專利名稱：用于抑制蛋白激酶3表達(dá)的方法
3表達(dá)的方法 用于抑制蛋白激酶本發(fā)明涉及適合于抑制蛋白激酶3(PKN3)表達(dá)的雙鏈核酸及其應(yīng)用。
Foulds (Foulds， 1958)將瘤發(fā)生描述為多級(jí)生物學(xué)過程，目前己知其通 過累積遺傳損害而發(fā)生。在分子水平上，該多級(jí)腫瘤發(fā)生過程包括破壞陽 性和陰性調(diào)節(jié)效應(yīng)子(Weinberg, 1989)。 Vogelstein及同事(Fearon和 Vogelstein, 1990)推定人類結(jié)腸癌的分子基礎(chǔ)涉及許多癌基因、腫瘤抑制基 因和修復(fù)基因。類似地，已將導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展的缺陷與另一種 腫瘤抑制基因聯(lián)系起來(Lee等，1987)。在多種其它惡性腫瘤中還識(shí)別了其 他癌基因和腫瘤阻抑基因。不幸地，僅有少量能夠治療的癌癥，且癌癥的 影響是災(zāi)難性的--一僅美國每年有超過50萬人死亡。
癌癥從根本上是遺傳疾病，其中對(duì)細(xì)胞DNA的損傷導(dǎo)致控制細(xì)胞增 殖的正常機(jī)制的破壞。腫瘤阻抑基因維持基因組完整性的兩種作用機(jī)制是 通過細(xì)胞停滯，由此容許修復(fù)損傷的DNA，或通過程序性細(xì)胞死亡去除 損傷的DNA(Ellisen和Haber, 1998)。程序性細(xì)胞死亡，另外稱為"程序性 細(xì)胞死亡(programmed cell death)",是小心地受到調(diào)節(jié)的生物化學(xué)事件網(wǎng) 絡(luò)，它起到以去除不可逆轉(zhuǎn)地受損細(xì)胞為目的的細(xì)胞自殺程序作用。程序 性細(xì)胞死亡能夠由許多方法觸發(fā)，包括結(jié)合腫瘤壞死因子，DNA損傷， 生長(zhǎng)因子的取消、和與Fas受體的抗體交聯(lián)。盡管已經(jīng)識(shí)別了若干在程序 性細(xì)胞死亡過程中起作用的基因，但是尚未完全闡明引起程序性細(xì)胞死亡 的途徑。許多研究者試圖以這樣的目標(biāo)識(shí)別新型程序性細(xì)胞死亡-促進(jìn)基 因，所述目標(biāo)是該基因應(yīng)該提供選擇性地在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死 亡方法，從而治療患者體內(nèi)的癌癥。
治療癌癥的備選方法涉及用試劑，諸如Endostatin 或抗-VEGF抗體 抑制血管發(fā)生。在該方法中，目標(biāo)是防止原發(fā)腫瘤的進(jìn)一步血管化，并且 潛在地，將轉(zhuǎn)移性病灶的尺寸限制為在無充分血管生長(zhǎng)的條件下能夠支持 腫瘤細(xì)胞的存活。
癌癥疾病的特殊組是在腫瘤生長(zhǎng)速率、向正常組織中的入侵、對(duì)化學(xué)療法或其他常規(guī)治療的抗性和形成遍及全身的轉(zhuǎn)移方面積極的那些癌癥 疾病。在更積極的癌癥情形中，癌癥組織更加不同于正常組織，且腫瘤更 易于擴(kuò)散。因此，當(dāng)前癌癥研究中的一個(gè)目的是開發(fā)這樣的試劑，其抑制 腫瘤生長(zhǎng)和/或減少癌癥細(xì)胞遍及全身的擴(kuò)散。
對(duì)什么是積極癌癥疾病的定義可以從國家癌癥研究所主頁，即
http:〃www.cancer.gov/Templates/db一alpha.aspx CdrlD二46053獲得。此夕卜，
為了描述癌癥疾病的積極性，典型地使用分級(jí)，所述分級(jí)是這樣的系統(tǒng)， 即根據(jù)在顯微鏡下檢査時(shí)它們表現(xiàn)出的異常來分類癌癥細(xì)胞。分級(jí)系統(tǒng)的 目的是提供關(guān)于腫瘤可能的生長(zhǎng)速率的信息，及其擴(kuò)散趨勢(shì)。用于分級(jí)腫 瘤的系統(tǒng)隨著各種類型的癌癥而變化。分級(jí)在治療決定中起作用。
所述分級(jí)系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所己知的。其中之一是Gleason分?jǐn)?shù)， 即基于顯微鏡下形態(tài)分級(jí)前列腺癌癥組織的系統(tǒng)。Gleason分?jǐn)?shù)在2-10的 范圍內(nèi)變化，并指示腫瘤將擴(kuò)散的可能性。低Gleason分?jǐn)?shù)意味著該癌癥 組織與正常前列腺組織類似，且該腫瘤具有較低的擴(kuò)散可能性；高Gleason 分?jǐn)?shù)意味著該癌癥組織與正常的非常不同，且該腫瘤更可能擴(kuò)散。
PKN3，也稱為蛋白激酶NP或PKNP，是與癌癥和腫瘤相關(guān)的有價(jià)值 靶標(biāo)。如在國際專利申請(qǐng)WO 2004/019973中所述，蛋白激酶N)3是PI-3 激酶/PTEN通路的下游靶標(biāo)，所述通路與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)。特別地， 后者作用似乎強(qiáng)烈地與抑制基因功能相關(guān)，更特別地，與PTEN腫瘤抑制 基因功能的喪失相關(guān)。如WO 2004/019973中所示，蛋白激酶N卩在這樣 的條件下會(huì)受到上調(diào)作用，在所述條件中PTEN，即PI-3激酶通路的抑制 劑，是無活性的。由于蛋白激酶N卩的上調(diào)作用，其中發(fā)生所述上調(diào)作用 的細(xì)胞會(huì)顯示出轉(zhuǎn)移行為和遷移行為的增加。這意味著蛋白激酶N卩的抑 制劑是用于控制細(xì)胞轉(zhuǎn)移和遷移行為的合適方法，和用于治療腫瘤和癌 癥，更特別地轉(zhuǎn)移的和其細(xì)胞顯示出轉(zhuǎn)移和/或遷移行為的那種腫瘤和癌癥
本領(lǐng)域中現(xiàn)在正需要用于治療腫瘤疾病的方法。更特別地，需要適合 于積極的并表現(xiàn)出入侵行為的那種腫瘤疾病的方法。
還需要適合于影響血管形成，更特別地，在解釋腫瘤疾病的病理機(jī)制 中所涉及的血管形成的方法。這些需要定義了本發(fā)明待解決的問題。
12通過附加的獨(dú)立權(quán)利要求的主題解決了本發(fā)明待解決的問題?？梢詮?從屬權(quán)利要求獲得優(yōu)選的實(shí)施方案。
通過雙鏈核酸分子解決了本發(fā)明待解決的問題， -其中，所述雙鏈結(jié)構(gòu)包括第--鏈和第二鏈，
-其中，所述第-一鏈包括連續(xù)核苷酸的第一段序列，并且所述第一段序 列至少部分地與靶核酸互補(bǔ)，和
-其中，所述第二鏈包括連續(xù)核苷酸的第二段序列，并且所述第二段序 列至少部分地與所述第一段序列互補(bǔ)，和
其中，所述靶核酸是編碼PKN3的mRNA。
更特別地，在第一方面中，通過包含雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸分子解決了本發(fā) 明待解決的問題，
其中，所述雙鏈結(jié)構(gòu)包括第一鏈和第二鏈，
其中，所述第一鏈包括連續(xù)核苷酸的第一段序列，并且所述第一段序 列至少部分地與靶核酸互補(bǔ)，和
其中，所述第二鏈包括連續(xù)核苷酸的第二段序列，并且所述第二段序 列至少部分地與所述第一段序列互補(bǔ)，
其中，所述第一段序列包括這樣的核酸序列，所述核酸序列至少部分 地與按照SEQ.ID.No. 1(NM一013355)的核酸序列的核苷酸核心序列或其一 部分互補(bǔ)，
其中，所述核苷酸核心序列包括來自下列各項(xiàng)的核苷酸序列 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置482 - 500(SEQ. ID.No. 2); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置1555 - 1573(SEQ. ID.No. 4); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置1556 - 1574 (SEQ. ID.No. 6); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置1559 - 1577 (SEQ. ID.No. 8); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置1566 - 1584 (SEQ. ID.No. 10); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置2094 -2112 (SEQ. ID.No. 12); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置2102 - 2120 (SEQ. ID.No. 14); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置2286 - 2304 (SEQ. ID.No. 16); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置2761 - 2779 (SEQ. ID.No. 18); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置2763 - 2781 (SEQ. ID.No. 20);
13來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置2764 - 2782 (SEQ. ID.No. 22); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置2843 - 2861 (SEQ. ID.No. 24); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置2844 - 2862 (SEQ. ID.No. 26);或 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置2846 - 2864 (SEQ. ID.No. 28);
優(yōu)選地，所述核苷酸核心序列包括來自下列各項(xiàng)的核苷酸序列 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置1555 - 1573(SEQ, ID.No. 4); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置1556 - 1574 (SEQ. ID.No. 6); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置1559 - 1577 (SEQ. ID.No. 8); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置1566 - 1584 (SEQ, ID.No. 10); 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置2094-21I2(SEQ. ID.No. 12);或 來自SEQ.ID.No. 1的核苷酸位置2286 - 2304 (SEQ. ID.No. 16); 其中，優(yōu)選地，所述第-一段序列另外至少部分地與所述核苷酸核心序 列5'末端前面的區(qū)域和/或與所述核苷酸核心序列3'末端后面的區(qū)域互補(bǔ)。 在本發(fā)明第一方面的實(shí)施方案中，所述核酸第一段序列與所述核苷酸 核心序列或其一部分互補(bǔ)。
在本發(fā)明第一方面的實(shí)施方案中，所述核酸第一段序列另外與所述核 苷酸核心序列3'末端后面的區(qū)域和/或所述核苷酸核心序列5'末端前面的 區(qū)域互補(bǔ)。
在本發(fā)明第一方面的實(shí)施方案中，所述核酸第一段序列以18-29個(gè)核 苷酸，優(yōu)選地，19-25個(gè)核苷酸，和更優(yōu)選地，19-23個(gè)核苷酸，與所述靶 核酸互補(bǔ)。
在本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸的核苷酸是連續(xù)的核苷酸。
在本發(fā)明第一方面的實(shí)施方案中，所述核酸第一段序列和/或第二段序 列包括18-29個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選地，19-25個(gè)連續(xù)的核苷酸，和更優(yōu) 選地，19-23個(gè)連續(xù)的核苷酸。
在本發(fā)明第一方面的實(shí)施方案中，所述核酸第一鏈由所述第一段序列 組成，和/或所述核酸第二鏈由所述第二段序列組成。
在第二方面中，通過核酸分子，優(yōu)選地按照第一方面、包括雙鏈結(jié)構(gòu) 的核酸分子，解決了本發(fā)明待解決的問題，其中所述雙鏈結(jié)構(gòu)是通過第一鏈和第二鏈形成的，其中所述第一鏈包括連續(xù)核苷酸的第一段序列且所述 第二鏈包括連續(xù)核苷酸的第二段序列，和其中所述第一段序列至少部分地 與所述第二段序列互補(bǔ)，其中
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 3的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 2的核苷酸序列組成；
-所述第--段序列由按照SEQ.ID.No. 5的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 4的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 7的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 6的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 9的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 8的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 11的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 10的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 13的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 12的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 15的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 14的核苷酸序列組成；
-所述第-一段序列由按照SEQ.ID.No. 17的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 16的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 19的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 18的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照8￡0.10.]^0.21的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 20的核苷酸序列組成；
-所述第--段序列由按照SEQ.ID.No. 23的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 22的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.25的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 24的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 27的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 26的核苷酸序列組成；或
-所述第--段序列由按照SEQ.ID.No. 29的核苷酸序列組成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No. 28的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.31的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 30的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 33的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 32的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 35的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 34的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 37的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 36的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 39的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 38的核苷酸序列組成；
優(yōu)選地，
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 5的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 4的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 7的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 6的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 9的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 8的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 11的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 10的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 13的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 12的核苷酸序列組成；
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 17的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 16的核苷酸序列組成；或
-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 31的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 30的核苷酸序列組成；
在本發(fā)明第一和第二方面的實(shí)施方案中，所述核酸分子第一段序列和 /或第二段序列包括許多在2'位處具有修飾，并形成規(guī)則的，優(yōu)選地交替 位置模式的被修飾核苷酸組，其中，在該序列中，每個(gè)被修飾核苷酸組在 ---端或兩端都側(cè)鄰側(cè)翼核苷酸的組，其中，形成側(cè)翼核苷酸組的側(cè)翼核苷酸是未修飾的核苷酸或具有與所述被修飾核苷酸的修飾不同的修飾的核
在本發(fā)明第一和第二方面的實(shí)施方案中，所述核酸第一段序列和/或所 述核酸第二段序列包括被修飾核苷酸組的模式和/或側(cè)翼核苷酸組的模式。
在本發(fā)明第一和第二方面的實(shí)施方案中，所述核酸第一段序列和/或所 述核酸第二段序列在3'末端包括二核苷酸，其中所述二核苷酸優(yōu)選地是TT。
在本發(fā)明第一和第二方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸第一段序列和 /或所述核酸第二段序列的長(zhǎng)度由19-21個(gè)核苷酸組成。
在本發(fā)明第-一和第二方面的實(shí)施方案中，所述核酸第一-和/或第二段序 列在3'末端包括1-5個(gè)核苷酸的突出端。
在本發(fā)明第一和第二方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸雙鏈結(jié)構(gòu)的長(zhǎng) 度是約16-24個(gè)核苷酸對(duì)，優(yōu)選地，20-22個(gè)核苷酸對(duì)。
在本發(fā)明第一和第二方面的實(shí)施方案中，所述核酸第一鏈和所述核酸 第二鏈彼此共價(jià)連接，優(yōu)選地，所述第一鏈的3'末端共價(jià)連接于所述第二 鏈的5'末端。
在本發(fā)明第一和第二方面的實(shí)施方案中，所述核酸分子由兩條下列鏈 的每一條組成，且其中其下劃線的核苷酸是2，-0-甲基
PKN3 (1): agc鵬aganciaggiggg (SEQ. ID. No. 2)
5C^i￡cguga^ciiU￡agcy (SEQ. ID. No. 3)
PKN3 (2): ，gaggic鵬ciiggaea (SEQ. ID. No. 4)
jigMC￡agg§agu￡ciic§ag (S￡Q. ID. No. 5)
PKN3 (3): uMgggga2uyceu鵬cga (SEQ. ID. No. 6)
uugugc^gga^gycgu與 (SEQ. ID. No, 7)
PKN3 (4): a鵬c鵬c巡眺agugc (SEQ. ID. No. 8)
gc5uyg3^agg^agugc叢 (SEQ. ID. No. 9)PKN3 (5): PKN3 (6): PKN3 (7): PKN3 (8): PKN3 (9): PKN3(10): PKN3(1I): PKN3(12): PKN3 (13): PKN3 (14): PKN3-23陽vl:
ga￡cyu￡C￡a^agugii￡C￡
u卿ggaggucquccuggu ac￡agg^gga￡cyu￡C￡a§
cyc￡agC￡aMg^cyg￡u;yu
ayu￡aga^g￡usc;yc￡aga UC鵬agg鵬uucugaau
u￡aga§g￡U￡qjc￡aga§g
acgu￡ugg^ggagcyi^ug
caguygguggyccuga^ga ci|U￡agggc￡a￡cgacugg
PKN3-23-v2: gg￡ayugu￡C5gga§g^c￡U￡a^ uugaggacuuccuggacaapgcc
PKN3 -23 -v3: guygycsagg§agu^ic§agu￡
PKN3-23-v4: sayugi^c§gga§gyc￡u^gM a^u;yg^gga￡U]|CCiigg§c§ayg
PKN3-23-v5: gcauuguccaggaaguccuc^ag
(SEQ. ID. No. 10 (SEQ. ID. No. 11:
(SEQ. ID. No. 12 (SEQ. ID. No. 13:
(SEQ. ID. No. 14: (SEQ. ID. No. 15:
(SEQ. ID. No. 16; (SEQ. ID. No. 17;
(SEQ. ID. No. 18〕 (SEQ. ID. No. 19〕
(SEQ. ID. No. 20〕 (SEQ. ID. No. 21)
(SEQ. ID. No. 22) (SEQ. ID. No. 23)
(SEQ. ID. No. 24) (SEQ. ID. No. 25)
(SEQ. ID. No. 26) (SEQ. ID. No. 27)
(SEQ. ID. No. 28) (SEQ. ID. No. 29)
(SEQ. ID. No. 31) (SEQ. ID. No. 30)
