRI+HindIII消化，與經(jīng)EcoRI+HindIII消化的pUC19連接，并且將連接混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)移至大腸桿菌SJ2中。將兩個正確的轉(zhuǎn)化體作為SJ7869(SJ2/pSJ7869)和SJ7870(SJ2/pSJ7870)保留。通過從pSJ7867切下0.5kbEcoRI-BglII片段并從pSJ7869切下0.5kbBgin-HindIII片段，再將這些片段與pSJ2739的4.4kbEcoRI-Hindlll片段連接，由此將C組分5，-和3，-側(cè)翼片段裝配至溫度敏感的、可遷移的整合載體中。將連接混合物轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌DN1885的感受態(tài)細(xì)胞，在30。C選擇紅霉素抗性(5微克/毫升)。將兩個正確的轉(zhuǎn)化體作為SJ7909(DN1885/pSJ7909)和SJ7910(DN1885/pSJ7910)保留。使用57。C的退火溫度和以下引物通過PCR從質(zhì)粒pDN1050(Diderichsen等，1993，Plasmid30,312-315)擴(kuò)增pC194的氯霉素抗性基因，SEQIDNO:19(#448716):5,gactggatccatgaactttaataaaattgatttagacSEQIDNO:20(#448718):5'gactgaattcgctagcacgcgttataaaagccagtcattaggcc將PCR擴(kuò)增出的片段用BamHI+EcoRI消化，與經(jīng)BamHI+EcoRI消化的pUC19連接，并且將連接混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SJ2。將正確的轉(zhuǎn)化體作為SJ7887(SJ2/pSJ7887)保留。通過從pSJ7887切下0.7kbBamHI-MluI片段，并且將這個片段與pSJ7909的5.4kbBglII-MluI片段連接，由此將pC194基因插入5，和3，C組分側(cè)翼區(qū)段之間。將連接混合物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)枯草芽孢桿菌DN1885細(xì)胞中，在3(TC選擇紅霉素(2微克/毫升)和氯霉素(6微克/毫升)抗性。保留了兩個轉(zhuǎn)化體，SJ7975(DN1885/pSJ7975)和SJ7976(DN1885/pSJ7976)。通過接合引入質(zhì)粒將同時含有氯霉素和紅霉素抗性基因的測試質(zhì)粒pSJ7976轉(zhuǎn)化入接合供體菌抹枯草芽孢桿菌PP289-5中，得到了菌抹SJ8000。使用地衣芽孢桿菌菌抹PP1897-3、cW缺失型衍生林SJ8071、菌抹ATCC14580和c^缺失型衍生抹SJ8344作為受體與供體菌抹SJ8000進(jìn)行接合，基本上如前文所述。對于每種供體/受體組合，將供體和受體菌落從過夜平板刮下，在小體積的液體TY培養(yǎng)基中混合，再將等體積的這種混合物鋪于含有D-丙氨酸的兩個LBPGS平板中的每一個上。在30。C溫育6小時之后，將一個平板復(fù)制到含有紅霉素(2微克/毫升)的LBPGS上，并將另一個平板復(fù)制到含有氯霉素(6微克/毫升)的LBPGS上。將這些平板在30。C過夜溫育，然后在室溫(20-25。C)再放置3天。過夜溫育之后，在含有紅霉素的平板上觀察到了全部供體/受體組合的清晰菌落(distinctcolonies)。ATCC14580和SJ8344平板上的數(shù)目大約相等，而PP1897-3平板上的菌落數(shù)是SJ8071的大約兩倍。使用氯霉素選擇的結(jié)果則完全不同。對于含有完整的染色體氯霉素抗性基因的兩個受體菌抹未觀察到清晰的轉(zhuǎn)移接合子菌落，但是復(fù)制平板含有均勻的成片纟田月包(anevensmearofcells)。對于c^缺失型受體菌林觀察到了清晰的轉(zhuǎn)移接合子菌落。就SJ8071受體以及SJ8344受體而言，當(dāng)使用氯霉素選擇時的轉(zhuǎn)移接合子數(shù)與使用紅霉素選擇時相同。對于每個含有清晰的轉(zhuǎn)移接合子菌落的平板，無論是用紅霉素或是用氯霉素進(jìn)行選擇的，均將10個菌落轉(zhuǎn)移至含有氯霉素或紅霉素的新平板，發(fā)現(xiàn)全部菌落均可在兩種類型的平板上生長。因此cat缺失型受體菌抹的使用允許成功的采用氯霉素抗性來選擇DNA向地衣芽孢桿菌中的引入。實(shí)施例5.地衣芽孢桿菌9945A的cw基因的DNA序列地衣芽孢桿菌菌林9945A(來自BacillusGeneticStockCenter的菌抹5A2;J.Bacteriology(1954)68:307)從CurtisB.Thome獲得，并作為JA102保存。使用引物#450168+#450171PCR擴(kuò)增了染色體基因區(qū)，并且使用相同的引物對擴(kuò)增出的片段DNA測序。所得序列示于SEQIDNO:21，而編碼的蛋白質(zhì)示于SEQIDNO:22。實(shí)施例6.另一地衣芽孢桿菌菌抹中的cW基因DNA的DNA序列國際專利公開WO03/083125(GenencorInt.Inc)在文本的第21和22頁公開了染色體氯霉素抗性基因的DNA和蛋白序列，并且將DNA序列作為此公開的SEQIDNO:58而蛋白序列作為SEQIDNO:59給出。同樣這兩個序列在本文分別作為SEQIDNO:23和SEQIDNO:24提供。實(shí)施例7.百分比同一性比對在表3中比對了四個不同的cw基因，即catATCC14580、catPL1980、cat9945A和catWO03/083125的DNA序列?；趯μ峁┑男蛄械?全部對全部"比對("allagainstall"alignments)計算了矩陣。將矩陣中第i行第j列的內(nèi)容計算為用序列i和序列j之間的比對中精確匹配的數(shù)目除以比對的總長度減去比對中缺口總長度的差。每個比對均使用EMBOSS軟件包版本2.8.0的needle程序進(jìn)行。程序needle執(zhí)行以下兩篇參考文件中描述的全局比對算法(globalalignmentalgorithm):Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol,48,443-453.Kruskal,J.B.(1983)AnoverviewofsequencecomparisonInD.SankoffandJ.B.Kruskal,(ed.),Timewarps,stringeditsandmacromolecules:thetheoryandpracticeofsequencecomparison,1-44頁AddisonWesley.比對使用了以下參數(shù)缺口開啟罰分(Gapopeningpenalty):10.00在夾口延伸罰分(Gapextensionpenalty):0.50取代矩陣EBLOSUM62表3.四種地衣芽孢桿菌cW基因的比對百分比同一性ATCC14580PL19809945AWO03/083125ATCC14580100.0096.3093.6799.67PL1980100.0092.5996.339945A100.0093,32WO03/083125100.00白序列，如表4中所示'23表4.由表3中的DNA編碼的四種蛋白質(zhì)的同一性比對<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>權(quán)利要求1.