(SEQ. ID. No. 33) (SEQ. ID. No. 32)
(SEQ. ID. No. 35' (SEQ. ID. No. 34:
(SEQ. ID. No. 37 (SEQ. ID. No. 36:
(SEQ. ID. No. 39 (SEQ. ID. No. 38:
18PKN3 (2):
PKN3 (3):
PKN3 (4):
PKN3 (5):
PKN3 (6):
PKN3 (8):
PKN3-23-vl:
MgMC￡agg^agugcyc§ag
aga￡uyg§gga￡ugc￡Uggac§a
(SEQ. ID. No. 4) (SEQ. ID. No. 5)
(SEQ.ID.No. 31) (SEQ. ID. No. 30)
說明書第9/68頁
uygaggapuucpugggcaa
gcgu^gyc￡agg^aguccy
gugaqagggauugugcggg g鵬c且cyuyggg^aggyc
cU-Ccagccaugccugcuuu ga^gg鄉(xiāng)cauggcuggag
(SEQ. ID. No. 6) (SEQ. ID. No. 7)
(SEQ. ID. No. 8) (SEQ. ID. No. 9)
(SEQ. ID. No. 10) (SEQ. ID. No. 11)
(SEQ. ID. No. 12) (SEQ. ID. No. 13)
(SEQ.ID.No. 16) (SEQ. ID. No. 17)
在第三方面中，通過脂質(zhì)體制劑解決了本發(fā)明待解決的問題，所述脂
質(zhì)體制劑包括按照第-一或第二方面所述的核酸。
在第四方面中，通過脂質(zhì)復(fù)合物(lip叩lex)解決了本發(fā)明待解決的問
題，所述脂質(zhì)復(fù)合物包括按照第-""或第二方面所述的核酸，和脂質(zhì)體。
在本發(fā)明第四方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)復(fù)合物的脂質(zhì)體由下 列各項(xiàng)組成
a) 約50摩爾％的3-精氨?；?2,3-二氨基丙酸-N-棕櫚基-N-油基-酰胺 三鹽酸，優(yōu)選地，(p-(L-精氨?；?-2,3-L-二氨基丙酸-W-棕櫚基-,油基-酰 胺三鹽酸)；
b) 約48-49摩爾％的1,2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺 (DPhyPE);禾口
c) 約1-2摩爾％的1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇， 優(yōu)選地，N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙
醇胺鈉鹽。
在本發(fā)明第四方面的更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)復(fù)合物的C-電勢(shì)是 約35-60 mV，優(yōu)選地，約45-50 mV。
在本發(fā)明第四方面的實(shí)施方案中，如通過QELS確定地，所述脂質(zhì)復(fù)
19合物具有約50-400nm，優(yōu)選地，約100-140nm ，和更優(yōu)選地，約 llOnm-130nm的尺寸。
在第五方面中，通過載體，優(yōu)選地表達(dá)載體，解決了本發(fā)明待解決的 問題，所述載體包括或編碼按照第一和第二方面的核酸。
在第六方面中，通過細(xì)胞解決了本發(fā)明待解決的問題，所述細(xì)胞包括 按照以上任一方面的核酸或按照以上任一方面的載體。
在第七方面中，通過組合物，優(yōu)選地，藥物組合物解決了本發(fā)明待解 決的問題，所述組合物包括按照第一或第二方面的核酸、按照第三方面的 脂質(zhì)體制劑、按照第四方面的脂質(zhì)復(fù)合物、按照第五方面的載體和/或按照 第六方面的細(xì)胞。
在本發(fā)明第七方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物是藥物組合物，其 任選地進(jìn)一步包括藥用賦形劑。
在本發(fā)明第七方面的更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物是藥物組合物， 并且所述藥物組合物用于治療血管發(fā)生-依賴性疾病，優(yōu)選地，由不足、異 常或過度血管發(fā)生所表征或引起的疾病。
在本發(fā)明第七方面的最優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物的血管發(fā)生是脂 肪組織、皮膚、心臟、眼睛、肺、腸、生殖器官、骨骼和關(guān)節(jié)的血管發(fā)生。
在本發(fā)明第七方面的實(shí)施方案中，疾病選自包括下列各項(xiàng)的組傳染 病、自體免疫病癥、血管畸形、動(dòng)脈粥樣硬化、移植動(dòng)脈病、肥胖、銀屑
病、疣、變應(yīng)性皮炎、玻璃體持續(xù)增生綜合征(persistent hyperplastic vitrous syndrome)、糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、與年齡相關(guān)的黃斑疾 病、脈絡(luò)膜新血管形成、原發(fā)性肺動(dòng)脈高血壓、哮喘、鼻息肉、炎性腸和 牙周疾病、腹水、腹膜粘連、子宮內(nèi)膜異位、子宮出血、卵巢囊腫、卵巢、 卵巢過度刺激(ovarian hyperstimulation)、關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、骨髓炎、骨 贅形成。
在本發(fā)明第七方面的實(shí)施方案中，所述藥物組合物用于治療腫瘤疾 病，優(yōu)選地，癌癥疾病，和更優(yōu)選地，實(shí)體腫瘤。
在本發(fā)明第七方面的實(shí)施方案中，所述藥物組合物用于治療選自包括 下列各項(xiàng)的組中的疾病骨癌、乳腺癌、前列腺癌、消化系統(tǒng)癌癥、結(jié)腸 直腸癌、肝癌、肺癌、腎癌、泌尿生殖器癌、胰腺癌、垂體癌、睪丸癌、
20眶癌、頭頸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥和呼吸系統(tǒng)癌癥。
在第八方面中，通過按照第一或第二方面的核酸，按照第三方面的脂 質(zhì)體制劑，按照第四方面的脂質(zhì)復(fù)合物，按照第五方面的載體和/或按照第 六方面的細(xì)胞用于制造藥物的用途，解決了本發(fā)明待解決的問題。
在本發(fā)明第八方面的實(shí)施方案中，所述藥物用于治療如關(guān)于本發(fā)明第 七方面所定義的任意疾病。
在本發(fā)明第八方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物與一種或數(shù)種其他治 療法聯(lián)合使用。
在本發(fā)明第八方面的更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述治療法選自包括下列各 項(xiàng)的組化學(xué)療法、冷凍療法、高熱、抗體療法、放射療法和抗血管發(fā)生 療法。
在本發(fā)明第八方面的最優(yōu)選實(shí)施方案中，所述治療法是抗體療法，和
更優(yōu)選地，是利用抗-VEGF抗體(諸如，例如，由基因技術(shù)-羅氏 (Genentech-Roche)提供和以Avastin名稱銷售的)或抗-血管生成素抗 體的抗體療法。
在本發(fā)明第八方面的實(shí)施方案中，所述抗-血管發(fā)生療法使用激酶受體 抑制劑，優(yōu)選地，酪氨酸激酶受體抑制劑，其中所述受體選自包括VEGF 受體、PDGF受體、Tie-2、 FGFR和EGFR的組。所述類型的抑制劑的實(shí) 例是靶向VEGF-R禾口 PDGF-R的Sorafenib (拜爾(Bayer))，和靶向EGFR 的抗體Erbitux(默克(Merck) /serono)。認(rèn)為這兩種藥物都是抗-血管發(fā)生 藥征。
在本發(fā)明第八方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抑制劑選自包括下列各項(xiàng) 的組siRNA、反義分子、適體、spiegelmer、高親和性結(jié)合肽、肽適體、
抗促成素和抗體。
在第八方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物與一種或數(shù)種其他治療法， 優(yōu)選地，抗-腫瘤或抗癌癥治療法組合使用。
在第八方面的更優(yōu)選實(shí)施方案中，所述治療法選自包括下列各項(xiàng)的組 中化學(xué)療法、冷凍療法、高熱、抗體療法和放射療法。
在第八方面的甚至更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療法是抗血管發(fā)生 治療法，且更優(yōu)選地，利用抗-VEGF抗體或抗-血管生成素抗體的抗體療法。
在本發(fā)明不同方面的進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，所述mRNA是人的 PKN3的mRNA。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述靶核酸是具有按照 SEQ.ID.No.l的核酸序列的mRNA。
如將要在本文中更詳細(xì)概述地，所述核酸分子和分別含有所述核酸分 子的藥物和制劑特別適合于抑制、或預(yù)防或治療侵入性癌癥、積極性癌癥 和惡性腫瘤。
優(yōu)選地用于本文時(shí)，侵入性癌癥是擴(kuò)散超過其發(fā)展的組織層并生長(zhǎng)到 周圍的健康組織中的癌癥。也稱為滲透性癌癥。
優(yōu)選地用于本文時(shí)，積極性癌癥是快速生長(zhǎng)的癌癥。 優(yōu)選地用于本文時(shí)，惡性腫瘤是能夠侵襲和破壞周圍組織并擴(kuò)散到身
體其他部分的癌性腫瘤。
本領(lǐng)域技術(shù)人員承認(rèn)，與具有SEQ.ID.No.l核苷酸序列的mRNA相比， 在不同個(gè)體或個(gè)體組中，優(yōu)選地，在種群中的mRNA中可能存在一個(gè)或 數(shù)個(gè)單核苷酸改變。與具有SEQ.ID.No.l核酸序列的mRNA相比，所述具 有一個(gè)或數(shù)個(gè)單核苷酸改變的mRNA，還應(yīng)該包括在優(yōu)選地在本文中使用 的術(shù)語靶核酸內(nèi)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，按照本發(fā)明不同方面的核酸分 子適合于抑制PKN3以及對(duì)其進(jìn)行編碼的mRNA的表達(dá)。更優(yōu)選地，所 述表達(dá)受到被稱為RNA干擾或轉(zhuǎn)錄后基因沉默的機(jī)制的抑制。因此按照 本發(fā)明，siRNA分子和RNAi分子分別適合于觸發(fā)RNA干擾反應(yīng)，從而 優(yōu)選地導(dǎo)致關(guān)于靶分子的mRNA的擊倒(knockdown)。在這種情況下，這 種類型的核酸分子適合于通過降低mRNA水平的表達(dá)而降低靶分子的表 達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)，可能存在其他編碼PKN3的mRNA，其應(yīng) 該也包括在本申請(qǐng)中。更特別地，基于本文所提供的技術(shù)教導(dǎo)，本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠在所述其他mRNA中確定由參考本文中SEQ.ID.No.l而確定的
具體核苷酸位置。
還應(yīng)該承認(rèn)按照本發(fā)明該方面的雙鏈核酸可以具有本文中關(guān)于這種 類型核酸分子所述的任意設(shè)計(jì)。此外，應(yīng)該承認(rèn)上述機(jī)制在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，關(guān)于不同方面和在本文中也稱為亞-方面的設(shè)計(jì)原則，也能夠應(yīng)用于 本文所公開的核酸。RNA干擾指在動(dòng)物中由短干擾RNA (siRNAs)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄 后基因沉默過程(Fire等，1998)。植物中的相應(yīng)過程普遍稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉 默或RNA沉默，并且在真菌中也稱為抑制(qudling)。認(rèn)為轉(zhuǎn)錄后基因 沉默過程是進(jìn)化-保守的細(xì)胞防御機(jī)制，其用于阻止一般由不同的群和門共 享的外源基因的表達(dá)(Fire, 1998 #263)。該避免外源基因表達(dá)的保護(hù)可能已 經(jīng)響應(yīng)雙鏈RNA(dsRNAs)的產(chǎn)生而進(jìn)化，所述雙鏈RNA(dsRNAs)源自病 毒感染或是轉(zhuǎn)座子元件通過細(xì)胞應(yīng)答隨機(jī)整合到宿主基因組中，其特異性 破壞同源單鏈RNA或病毒基因組RNA。細(xì)胞中dsRNA的存在通過尚未 得到完全表征的機(jī)制觸發(fā)RNAi的應(yīng)答。該機(jī)制，其還存在于動(dòng)物細(xì)胞中， 且具體地還存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，似乎與干擾素應(yīng)答不同，所述干擾素 應(yīng)答由dsRNA-介導(dǎo)的蛋白激酶PKR和2'， 5'-寡腺苷酸合酶的活化引起， 所述活化導(dǎo)致核糖核酸酶L對(duì)mRNA的非-特異性裂解。
siRNA分子或RNAi分子的基本設(shè)計(jì)，其主要區(qū)別于尺寸，基本上是 這樣的，其使所述核酸分子包括雙鏈結(jié)構(gòu)。該雙鏈結(jié)構(gòu)包括第一鏈和第二 鏈。更優(yōu)選地，所述第一鏈包括連續(xù)核苷酸的第一段序列，且所述第二段 序列包括連續(xù)核苷酸的第二段序列。至少所述第一段序列和所述第二段序 列基本上彼此互補(bǔ)。該互補(bǔ)性典型地基于沃森-克里克堿基配對(duì)或本領(lǐng)域技 術(shù)人員己知的其他堿基配對(duì)機(jī)制，包括但不限于Hoogsteen堿基配對(duì)和其 他。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)，依賴于該雙鏈結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度，不必然需要在 堿基互補(bǔ)性方面的完美匹配。然而，在一些實(shí)施方案中，所述完美的互補(bǔ) 性是優(yōu)選的。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，互補(bǔ)性和/或同一性是至少75%、 80%、 85%、 90%或95%。在備選的特別優(yōu)選實(shí)施方案中，互補(bǔ)性和/或同 一性是這樣的，使互補(bǔ)的和/或相同的核酸分子在下列條件下，與按照本發(fā) 明的核酸分子的一條鏈，更優(yōu)選地，與這兩序列之一雜交，所述條件是 能夠在下述條件下與耙基因轉(zhuǎn)錄物的一部分雜交，所述條件是400 mM NaCl， 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50°C或70°C雜交12-16小時(shí)，隨 后清洗。各自的反應(yīng)條件特別記述在歐洲專利EP 1 230 375中。
錯(cuò)配也是可以容忍的，大多數(shù)在這樣的條件下，所述條件是雙鏈結(jié)構(gòu) 仍然適合觸發(fā)RNA干擾機(jī)制，且優(yōu)選地該雙鏈結(jié)構(gòu)分別在細(xì)胞、組織和 生物體中的主要生理?xiàng)l件下，仍然穩(wěn)定地形成，所述生物體包含或者原則上含有該細(xì)胞、組織和器官。更優(yōu)選地，該雙鏈結(jié)構(gòu)在生理緩沖液中，在 37。C穩(wěn)定。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該承認(rèn)，這種類型的錯(cuò)配能夠優(yōu)選地包含 于按照本發(fā)明的核酸分子中與核心區(qū)域不同的位置處。
優(yōu)選地用于本文時(shí)，術(shù)語核酸分子或序列或其部分與耙核酸分子部分
地互補(bǔ)，優(yōu)選地，意指如果RNA干擾(介導(dǎo))核酸直接或間接地靶向所
述耙核酸，則所述靶核酸和所述核酸、其序列或部分之間的互補(bǔ)性，或由
于該互補(bǔ)性形成的雙鏈結(jié)構(gòu)，能夠觸發(fā)RNA干擾。應(yīng)該理解該互補(bǔ)性要 求不受限于RNA干擾機(jī)制，而受限于任何導(dǎo)致分子諸如由靶核酸編碼的 多肽活性下調(diào)或降低的機(jī)制。在一個(gè)實(shí)施方案中，與另一個(gè)核酸分子部分 互補(bǔ)的核酸分子包括1、 2、 3、 4或5個(gè)基于兩個(gè)核酸分子堿基配對(duì)的錯(cuò) 配。更優(yōu)選地，由此形成的雙鏈核酸分子包括19-25個(gè)堿基對(duì)。
典型地，所述第一段序列至少部分地與靶核酸互補(bǔ)或至少部分地與靶 核酸相同，并且，特別是考慮了所述第一和第二段序列之間關(guān)于堿基互補(bǔ) 性方面的關(guān)系時(shí)，所述第二段序列至少部分地與靶核酸相同或至少部分地 與耙核酸互補(bǔ)。所述靶核酸優(yōu)選地是mRNA，盡管其他形式的RNA諸如 hnRNAs也適合于本文所公開的核酸分子的目的。優(yōu)選地用于本文時(shí)，所 述靶標(biāo)是PKN3，且更優(yōu)選地，所述靶核酸是編碼PKN3的DNA或RNA， 或其一部分，條件是該部分仍然優(yōu)選地至少具有全長(zhǎng)PKN3起激酶作用的特征。
盡管依靠利用長(zhǎng)核酸分子，能夠觀察到RNA干擾，較短的RNAi分 子通常是優(yōu)選的，所述長(zhǎng)核酸分子分別包括數(shù)打和有時(shí)甚至數(shù)百個(gè)核苷酸 和核苷酸對(duì)。所述第一段序列和/或第二段序列長(zhǎng)度更優(yōu)選的范圍是約 18-29個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選地，19-25個(gè)連續(xù)的核苷酸，且更優(yōu)選地，19-23 個(gè)連續(xù)的核苷酸。更優(yōu)選地，所述第一段序列和所述第二段序列二者具有 相同的長(zhǎng)度。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，雙鏈結(jié)構(gòu)優(yōu)選地包括16-29，優(yōu)選 地，18-25，更優(yōu)選地，19-23，和最優(yōu)選地，19-21個(gè)堿基對(duì)。
盡管按照本發(fā)明，原則上，編碼PKN3的mRNA的任意部分能夠分別 用于設(shè)計(jì)所述siRNA分子和RNAi分子，本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)從具有 SEQ.ID.NO.核苷酸序列的SEQ.ID.NO. 1的mRNA的核苷酸位置1555, 1556, 1559， 1566,2094, 2286處開始的序列特別適合于由RNA干擾介導(dǎo)分
24子的處理。
更特別地，本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)盡管這些序列和起始點(diǎn)是對(duì)PKN3的表達(dá)抑制特別優(yōu)選的靶序列，但是在這些序列的附近存在核苷酸的中心，所述核苷酸的核心在這種情況下是特別有效的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該核
心是由以上特指的核苷酸序列的最后約9-11個(gè)核苷酸組成的序列。從其開
始，該核心能夠延伸，以獲得具有功能活性的雙鏈核酸分子，其中優(yōu)選地，
具有功能活性意指適合于影響PKN3的表達(dá)抑制。為了該目的，基本上與mRNA的相應(yīng)部分，即核心序列相同的第二段序列因此在5'末端延長(zhǎng)一個(gè)，優(yōu)選地?cái)?shù)個(gè)核苷酸，其中，這樣添加的核苷酸與靶核酸中相應(yīng)位置處存在的核苷酸基本相同。也為了該目的，基本上與靶核酸互補(bǔ)的第一鏈因此在3'末端延長(zhǎng)一個(gè)，優(yōu)選地?cái)?shù)個(gè)核苷酸，其中，這樣添加的核苷酸與靶核酸中相應(yīng)位置處，即5'末端處存在的核苷酸基本互補(bǔ)。
按照該設(shè)」
:發(fā)明的核心序列總結(jié)如下:
PKN3 (2): cuuga鵬c^cyggaea
(SEQ. ID. No, 4)(SEQ. ID. No. 5)
PKN3 (3): uyg^gga￡uyc￡Uggic§a
(SEQ. ID. No, 6)(SEQ. ID. No. 7)
PKN3 (4): a腿c^c鵬a^ugc
(SEQ. ID. No. 8)(SEQ. ID. No. 9)
PKN3 (5): c￡uggiciaMgccMgMcac
(SEQ. ID. No.0)(SEQ. ID. No. 11)
PKN3 (6): g鵬c這CMUMggg^agaic
(SEQ. ID. No. 12)(SEQ. ID. No. 13)
PKN3 (8): cyceagc^a鵬c鵬t^u
(SEQ. ID. No. 16)(SEQ. ID. No. 17)更優(yōu)選地，在該表示法中，每個(gè)雙鏈分子的上鏈?zhǔn)怯辛x鏈，而下鏈?zhǔn)欠戳x鏈，兩條鏈均以5'->3'的方向表示。甚至更優(yōu)選地，在有義鏈中，從
第二個(gè)核苷酸開始，每隔一個(gè)核苷酸在2'位處被優(yōu)選地修飾為2'-O-Me修飾的核苷酸，且在反義鏈中，從第一個(gè)核苷酸開始，每隔一個(gè)核苷酸在2，位處被優(yōu)選地修飾為2'-0-Me修飾的核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，能夠在任何按照本發(fā)明的核酸分子上獲得這種類型的修飾或規(guī)則的或空間的修飾模式。
在其進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述核心序列與按照本發(fā)明的雙鏈核酸分子的第二段序列的核苷酸序列相同，且第-一段序列基本與其互補(bǔ)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的雙鏈核酸分子的長(zhǎng)度受到本文中關(guān)于不同的方面和亞-方面所分別公開的限制。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)，siRNA分子和RNAi分子的具體設(shè)計(jì)分別可以按照當(dāng)前的和未來的設(shè)計(jì)原則而改變。暫時(shí)存在一些設(shè)計(jì)原則，以下會(huì)更加詳細(xì)地討論和公開所述原則，并且將其稱為按照本發(fā)明的核酸分子的亞-方面或第一方面的亞-方面。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，對(duì)于一個(gè)具體的亞方面，即核酸的設(shè)計(jì)所述的所有特征和實(shí)施方案也適合于按照本發(fā)明核酸的任何其他方面和亞-方面，并因此形成其各自的實(shí)施方案。
第一亞-方面涉及按照本發(fā)明的核酸，其中，第一段序列包括許多在2'位置處具有修飾的被修飾核苷酸組，其中，在該序列中，每個(gè)被修飾核苷酸組在一端或兩端都側(cè)鄰側(cè)翼核苷酸的組，其中，形成側(cè)翼核苷酸組的側(cè)翼核苷酸是未修飾的核苷酸或具有與所述被修飾核苷酸的修飾不同的修飾的核苷酸。該設(shè)計(jì)特別記述在國際專利申請(qǐng)WO 2004/015107中。如一些實(shí)施方案中所概述地，盡管按照該方面的核酸優(yōu)選地是核糖核酸，但是，從純化學(xué)的觀點(diǎn)出發(fā)，2'位置處的修飾導(dǎo)致原來的核苷酸不再是核糖核苷酸。然而，在本發(fā)明范圍內(nèi)，應(yīng)該將所述修飾的核糖核苷酸在本文中作為核糖核苷酸看待和處理，并且將含有所述修飾的核糖核苷酸的分子作為核糖核酸看待和處理。
在按照本發(fā)明第一亞-方面的核糖核酸的實(shí)施方案中，所述核糖核酸在雙鏈結(jié)構(gòu)的一側(cè)或兩側(cè)都是平端的。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該雙鏈結(jié)構(gòu)包括或由18-25，優(yōu)選地18-23，和更優(yōu)選地，19、 21或23個(gè)堿基對(duì)組成，
26其中所述雙鏈結(jié)構(gòu)優(yōu)選地是平端的。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸僅由所述第一段序列和所述第二段序列組成。
在按照本發(fā)明第一亞-方面的核糖核酸的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一段序列和/或所述第二段序列包括許多被修飾的核苷酸組。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一段序列還包括許多側(cè)翼核苷酸組。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，許多組意指至少兩組。
在按照本發(fā)明第一亞-方面的核糖核酸的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二段序列包括許多被修飾的核苷酸組。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二段序列還包括許多側(cè)翼核苷酸組。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，許多組意指至少兩個(gè)組。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一和第二段序列包括許多被修飾的核苷酸組和側(cè)翼核苷酸的組。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述許多被修飾的核苷酸組和側(cè)翼核苷酸組在所述第一段序列和/或所述第二段序列上形成一種模式，優(yōu)選地，規(guī)則的和/或重復(fù)的模式，其中更優(yōu)選地，在所述第--和第二段序列上都形成該模式。
在按照本發(fā)明第一亞-方面的核糖核酸的優(yōu)選實(shí)施方案中，被修飾的核苷酸組和/或側(cè)翼核苷酸組包括許多核苷酸，其中該數(shù)量選自包括1個(gè)核苷酸-10個(gè)核苷酸的組。關(guān)于本文中所指定的任意范圍，應(yīng)該理解每個(gè)范圍公開了用于定義該范圍的各個(gè)數(shù)字之間的任意單個(gè)整數(shù)，包括該定義所述范圍的兩個(gè)數(shù)字。在該情形中，所述組因此包括一個(gè)核苷酸、二個(gè)核苷酸、三個(gè)核苷酸、四個(gè)核苷酸、五個(gè)核苷酸、六個(gè)核苷酸、七個(gè)核苷酸、八個(gè)核苷酸、九個(gè)核苷酸和十個(gè)核苷酸。
在按照本發(fā)明第--亞-方面的核糖核酸的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一段序列的被修飾核苷酸的模式與所述第二段序列的被修飾核苷酸的模式相同。
在按照本發(fā)明第一亞-方面的核糖核酸的優(yōu)選實(shí)施方案中，將所述第一
段序列的模式與所述第二段序列的模式進(jìn)行匹配(align)。
在按照本發(fā)明第一亞-方面的核糖核酸的備選實(shí)施方案中，所述第一段
序列的模式相對(duì)于所述第二段序列的模式移動(dòng)了一個(gè)或多個(gè)核苷酸。
在按照本發(fā)明第- -亞-方面的核糖核酸的實(shí)施方案中，位于2，位處的修飾選自包括氨基、氟、甲氧基、烷氧基和烷基的組中。
在按照本發(fā)明第一亞-方面的核糖核酸的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙鏈結(jié)構(gòu)是平端的。
在按照本發(fā)明第一亞-方面的核糖核酸的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙鏈結(jié)構(gòu)在雙鏈結(jié)構(gòu)的兩側(cè)都是平端的。
在按照本發(fā)明第一亞-方面的核糖核酸的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙鏈
結(jié)構(gòu)在雙鏈結(jié)構(gòu)的一個(gè)側(cè)端是平端的，所述側(cè)端是由所述第一鏈的5'末端和所述第二鏈的3'末端定義的。
在按照本發(fā)明第--亞-方面的核糖核酸的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙鏈結(jié)構(gòu)在雙鏈結(jié)構(gòu)的一個(gè)側(cè)端是平端的，所述側(cè)端是由所述第一鏈的3'末端和所述第二鏈的5'末端定義的。
在按照本發(fā)明第一亞-方面的核糖核酸的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩條鏈中的至少一條在5'末端處具有至少一個(gè)核苷酸的突出端。
在按照本發(fā)明第一亞-方面的核糖核酸的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述突出端由至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸組成。
在按照本發(fā)明第一亞-方面的核糖核酸的另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一條所述鏈在3'末端處具有至少一個(gè)核苷酸的突出端。
在第-一亞-方面的核糖核酸的實(shí)施方案中，所述雙鏈結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度是約17-23，和更優(yōu)選地18或19個(gè)堿基或堿基對(duì)。
在第一亞-方面的核糖核酸的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一鏈的長(zhǎng)度和/或所述第二鏈的長(zhǎng)度彼此獨(dú)立地選自包括下列范圍的組中的一種范圍約15-約23個(gè)堿基，17-21個(gè)堿基，和18或19個(gè)堿基或堿基對(duì)，和更優(yōu)選地，19、 21或23個(gè)堿基對(duì)。
在按照本發(fā)明第一亞-方面的核糖核酸的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一鏈和所述靶核酸之間的互補(bǔ)性是完美的。
在按照第一亞-方面的核糖核酸的實(shí)施方案中，在所述第一鏈和所述靶核酸之間形成的雙鏈體(duplex)包括至少15個(gè)核苷酸，其中在形成所述雙鏈結(jié)構(gòu)的所述第-一鏈和靶核酸之間存在一處錯(cuò)配或兩處錯(cuò)配。
在按照第--亞-方面的核糖核酸的實(shí)施方案中，所述第 一鏈和所述第二鏈都包括至少一個(gè)被修飾的核苷酸組和至少一個(gè)側(cè)翼核苷酸組，其中每個(gè)被修飾的核苷酸組包括至少一個(gè)核苷酸，且其中每個(gè)側(cè)翼核苷酸組包括至少一個(gè)核苷酸，其中所述第一鏈的每個(gè)被修飾核苷酸組與所述第二鏈的側(cè)翼核苷酸組進(jìn)行比對(duì)，其中所述第一鏈的最末端的5'核苷酸是被修飾核苷酸組中的核苷酸，且所述第二鏈的最末端的3'核苷酸是側(cè)翼核苷酸組中的核苷酸。
在按照第一亞-方面的核糖核酸的優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)被修飾的核苷酸組由單核苷酸組成，和/或每個(gè)側(cè)翼核苷酸組由單核苷酸組成。
在按照第一亞-方面的核糖核酸的另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一鏈上形成側(cè)翼核苷酸組的核苷酸是未修飾的核苷酸，相對(duì)于形成被修飾核苷酸
組的核苷酸，其以3'方向排列，且其中在所述第二鏈上形成被修飾核苷酸
組的核苷酸是被修飾的核苷酸，相對(duì)于形成側(cè)翼核苷酸組的核苷酸，其以
5'方向排列。
在按照第一亞-方面的核糖核酸的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一鏈包括8-12個(gè)，優(yōu)選地9-13個(gè)被修飾的核苷酸組，且其中所述第二鏈包括7-13個(gè)，優(yōu)選地8-10個(gè)被修飾的核苷酸組。
在本發(fā)明中，以上指定的也分別適用于所述第一和第二鏈。這對(duì)于其中所述鏈僅由所述序列組成的那些實(shí)施方案是特別正確的。
可以將按照該第一亞-方面的核糖核酸分子設(shè)計(jì)為在所述第一鏈處具有游離的5'羥基基團(tuán)，本文中也稱為游離的5'OH-基團(tuán)。游離5'OH-基團(tuán)意指形成所述第一鏈的最末端的核苷酸是存在的且因此未被修飾，特別是沒有由末端修飾而修飾。典型地，所述第二鏈的末端5'-羥基基團(tuán)也分別以未修飾的方式存在。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一鏈和第一段序列的3'末端也分別是未修飾的，例如其中存在游離OH-基團(tuán)，本文中也將其稱為游離3'OH-基團(tuán)，其中5'末端核苷酸的設(shè)計(jì)是前述任意實(shí)施方案之一。優(yōu)選地，所述游離OH-基團(tuán)也分別存在于所述第二鏈和第二段序列的3，末端。在如先前按照本發(fā)明所述的核糖核酸分子的其他實(shí)施方案中，所述第一鏈和第一段序列的3'末端，分別地，和/或所述第二鏈和第二段序列的3'末端，分別地，可以在3'末端具有末端修飾。
當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語游離5'OH-基團(tuán)和3'OH-基團(tuán)還分別表示在形成雙鏈結(jié)構(gòu)的多核苷酸，即分別地，所述核酸或鏈或序列的5末端和3'末端處最末端的核苷酸存在OH-基團(tuán)。所述OH-基團(tuán)可以來自核苷酸的糖部分，更優(yōu)選地，在5'OH-基團(tuán)的情形中來自5'位和域在3'OH-基團(tuán)的情形中來自3，位，或來自附著在各個(gè)末端核苷酸的糖部分上的磷酸酯基團(tuán)。磷酸酯基團(tuán)原則上可以附著于核苷酸糖部分的任意OH-基團(tuán)。優(yōu)選地，在游離5'OH-基團(tuán)的情形中，該磷酸酯基團(tuán)附著于糖部分的5'OH-基團(tuán)，和/或在游離3'OH-基團(tuán)的情形中，其附著于糖部分的3'OH-基團(tuán)，仍然提供在本文稱為游離5'OH-基團(tuán)或3'OH-基團(tuán)的基團(tuán)。
與第一亞-方面的任意實(shí)施方案一起用于本文時(shí)，術(shù)語末端修飾意指向所述第一和/或第二鏈最5'或3'核苷酸添加的化學(xué)實(shí)體。所述末端修飾的實(shí)例包括，但不限于，反向的(脫氧)無堿基(abasic)、氨基、氟、氯、溴、CN、 CF、甲氧基、咪唑、羧酸酯、thioate、 C,一C^低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烷芳基或芳垸基、OCF3、 OCN、 O-、 S-、或N-烷基；O-， S-或N-鏈烯基；SOCH3; S02CH3; ON02; N02， N3;雜環(huán)烷基(heterozydoalkyl);雜環(huán)垸芳基(heterozycloalkaryl);氨基烷基氨基；聚烷基氨基或取代的甲硅烷基，特別如歐洲專利EP 0 586 520 Bl或EP 0 618 925 Bl中所述。
用于本文時(shí)，烷基或任何包括"烷基"的術(shù)語意指包括1-12，優(yōu)選地1-6和更多個(gè)，優(yōu)選地1-2個(gè)C原子的任何碳原子鏈。
另一種末端修飾是生物素基團(tuán)。所述生物素基團(tuán)可以優(yōu)選地附著于所述第一和/或第二鏈的最5'或最3'核苷酸，或附著于兩末端。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物素基團(tuán)與多肽或蛋白質(zhì)偶聯(lián)。所述多肽或蛋白質(zhì)通過任何其他上述末端修飾附著也屬于本發(fā)明的范圍。該多肽或蛋白質(zhì)可以為本發(fā)明的核酸分子賦予進(jìn)一步的特征。其中，該多肽或蛋白質(zhì)可以起到另一種分子的配體的作用。如果所述另一種分子是受體，則該受體的功能和活性可以由結(jié)合配體激活。該受體可以顯示出內(nèi)在化活性，內(nèi)在化活性容許與配體結(jié)合的本發(fā)明核酸分子的有效轉(zhuǎn)染。關(guān)于與本發(fā)明核酸分子偶聯(lián)的配體的實(shí)例是VEGF，且相應(yīng)的受體是VEGF受體。
下表1中顯示了具有不同類型末端修飾的本發(fā)明RNAi的多種可能的實(shí)施方案。
表1:按照本發(fā)明的干擾核糖核酸的多種實(shí)施方案
30第一鏈/第一段序列第二鏈/第二段序列
1. ) 5'-末端
3'國末端
2. ) 5:末端
3'-末端
3. ) 5'-末端
3'-末端
4. ) 5'畫末端
3'-末端
5. ) 5'-末端
3'-末端
6. ) 5'-末端
3'-末端
7. ) 5'-末端
3'-末端
8. ) 5'-末端
3'-末端
游離OH游離OH
游離OH
末端修飾
游離OH游離OH
游離OH
末端修飾
游離()H游離OH
游離OH
末端修飾
游離OH游離OH
游離OH
末端修飾
游離OH游離OH
游離OH
末端修飾
游離OH
上山/,々
禾順修飾
游離OH游離OH
末端修飾游離OH
末端修飾游離OH
末端修飾
末端修飾末端修飾
如本文中所公開的多種末端修飾優(yōu)選地位于核糖核酸的核苷酸的核糖部分。更特別地，該末端修飾可以附著于或替代核糖部分的任意OH-基團(tuán)，包括但不限于2， OH、 3' OH和5' OH位，條件是如此修飾的核苷酸是末端核苷酸。反向無堿基(irwerted abasic)是核苷酸，即脫氧核糖核苷酸或不具有核堿基(nucleobase)部分的核糖核苷酸。這種類型的化合物
31特別記述在(Stemberger等，2002)中。
任何上述末端修飾可以關(guān)于表1中描述的多種RNAi實(shí)施方案使用。 與此相關(guān)地應(yīng)該指出，本文中公開的任何RNAi形式或?qū)嵤┓桨?，RNAi 的有義鏈被失活，優(yōu)選地通過具有末端修飾，更優(yōu)選地在5'末端處具有末 端修飾而失活，是特別有益的。這是由于與這里所述的核糖核酸的第二鏈 相對(duì)應(yīng)的有義鏈的失活，它可能反過來干擾細(xì)胞中的無關(guān)的單鏈RNA。 這樣，更特異性地影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)和更具體的其翻譯模式。該影 響也稱作脫靶(off-target)效應(yīng)。參考表1，作為實(shí)施方案7和8進(jìn)行說明的 那些實(shí)施方案在上述意義上是特別有益的，因?yàn)樵撔揎棇?dǎo)致RNAi (其為 所述第二鏈)的-靶標(biāo)非特異性部分-失活，這樣減少了第二鏈與在細(xì)胞系 統(tǒng)或類似系統(tǒng)中的單鏈RNA的任何非特異性相互作用，在所述系統(tǒng)中， 按照本發(fā)明的RNAi將分別用于擊倒特異性核糖核酸和蛋白質(zhì)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，按照第一亞-方面的核酸在核糖核酸的5，末端處 具有突出端。更特別地，該突出端原則上可以存在于按照本發(fā)明的核糖核 酸的第一鏈和第二鏈之一或二者上。所述突出端的長(zhǎng)度可以是短到1個(gè)核 苷酸，和長(zhǎng)到2-8個(gè)核苷酸，優(yōu)選地，2、 4、 6或8個(gè)核苷酸。5'突出端可 以位于本發(fā)明所述的核糖核酸的第一鏈和/或第二鏈上，也在本發(fā)明的范圍 內(nèi)。形成突出端的核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其延長(zhǎng)部 分。
所述突出端優(yōu)選地包括至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸，其中所述一個(gè)脫氧 核糖核苷酸優(yōu)選地是最5'-末端的那個(gè)。本發(fā)明還包括，本發(fā)明核糖核酸 的各自的反-鏈(counter-strand)的3，-末端不具有突出端，更優(yōu)選地，不 具有脫氧核糖核苷酸突出端。再者，任何本發(fā)明的核糖核酸可以包含關(guān)于 表1中列出的末端修飾方案和/或本文列出的末端修飾。。
考慮該連續(xù)的核苷酸序列，可以在實(shí)施方案中獲得形成該序列的模 式，優(yōu)選地，規(guī)則和/或重復(fù)的核苷酸修飾模式，抑制單核苷酸或通過標(biāo)準(zhǔn) 磷酸二酯鍵或，至少部分地，通過硫代磷酸酯鍵彼此共價(jià)連接的核苷酸組 顯示出這種類型的修飾。如果所述核苷酸或本文中還稱為被修飾的核苷酸 組的核苷酸組不形成所述序列的5'-末端或3'末端，則核苷酸或核苷酸組 緊跟著(follow on)這樣的核苷酸的兩側(cè)，所述這樣的核苷酸不具有前面的核苷酸或核苷酸組的修飾。然而，注意到，這種類型的核苷酸或核苷酸組可以具有不同的修飾。本文中還將這種類型的核苷酸或核苷酸組稱為側(cè)翼核苷酸組。分別地，被修飾的核苷酸和被修飾的核苷酸組，和未修飾的或被區(qū)別性修飾的核苷酸或未修飾的或區(qū)別性修飾的核苷酸組的序列可以重復(fù)一次或數(shù)次。優(yōu)選地，該序列重復(fù)多于一次。為了清楚的原因，以下更加詳細(xì)地討論了該模式，通常參考被修飾的核苷酸組或未修飾的核苷酸組，其中每個(gè)所述組實(shí)際上可以包括少至單個(gè)核苷酸。未修飾的核苷酸用于本文時(shí)，意指在形成各自的核苷酸或核苷酸組的核苷酸處不具有任何上述修飾，或具有分別與被修飾的核苷酸和核苷酸組的修飾不同的修飾。
本發(fā)明還包括未修飾的核苷酸的修飾，其中這樣的未修飾的核苷酸實(shí)際上是以與修飾的核苷酸的修飾不同的方式修飾，所述未修飾的核苷酸的修飾可以與形成所述的未修飾的核苷酸的各種核苷酸或各種側(cè)翼核苷酸組的修飾相同或甚至不同。
修飾的和未修飾的核苷酸的模式可以是這樣的，即所述鏈或所述序列的5'-末端核苷酸起始于修飾的核苷酸組，或起始于未修飾的核苷酸組。然而，在備選的實(shí)施方案中，還可能通過未修飾的核苷酸組形成5，-末端核苷酸。
這種類型的模式可以在干擾RNA的第一段序列或第二段序列之一或二者上實(shí)現(xiàn)。必須注意到，siRNA雙鏈體的耙標(biāo)-互補(bǔ)鏈上的5'磷酸酯對(duì)于siRNA的功能是必需的，這提示細(xì)胞通過游離5，OH (能夠?qū)ζ溥M(jìn)行磷酸化)檢驗(yàn)siRNA的真實(shí)性，并僅容許所述真實(shí)的siRNA指導(dǎo)靶RNA的破壞(Nykanen等，2001)。
優(yōu)選地，所述第一段序列顯示出修飾的和未修飾的核苷酸組，即被修飾的核苷酸組和側(cè)翼核苷酸組的模式類型，而所述第二段序列沒有顯示出這種類型的模式或完全不顯示任何模式。在這種情況下，這可能是有用的，因?yàn)樗龅谝欢涡蛄袑?shí)際上對(duì)于靶標(biāo)-特異性降解過程更重要，所述靶標(biāo)-特異性降解過程解釋了 RNA的干擾現(xiàn)象，因此，為了特異性的原因，可以對(duì)所述第二段序列進(jìn)行化學(xué)修飾，以使其不具有介導(dǎo)RNA干擾的功能。
然而，本發(fā)明還包括，所述第一段序列和第二段序列都具有這種類型的模式。優(yōu)選地，對(duì)于所述第一鏈和所述第二鏈，該修飾和非-修飾模式相在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，形成第二段序列且與第一段序列的核苷酸的修飾組對(duì)應(yīng)的核苷酸組也是被修飾的，而形成第二段序列或第二段序列的未修飾的核苷酸組與形成第一段序列或第一段序列的未修飾的核苷酸的組對(duì)應(yīng)。另外備選的是第一段序列和第一鏈各自的修飾模式相對(duì)于第二段序列和第二鏈各自的修飾模式存在相位移動(dòng)。優(yōu)選地，該移動(dòng)是這樣的，以使第一鏈的修飾的核苷酸的組與第二鏈的未修飾的核苷酸的組對(duì)應(yīng)，且反之亦然。本發(fā)明還包括，修飾模式的相位移動(dòng)不是完整的而是重疊的。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分別位于所述鏈和序列末端處的第二個(gè)核苷酸是未修飾的核苷酸或未修飾核苷酸組的開始。優(yōu)選地，該未修飾的核苷酸
或未修飾的核苷酸組分別位于所述第一和第二鏈的5'-末端，和甚至更優(yōu)選地，第一鏈的5'-末端。在進(jìn)--步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述未修飾的核苷酸或未修飾的核苷酸組分別位于所述第一鏈和第一段序列的5'-末端。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該模式由交替的單個(gè)修飾的和未修飾的核苷酸組成。
在本發(fā)明該方面的進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，干擾核糖核酸對(duì)象包括兩條鏈，其中2'-0-甲基修飾的核苷酸和未修飾的核苷酸，優(yōu)選地是非2'-0-甲基修飾的核苷酸，以交替的方式結(jié)合在兩鏈上，這意味著每隔一個(gè)核苷酸分別是2，-O-甲基修飾的和非-修飾的核苷酸。這意指在所述第一鏈上，一個(gè)2'-0-甲基修飾的核苷酸后面是非-修飾的核苷酸，其又接著是2'-0-甲基修飾的核苷酸，等等。在所述第二鏈上存在相同的2'-0-甲基修飾和非-修飾序列，其中優(yōu)選地存在相位移動(dòng)，這樣在所述第一鏈上的2'-0-甲基修飾的核苷酸與所述第二鏈上的非-修飾的核苷酸堿基配對(duì)，且反之亦然。該特殊安排，即在兩條鏈上的2，-0-甲基修飾的和未修飾的核苷酸的堿基配對(duì)，在短干擾核糖核酸，即短堿基配對(duì)的雙鏈核糖核酸的情形中是特別優(yōu)選的，因?yàn)楸M管本發(fā)明人不希望受到該理論的限制，仍然假定了在兩個(gè)堿基-配對(duì)的2'-0-甲基修飾的核苷酸之間存在某種斥力，這會(huì)使雙鏈體，優(yōu)選地，短雙鏈體不穩(wěn)定。關(guān)于該特殊的安排，優(yōu)選地是如果反義鏈起始自位于5'末端的2'-0-甲基修飾的核苷酸，其中第二個(gè)核苷酸因此是非-修飾的，則第三、第五、第七等核苷酸因此也是2，-0-甲基修飾的，而
34第二、第四、第六、第八等核苷酸是非-修飾的核苷酸。此外，不希望受到任何理論的限制，似乎在不應(yīng)該包含任何修飾的反義鏈的5'末端處的第二個(gè)和任選的第四、第六、第八個(gè)和/或相似位置是特別重要的，而反義鏈的最5'末端核苷酸，即第一個(gè)5'末端核苷酸可以在任何奇數(shù)位存在這樣的修飾，例如反義鏈上第一個(gè)、任選的第三、第五和相似位置可以被修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的和非-修飾的核苷酸各自的修飾和非-修飾分別可以是本文中所述的任一種。在更特定的實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的雙鏈