一種用于將重組DNA構(gòu)建體引入修飾的地衣芽孢桿菌宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括a)提供修飾的地衣芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其中已將一個或多個內(nèi)源基因組氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因失活；b)將重組DNA構(gòu)建體引入所述修飾的宿主細(xì)胞，所述重組DNA構(gòu)建體包含編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的選擇標(biāo)記；c)在包含抑制濃度的氯霉素的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(b)的宿主細(xì)胞；和d)選擇能夠在步驟(c)的培養(yǎng)基中生長的包含所述DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述重組DNA構(gòu)建體是質(zhì)?；蚓€性化的質(zhì)粒，優(yōu)選線性化和多聯(lián)體化的質(zhì)粒。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述重組DNA構(gòu)建體還包含編碼感興趣的多肽的多核芬酸，所述多肽優(yōu)選是酶。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中一個或多個基因組氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，所述氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDNO:2、SEQIDNO:13、SEQIDNO:22或SEQIDNO:24中所示序列至少80%同一的氨基St字列。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述一個或多個基因組氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:12、SEQIDNO:21或SEQIDNO:23中所示序列至少80%同一的多核苷酸序列。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述DNA構(gòu)建體的選擇標(biāo)記編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，所述氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDNO:2、SEQIDNO:13、SEQIDNO:22或SEQIDNO:24中所示序列至少80%同一的氨基酸序列。7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述DNA構(gòu)建體的選擇標(biāo)記的側(cè)翼有解離酶位點(diǎn)。8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述DNA構(gòu)建體還包含與宿主細(xì)胞的基因組DNA區(qū)充分同源的多核香酸區(qū)，以通過同源重組實(shí)現(xiàn)將所述DNA構(gòu)建體整合入基因組中。9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述生長培養(yǎng)基中氯霉素的抑制濃度是至少1微克/毫升，優(yōu)選至少2微克/毫升，更優(yōu)選至少3微克/毫升，6微克/毫升，9微克/毫升，或至少12微克/毫升。10.—種修飾的地衣芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其中已將一個或多個基因組氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因失活，所述宿主細(xì)胞包含攜帶編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的選4奪標(biāo)記的重組DNA構(gòu)建體。11.權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，其中所述重組DNA構(gòu)建體是質(zhì)?；蚓€性化的質(zhì)粒，優(yōu)選線性化和多聯(lián)體化的質(zhì)粒。12.權(quán)利要求10或11的宿主細(xì)胞，其中所述重組DNA構(gòu)建體還包含編碼感興趣的多肽的多核普酸，所述多肽優(yōu)選是酶。13.權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述一個或多個基因組氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，所述氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDNO:2、SEQIDNO:13、SEQIDNO:22或SEQIDNO:24中所示序列至少80%同一的氨基酸序列。14.權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述一個或多個基因組氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:12、SEQIDNO:21或SEQIDNO:23中所示序列至少80%同一的多核香酸序列。15.權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述DNA構(gòu)建體的選擇標(biāo)記編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，所述氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶包含與SEQIDNO:2、SEQIDNO:13、SEQIDNO:22或SEQIDNO:24中所示序列至少80%同一的氨基酸序列。16.權(quán)利要求10-15中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述DNA構(gòu)建體的選擇標(biāo)記的側(cè)翼有解離酶位點(diǎn)。17.權(quán)利要求10-16中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中所述DNA構(gòu)建體還包含與宿主細(xì)胞的基因組DNA區(qū)充分同源的多核苷酸區(qū)，以通過同源重組實(shí)現(xiàn)將所述DNA構(gòu)建體整合入基因組中。全文摘要本發(fā)明涉及修飾的地衣芽孢桿菌宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)使一個或多個天然存在的染色體氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因cat失活。染色體cat基因的失活允許將氯霉素作為有效的選擇劑用于將DNA引入所述修飾的細(xì)胞的方法。文檔編號C12N9/10GK101495625SQ200780027873公開日2009年7月29日申請日期2007年5月29日優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日發(fā)明者斯蒂恩·T·喬爾根森申請人:諾維信公司