核酸分子由19、 21或23個(gè)連續(xù)核苷酸的第一鏈和19、 21或23個(gè)連續(xù)核苷酸的第二鏈組成，其中所述第一鏈和所述第二鏈基本彼此互補(bǔ)。此外，在所述更特定的實(shí)施方案中，該雙鏈結(jié)構(gòu)在兩個(gè)末端都是平端的?；九c靶核酸，即編碼PKN3的mRNA互補(bǔ)的第一鏈在5'末端起始于這樣的核苷酸，即，該核苷酸在2'OH基團(tuán)處被甲基化，從而形成2，0-Me基團(tuán)。該第一鏈的每隔一個(gè)核苷酸具有相同的修飾，即在2'OH基團(tuán)處對(duì)其進(jìn)行甲基化。因此，以該方式修飾所述第一鏈的第一、第三、第五等，即任何奇數(shù)核苷酸位置。所述第一鏈偶數(shù)位置處的核苷酸是非-修飾的核苷酸或修飾的核苷酸，其中該修飾與位于所述第一鏈奇數(shù)核苷酸位置處的核苷酸修飾不同。所述第二鏈，其也優(yōu)選地包括19、 21或23個(gè)核苷酸，在第二、第四、第六等，即任何偶數(shù)核苷酸位置處具有被修飾的核苷酸。任何其他核苷酸是非-修飾的核苷酸或修飾的核苷酸，其中該修飾與位于所述第一鏈偶數(shù)核苷酸位置處的核苷酸修飾不同。因此，在以上理解下，所述第二鏈在5'末端起始于非-修飾核苷酸。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一和第二鏈的被修飾核苷酸的修飾是相同的，且所述第一和第二鏈的非-修飾核苷酸的修飾也相同。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義鏈，即所述第一鏈的5'末端具有OH-基團(tuán)，其優(yōu)選地可以在細(xì)胞中，優(yōu)選地，在靶細(xì)胞中，被磷酸化，其中本發(fā)明的核酸分子應(yīng)該是活性的或功能性的，或具有磷酸酯基團(tuán)。優(yōu)選地，還修飾了有義鏈，即所述第二鏈的5，末端，更優(yōu)選地，如本文所公開地修飾。在實(shí)施方案中，3'末端任一或二者都具有末端的磷酸酯。
本發(fā)明包括，通過兩條單獨(dú)的鏈，即所述第一和第二鏈，形成了雙鏈結(jié)構(gòu)。然而，本發(fā)明還包括所述第一鏈和第二鏈彼此共價(jià)連接。該連接可
以發(fā)生在分別形成所述第一鏈和第二鏈的任意核苷酸之間。然而，優(yōu)選地，一個(gè)或兩個(gè)末端。該連接可以通過共價(jià)的或非-共價(jià)的連接形成。共價(jià)連接可以通過以化合物將兩條鏈一次或數(shù)次和在數(shù)個(gè)位置分別地連接形成，所述化合物選自包括亞甲基藍(lán)和雙官能團(tuán)的組。所述雙官能團(tuán)優(yōu)選地選自包括雙(2-氯乙基)胺,N-乙酰基-N，-(對(duì)
-乙醛酰苯甲?；?胱胺,4-硫尿嘧啶和補(bǔ)骨脂素的組。
在按照本發(fā)明任意第一亞-方面的核糖核酸的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一鏈和第二鏈通過環(huán)結(jié)構(gòu)連接。
在按照本發(fā)明第一亞-方面的核糖核酸的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述環(huán)結(jié)構(gòu)包括非-核酸聚合物。
在其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非-核酸聚合物是聚乙二醇。
在按照本發(fā)明任意第一亞-方面的核糖核酸的實(shí)施方案中，所述第一鏈
的5'-末端與所述第二鏈的3'-末端相連接。
在按照本發(fā)明任意方面的核糖核酸的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一鏈的3'-末端與所述第二鏈的5'-末端相連接。
在實(shí)施方案中，所述環(huán)由核酸組成。用于本文時(shí)，認(rèn)為如Elayadi和Corey (Elayadi等，2001); (Omm和Wengel, 2001)所述的LNA;以及PNA是核酸，且還可以作為形成聚合物的環(huán)來使用?；旧希龅谝绘湹?'-末端可以與所述第二鏈的3'-末端相連接。作為備選地，所述第一鏈的3'-末端可以與所述第二鏈的5，-末端相連接。通常不認(rèn)為形成所述環(huán)結(jié)構(gòu)的核苷酸序列是關(guān)鍵的。然而，形成所述環(huán)的核苷酸序列的長(zhǎng)度似乎由于空間排列的原因是關(guān)鍵的。因此，四個(gè)核苷酸的最短長(zhǎng)度似乎適于形成所需要的環(huán)結(jié)構(gòu)。原則上，在待雜交的兩序列或兩條鏈之間形成鉸合部或連接的核苷酸的最大數(shù)量是不受限制的。然而，多核苷酸越長(zhǎng)，二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)越容易形成，并且從而影響需要的序列定向。優(yōu)選地，形成鉸合部的核苷酸最多數(shù)量是約12個(gè)核苷酸。本申請(qǐng)公開的內(nèi)容包括，任意上述設(shè)計(jì)可以分別與在本文中公開的和本領(lǐng)域已知的任意其他設(shè)計(jì)組合，即以能通過環(huán)結(jié)構(gòu)或類似結(jié)構(gòu)產(chǎn)生后折疊(back folding)的方式共價(jià)地連接兩條鏈。
本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)如果該環(huán)位于反義鏈，即按照本發(fā)明的核糖核酸的第一鏈的3，，則這種類型的RNAi的活性比將環(huán)置于反義鏈的5'端更高。因此，分別相對(duì)于反義鏈和有義鏈，即第一鏈和第二鏈的特殊環(huán)排列是至關(guān)重要的，并且因此與如現(xiàn)有技術(shù)中所表達(dá)的理解相反，在現(xiàn)有技術(shù)中認(rèn) 為方向是無關(guān)的。但是，根據(jù)這里所述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這好像是錯(cuò)誤的。現(xiàn) 有技術(shù)中所表達(dá)的理解基于這樣的假設(shè)，即在加工任何RNAi的過程中產(chǎn)
生非環(huán)連接的RNAi。但是，如果這是正確的，就不能解釋清楚地觀察到 的具有位于反義鏈的3'的環(huán)的那些結(jié)構(gòu)的增加的活性。迄今為止，在這種 小的干擾RNAi的5'—3'方向的優(yōu)選排列是第二鏈-環(huán)-第一鏈。可以將各
自的構(gòu)建體引入到合適的載體系統(tǒng)中。優(yōu)選地，所述載體包括用于表達(dá)
RNAi的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，各自的啟動(dòng)子是pol III，且更優(yōu)選地，所述啟 動(dòng)子是如Good等(Good等，1997)中所述的U6、 Hl、 7SK啟動(dòng)子。
本發(fā)明第一方面的第二亞-方面涉及按照本發(fā)明的核酸，其中所述第一 段序列和/或第二段序列在3'末端包括二核苷酸，其中所述二核苷酸優(yōu)選 地是TT。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一段序列/或第二段序列的長(zhǎng)度由 19或21或23個(gè)核苷酸組成，且更優(yōu)選地，雙鏈結(jié)構(gòu)包括18-22個(gè)，和更 優(yōu)選地，19-21個(gè)堿基對(duì)。按照該亞-方面的核酸的設(shè)計(jì)更加詳細(xì)地記述在， 例如國際專利申請(qǐng)WO 01/75164中。
本發(fā)明第一方面的第三亞-方面涉及按照本發(fā)明的核酸，其中所述第一 和/或第二段序列在3'末端包括1-5個(gè)核苷酸的突出端。按照該亞-方面的 核酸的設(shè)計(jì)更加詳細(xì)地記述在國際專利申請(qǐng)WO 02/44321中。更優(yōu)選地，
所述突出端是核糖核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所定義的每條鏈和 更優(yōu)選地每個(gè)序列具有19-25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，其中更優(yōu)選地，所述鏈由 所述序列組成。在優(yōu)選的實(shí)施方案屮，按照本發(fā)明的核酸的雙鏈結(jié)構(gòu)包括 17-25個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選地19-23個(gè)堿基對(duì)，更優(yōu)選地19、 21或23個(gè)堿基對(duì)。
本發(fā)明第一方面的第四亞-方面涉及按照本發(fā)明的核酸，其中所述第一 和/或第二段序列在3'末端包括1-5個(gè)核苷酸的突出端。按照該亞-方面的 核酸的設(shè)計(jì)記述在WO 02/44321中。
在本發(fā)明第--方面的第五亞-方面中，按照本發(fā)明的核酸是雙鏈核酸， 其為化學(xué)合成的雙鏈短干擾核酸(siNA)分子，該分子指導(dǎo)CD31 mRNA 的裂解，優(yōu)選地通過RNA干擾進(jìn)行，其中所述siNA分子的每條鏈?zhǔn)?8-27 或19-29個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，并且所述siNA分子包括至少一個(gè)化學(xué)修飾的
37核苷酸非-核苷酸。按照該亞-方面的核酸的設(shè)計(jì)更加詳細(xì)地記述在國際專
利申請(qǐng)WO 03/070910和英國專利2 397 062中。
在它的--個(gè)實(shí)施方案中，siNA分子不包括核糖核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，siNA分子包括-個(gè)或多個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué) 修飾的核苷酸包括2'-脫氧核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)修飾的核 苷酸包括2'-脫氧-2'-氟核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)修飾的核苷酸 包括2'-0-甲基核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)修飾的核苷酸包括硫 代磷酸酯核苷酸間連接。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述非-核苷酸包括無堿 基部分，其中優(yōu)選地，該無堿基部分包括反向脫氧無堿基部分。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，非-核苷酸包括甘油基部分。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述第一鏈和第二鏈通過連接體分子相連 接。優(yōu)選地，該連接體分子是多核苷酸連接體。備選地，該連接體分子是 非-核苷酸連接體。
在按照第五亞-方面的核酸的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述第二鏈中的嘧啶 核苷酸是2'-0」甲基嘧啶核苷酸。
在按照第五亞-方面的核酸的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述第二鏈中的嘌呤 核苷酸是2'-脫氧嘌呤核苷酸。
在按照第五亞-方面的核酸的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述第二鏈中的嘧啶 核苷酸是2'-脫氧-2'-氟嘧啶核苷酸。
在按照第五亞-方面的核酸的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述第二鏈在5'末 端、3'末端或5'末端和3'末端兩處包括末端帽部分。
在按照第五亞-方面的核酸的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述第一鏈中的嘧啶 核苷酸是2'-脫氧-2'-氟基嘧啶核苷酸。
在按照第五亞-方面的核酸的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述第一鏈中的嘌呤 核苷酸是2'-0-甲基嘌呤核苷酸。
在按照第五亞-方面的核酸的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述第一鏈中的嘌呤 核苷酸是2'-脫氧嘌呤核苷酸。
在按照第五亞-方面的核酸的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述第一鏈在第一鏈 的3'末端處包括硫代磷酸酯核苷酸間連接。
在按照第五亞-方面的核酸的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述第一鏈在第一鏈的3'末端處包括甘油基修飾。
在按照第五亞-方面的核酸的進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述第一和第二鏈的 約19-23個(gè)核苷酸是堿基-配對(duì)的，且其中優(yōu)選地，siNA分子每條鏈的至 少兩個(gè)3'末端核苷酸不與另一條鏈的核苷酸堿基-配對(duì)。優(yōu)選地，siNA分 子每條鏈的這兩個(gè)3'末端核苷酸中的每一個(gè)均是2'-脫氧-嘧啶。更優(yōu)選地， 所述2'-脫氧-嘧啶是2'-脫氧-胸腺嘧啶核苷。
在按照第五亞-方面的核酸的另一個(gè)方面中，所述第一鏈的5，末端包括 磷酸酯基團(tuán)。
在按照本發(fā)明核酸的第五亞-方面的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的 siNA分子在維持介導(dǎo)RNAi能力的同時(shí)，包括被修飾的核苷酸。所述被修 飾的核苷酸能夠用于改善體外或體內(nèi)特征，諸如穩(wěn)定性、活性和/或生物利 用率。例如，本發(fā)明的siNA分子能夠按照siNA分子中存在的總核苷酸數(shù) 量的百分比，包含被修飾的核苷酸。這樣，本發(fā)明的siNA分子通常能夠 包括約5%-約100%的被修飾核苷酸(例如，5%、 10%、 15%、 20%、 25 %、 30 %、 35 %、 40 %、 45 %、 50 %、 55 %、 60 %、 65 %、 70 %、 75 %、 80%、 85%、 90%、 95%或100 %的被修飾的核苷酸)。給定的siNA分 子中存在的被修飾核苷酸的實(shí)際百分比應(yīng)該依賴于siNA中存在的核苷酸 總數(shù)。如果該siNA分子是單鏈的，則修飾百分比能夠基于單鏈siNA分子 中存在的核苷酸總數(shù)。同樣地，如果siNA分子是雙鏈的，則修飾百分比 可以基于有義鏈、反義鏈或有義和反義鏈二者中存在的核苷酸總數(shù)。
在非-限制性實(shí)例中，將化學(xué)-修飾的核苷酸引入到按照本發(fā)明的核酸 第五亞-方面的具體核酸分子中，為克服外源性遞送的天然RNA分子所固 有的體內(nèi)穩(wěn)定性和生物利用率的潛在局限性提供有力工具。例如，對(duì)于指 定的治療效果，使用化學(xué)-修飾的核酸分子可以允許較低劑量的特殊核酸分 子，因?yàn)榛瘜W(xué)-修飾的核酸分子在血清中傾向于具有較長(zhǎng)的半衰期。此外， 某些化學(xué)修飾可以通過耙向特定的細(xì)胞或組織和/或改善核酸分子的細(xì)胞 吸收而改善核酸分子的生物利用率。因此，即使與天然核酸分子相比，例 如，當(dāng)與全-RNA核酸分子相比較時(shí)，化學(xué)-修飾的核酸分子的活性降低了， 但是，修飾的核酸分子的總體活性由于改善的分子穩(wěn)定性和/或遞送，可以 高于天然分子的活性。與天然未修飾的siNA不同，化學(xué)-修飾的siNA還可以在人體中使活化干擾素活性的可能性最小化。
優(yōu)選地，關(guān)于按照本發(fā)明的核酸的第五亞-方面，本發(fā)明siNA分子的 反義鏈，即第一鏈能夠在所述反義區(qū)域的3'-末端處包括硫代磷酸酯核苷 酸間連接。該反義鏈可以在所述反義區(qū)域的5'-末端處包括約1-約5個(gè)硫 代磷酸酯核苷酸間連接。本發(fā)明siNA分子的3'-末端核苷酸突出端可以包 括在核酸糖、堿基或主鏈處化學(xué)-修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。該 3'-末端核苷酸突出端可以包括一個(gè)或多個(gè)通用堿基核糖核苷酸。該3'-末 端核苷酸突出端可以包括一個(gè)或多個(gè)無環(huán)核苷酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)，具體地，本發(fā)明的實(shí)施方案，其包括由核 苷酸構(gòu)成的環(huán)，適合于通過載體使用和表達(dá)。優(yōu)選地，所述載體是表達(dá)載 體。所述表達(dá)載體在任何基因治療方法中特別有效。因此，所述載體可以 用于制備能夠優(yōu)選地用于治療本文所公開的疾病的藥物。然而，本領(lǐng)域技 術(shù)人員還應(yīng)該承認(rèn)，任何按照本發(fā)明的核酸的實(shí)施方案，其包括任何非-天然存在的修飾，不能立即用于在載體和關(guān)于該載體的表達(dá)系統(tǒng)諸如細(xì) 胞、組織、器官和生物體中表達(dá)。然而，在本發(fā)明中，典型地，在通過載 體進(jìn)行核酸表達(dá)后，可以將修飾添加或引入到按照本發(fā)明的載體來源的或 載體表達(dá)的核酸中。特別優(yōu)選的載體是質(zhì)粒載體或病毒載體。例如，對(duì)于 如何在表達(dá)載體中使用siRNA分子和RNAi分子的技術(shù)教導(dǎo)記述在國際專 利申請(qǐng)WO 01/70949中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)，優(yōu)選地，所述載體在 任何治療或診斷方法中有效，其中按照本發(fā)明的核酸的持續(xù)存在分別是理 想和有效的，而按照本發(fā)明的非-載體核酸和具體地按照本發(fā)明化學(xué)修飾或 化學(xué)合成的核酸是特別有效的，其中該分子的短暫存在是理想或有效的。
用于合成本文所述的核酸分子的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的。所述 方法特別記述在(Camthers等，1992)， Thompson等，國際PCT公開號(hào)WO 99/54459, (Wincott等，1995)， (Wincott和Usman, 1997)， Brennan等，1998, 生激皮術(shù),生激—r程(^'ofec/wo/J ,61, 33-45，和Brennan,美國專 利號(hào)6,001,311中。將全部這些參考文獻(xiàn)引入本文作為參考。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及脂質(zhì)體制劑，其包括且更特別地包含一種 或數(shù)種按照本發(fā)明的核酸分子。優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體制劑由定義內(nèi)部體積 的脂質(zhì)組成。所述內(nèi)部體積優(yōu)選地包含本發(fā)明的核酸分子。更優(yōu)選地，所
40述制劑包括脂質(zhì)體，其中在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體包括或包含一 種或數(shù)種陽離子脂質(zhì)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體制劑包含一種 或數(shù)種本發(fā)明的核酸分子，這樣在脂質(zhì)體外表面處或其上不能檢測(cè)到或不 存在所述核酸分子。優(yōu)選地用于本文時(shí)，所述脂質(zhì)體的外表面是與該脂質(zhì) 體周圍環(huán)境相接觸的脂質(zhì)體表面，特別地跟與由該脂質(zhì)體包含的脂質(zhì)相接
觸的脂質(zhì)體表面相反。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，分別通過所述脂質(zhì)體和 脂質(zhì)體制劑或在所述脂質(zhì)體和脂質(zhì)體制劑中包裝或包封按照本發(fā)明的核 酸分子。
本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及脂質(zhì)復(fù)合物，其包括按照本發(fā)明的核酸，其 中所述脂質(zhì)復(fù)合物由--個(gè)和數(shù)個(gè)核酸分子和一個(gè)或數(shù)個(gè)脂質(zhì)體組成。在優(yōu) 選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)復(fù)合物由一個(gè)脂質(zhì)體和數(shù)個(gè)核酸分子組成。
可以將脂質(zhì)復(fù)合物表征如下。按照本發(fā)明的脂質(zhì)復(fù)合物具有約40-55 mV的；-電勢(shì)，優(yōu)選地，約45-50 mV的^-電勢(shì)。如通過動(dòng)態(tài)光散射(QELS)， 諸如例如通過按照供應(yīng)商的建議，利用來自貝克曼庫爾特(Beckman Coulter)的N5超細(xì)顆粒尺寸分析器所確定地，按照本發(fā)明的脂質(zhì)復(fù)合物 為大小約80-200nm，優(yōu)選地，約100-140nm，和更優(yōu)選地，約110nm-130nm。
作為形成按照本發(fā)明的脂質(zhì)復(fù)合物一部分的脂質(zhì)體優(yōu)選地是帶正電
的脂質(zhì)體，其由下列各項(xiàng)組成
a) 約50摩爾％的(3-精氨?；?2,3-二氨基丙酸-N-棕櫚基-N-油基-酰胺 三鹽酸，優(yōu)選地，((3-(L-精氨酰基)J,3-L-二氨基丙酸-7V-棕櫚基-7V-油基-酰 胺三鹽酸；
b) 約48-49摩爾％的1，2-二植烷酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺 (DPhyPE);禾卩
c) 約1-2摩爾％的1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇， 優(yōu)選地，N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙
醇胺鈉鹽。
優(yōu)選地，脂質(zhì)復(fù)合物和形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)組合物包含在載體中。然而， 脂質(zhì)復(fù)合物還可以以凍干的形式存在。載體中包含的脂質(zhì)組合物通常形成 分散體。更優(yōu)選地，如本文中進(jìn)一步表征地，所述載體是水性介質(zhì)或水溶 液。該脂質(zhì)組合物典型地在載體中形成脂質(zhì)體，其中優(yōu)選地，該脂質(zhì)體也在內(nèi)部包含所述載體。
載體中包含的脂質(zhì)組合物和載體分別優(yōu)選地具有約50-600 mosmole/kg，優(yōu)選地，約250 - 350 mosmole/kg，和更優(yōu)選地，約280-320 mosmole/kg的摩爾滲透壓濃度。
優(yōu)選地由第一脂質(zhì)成分和任選地還由第一輔助脂質(zhì)，優(yōu)選地與第一脂 質(zhì)成分結(jié)合形成的脂質(zhì)體優(yōu)選地表現(xiàn)出約20-200 nm，優(yōu)選地，約30-100
nm，和更優(yōu)選地，約40-80 nm的顆粒大小。
此外，應(yīng)該承認(rèn)該顆粒大小符合某種統(tǒng)計(jì)學(xué)分布。
按照本發(fā)明的脂質(zhì)組合物的另一種任選的特性是載體的pH優(yōu)選為約 4.0-6.0。然而，其他pH范圍諸如4.5-8.0，優(yōu)選地約5.5-7.5和更優(yōu)選地約 6.0- 7.0也屬于本發(fā)明的范圍。
為了認(rèn)識(shí)這些特定的特性，進(jìn)行了不同的測(cè)量。對(duì)于調(diào)節(jié)摩爾滲透壓 濃度，例如， 一種糖或多種糖的組合是特別有效的。在該情況下，本發(fā)明 的脂質(zhì)組合物可以包括一種或數(shù)種下列糖蔗糖、海藻糖、葡萄糖、半乳 糖、甘露糖、麥芽糖、乳酮糖、菊粉和棉子糖，其中，蔗糖、海藻糖、菊 粉和棉子糖是特別優(yōu)選的。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，主要通過添加糖來 調(diào)節(jié)的摩爾滲透壓濃度是約300 mosmole/kg，這對(duì)應(yīng)于270 mM的蔗糖溶 液或280 mM的葡萄糖溶液。優(yōu)選地，載體與被施用了所述脂質(zhì)組合物的 體液等滲。用于本文時(shí)，術(shù)語摩爾滲透壓濃度主要通過添加糖來調(diào)節(jié)意指 至少約80%，優(yōu)選地至少約90%的摩爾滲透壓濃度由所述糖或所述糖的組 合提供。
如果本發(fā)明的脂質(zhì)組合物的pH受到調(diào)節(jié)，則這是通過利用本身為本 領(lǐng)域技術(shù)人員基本己知的緩沖物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)選地，使用了堿性物質(zhì)，其 適合于補(bǔ)償陽離子脂質(zhì)和更特別地，陽離子頭部基團(tuán)的銨基團(tuán)的堿性特 征。當(dāng)添加堿性物質(zhì)諸如分別地，堿性氨基酸和弱堿時(shí)，要考慮上述摩爾 滲透壓濃度。優(yōu)選地，所述脂質(zhì)組合物和由所述脂質(zhì)組合物形成的脂質(zhì)體 的顆粒大小是通過動(dòng)態(tài)光散射，諸如通過按照供應(yīng)商的建議，利用來自貝 克曼庫爾特(Beckman Coulter)的N5超細(xì)顆粒大小分析器來確定的。
如果脂質(zhì)組合物包含一個(gè)或數(shù)個(gè)核酸，則該脂質(zhì)組合物通常形成脂質(zhì) 復(fù)合物，即由脂質(zhì)體和核酸組成的復(fù)合物。脂質(zhì)復(fù)合物中總脂質(zhì)含量在優(yōu)
42選地等滲270 mM蔗糖或280 mM葡萄糖中的更優(yōu)選濃度是約0,01-100 mg/ml,優(yōu)選地0.01-40mg/ml和更優(yōu)選地0.01-25mg/ml。應(yīng)該承認(rèn)，典型 地，可以增高該濃度2-3倍，從而制備合理的儲(chǔ)液。本發(fā)明還包括，基于 此，制備了稀釋液，其中典型地將所述稀釋液這樣制備從而使摩爾滲透壓 濃度屬于以上指定的范圍。更優(yōu)選地，在載體中制備稀釋液，所述載體等 同于或在功能和更特別地摩爾滲透壓濃度方面類似于與脂質(zhì)組合物聯(lián)合 使用的或其中包含脂質(zhì)組合物的載體。在本發(fā)明脂質(zhì)組合物的實(shí)施方案 中，其中，所述脂質(zhì)組合物還包括核酸，優(yōu)選地，功能性核酸，諸如但不 限于，siRNA， siRNA在脂質(zhì)組合物中的濃度是約0.2-0.4mg/ml，優(yōu)選地， 0.28mg/ml，且總脂質(zhì)濃度是約1.5-2.7 mg/ml，優(yōu)選地，2.17mg/ml。應(yīng)該 承認(rèn)，核酸級(jí)分和脂質(zhì)組分之間的這種質(zhì)量比是特別優(yōu)選的，由此獲得的 電荷比也如此。與本發(fā)明脂質(zhì)組合物的任何其他濃度或稀釋度相關(guān)，優(yōu)選 地，在該特殊實(shí)施方案中分別獲得的質(zhì)量比和電荷比，無論其濃度或稀釋 度，優(yōu)選地得到維持。
所述用于例如藥物組合物中的濃度可以通過將脂質(zhì)分散到適量介質(zhì)， 優(yōu)選地生理用緩沖液或本文所述的任何載體中獲得，或者可以通過適當(dāng)?shù)?方法濃縮。所述適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ牵?，超濾法，包括交叉流超濾。過濾膜 可以顯示1.000-300.000 Da分子量截?cái)嘀?MWCO)或5 nm-lpm的孔寬 度。特別優(yōu)選的是約10.000-100.000 DaMWCO的孔寬度。本領(lǐng)域技術(shù)人 員還應(yīng)該承認(rèn)，脂質(zhì)組合物，更特別地，按照本發(fā)明的脂質(zhì)復(fù)合物可以以 凍干的形式存在。所述凍千形式典型地適合于延長(zhǎng)脂質(zhì)復(fù)合物的保存期。 特別為了提供適當(dāng)?shù)哪枬B透壓濃度而添加的糖與其聯(lián)合用作低溫-保護(hù) 劑。與其聯(lián)合，還應(yīng)該承認(rèn)，上述摩爾滲透壓濃度、pH以及脂質(zhì)復(fù)合物 濃度的特征指脂質(zhì)組合物在載體中的溶解、混懸或分散形式，其中所述載 體在原則上是本文所述的任何載體，且典型地，是水性載體，諸如水或生 理川緩沖液，優(yōu)選地，等滲緩沖液或等滲溶液。
除這胖具體制劑外，還可以將按照本發(fā)明的核酸分子配制到本領(lǐng)域中 己知的藥物組合物中。
因此，按照本發(fā)明的核酸分子可以優(yōu)選地適合于單獨(dú)地或與其他治療 法結(jié)合作為藥物和診斷法使用。例如，按照本發(fā)明的核酸分子可以包括用于向受試者施用的包括脂質(zhì)體的遞送賦形劑、載體和稀釋劑及它們的鹽， 和/或能夠以藥用制劑的形式存在。用于遞送核酸分子的方法記述在
(Agrawal和Akhtar, 1995; Akhtar和Juliano, 1992), (Maurer等，1999); (Hofland禾卩Huang， 1995);和Lee等，2000, ACS討論會(huì)叢書(ACS Symp. Ser.) ,752, 184-192中，將其全部引入本文作為參考。Beigelman等，美國 專利號(hào)6,395,713和Sullivan等，PCT WO 94/02595進(jìn)一步描述了用于遞送 核酸分子的一般方法。這些方案實(shí)質(zhì)上能夠用于遞送任何核酸分子。還能 夠通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法，其包括，但不僅限于脂質(zhì)體中的 包封，通過離子電滲療法，或通過引入到其他賦形劑，諸如水凝膠、環(huán)糊 精(見例如Gonzalez等,1999)、可生物降解的納米膠囊(nanocapsule)和 生物粘性微球體中，或通過蛋白質(zhì)載體(O，Hare和Normand,國際PCT公 開號(hào)WO 00/53722)，將核酸分子施用到細(xì)胞中。備選地，通過直接注射或 通過使用灌輸泵，局部遞送核酸/賦形劑組合。本發(fā)明核酸分子的直接注射， 無論皮下、肌內(nèi)或皮內(nèi)，可以利用標(biāo)準(zhǔn)針頭和注射器方法，或通過無針頭 的技術(shù)諸如(Corny等，1999)和Barry等，國際PCT公開號(hào)WO 99/31262 中描述的那些來進(jìn)行。本發(fā)明的分子能夠用作藥物試劑。優(yōu)選地，藥物試 劑在受試者中預(yù)防、調(diào)節(jié)疾病狀態(tài)的發(fā)生，或治療(在某種程度上緩解癥 狀，優(yōu)選地全部癥狀)。
因此，本發(fā)明還在可接受的載體，諸如穩(wěn)定劑、緩沖劑等中提供了藥 物組合物，其包括一種或多種按照本發(fā)明的核酸。在有或無穩(wěn)定劑、緩沖 劑等的條件下，能夠通過任何標(biāo)準(zhǔn)方法，在受試者中施用(例如RNA、 DNA或蛋白質(zhì))和引入本發(fā)明的多核苷酸或核酸(分子)，從而形成藥物 組合物。當(dāng)理想地使用脂質(zhì)體遞送機(jī)制時(shí)，可以遵從用于形成脂質(zhì)體的標(biāo) 準(zhǔn)方案。還可以以用于口服施用的片劑、膠囊或酏劑，用于直腸施用的栓 劑，用于注射施用的無菌溶液、混懸液，和其他本領(lǐng)域中已知的組合物形 式，配制并使用本發(fā)明的組合物。
進(jìn)一步提供了按照本發(fā)明核酸分子的藥用制劑。這些制劑包括上述化 合物的鹽，例如酸式加成鹽，例如鹽酸、氫溴酸、乙酸和苯磺酸的鹽。
藥理學(xué)組合物或制劑指處于適合于向細(xì)胞或受試者，包括例如人中施 用，例如全身施用的形式的組合物或制劑。合適的形式，部分地，依賴于
44用途以及進(jìn)入的途徑，例如口服、經(jīng)皮或通過注射。該形式不應(yīng)該阻止所 述組合物或制劑到達(dá)靶細(xì)胞(即，這樣的細(xì)胞，為了向該細(xì)胞遞送，帶負(fù) 電的核酸是理想的)。例如，注射到血流中的藥理學(xué)組合物應(yīng)該是可溶的。 其他因素是本領(lǐng)域中己知的，且包括考慮因素諸如阻止所述組合物或制劑 發(fā)揮其作用的毒性和形式。
所謂"全身施用"優(yōu)選地意指在血流中體內(nèi)全身吸收或累積藥物，隨 后遍及全身分布。引起全身吸收的施用途徑包括，但不限于靜脈內(nèi)、皮 下、腹膜內(nèi)、吸入、口服、肺內(nèi)和肌內(nèi)。這些施用途徑中的每一種都使本 發(fā)明的siNA分子暴露于易受影響的患病組織。已顯示出藥物進(jìn)入循環(huán)的 速率是分子量或尺寸的函數(shù)。使用脂質(zhì)體或其他藥物載體，包括按照本發(fā) 明的核酸，能夠潛在地將藥物局部化，例如，在某些組織類型中，諸如腫 瘤組織中。能夠促進(jìn)藥物與細(xì)胞如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表面結(jié)合的脂質(zhì) 體制劑也是有效的。該方法能夠通過利用異常細(xì)胞，諸如形成腫瘤組織的 細(xì)胞的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞免疫識(shí)別的特異性，提供藥物向靶細(xì)胞增強(qiáng)的 遞送。
"藥用制劑"，優(yōu)選地意指這樣的組合物或制劑，其容許按照本發(fā)明 的核酸分子在最適合于它們理想活性的物理位置中的有效分布。適用于具 有按照本發(fā)明核酸分子的制劑的這樣的試劑的非限制性實(shí)例包括P-糖蛋
白抑制劑(諸如普盧蘭尼克(Pluronic) P85)，其能夠增強(qiáng)藥物進(jìn)入CNS (Joiet-Riant和Tilement,999);可生物降解的聚合物，諸如用于在腦內(nèi) 植入后持續(xù)釋放遞送的聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)微球體(Emerich等，1999) (Alkermes公司，劍橋，MA);和負(fù)載的納米顆粒，諸如由聚丁基氰基丙烯 酸酯構(gòu)成的那些，其能夠遞送藥物穿過血腦屏障并能夠改變神經(jīng)元的吸收 機(jī)制(神經(jīng)心理藥理學(xué)安定生物精神病學(xué)的發(fā)展(Prog Neuropsychopha謹(jǐn)colBiol Psychiatry) ,23,941-949, 1999)。關(guān)于本發(fā)明核 酸分子遞送策略的其他非-限制性實(shí)例包括(Boado等，1998);Tyler等，1999, FEBS通信(FEBS Lett.) ， 421, 280-284; pardridge等，1995,美國PNAS, 92,5592-5596; Boado, 1995,藥物遞送進(jìn)展綜述(Adv. Drug Delivery Rev.), 15,73-107; Aldrian-Herrada等,1998,核酸研究(Nucleic Acids Res.) , 26, 4910-4916;和Tyler等，1999, PNAS美國，96， 7053-7058中所述的材料。
45按照本發(fā)明，還提供了包括表面-修飾的脂質(zhì)體的組合物的用途，所述 脂質(zhì)體包含聚(乙二醇)脂質(zhì)(PEG-修飾的、或長(zhǎng)久-循環(huán)脂質(zhì)體或潛在
的(stealth)脂質(zhì)體)。這些制劑提供用于增加藥物在靶組織中積累的方法。 該藥物載體種類通過單核吞噬系統(tǒng)(MPS或RES)抵抗調(diào)理作用和消除， 從而允許更長(zhǎng)久的血液循環(huán)時(shí)間和對(duì)包封的藥物增強(qiáng)的組織暴露(Lasic 等，化學(xué)綜述(Chem, Rev.) 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata等，化學(xué)和藥理 學(xué)報(bào)告(Chem. Pharm. Bull.) 1995,43,1005-1011)。已經(jīng)顯示出該脂質(zhì)體 選擇性地在腫瘤中積累，推測(cè)是通過新血管形成的靶組織中的外滲和捕獲 實(shí)現(xiàn)的(Lasic等，科學(xué)(Science) 1995, 267, 1275-1276; Oku等，1995， Biochim. Bi叩hys. Acta, 1238， 86-90)。特別與己知在MPS組織中積累的常 規(guī)陽離子脂質(zhì)體相比(Liu等，生物學(xué)和化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 1995,42,24864-24780; Choi等，國際PCT公開號(hào)WO 96/10391; Ansell等, 國際PCT公開號(hào)WO 96/10390; Holland等，國際PCT公開號(hào)WO 96/10392)，長(zhǎng)-循環(huán)脂質(zhì)體增強(qiáng)DNA和RNA的藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)。與 陽離子脂質(zhì)體相比，長(zhǎng)-循環(huán)脂質(zhì)體可能還在較大程度上保護(hù)藥物免受核酸 酶的降解，這基于它們避免在代謝積極的MPS組織，諸如肝和脾中積累 的能力。
而且，提供了為儲(chǔ)存施用而制備的組合物，其包括在藥用載體或稀釋 劑中的藥物有效量的需要的化合物。用于治療用途的可用載體或稀釋劑在 制藥領(lǐng)域是眾所周知的，并且記述在，例如，雷明頓制藥科學(xué)(Remington's Pharmaceutical Sciences),馬克出版公司(Mack Publishing Co.) (A.R. Gennaro版本1985)，據(jù)此引入本文作為參考。例如，能夠提供防腐劑、穩(wěn) 定劑、染料和調(diào)味劑。這些包括苯甲酸鈉、山梨酸和對(duì)羥基苯甲酸的酯。 另外，能夠使用抗氧化劑和懸浮劑。
藥物有效劑量是預(yù)防、抑制發(fā)生，或治療(在某種程度上緩解癥狀， 優(yōu)選地全部癥狀)疾病狀態(tài)所需要的劑量。藥物有效劑量依賴于疾病的類 型、使用的組合物、施用的途徑、被治療的哺乳動(dòng)物類型、考慮的特定哺 乳動(dòng)物的身體特征、同時(shí)進(jìn)行的藥物治療和醫(yī)藥領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí) 到的其他因素。通常，根據(jù)帶負(fù)電荷的聚合物的潛能，施用0.1 mg/kg-100 mg/kg體重/天的活性成分的量?？梢钥诜亍⒕植康?、腸胃外地、通過吸入或噴霧、或直腸地，以劑 型制劑的形式，施用按照本發(fā)明的核酸分子及其制劑，所述劑型制劑包含 常規(guī)非-毒性藥用載體、輔劑和/或賦形劑。用于本文時(shí)，術(shù)語腸胃外的包 括經(jīng)皮的、皮下的、血管內(nèi)的(例如，靜脈內(nèi)的)、肌內(nèi)的或鞘內(nèi)注射或灌 輸技術(shù)等。另外，提供了藥物制劑，其包括本發(fā)明的核酸分子和藥用載體。 一種或多種按照本發(fā)明的核酸分子能夠與一種或多種非-毒性藥用載體和/ 或稀釋劑和/或輔劑，和如果需要，其他活性成分聯(lián)合存在。含有按照本發(fā) 明的核酸分子的藥物組合物能夠處于適合于口服使用的形式，例如，作為 片劑、藥片、錠劑、水性或油性混懸液、可分散的粉末或顆粒、乳劑、硬 或軟膠囊、或糖漿或酏劑形式。
可以按照藥物組合物制備領(lǐng)域中已知的任何方法，制備意欲用于口服 使用的組合物和具體地藥物組合物，并且該組合物可以包含一種或多種所 述甜味劑、調(diào)味劑、著色劑或防腐劑，從而提供在制藥上美觀且可口的制 劑。片劑包含活性成分，其與非-毒性藥用賦形劑混合，所述藥用賦形劑適 合于片劑的制備。這些賦形劑可以是，例如，惰性的稀釋劑；諸如碳酸鈣、 碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；?；捅澜鈩?，例如，玉米淀粉或海藻 酸；粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠，和潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂、硬 脂酸或滑石。片劑可以是未包被的，或者可以通過已知技術(shù)對(duì)它們進(jìn)行包 被。在- 些情形中，所述包衣能夠通過已知技術(shù)制備，從而延遲在胃腸道 中的崩解和吸收，并由此在較長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)提供持續(xù)作用。例如，能夠使用 時(shí)間延遲物質(zhì)，諸如甘油基單硬脂酸酯或甘油基二硬脂酸酯。
用于口服使用的制劑還能夠以硬明膠膠囊的形式存在，其中活性成分 與惰性的固體稀釋劑，例如，碳酸鈣、磷酸鈣或白陶土相混合，或者以軟 明膠膠囊的形式存在，其中活性成分與水或油介質(zhì)，例如花生油、液體石 蠟或橄欖油相混合。 .
水性混懸液含有活性物質(zhì)，其與適合于制備水性混懸液的賦形劑混 合。所述賦形劑是懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、氫丙基甲 基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠；分散或潤(rùn) 濕劑可以是天然-存在的磷脂，例如磷脂酰膽堿，或氧化烯與脂肪酸的縮合 產(chǎn)物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或環(huán)氧乙烷與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，例如十七碳乙烯氧基辛醇，或環(huán)氧乙烷與源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合 產(chǎn)物，諸如聚氧乙烯山梨醇一油酸酯，或環(huán)氧乙烷與具有源自脂肪酸和己 糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物，例如聚乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯。水性混懸 液還可以包含一種或多種防腐劑，例如乙基，或正丙基對(duì)羥基苯甲酸酯， 一種或多種著色劑， 一種或多種調(diào)味劑和一種或多種甜味劑，諸如蔗糖或 糖精。
油性混懸液可以通過將活性成分混懸于植物油，例如花生油、橄欖油、 芝麻油或椰子油，或礦物油諸如液體石蠟中而配制。油性混懸液可以包含 增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇。可以添加甜味劑和調(diào)味劑，從而提 供適口的口服制劑。能夠通過添加抗氧化劑諸如抗壞血酸來保存這些組合 物。
適合于通過添加水而制成水性混懸液的可分散粉末和顆粒提供與分 散或潤(rùn)濕劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑相混合的活性成分。合適的分散 或潤(rùn)濕劑或懸浮劑由上面己經(jīng)提及的那些為例。還可以存在另外的賦形 劑，例如甜味劑、調(diào)味劑和著色劑。
本發(fā)明的藥物組合物還可以處于水包油的乳劑形式。油相可以是植物 油或礦物油或其混合物。合適的乳化劑可以是天然-存在的樹膠，例如阿拉 伯樹膠或黃蓍樹膠，天然-存在的磷脂，例如大豆、磷脂酰膽堿和源自脂肪 酸和己糖醇、酐的酯或偏酯，例如脫水山梨糖醇一油酸酯，和所述偏酯與 環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯。這些乳劑還
糖漿和酏劑可以用甜味劑，例如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗 糖配制。該制劑還可以包含緩和劑、防腐劑、調(diào)味劑和著色劑。藥物組合 物可以處于無菌可注射水性或油質(zhì)混懸液的形式。按照本領(lǐng)域已知的技 術(shù)，利用上文提及的那些合適的分散或潤(rùn)濕劑和懸浮劑，能夠配制該混懸 液。無菌可注射制劑還可以是處于非-毒性母體可接受的稀釋劑或溶劑中的 無菌可注射溶液或混懸液，例如，如在1，3-丁二醇中的溶液?？梢允褂玫?br> 可用賦形劑和溶劑中特別是水、Ringer溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，無 菌不揮發(fā)的油類常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了該目的，可以使用任何溫 和的不揮發(fā)的油類，包括合成的單甘油酯或甘油二酯。另外，脂肪酸諸如油酸在制備注射劑中存在用途。
還可以以栓劑的形式施用本發(fā)明的核酸分子，例如，用于藥物的直腸 施用?？梢酝ㄟ^混合藥物和合適的無刺激性賦形劑來制備這些組合物，所 述賦形劑在常溫下是固態(tài)的，但在直腸溫度下是液態(tài)的，并因此會(huì)在直腸 中融化，從而釋放藥物。這樣的物質(zhì)包括可可脂和聚乙二醇。
可以腸胃外施用處于無菌介質(zhì)中的本發(fā)明的核酸分子。根據(jù)所使用的 賦形劑和濃度，能夠?qū)⑺幬锘鞈一蛉芙庠谫x形劑中。有利地，輔劑諸如局 部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑可以溶解在賦形劑中。
本領(lǐng)域中技術(shù)人員通過常規(guī)試驗(yàn)?zāi)軌蚍謩e確定藥物和藥物組合物的 劑量水平。
應(yīng)該理解，關(guān)于任何具體受試者的特異性劑量水平依賴于多種因素， 包括所使用的具體化合物的活性、年齡、體重、 一般健康狀態(tài)、性別、飲 食、施用時(shí)間、施用途徑和排泄率、，藥物聯(lián)合和經(jīng)歷治療的具體疾病的嚴(yán) 重性。
為了將按照本發(fā)明的藥物施用到非人動(dòng)物，諸如狗、貓、馬、牛、豬、 山羊、綿羊、小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠中，還可以優(yōu)選地將所述組合物添 加到動(dòng)物飼料或飲用水中?？梢苑奖愕嘏渲苿?dòng)物伺料和飲用水組合物，以 使動(dòng)物隨著它的飲食獲得治療合適量的該組合物。該組合物還能夠方便地 作為用于添加到飼料或飲用水中的預(yù)混合物存在。
本發(fā)明的核酸分子還可以與其他治療化合物聯(lián)合施用于受試者，從而 增加總體治療效果。使用多種化合物治療適應(yīng)癥能夠增加有益效果，同時(shí) 降低副作用的出現(xiàn)。
在實(shí)施方案中，所述核酸分子在它們不同的實(shí)施方案、形式和制劑中， 能夠分別與其他治療法諸如化學(xué)療法、冷凍療法、高熱、抗體療法、放射 療法和抗-血管發(fā)生療法一起使用。特別優(yōu)選的治療法是抗-血管發(fā)生療法。
與抗-血管發(fā)生療法聯(lián)合，特別優(yōu)選的靶標(biāo)是VEGF受體和PDGF受體。 典型地，通過利用針對(duì)與血管發(fā)生相關(guān)的靶標(biāo)，諸如VEGF受體和PDGF 受體的抑制劑，實(shí)施抗-血管發(fā)生療法。除小分子外，還能夠產(chǎn)生或提供或 使用其他類型的化合物，其起到針對(duì)所述靶標(biāo)的抑制劑作用。因此可以使 用下列類型的化合物特別如WO 00/44895或WO 01/75164中所述的
49siRNA;特別如US 5,849,902, US 5，989，912中所述的或稱為基因區(qū)組的反 義分子；特別如EP 0 533 838 Bl中所述的適體；特別如WO 98/08856中 所述的spiegelmer;能夠從包括102-1018個(gè)肽的隨機(jī)序列肽庫中識(shí)別出的高 親和性結(jié)合肽，所述102-1018個(gè)肽以一種類似于適體的方式在它們的氨基 酸序列上相區(qū)別，并且因此有時(shí)也被稱為肽適體；特別如DE 197 42 706 中所述的抗促成素；和特別如"抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)"("Antibodies: A Laboratory Manual") , 令H港'I^驗(yàn)^; (Cold Spring Harbor Laboratory ) (Harlow, E.和Lane D.版本)中所述的抗體。
在-一個(gè)實(shí)施方案中，提供了適合于將按照本發(fā)明的核酸分子施用于特 定細(xì)胞類型的組合物，其中該組合物分別典型地引入一種或數(shù)種下列成分 和分子。例如，脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPr)(Wu和Wu, 1987,生激眾學(xué) ^P,志Q CAem.) 262, 4429-4432)對(duì)肝細(xì)胞是獨(dú)特的，且結(jié)合分支的
半乳糖-末端的糖蛋白，諸如脫唾液酸血清類黏蛋白(ASOR)。在另一個(gè)實(shí) 例中，在許多癌細(xì)胞中過表達(dá)葉酸受體。所述糖蛋白、合成的復(fù)合糖或葉 酸與受體的結(jié)合以這樣的親和性發(fā)生，所述親和性強(qiáng)烈依賴于寡糖鏈的分 支程度，例如，三觸角(tria-tennary)結(jié)構(gòu)以比二觸角(biatenarry)或單 觸角(monoatennary)鏈更高的親和性結(jié)合(Baenziger和Fiete， 1980，翁虜 (Ce〃)， 22, 611-620; Connolly等，1982,主激眾^"J^吉(J Ao/. C&m. )' 257, 939-945)。 Lee禾卩Lee, 1987.復(fù)合^"染,志(^G(ycoco"ywgate , 4， 317-328, 通過使用N-乙酰-D-半乳糖胺作為糖部分，獲得了該高特異性，所述N-乙 酰-D-半乳糖胺與半乳糖相比，具有針對(duì)受體的更高的親和性。為了結(jié)合 和吸收甘露糖基-末端的糖蛋白或復(fù)合糖，還描述了"聚集效應(yīng)"(Ponpipom 等，1981,度學(xué)浙眾學(xué)雜,吉"MeJ. CfemJ , 24, 1388-1395)。使用基于半 乳糖、半乳糖胺或葉酸的綴合物運(yùn)送外源化合物穿過細(xì)胞膜能夠提供靶定 的遞送方法，從而例如，治療肝病、肝癌或其他癌癥。使用生物綴合物也 能夠提供治療所需的治療化合物的必需劑量中的減少。此外，能夠通過使 用本發(fā)明的核酸生物綴合物來調(diào)節(jié)治療的生物利用率、藥效學(xué)和藥物動(dòng)力 學(xué)參數(shù)。所述生物綴合物的非限制性實(shí)例記述在Vargeese等，2001年8月 13日提交的USSN 10/201,394;和Matulic-Adamic等，2002年3月6日提 交的USSN 60/362,016中。在它們的不同實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的核酸分子，包含所述核酸分 子的載體、細(xì)胞、藥物、組合物和具體地藥物組合物，按照本發(fā)明的包含 所述核酸分子的組織和動(dòng)物，分別可以用在為了治療以及在診斷和研究領(lǐng) 域中。
由于F列疾病中涉及PKN3在不同組織和血管內(nèi)皮中的分布，按照本 發(fā)明的核酸分子可以用于治療和/或預(yù)防所述疾病，優(yōu)選地，特征為涉及， 優(yōu)選地在病理或患病組織、細(xì)胞，優(yōu)選地PTEN-陰性腫瘤細(xì)胞中的疾病。
因此，如本文所公開的核酸分子和包含它的藥物和藥物組合物可以用 于促-和抗-血管生成的治療，包括由不足量、異?；蜻^量的血管發(fā)生所表 征或引起的疾病。所述疾病包括傳染病、自體免疫病癥、血管畸形、動(dòng)脈 粥樣硬化、移植動(dòng)脈病、肥胖、銀屑病、疣、變應(yīng)性皮炎、玻璃體持續(xù)增 生綜合征、糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、與年齡相關(guān)的黃斑疾病、 脈絡(luò)膜新血管形成、原發(fā)性肺動(dòng)脈高血壓、哮喘、鼻息肉、炎性腸和牙周 疾病、腹水、腹膜粘連、子宮內(nèi)膜異位、子宮出血、卵巢囊腫、卵巢的、 卵巢過度刺激、關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、骨髓炎、骨贅形成和中風(fēng)、潰瘍、動(dòng)脈 粥樣硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
其他疾病是包括或特征為腫瘤組織的那些。優(yōu)選地用于本文時(shí)，術(shù)語 腫瘤組織指由生物體、該生物體的組織或細(xì)胞產(chǎn)生的組織，該組織是不應(yīng) 該產(chǎn)生的，且被認(rèn)為是病態(tài)的，即在不患所述這種疾病的受試者中不存在。 而且，優(yōu)選地用于本文時(shí)，腫瘤疾病是由于腫瘤組織的存在而直接或間接 形成的任意疾病，其中優(yōu)選地，所述腫瘤組織由一種/該組織的異常調(diào)節(jié)或 不受控制的，優(yōu)選地自主生長(zhǎng)而形成。術(shù)語腫瘤疾病優(yōu)選地還包括良性和 惡性腫瘤疾病。更優(yōu)選地，腫瘤疾病選自包括下列任意癌癥的組，例如骨 癌、乳腺癌、前列腺癌、消化系統(tǒng)癌癥、結(jié)腸直腸癌、肝癌、肺癌、腎癌、 泌尿生殖器癌、胰腺癌、垂體癌、睪丸癌、眶癌、頭頸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng) 癌癥、呼吸癌癥。
原則上分別可以利用按照本發(fā)明藥物組合物和藥物，其包括所述脂質(zhì) 組合物和脂質(zhì)復(fù)合物，治療的其他特定疾病可以來自下列列表急性成淋 巴細(xì)胞白血病(成人)，急性成淋巴細(xì)胞白血病(兒童)，急性骨髓白血病 (成人)，急性骨髓白血病(兒童)，腎上腺皮質(zhì)癌，腎上腺皮質(zhì)癌(兒童)，AIDS-相關(guān)的癌癥，AIDS-相關(guān)的淋巴瘤，肛門癌，星形細(xì)胞瘤(兒童)，
小腦星形細(xì)胞瘤(兒童)，大腦星形細(xì)胞瘤，肝外膽管癌，膀胱癌，膀胱 癌(兒童)，骨癌，骨肉瘤/惡性纖維性組織細(xì)胞瘤，腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤(兒 童)，腦瘤(成人)，腦瘤，腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤(兒童)，腦瘤，小腦星形細(xì) 胞瘤(兒童)，腦瘤，大腦星形細(xì)胞瘤/惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(兒童)，腦瘤，室鼓 膜細(xì)胞瘤(兒童)，腦瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤(兒童)，腦瘤，腦幕上初級(jí)神經(jīng)外 胚層瘤(兒童)，腦瘤，視覺通路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤(兒童)，腦瘤(兒童)， 乳腺癌，乳腺癌(兒童)，雄性乳腺癌，支氣管腺瘤/類癌瘤(兒童)，伯基特 淋巴瘤，類癌瘤(兒童)，胃腸的類癌瘤，未知的原發(fā)癌，原發(fā)性中樞神經(jīng)系 統(tǒng)淋巴瘤，小腦星形細(xì)胞瘤(兒童)，大腦星形細(xì)胞瘤/惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(兒 童)，宮頸癌，慢性淋巴細(xì)胞白血病，慢性骨髓性白血病，慢性骨髓增生病
癥，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌(兒童)，皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤，子宮內(nèi)膜癌，室鼓膜
細(xì)胞瘤(兒童)，食道癌，食道癌(兒童)，尤因腫瘤家族，顱外生殖細(xì)胞瘤 (兒童)，性腺外生殖細(xì)胞瘤，肝外膽管癌，眼癌，眼內(nèi)黑素瘤，眼癌，成視 網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，膽囊癌，胃(胃)癌，胃(胃)癌(兒童)，胃腸類癌瘤，顱外 生殖細(xì)胞瘤(兒童)，性腺外生殖細(xì)胞瘤，卵巢生殖細(xì)胞瘤，妊娠絨毛膜上 皮瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤(成人)，腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤(兒童)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，(兒童) 大腦星形細(xì)胞瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，(兒童)視覺通路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤，毛細(xì) 胞白血病，頭頸癌，肝細(xì)胞(肝)癌(成人)(原發(fā)性)，肝細(xì)胞(肝)癌(兒童) (原發(fā)性)，霍奇金淋巴瘤(成人)，霍奇金淋巴瘤(兒童)，下咽癌，下丘腦 和視覺通路神經(jīng)膠質(zhì)瘤(兒童)，眼內(nèi)黑素瘤，島細(xì)胞癌(內(nèi)分泌胰腺)，卡 波西肉瘤，腎(腎細(xì)胞)癌，腎癌(兒童)，喉癌，喉癌(兒童)，急性淋巴細(xì)胞 白血病(成人)，急性淋巴細(xì)胞白血病(兒童)，急性骨髓白血病(成人)，急 性骨髓白血病(兒童)，白血病，慢性淋巴細(xì)胞白血病，慢性骨髓性白血病， 毛細(xì)胞白血病，唇和口腔癌，肝癌(成人)(原發(fā)性)，肝癌(兒童)(原發(fā)性),
肺癌，非-小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞淋巴瘤，AIDS-相關(guān)的淋巴瘤，伯基特淋巴瘤, 皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(成人)，霍奇金淋巴瘤(兒童)，非-霍奇 金淋巴瘤(成人)，非-霍奇金淋巴瘤(兒童)，原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤， 瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥，骨/骨肉瘤的惡性纖維性組織細(xì)胞瘤，成神經(jīng) 管細(xì)胞瘤(兒童)，黑素瘤，眼內(nèi)(眼)黑素瘤，默克爾細(xì)胞癌，惡性間皮瘤
52(成人)，間皮瘤(兒童)，具有隱匿性原發(fā)灶的轉(zhuǎn)移鱗狀頸部癌(Metastatic squamous Neck Cancer with Occult Primary),多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成綜合 征(兒童)，多發(fā)性骨髓瘤/血漿細(xì)胞瘤，蕈樣霉菌病，骨髓發(fā)育不良綜合征, 骨髓發(fā)育不良/骨髓增生疾病，慢性骨髓性白血病，急性骨髓白血病(成 人)，急性骨髓白血病(兒童)，多發(fā)性骨髓瘤，慢性骨髓增生病癥，鼻腔和 鼻竇癌，鼻咽癌，鼻咽癌(兒童)，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，非-霍奇金淋巴瘤(成人), 非-霍奇金淋巴瘤(兒童)，非-小細(xì)胞肺癌，口癌(兒童)，口腔癌，唇和口咽 癌，骨的骨肉瘤/惡性纖維性組織細(xì)胞瘤，卵巢癌(兒童)，卵巢上皮癌，卵 巢生殖細(xì)胞瘤，卵巢低惡性潛力瘤，胰腺癌，胰腺癌(兒童)，島細(xì)胞胰腺 癌，鼻竇和鼻腔癌,甲狀旁腺癌，陰莖癌，嗜鉻細(xì)胞瘤，成松果體細(xì)胞瘤和 腦幕上的初級(jí)神經(jīng)外胚層瘤(兒童)，垂體瘤，血漿細(xì)胞瘤/多發(fā)性骨髓瘤, 胸膜肺母細(xì)胞瘤，妊娠和乳腺癌，妊娠和霍奇金淋巴瘤，妊娠和非-霍奇金 淋巴瘤，原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤，前列腺癌，直腸癌，腎細(xì)胞(腎)癌， 腎細(xì)胞(腎)癌(兒童)，腎盂和輸尿管過渡細(xì)胞癌，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，橫紋 肌肉瘤(兒童)，唾液腺癌，唾液腺癌(兒童)，尤因肉瘤，卡波西肉瘤，軟 組織肉瘤(成人)，軟組織肉瘤(兒童)，子宮肉瘤，賽塞利綜合征，皮膚癌 (非-黑素瘤)，皮膚癌(兒童)，皮膚癌(黑素瘤)，默克爾細(xì)胞皮膚癌，小細(xì) 胞肺癌，小腸癌，軟組織肉瘤(成人)，軟組織肉瘤(兒童)，鱗狀細(xì)胞癌， 具有隱匿性原發(fā)灶的轉(zhuǎn)移鱗狀頸部癌，轉(zhuǎn)移性胃(胃)癌，胃(胃)癌(兒童), 腦幕上初級(jí)神經(jīng)外胚層瘤(兒童)，皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤，睪丸癌，胸腺瘤(兒 童)，胸腺瘤和胸腺癌，甲狀腺癌，甲狀腺癌(兒童)，腎盂和輸尿管過渡細(xì) 胞癌，妊娠絨毛膜上皮瘤，輸尿管和腎盂過渡細(xì)胞癌，尿道癌，子宮內(nèi)膜 子宮癌，子宮肉瘤，陰道癌，視覺通路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤(兒童)，外陰 癌，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥，維爾姆斯瘤。
除了在血管發(fā)生中，更特別地，在抑制負(fù)責(zé)腫瘤血管發(fā)生和腫瘤遷移 的內(nèi)皮細(xì)胞游動(dòng)性中，更特別地，在前列腺癌的情形中涉及PKN3以外(參 考Leenders等，2004, EMBO J. 23 (16):3303-3313 )， PKN3是PI3-激酶通路 的一部分。
PI 3-激酶通路的特征在于隨著生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)而產(chǎn)生的PI 3-激酶活性 和平行信號(hào)傳導(dǎo)通路。生長(zhǎng)因子刺激細(xì)胞導(dǎo)致它們?cè)诩?xì)胞膜上的關(guān)連受體
53的活化，這隨之聯(lián)合并活化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子，諸如PI 3-激酶。PI 3-激酶(由調(diào)節(jié)性p85和催化性p110亞基組成)的活化導(dǎo)致通過磷酸化作
用活化Akt，從而支持細(xì)胞響應(yīng)，諸如增殖，存活或進(jìn)一步向下游遷移。 因此PTEN是這樣的腫瘤抑制基因，它參與磷脂酰肌醇(PI) 3-激酶通路， 并且它在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的作用曾經(jīng)得到了廣泛的研究(關(guān)于綜述 參見，Stein, R.C.和Waterfield， M. D. (2000). PI3-激酶抑制:藥物開發(fā)的 目標(biāo)？ (PI 3-kinase inhibition: a target for drug development )今日分子醫(yī)學(xué) (Mol Med Today) 6, 347-357; Vazquez, R和Sellers, W. R. (2000). PTEN腫 瘤抑制基因蛋白質(zhì)..磷酸肌醇3-激酶信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑(The PTEN tumor suppressor protein: an antagonist of phosphoinositide 3- kinase signaling).生 物化學(xué)和生物物理集(Biochim Biophys Acta) 1470, M21-35; Roymans, D. 和Siegers, H. (2001).腫瘤發(fā)展中的磷脂酰肌醇3-激酶 (Phosphatidylinositiol 3-kinases in tumor progression).歐洲生物化學(xué)雜志 (Eur J Biochem) 268, 487-498)。月中瘤抑制基因PTEM通過逆轉(zhuǎn)PI 3-激酶 -催化的反應(yīng)而起到PI 3-激酶的陰性調(diào)節(jié)子功能，并由此確保通路的活化 以瞬間和受控的方式發(fā)生。PI3-激酶信號(hào)傳導(dǎo)的長(zhǎng)期超活化作用由PTEN 功能性去活化作用引起。PI 3-激酶活化能夠通過添加小分子抑制劑 LY294002而被阻斷。在平行通路中起作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶MEK的活性和 下游響應(yīng)能夠例如受到小分子抑制劑PD98059的抑制。
PI 3-激酶通路通過缺失PTEN功能所引起的長(zhǎng)期活化作用是腫瘤發(fā)生 和轉(zhuǎn)移的主要貢獻(xiàn)者，這說明該腫瘤抑制基因代表關(guān)于受控細(xì)胞增殖的重 要關(guān)卡。PTEN敲除細(xì)胞顯示出與這樣的細(xì)胞相似的特征，在所述細(xì)胞中， 通過PI 3-激酶的活化形式長(zhǎng)期誘導(dǎo)PI 3-激酶通路。(Di Cristofano， A.， Pesce, B., Cordon-Cardo， C.和Pandolfi, P. P. (1998). PTEN是胚胎發(fā)育和腫瘤抑制 的基石出 (PTEN is essential for embryonic development and tumour suppression).自然遺傳學(xué)(Nat Genet) 19, 348-355. Klippel， A., Escobedo, M. A.， Wachowicz, M. S.， Apell, G" Brown, T. W., Giedlin, M. A., Kavanaugh, W.M.和Williams, L.T.( 1998).磷脂酰肌醇3-激酶的活化足以引起細(xì)胞周 期進(jìn)入并促進(jìn)特征為致癌轉(zhuǎn)化的細(xì)胞變化(Activation of phosphatidylinositiol 3-kinase is sufficient for cell cycle entry and promotescellular changes characteristic of oncogenic transformation).分子纟田胞生凈勿 學(xué)(Mol Cell Biol) 18, 5699-5711. Kobayashi， M.， Nagata, S., Iwasaki, T.， Yanagihara, K., Saitoh, I" Karouji, Y., Ihara， S.和Fukui, Y. (1999).由磷脂酰 肌醇3-激酶引起的腺癌去分化(Dedifferentiation of adenocarcinomas by activation of phosphatidylinositiol 3—kinase).美國國家禾斗學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc Natl Acad Sci US A) 96,4874-4879)。
PTEN參與若干通路，所述通路也稱為PTEN相關(guān)通路，諸如 PI3K/PTEN通路、Akt通路、EGF-相關(guān)自分泌環(huán)和mTOR通路。實(shí)際上， PI 3-激酶通路是任何直接或間接地涉及PI 3-激酶的通路。PI 3-激酶可以在 所述通路中起抑制劑或活化劑的作用，或者它可以同樣地受到該通路的其 他元件的調(diào)節(jié)。
存在著充足的描述涉及PI 3-激酶通路的疾病和病癥的現(xiàn)有技術(shù)。因此 在本文中教導(dǎo)了可以由本發(fā)明方法及其設(shè)計(jì)、篩選或制造的藥物和診斷劑 處理的任何這些病癥和疾病。由于舉例說明而非限制的原因，是指下述 子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌、腺癌、子宮內(nèi)膜增 生、Cowden綜合征、遺傳性非-息肉病結(jié)腸直腸癌、Li-Fraumene綜合征、 乳腺-卵巢癌、前列腺癌(Ali， I. U.，國家癌癥研究所雜志(Journal of the National Cancer Institute),巻92, 11期，2000年6月7日，第861 - 863頁)、 Bannayan-Zonana綜合征、LDD(Lhermitte-Duklos綜合征)(Macleod, K.,見 上)錯(cuò)構(gòu)瘤-巨頭疾病包括Cow病(CD)禾口 Bannayan-Ruvalcaba-Rily綜合 征(BRR)、粘膜與皮膚病灶(例如，外毛根鞘瘤)、巨頭、智力遲鈍、胃與 腸錯(cuò)構(gòu)瘤、脂肪瘤、甲狀腺瘤、乳腺纖維囊性疾病、小腦發(fā)育異常神經(jīng)節(jié) 細(xì)胞瘤和乳腺和甲狀腺惡性腫瘤(Vazquez, F., Sellers, W. R.，見上)。
鑒于此，PKN3是PI3-激酶通路中有價(jià)值的下游藥物靶標(biāo)，所述PI3-激酶通路能夠受到這樣的藥物的處理，所述藥物具有比其他作用于PKN3 上游靶標(biāo)的藥物更少的副作用。由于具有對(duì)效應(yīng)子分子的這個(gè)特殊部分， 即蛋白質(zhì)PKN3和參與該通路中的更下游分子的控制，在該信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián) 中僅有非常有限數(shù)量的平行分支或更上游的靶標(biāo)可能引起不希望的作用。 因此，與細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、程序性細(xì)胞死亡、葡萄糖運(yùn)輸、翻譯相 關(guān)的其他PI-3激酶/PTEN通路活性不受影響。而且，不誘導(dǎo)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，這意味著實(shí)際上避免了在連同使用LY294002中觀察到的糖尿病響應(yīng) 或其他副作用。LY294002(2-(4-嗎啉基)8-苯基色酮)是由Lilly研究實(shí)驗(yàn)室 (Indianapolis)作為PI-3K抑制劑所開發(fā)的若干色酮衍生物小分子抑制劑 之一(Vlahos等1994, JBC 269， 5241 - 5248)。其耙向它們的PI-3K分子催 化亞基，p110，并通過與催化中心中結(jié)合的ADP競(jìng)爭(zhēng)而起作用。然而， LY294002不能區(qū)分被暗示具有不同的細(xì)胞功能的不同p110同種型(a、 (3、 Y、 5)。
PKN3也在被瑞帕霉素處理的mTOR的更下游。mTOR (瑞帕霉素的 哺乳動(dòng)物靶標(biāo))，也稱為Raft或FRAP,在PI 3-激酶下游起作用，從而調(diào) 節(jié)諸如依賴于pp70 S6激酶進(jìn)入細(xì)胞周期的過程。mTOR起生長(zhǎng)因子和營 養(yǎng)適用性傳感器作用，從而通過活化pp70 S6激酶和起始因子4E來控制 翻譯。mTOR功能受到細(xì)菌大環(huán)內(nèi)酯瑞帕霉素的抑制，所述細(xì)菌大環(huán)內(nèi)酯 瑞帕霉素阻斷T細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(Kuruvilla和Schreiber 1999, 化學(xué)和生物學(xué)(Chemistry & Biology) 6, R129-R136)。
如例如Yu等所述，瑞帕霉素及其衍生物是目前臨床使用的合適藥物 的事實(shí)證明了藥物靶標(biāo)如果是更有效的，并具有較少的副作用，則它對(duì)特 殊分子機(jī)制更具特異性(Yu， K.等(2001)內(nèi)分泌-相關(guān)癌癥 (Endrocrine-RelatCanc) 8,249)。
PKN3是蛋白激酶C家族的成員，認(rèn)為全部蛋白激酶C家族是蛋白質(zhì) -絲氨酸/蘇氨酸激酶。典型地，這種類型的蛋白激酶包括一個(gè)調(diào)節(jié)性和--個(gè)催化性亞基，并利用鈣離子和磷脂作為輔因子。二?；视推鸬竭@種蛋 白激酶家族活化劑的作用。蛋白激酶C家族的成員參與若干與激素或神經(jīng) 遞質(zhì)相連接的信號(hào)傳導(dǎo)通路。這些蛋白激酶通過磷酸化作用調(diào)節(jié)它們靶蛋 白的活性。本領(lǐng)域中己知蛋白激酶C的非生理延續(xù)活性導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表 型，該表型可能引起癌癥的產(chǎn)生。
數(shù)據(jù)庫中存在作為mRNA的PKN3完整序列，例如以編號(hào)gi 7019488 或NM一013355。利用該遺傳密碼，可以從該mRNA中推斷出該特殊氨基 酸序列。而且，數(shù)據(jù)庫中存在編號(hào)為gi 7019489或NP一037487.1的PKN3 氨基酸序列。
特別在小家鼠(M. musculus)，褐家鼠(Rnorvegicus),擬南芥(A,thaliana),秀麗隱桿線蟲(C. elegans),黑腹果蠅(D. melanogaster)和 釀酒酵母(S.cerevisiae)中可以發(fā)現(xiàn)人PKN3的同系物。針對(duì)先前提及的 不同種類，該比對(duì)區(qū)域的百分比特異性和長(zhǎng)度分別是67 %和279個(gè)氨基 酸，51 %和866個(gè)氨基酸，38 %和305個(gè)氨基酸，36 %和861個(gè)氨基酸，63 % 和296個(gè)氨基酸和44 %和362個(gè)氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)任何這 些或其他同系物應(yīng)該原則上適合于實(shí)踐本發(fā)明，除非利用該同系物生成的 藥物仍然可以與人蛋白激酶NP或任何其他所指的蛋白激酶NP相互作用。
人氨基酸序列還可以獲自ProtEST，編號(hào)pir: JC7083，其中各自的蛋 白激酶N卩稱為JC7083蛋白激酶。來自人蛋白激酶N卩的基因位于人9 號(hào)染色體上。關(guān)于蛋白激酶N(3的cDNA來源通常是許多癌癥和不同胎兒 或胚胎組織，更特別地，特別是胃、腺癌、腦、乳腺、伯基特、淋巴瘤、 宮頸、軟骨肉瘤、結(jié)腸、胎兒眼睛、胎兒晶狀體、胎兒眼睛前段、胎兒視 神經(jīng)、胎兒視網(wǎng)膜、胎兒視網(wǎng)膜凹、胎斑性胎兒脈絡(luò)膜、纖維性卵泡膜細(xì) 胞瘤(fibrotheoma)、生殖系、nead頸、心臟、腎、大細(xì)胞癌、平滑肌肉 瘤轉(zhuǎn)移軟骨肉瘤、卵巢、甲狀旁腺、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤、橫紋肌肉瘤、小 細(xì)胞癌、扁平細(xì)胞癌、睪丸、和子宮。由這個(gè)列表，顯然地，除了如本文 中公開的任何其他疾病和如本文中公開的患病狀態(tài)外，本文中也稱為藥物 的藥物，還可以用于治療和/或預(yù)防任何這些疾病或任何涉及所述特異性細(xì) 胞、組織或器官的疾病。這些疾病和患病狀態(tài)也應(yīng)該包含在術(shù)語"如本文 中所述的疾病"中。
能夠由按照本發(fā)明的核苷酸分子和含有所述核苷酸分子的藥物治療 和/或預(yù)防的如本文中所述的疾病以及如本文中所述的患病狀態(tài)還包括腫 瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。這具體應(yīng)用于如本文中所述的那些疾病和如本文中所述的 那些患病狀態(tài)，其中所述疾病或患病狀態(tài)中涉及的細(xì)胞是PTEN陰性的， 這意味著腫瘤抑制基因PTEN沒有活性，或具有降低的活性水平。所述疾 病還包括通常涉及PI3-激酶通路的那些疾病。除具體的轉(zhuǎn)移瘤外，糖尿病 分別屬于這種類型的疾病和患病狀態(tài)。因此，細(xì)胞，具體地如本文中所述 的疾病或患病狀態(tài)中涉及的和PTEN陰性的那些，易受由這樣的藥物治療 的影響，所述藥物的作用模式是諸如降低或消除各自涉及的細(xì)胞中的 PKN3活性。因此，利用所述藥物能夠方便地治療這樣的患者，所述患者的腫瘤特征為優(yōu)選超活化的PI 3-激酶通路，包括但不僅限于通過增殖或突
變編碼PI 3-激酶通路成分(pllO，Akt)的基因，或是PTEN陰性的，或具有 PTEN陰性細(xì)胞，特別是如果這些在如本文中所述的疾病或如本文中所述 的患病狀態(tài)中有所涉及。所述活性降低可以源自轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平，即 PKN3酶活性的降低。在不希望受限于任何理論的條件下，后一方面，即 修飾PKN3的活性還由PKN3的特征引起，即PKN3的酶活性也可以被上 調(diào)和下調(diào)，更優(yōu)選地，被下調(diào)。
另--組可以利用所述藥物方便治療的患者是患有癌癥的那些，所述癌 癥具有關(guān)于缺失PTEN功能的高發(fā)生頻率，特別是在晚期腫瘤中(Cantley 和Neel, 1999)。 PTEN的缺失與各自腫瘤細(xì)胞增高的積極性和侵入行為相 關(guān)聯(lián)。
應(yīng)該承認(rèn)，本文中所述的可以使用按照本發(fā)明的藥物組合物治療和預(yù) 防的不同疾病也是能夠用本文所述的藥物預(yù)防和/或治療的那些疾病，且反 之亦然。
用于本文時(shí)，術(shù)語疾病的治療還應(yīng)該包括預(yù)防該疾病。 其他特性、實(shí)施方案和優(yōu)點(diǎn)可以來自下列附圖。

圖1是說明PKN3參與PI 3-通路的示意圖。
圖2顯示在人細(xì)胞系(HeLa, HUVEC)和小鼠細(xì)胞系(EOMA)中利用 PKN3特異性siRNA進(jìn)行的擊倒試驗(yàn)的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。
圖3顯示利用配制為脂質(zhì)復(fù)合物的不同濃度PKN3特異性siRNA分子 進(jìn)行的擊倒試驗(yàn)結(jié)果，以確定HeLa和HUVEC細(xì)胞中siRNA的IC50。
圖4顯示利用PKN3特異性siRNA分子和作為對(duì)照的PKN3特異性反 義分子的擊倒試驗(yàn)的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果，其中在不同時(shí)間點(diǎn)評(píng)估所述分 子在抑制力方面的功效。
.圖5顯示擊倒試驗(yàn)的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果，其中使用了不同濃度的 PKN3特異性siRNA脂質(zhì)復(fù)合物，其在3'末端表現(xiàn)或不表現(xiàn)出磷酸酯基團(tuán)。
圖6顯示利用不同PKN3特異性siRNA分子(圖6A)的擊倒試驗(yàn)的 蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果和說明細(xì)胞外基質(zhì)上失去對(duì)HUVEC生長(zhǎng)的PKN3功 能的顯微照片(圖6B)。
圖7說明了在s. c. PC-3異種移植腫瘤小鼠模型中，用于測(cè)試PKN3
58特異性siRNA分子體內(nèi)功效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(圖7A)和該分子對(duì)腫瘤體積(圖 7B)和體重(圖7C)的影響。
圖8說明了在s. c. PC-3異種移植腫瘤小鼠模型中，用于測(cè)試PKN3 特異性siRNA分子體內(nèi)功效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(圖8A)和以體重或腫瘤體積的 百分比表示的不同劑量的所述siRNA分子的效果(圖8B)，和利用以體重 或腫瘤體積百分比表示的所述分子的不同治療時(shí)間表的效果(圖8C)。
圖9說明前列腺內(nèi)PC-3異種移植腫瘤小鼠模型中，用于測(cè)試PKN3 特異性siRNA分子體內(nèi)功效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(圖9A)，所述分子對(duì)前列腺腫瘤 體積和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的影響(圖9B)和所述分子對(duì)肺組織中PKN-3和Tie2 mRNA減少的影響(圖9C)。
圖10說明前列腺內(nèi)PC-3異種移植腫瘤小鼠模型中，用于測(cè)試?yán)萌?身性施用的特異性siRNA分子的不同治療方案的體內(nèi)功效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(圖 IOA)，和所述不同治療方案對(duì)前列腺腫瘤體積(圖10B)和對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 瘤體積(圖10C)的影響。
圖11用于測(cè)試全身性施用的不同劑量PKN3特異性siRNA分子的體 內(nèi)功效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(圖IIA)，和所述不同劑量對(duì)前列腺腫瘤體積(圖11B) 和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤體積(圖11C)的影響。
圖12A顯示形成脂質(zhì)復(fù)合物的化合物。
圖12B顯示按照本發(fā)明的脂質(zhì)復(fù)合物與脂質(zhì)體相比較的結(jié)構(gòu)示意性圖解。
圖13顯示利用具有19個(gè)堿基對(duì)或23個(gè)堿基對(duì)的PKN3特異性siRNA
分子的擊倒試驗(yàn)的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。
圖14顯示利用不同PKN3特異性siRNA分子的擊倒試驗(yàn)的蛋白質(zhì)印
跡分析結(jié)果。
圖15顯示在三個(gè)不同細(xì)胞系中，利用具有19個(gè)堿基對(duì)或23個(gè)堿基 對(duì)的siRNA分子的擊倒試驗(yàn)的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果，其中以不同濃度使用 所述siRNA分子。
圖16顯示在同位前列腺癌小鼠模型中，用于測(cè)試PKN3特異性siRNA 分子體內(nèi)功效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(圖16A)和所述具有19個(gè)堿基對(duì)或23個(gè)堿基 對(duì)的PKN3特異性siRNA分子對(duì)前列腺腫瘤體積(圖16B)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤體積(圖16C)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤擴(kuò)散(圖16D).減少的影響。
圖17顯示在同位前列腺癌小鼠模型中，用于測(cè)試不同劑量的包括23 個(gè)堿基對(duì)的PKN3特異性siRNA分子的體內(nèi)功效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(圖17A)和 所述不同劑量對(duì)前列腺腫瘤體積(圖17B)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤體積(圖17C) 和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤擴(kuò)散(圖17D)減少的影響。
實(shí)施例l:材料和方法
體外轉(zhuǎn)染和免疫印跡；抗體
利用上述陽離子脂質(zhì)體，用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。簡(jiǎn)要地，細(xì)胞播種后 約12小時(shí)，向細(xì)胞中加入不同量的siRNA-脂質(zhì)復(fù)合物溶液，所述siRNA-脂質(zhì)復(fù)合物溶液是被稀釋在含有10%血清的培養(yǎng)基中的，以獲得在1-50 nMsiRNA范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)染濃度。轉(zhuǎn)染后(48小時(shí))，如上所述地溶解細(xì)胞， 并對(duì)其進(jìn)行免疫印跡(Klippel等，1998)。利用DC蛋白質(zhì)測(cè)定(BioRad)確定 蛋白質(zhì)濃度，并且等量加載，以進(jìn)行利用下列抗體的免疫印跡分析兔抗 -PTEN(Ab-2, Neomarkers)、 Akt-l 、兔抗-PKN3 (Leenders等，2004)。
細(xì)胞系
按照ATCC建議培養(yǎng)PC-2、 HeLa、 HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)、和 EOMA細(xì)胞系。
腫瘤異種移植
在該研究中使用雄性Hsd:NMRI-nu/nu小鼠(8周齡)。為了對(duì)定植腫 瘤異種移植物進(jìn)行腫瘤治療試驗(yàn)，皮下植入總量5.0 x 106個(gè)腫瘤細(xì)胞 /100plPBS。利用測(cè)徑器確定，并按照公式體積=(長(zhǎng)x寬2) /2計(jì)算腫瘤 體積。對(duì)于腫瘤治療試驗(yàn)，通過低壓、小體積尾靜脈注射，靜脈內(nèi)(i.v.) 施用siRNA-脂質(zhì)復(fù)合物溶液。在同位腫瘤模型中，在全身麻醉?xiàng)l件下， 將2.0 x 106個(gè)PC-3細(xì)胞/30jil PBS注射到前列腺的左背外側(cè)葉中 (Stephenson等，1992)。手術(shù)后50天時(shí)殺死動(dòng)物，并如上所述地確定腫瘤 (前列腺)體積和區(qū)域性轉(zhuǎn)移瘤(尾部、腰部和腎淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤)。
對(duì)于靜脈內(nèi)治療，通過經(jīng)由單次尾靜脈注射200)al溶液，靜脈內(nèi)施用siRNA脂質(zhì)復(fù)合物，執(zhí)行siRNA-脂質(zhì)復(fù)合物，所述注射以1.88mg/kg siRNA 和14.5mg/kg脂質(zhì)作為最終劑量或關(guān)于不同劑量的不同時(shí)間表(如所示)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
將數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值士 s.e.m。通過Mann-Whitney "檢驗(yàn)確定差別的 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。認(rèn)為尸值<0.05是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
Matrigel觀'J定
為了測(cè)定細(xì)胞在Matrigd基質(zhì)上的生長(zhǎng)，用siRNA轉(zhuǎn)染HUVEC 48 小時(shí)。胰蛋白酶化后，將細(xì)胞一式兩份地接種到經(jīng)250 pi Matrigel底膜基 質(zhì)預(yù)-包被的24-孔板(110，000個(gè)細(xì)胞/孔)上，并在重新涂布后20小時(shí)，利 用安裝在Axiovert S100顯微鏡上的Axiocam相機(jī)，以xl.25或x2.5放大
倍數(shù)，獲得顯微照片。
實(shí)施例2: PKN3siRNA分子
按照本發(fā)明的分子，其在本文中也稱為siRNA分子(AtuRNAi，見表 la和lb.)并用在本研究中，如在(Czaudema等,2003)中描述，并由BioSpring (Frankfurt a. M.,德國)合成。
所述分子的雙鏈體由各自有義和反義鏈形成，其各自以5'->3'的方向 顯示在表la和lb中。因此，通過組合各自的有義和反義鏈而形成雙鏈分 子，例如形成具有雙鏈結(jié)構(gòu)分子的PKN3-hm-ls和PKN3-hm-las，其在具 體實(shí)施例中也稱為PKN3 (1)。所述分子是平端的，然而，形成雙鏈分子 的每條鏈具有與3，-末端，更具體地與末端3，0H末端相連的磷酸酯。通過 交換兩條鏈上的2，-0-甲基糖修飾來化學(xué)穩(wěn)定所述分子，其中未修飾的核 苷酸面對(duì)對(duì)面鏈上修飾的核苷酸，正如也從表la獲得地。這些雙鏈分子 是按照本發(fā)明核酸分子的特別優(yōu)選實(shí)施方案。
表la:
PKN3 (I): s agcygiagaMc^agg絲gg(SEQ, ID. No. 2) as ￡C￡u&c;yugaiiqju￡agcy;(SEQ. ID. No. 3)
61PKN3 (2): s cyugaggacuuccuggaga(SEQ. ID. No. 4) as yg^aggiagu^c與(SEQ. ID. No. 5)
PKN3 (3): s uyg§gga￡UMC￡Ugg^cga as uugugc絲ga^gycgj與
(SEQ. ID. No. 6) (SEQ, ID. No. 7)
PKN3 (4): s agggc—yuccuggacaaugc as gc§uygyc￡agg^agu￡ca
(SEQ. ID. No. 8) (SEQ. ID, No. 9)
PKN3 (5): s c￡ugg§c§aygcci|gyc§c as guga￡agg￡ayugu￡c§gg
(SEQ, ID. No. 10) (SEQ. ID. No. 11)
PKN3 (6): s ggggcgcu即ggggaggjjc as ga￡cyu￡C￡a§agugu￡C￡
(SEQ. ID. No. 12) (SEQ. ID. No. 13)
PKN3 (7): s uyggggaggMCsu^c巡gu
as accag辟ggaccuugcgag
PKN3 (8): s cycqagccaugqc鵬uau
as gagggagggayiggc鵬ag
(SEQ. ID. No. 14) (SEQ. ID. No. 15)
(SEQ. ID. No. 16) (SEQ. ID. No. 17)
PKN3 (9): s
3S
auucagaagcuccuccaga
(SEQ. ID. No. 18) (SEQ. ID. No. 19)
PKN3 (10): s as
uqaga^gcugqjCQagagg cuucyiggaggagcuijcuga
(SEQ. ID. No. 20) (SEQ. ID. No. 21)
PKN3(11): s cag站gci4ccupcag鴨u as qcuuguggaggagcyuf ug
(SEQ. ID. No. 22) (SEQ. ID. No. 23)
PKN3 (12): s U￡uyc§gga￡c§C￡a^cyg as caguugguggycqugaaga
(SEQ. ID. No. 24) (SEQ. ID. No. 25)PKN3 (13):s c鵬a鵬ceaeciacugg (SEQ. ID. No. 26)
as ￡c^gMuggMggu￡c^g^ag(SEQ. ID. No. 27)
PKN3(〗4): s 1^agg^aec^agu鵬a (SEQ. ID. No. 2g)
as Mg2CggMUgggggugc鵬(SEQ. ID. No. 29)
在具有2'-O-甲基修飾的核苷酸下劃線；由該劃線部分證明了每隔一 個(gè)核苷酸具有這種類型的修飾，其中所述修飾起始自反義鏈上的第一個(gè)核 苷酸，和有義鏈上的第二個(gè)核苷酸(處于這樣的附加條件下，即從左向右，
以5' - 3'描述有義鏈和反義鏈)。
S鏈代表有義鏈，其在本文中也稱為第二鏈；且as鏈代表反義鏈，其 在本文中也稱為第一鏈，其中所述第一鏈包括第一連續(xù)核苷酸序列，且所 述第一段序列至少部分地與靶核酸互補(bǔ)，其中所述耙核酸，用于本文時(shí)， 優(yōu)選地是待降解或destilized的核酸。
這些分子在本文中也稱為PKN3特異性siRNA，并在兩種人細(xì)胞系， 即HeLa、 HUVEC，和-"種小鼠細(xì)胞系(EOMA)中對(duì)其進(jìn)行了篩選。如實(shí) 施例1中所述，轉(zhuǎn)染了 20 nM siRNA，并在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，由全細(xì)胞溶 解物進(jìn)行免疫印跡。將結(jié)果顯示在圖2中。如可以獲自圖2地，特別優(yōu)選 的是核酸分子KN3 (2)、 PKN3 (3)、 PKN3 (4)、 PKN3 (5)、 PKN3 (6)、 PKN3 (8)。
甚至更優(yōu)選的分子是PKN3(3)，將其用于進(jìn)一步的研究中。 基于PKN3(3)，設(shè)計(jì)了其他siRNA分子，將其顯示在下表lb中，并 將由PKN3-hm-3A23vl和PKN3-hm-3B23vl分子，即單鏈組成的分子注釋 為PKN3-23-vl，將由PKN3-hm-3A23v2禾P PKN3-hm-3B23v2分子，即單 鏈組成的分子注釋為PKN3-23-v2 ， 將由PKN3-hm-3A23v3和 PKN3-hm-3B23v3分子，即單鏈組成的分子注釋為PKN3-23-v3，將由 PKN3-hm-3A23v4禾卩PKN3-hm-3B23v4分子，即單鏈組成的分子注釋為 PKN3-23-v4，并將由PKN3-hm-3A23v5禾卩PKN3-hm-3B23v5分子，即單 鏈組成的分子注釋為PKN3-23-v5。
表示和設(shè)計(jì)這些siRNA分子的方式與對(duì)表la中包含的siRNA分子所 描述的相同。如可以獲自表lb，起始自PKN3 (3)，在表lb中稱為PKN3-hm-3A19/PKN3-hm-3B19，在有義鏈3'末端和反義鏈5'末端加入總 數(shù)4個(gè)核苷酸(PKN3-23-vl)，在有義鏈5'末端加入總數(shù)4個(gè)核苷酸并在反 義鏈3'末端加入總數(shù)4個(gè)核苷酸(PKN3-23-v2)，在有義鏈5'末端加入1個(gè) 核苷酸和3'末端加入3個(gè)核苷酸并在反義鏈5'末端加入3個(gè)核苷酸和在3' 末端加入1個(gè)核苷酸(PKN3-23-v3)，在有義鏈5'末端加入2個(gè)核苷酸和3' 末端加入2個(gè)核苷酸并在反義鏈5'末端加入2個(gè)核苷酸和在3'末端加入2 個(gè)核苷酸(PKN3-23-v4)，和在有義鏈5'末端加入3個(gè)核苷酸和3'末端加入 1個(gè)核苷酸并在反義鏈5'末端加入1個(gè)核苷酸和在3'末端加入3個(gè)核苷酸 (PKN3-23-v5)。在表lb中以斜體顯示新加入的核苷酸。
表lb
PKN3 (3)
PKN3-hm-3B19 PKN3-hm-3A19
PKN3-23-vl
PKN3-hm-3A23vl PKN3-hm-3B23vl
PKN3-23-v2
PKN3-hm-3A23v2 PKN3-hm-3B23v2
PKN3-23-v3
PKN3-hm-3A23v3 PKN3-hm-3B23v3
s uugaggacuuccuggacaa as gugu￡cggga§g^C￡U￡a^
(SEQ. ID. No. 6) (SEQ. ID. No. 7)
as s
Bugu￡C5gga§g^C￡U^a§^￡C|￡ (SEQ. ID. No. 31) aga￡U^g^ggasugcsugg§c§a (SEQ. ID. No. 30)
as g^ayugugc^ga^giicsuga^ (SEQ. ID. No. 33) s u]ig^ggaguucsugg^cga巡ecr (SEQ. ID. No. 32)
as ^uygycgagg^agi^cgc^agwe (S￡Q. ID. No. 35) s gacuugaggacuucciaggacaazj (SEQ. ID. No. 34)
64PKN3-23-v4
PKN3-hm-3A23v4 as ￡a]iiugu￡c^ga§gyc￡uea§g^ (SEQ. ID. No. 37) PKN3-hm-3B23v4s ?！陁;yg^gai￡v^ccugg§c§a^ (SEQ. ID. No. 36)
PKN3-23匿v5
PKN3-hm-3A23v5 as gc^ujygMC^agg^aguecycgag (SEQ. ID. No. 39) PKN3-hm-3B23v5 s cM，gg§，￡CMgga￡a§wgc (SEQ. ID. No. 38) 檢測(cè)表lb的siRNA分子的擊倒功效，并與具有19個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的 PKN3特異性siRNA之-一，更具體地與PKN3(3)相比較。為了該目的，將 HeLa B細(xì)胞涂布在6個(gè)孔中(40k)， 16小時(shí)后用20nM轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染 后48小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞溶解以獲得細(xì)胞提取物。如果沒有明確指出是相反的， 則連同這些siRNA分子使用的技術(shù)和程序是本文中在實(shí)施例部分和更明 確地在實(shí)施例1中所述的那些。
圖13中描述了用抗-PKN3抗體和抗-PTEN抗體探測(cè)的細(xì)胞溶解物的 蛋白質(zhì)印跡，后者起加載對(duì)照的作用。如可以獲自圖13地，PKN3-23-vl 是特別有效的，在功效方面，其次是PKN3-23-v4、PKN3-23-v5、PKN3-23-v2 和PKN3-23-v3。使用包含作為有義鏈Luc-siRNA-2B (cgu§cgcgg§aua^^cga: SEQ.ID.No 56)禾卩作為反義f連 Luc-siRNA-2A (Licga這gyagi^cgcgu旦cg， SEQ.ID.No 57)的螢光素酶特異性siRNA分子作為對(duì)照(KO)。
篩選了其他潛在的siRNA分子，將其描述在表2中，其中表達(dá)和修飾 的方式與對(duì)上表la和lb中所示的siRNA分子所述的相同。
表2
名稱 PKN3-23-19
PKN3-23-hmr-19A as PKN3-23-hmr-19B s
PKN3-23-20
PKN3-23-hmr-20A as PKN3-23-hmr-20B s
序列
gagu迎guggycgjg鄉(xiāng)^a腿g (SEQ. ID. No. 41)
C￡ayu￡u;yc^ga￡C5c^cyg (SEQ. ID. No. 40)
ygcc—aguuggugguccugaagaa (SEQ. ID. No. 43)
u^|C]^u￡agg^csa￡C5a￡ugg￡a (SEQ. ID. No. 42)
PKN3-23-21PKN3-23-hmr-21Aas(SEQ.ID.No.45)
PKN3-23-hmr-21Bs(SEQ.ID.No.44)
PKN3-23-22
PKN3-23-hmr-22Aasgcqaggaggaccyugcgagagug(SEQ.ID-No.47)
PKN3-23-hmr-22Bscacuuugggaagguccuccuggu(SEQ.ID.No.46)
PKN3-23-23
PKN3-23-hmr-23Aas(SEQ.ID.No.49)
PKN3-23-hmr-23Bs(SEQ.ID.No.48)
PKN3-23-24
PKN3-23-hmr-24Agg￡UHcsii￡uscyiigggggugcs(SEQ.ID-No.51)
PKN3-23-hmr-24Bs(SEQ.ID.No.50)
P副-23-25
PKN3-23-hmr-25Aas§gga￡cyii￡C￡a§agugu￡C￡Cg(SEQ.ID.No.53)
PKN3-23-hmr-25Bs(SEQ.ID.No.52)
PKN3-23-26
PKN3-23-hmr-26Aasgg￡ugciic￡agg￡ggcgg^ugg^(SEQ.ID.No.55)
PKN3-23-hmr-26Bsu￡caa￡cgc￡g￡cyggagc§g￡u(SEQ.ID.No.54)
在如上所述的HUVEC細(xì)胞中的初歩篩選中篩選出表2中所述的這些 siRNA分子。將細(xì)胞涂布在6個(gè)孔中(40k)， 16小時(shí)后用20nM siRNA和 l嗎/ml AtuFECTOl轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞溶解以獲得蛋白提
66取物。圖14中描述了用抗-PKN3和抗-PTEN探測(cè)的細(xì)胞溶解物的蛋白質(zhì) 印跡，后者起加載對(duì)照的作用，其中ut代表未處理的；Luci代表如上定 義的蛋白螢光素酶siRNA;且co3是
PKN3-23-vl
PKM3國hm-3A23vl as uugi^c鵬a5gyc^a郷cji PKN3-hm-3B23vls agaeuiigagga^csugggc^a
如果沒有明確指出是相反的，則連同這些siRNA分子使用的技術(shù)和程 序是本文中在實(shí)施例部分和更明確地在實(shí)施例中所述的那些。
實(shí)施例3: PKN3特異性siRNA分子的脂質(zhì)復(fù)合物制劑
基本如Santel所述地制備脂質(zhì)復(fù)合物制劑(Santd等2006)。 通過在300mM無菌無RNA酶蔗糖溶液中再水合脂質(zhì)膜，以摩爾比 50/49/1，混合陽離子脂質(zhì)AtuFECTOl ((3-丄-精氨?；?2,3-丄-二氨基丙酸-7V-棕櫚基-vV-油基-酰胺三鹽酸，Atugen AG)、中性磷脂1，2-二植烷酰-sn-甘油 基-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE) (Avanti極性脂質(zhì)公司(Avanti Polar Lipids Inc.)， Alabaster, AL)和PEG化的脂質(zhì)N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-l,2-二硬脂 酰-sn-甘油基-3-磷酸-乙醇胺鈉鹽(DSPE-PEG) (Lipoid GmbH,路德維希 港(Ludwigshafen),德國)，從而獲得總脂質(zhì)濃度4.34 mg/ml。如果沒有明確 指出是相反的，則典型地，對(duì)30g小鼠的單次靜脈內(nèi)注射以標(biāo)準(zhǔn)劑量1.88 mg/kg siRNA和W.5mg/kg脂質(zhì)進(jìn)行。而且，如果沒有明確指出是相反的， 則PKN3特異性siRNA分子是實(shí)施例2中定義的PKN3 (3)分子。圖12A 中描述了形成按照本發(fā)明脂質(zhì)復(fù)合物的不同化合物，包括PKN3(3)，由此 應(yīng)該理解特異性siRNA分子原則上可以是本文中公開的任何siRNA分子， 優(yōu)選地，如表la和lb中所示的任何siRNA分子。
圖12B顯示siRNA脂質(zhì)復(fù)合物，即在siRNA分子與上述脂質(zhì)，即陽 離子脂質(zhì)、也稱為輔助子脂質(zhì)的DphyPE、和PG-脂質(zhì)即DSPE-PEG之間 或由其形成的復(fù)合物。PKN3-特異性siRNA的粗體核苷酸表示單獨(dú)核苷酸 的2'-0-甲基修飾。
67實(shí)施例4:確定IC50
在HeLa和HUVEC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染后，確定由PKN3 (3)分子和實(shí)施例3 中指定的脂質(zhì)一起形成的脂質(zhì)復(fù)合物，也稱為siRNA-PKN3(3)-脂質(zhì)復(fù)合 物的IC50。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)制備蛋白質(zhì)細(xì)胞溶解物，并用PKN3禾fl PTEN-特異性抗體進(jìn)行免疫印跡。
脂質(zhì)復(fù)合的(以脂質(zhì)復(fù)合物配制的)siRNA分子("siRNA-PKN3 (3)") 的濃度是1, 5， 10和20nM，
結(jié)果描述在圖3中。
由圖3，可以獲得在HeLa細(xì)胞中，濃度為5 nM的siRNA-PKN3 (3) 己經(jīng)適合于在蛋白質(zhì)水平上顯著抑制PKN3。這同樣適用于HUVEC細(xì)胞， 由此需要稍微更高的濃度以達(dá)到與HeLa細(xì)胞中非常相同的抑制程度。使 用PTEN作為加載對(duì)照。
另外，在細(xì)胞系HUVEC和EOMA中，分別對(duì)由如本文中表lb中所 述的PKN3分子形成的脂質(zhì)復(fù)合物，更具體地PKN3-23-vl，與作為19mer 的PKN3(3灘比較，進(jìn)行劑量滴定。如以上實(shí)施例中所述地，將細(xì)胞涂布 在6個(gè)孔中(40k)， 16小時(shí)后用指定濃度的siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染 后48小時(shí)溶解以獲得蛋白提取物。圖15中描述了由抗-PKN3抗體和抗 -PTEN抗體探測(cè)的溶解物的蛋白質(zhì)印跡，后者起加載對(duì)照的作用。
如可以從圖15中獲得地，PKN3-23-vl siRNA在功效上與PKN3 (3) 的那個(gè)相似。通過細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)和隨后的半定量免疫印跡評(píng)估19mer 和23mer分子的IC50，并對(duì)三種不同的細(xì)胞系顯示出相似的功效(IC50 5 nM)。值得指出的是EOMA是小鼠來源的內(nèi)皮細(xì)胞系，其指示關(guān)于小鼠和
實(shí)施例5: PKN3特異性siRNA分子的瞬時(shí)作用
為了顯示PKN3特異性siRNA分子，艮卩siRNA-PKN-3 (3)和PKN3特 異性反義分子(GB對(duì)照)抑制作用的瞬時(shí)特征(Leenders等，2004)，將這 些分子轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中。在48小時(shí)、96小時(shí)、144小時(shí)和192小時(shí)制 備蛋白質(zhì)溶解物。在每種情形中，如實(shí)施例3中所述地，使細(xì)胞暴露于含
68有PKN3 (3)分子的siRNA脂質(zhì)復(fù)合物24小時(shí)，并在所述24小時(shí)后除去 所述siRNA脂質(zhì)復(fù)合物。 結(jié)果描述在圖4中。
從圖4可知，直到96小時(shí)，仍能夠觀察到siRNAPKN3 (3)在蛋白質(zhì) 水平上對(duì)PKN3的作用，由此144小時(shí)后，特定siRNA分子的功效似乎降 低，且192小時(shí)后基本不再能觀察到抑制作用。與GB對(duì)照相比，按照本 發(fā)明的siRNA分子因而顯示出比反義分子持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)的活性，所述反義 分子的抑制在96小時(shí)后已經(jīng)顯著減小。
實(shí)施例6:與按照本發(fā)明的siRNA分子的3，末端相連的磷酸酯基團(tuán)的影響
在該實(shí)施例中，研究了位于形成按照本發(fā)明的雙鏈結(jié)構(gòu)或分子的有義 鏈和反義鏈的3'-末端的3'-磷酸酯修飾的影響，其中使用PKN3 (3M乍為抑 制介導(dǎo)核酸分子，且配制所述核酸分子，從而形成如實(shí)施例3中所述制備 的各自脂質(zhì)復(fù)合物。在HeLa細(xì)胞中測(cè)試由此獲得的脂質(zhì)復(fù)合物，由此分 別轉(zhuǎn)染不同量的所述siRNA分子和脂質(zhì)復(fù)合物，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)制備蛋白 質(zhì)溶解物。如本文中所述地分析免疫印跡，并將結(jié)果顯示在圖5中。
如從圖5中可知地，磷酸酯修飾實(shí)際上對(duì)siRNA分子和含有所述 siRNA分子的脂質(zhì)復(fù)合物的功效沒有影響。
實(shí)施例7: PKN3對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)上HUVEC生長(zhǎng)的功能丟失
為了進(jìn)一步顯示隨著利用按照本發(fā)明的分子抑制PKN3，還存在一些 生理學(xué)和形態(tài)學(xué)上的改變，使用了細(xì)胞外基質(zhì)生長(zhǎng)測(cè)定(Leenders等, 2004)。
更特別地，用4種不同的siRNA-PKN3脂質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)染HUVEC，所 述脂質(zhì)復(fù)合物各自分別含有PKN3 (1)、 PKN3 (3)、 PKN3 (4)和PKN3 (5) 作為siRNA分子，并用siRNALuc-脂質(zhì)復(fù)合物(20nM)作為對(duì)照。在轉(zhuǎn)染 開始的48小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞保持生長(zhǎng)直至匯合。48小時(shí)后，胰蛋白酶消化細(xì) 胞，以等細(xì)胞數(shù)量(110.000個(gè)細(xì)胞)重新涂布，并將其涂布在24個(gè)含有 matigel的孔中。
獲得各自的顯微鏡照片，從而監(jiān)測(cè)重新涂布后20小時(shí)HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)中的變化。結(jié)果描述在圖6中。
如所預(yù)期地，在有效的siRNA PKN3脂質(zhì)復(fù)合物，優(yōu)選地PKN3 (3) 脂質(zhì)復(fù)合物和PKN3 (5)脂質(zhì)復(fù)合物的情形中，觀察到生長(zhǎng)的顯著抑制。
實(shí)施例8:抑制皮下s.c. PC-3異種移植腫瘤生長(zhǎng)
通過皮下注射PC-3細(xì)胞生成PC-3異種移植腫瘤模型。隨后，用實(shí)施 例3中所述的脂質(zhì)復(fù)合物處理由此產(chǎn)生的腫瘤。所述脂質(zhì)復(fù)合物中包含的 siRNA分子是PKN3(3)。圖7A中描述了基本試驗(yàn)設(shè)計(jì)。構(gòu)建了總共3個(gè) 不同的處理組，其中每組由6只小鼠組成。第一組僅接受蔗糖，第二組接 受含有針對(duì)螢光素酶的siRNA的脂質(zhì)復(fù)合物(siRNALuc-脂質(zhì)復(fù)合物)， 且第三組接受含有特異于PKN3的siRNA的脂質(zhì)復(fù)合物(siRNA PKN3-月旨 質(zhì)復(fù)合物)。
腫瘤細(xì)胞接種后，從第25到35天施用不同試劑。每日進(jìn)行8次靜脈 內(nèi)注射。siRNA脂質(zhì)復(fù)合物的劑量是1.88 mg/kg siRNA和14.5 mg/kg總 脂質(zhì)(Santel等，2006a; Santel等，2006b)。
平行地，與PKN3 (3)相比較，評(píng)估了 PKN3-23-vl siRNA分子。圖16A 中描述了各自的基本試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其中在腫瘤細(xì)胞接種后，從第29到47天 施用不同試劑，即蔗糖、PKN3(3)和PKN3-23-vl，其中施藥是每隔一天進(jìn) 行10x靜脈內(nèi)注射(在包括12只小鼠的組中)。siRNA脂質(zhì)復(fù)合物的劑量 是2，8 mg/kg siRNA禾n 21,7 mg/kg總脂質(zhì)(Santel等，2006a, Santel等， 2006b)。
與PKN3 (3)相比，在圖7B和圖7C中針對(duì)PKN3 (3)和在圖16B-16D 中針對(duì)PKN3-23-vl siRNA分子，描述了所述處理方案的結(jié)果。
如從圖7B可知地，與如所示(標(biāo)準(zhǔn)劑量1.88mg/kg/天siRNA; 14.5mg/kg/天脂質(zhì)；箭頭)處理的siRNALuc-脂質(zhì)復(fù)合物(三角形)或等 壓蔗糖(實(shí)心圓)相比，構(gòu)建的PC-3異種移植物的生長(zhǎng)顯著受到siRNA PKN3脂質(zhì)復(fù)合物(菱形)的抑制。在如圖7B中所示的處理過程中監(jiān)測(cè) 體重變化。各個(gè)數(shù)據(jù)代表每日腫瘤體積的平均值s.e.m。隨著施用不同的 脂質(zhì)復(fù)合物，僅能觀察到體重的微量減小，這證實(shí)了，如果有影響的話， 脂質(zhì)復(fù)合物的脂質(zhì)成分對(duì)動(dòng)物健康僅有最小的影響。如從圖16B、 16C禾P 16D中可知地，測(cè)試的兩種siRNA分子，即PKN3 (3),即"19mer",和PKN3-23-vl，即"23mer"，在該前列腺腫瘤模型中顯 示出相同的功效，將其表達(dá)為前列腺腫瘤體積的減小(圖16B),淋巴結(jié) 轉(zhuǎn)移瘤體積的減小(圖16C)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散(圖16D)。
實(shí)施例9:抑制皮下PC-3異種移植腫瘤生長(zhǎng)不同脂質(zhì)復(fù)合物劑量的影 響
進(jìn)行了下述試驗(yàn)，從而研究不同脂質(zhì)復(fù)合物劑量對(duì)抑制皮下PC-3異 種移植腫瘤生長(zhǎng)的影響。更具體地，使用了 siRNAPKN3(3)脂質(zhì)復(fù)合物。 如實(shí)施例3中所述地制備脂質(zhì)復(fù)合物。由圖8A可知該試驗(yàn)設(shè)計(jì)。處理組 由6只小鼠組成，其中一組動(dòng)物接受蔗糖作為陰性對(duì)照，而其他組接受 siRNAPKN3-脂質(zhì)復(fù)合物，更明確地，siRNAPKN3 (3)脂質(zhì)復(fù)合物。在皮 下腫瘤細(xì)胞接種后，從第22-38天，每日對(duì)動(dòng)物施用11次靜脈內(nèi)注射，并 評(píng)估存活直到第67天。
siRNA脂質(zhì)復(fù)合物制劑的配方如下1.88mg/kg siRNA + 14.5mg/kg atuFect01/l% PEG;
不同的脂質(zhì)復(fù)合物劑量如下
-每日0.94mg/kg siRNA，第22 — 32天，
-每日1.88mg/kgsiRNA，第22 — 32天
-1.88mg/kgsiRNA，每日二次50%劑量，第22 —28天，
—每隔一日1.88mg/kg，第22 —38天
結(jié)果描述在圖8B中。從圖8B可知，每日1.88mg/kg的劑量導(dǎo)致腫瘤 體積的顯著減小，由此體重僅微小改變，并且同樣對(duì)所述脂質(zhì)復(fù)合物制劑 沒有觀察到負(fù)作用。
實(shí)施例10:抑制皮下PC-3異種移植腫瘤生長(zhǎng)不同處理方案的影響
與實(shí)施例8相聯(lián)系，描述了試驗(yàn)設(shè)計(jì)。
結(jié)果描述在圖8C中。更具體地，從圖8C可知，該實(shí)施例中研究的處 理時(shí)間表的效果在影響腫瘤體積方面沒有不同。然而，由每日兩次、每曰 和每隔一日組成的處理時(shí)間表顯示出相同的腫瘤生長(zhǎng)抑制，這說明每隔一日用PKN3-siRNA脂質(zhì)復(fù)合物處理足以維持治療功效。另外，每日兩次處 理導(dǎo)致體重的顯著減小，這暗示了不具有附加治療益處的極限劑量(Santel 等，2006a)。
實(shí)施例ll:在同位異種移植腫瘤模型中，用siRNAPKN3 (3)脂質(zhì)復(fù)合物 全身性處理小鼠
在同位異種移植腫瘤模型中進(jìn)行該試驗(yàn)，從而研究用siRNAPKN3脂 質(zhì)復(fù)合物和更明確地siRNA PKN3 (3)脂質(zhì)復(fù)合物全身性處理小鼠對(duì)腫瘤 生長(zhǎng)的影響，(試驗(yàn)詳細(xì)信息見(Santel等，2006a))。
圖9A中描述了用于在同位PC-3前列腺腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤模型中分 析siRNAPKN3脂質(zhì)復(fù)合物處理的功效的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。定義了總共4個(gè)處理 組，每組由9只小鼠組成，即接受蔗糖、siRNA Luc-脂質(zhì)復(fù)合物、siRNA PKN3-脂質(zhì)復(fù)合物和siRNATie2-脂質(zhì)復(fù)合物的組。在前列腺內(nèi)腫瘤細(xì)胞接 種后，從第35-49天，每隔一日，8次靜脈內(nèi)注射由1.88mg/kg siRNA和 14.5mg/kg atuFectOl/1% PEG組成的siRNA脂質(zhì)復(fù)合物劑量。在第35天， 進(jìn)行了預(yù)-處理對(duì)照。
由該試驗(yàn)，與用蔗糖或螢光素酶特異性siRNA分子(siRNALuc)處理的 組相比，在用指定的siRNA脂質(zhì)復(fù)合物處理后的小鼠中觀察到前列腺PC-3 腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤體積的減小，將其更明確地描述在圖9B中(前列腺 月中瘤的體積尺寸和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的體積)。
在左側(cè)顯示了開始處理前的腫瘤轉(zhuǎn)移瘤體積(第35天，對(duì)照)。由星 號(hào)表示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。如從所述圖中可知地，PKN3特異性siRNA分子， 更明確地含有所述PKN3特異性siRNA分子的脂質(zhì)復(fù)合物，在減小前列腺 腫瘤體積和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤體積方面高度有效。
為了證明由靜脈內(nèi)施用PKN3-siRNA脂質(zhì)復(fù)合物引起的體內(nèi)RNA干 擾，分析了肺組織中mRNA擊倒。更明確地，在圖9C中描述了由定量 TaqMan反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)揭示的來自經(jīng)相應(yīng)siRNA脂質(zhì)復(fù)合物處理 的小鼠的肺組織中PKN-3和Tie2 mRNA水平的降低。顯示了針對(duì)CD34 mRNA標(biāo)準(zhǔn)化的肺中Tie2或PKN3 mRNA相對(duì)平均量，從而證明體內(nèi)脂 質(zhì)復(fù)合物介導(dǎo)體內(nèi)干擾。平行檢測(cè)了對(duì)照TIE-2受體特異性siRNA脂質(zhì)復(fù)合物，也證明了當(dāng)與陰性螢光素酶特異性siRNA-脂質(zhì)復(fù)合物相比較時(shí)， 靶特異性mRNA的減少(圖9，右圖)，但沒有揭示出對(duì)腫瘤生長(zhǎng)或形成 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的顯著抑制。這些數(shù)據(jù)證明了利用PKN3-siRNA-脂質(zhì)復(fù)合物 的耙基因(gebne)特異性治療效果。
實(shí)施例12:在同位異種移植腫瘤模型中，用siRNA-PKN3 (3)-脂質(zhì)復(fù)合物 全身性處理小鼠處理時(shí)間表的影響
在同位異種移植腫瘤模型中進(jìn)行該試驗(yàn)，從而測(cè)試與用siRNA-PKN3-脂質(zhì)復(fù)合物和更明確地siRNA-PKN3 (3)-脂質(zhì)復(fù)合物全身性處理小鼠相關(guān) 的不同處理時(shí)間表。
在圖IOA中描述了試驗(yàn)設(shè)置。存在兩個(gè)處理組，其中每組由9只接受 蔗糖或siRNAPKN3脂質(zhì)復(fù)合物施藥的小鼠組成。在前列腺內(nèi)腫瘤細(xì)胞接 種后，從第35-53天，每隔-一日或每隔兩日進(jìn)行10/7x靜脈內(nèi)注射。使用 了兩種不同的siRNA脂質(zhì)復(fù)合物劑量，如下1.88/2.8mg/kg siRNA 14.5/21.7mg/kg atuFectOl/1% PEG,即具有14.5/21.7mg/kg總脂質(zhì)。
將結(jié)果描述為前列腺腫瘤的體積(圖10B)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤體積(圖 IOC)。觀察到針對(duì)兩種參數(shù)腫瘤體積和LN轉(zhuǎn)移瘤形成的抑制，然而，當(dāng) 與每隔兩日的處理相比較時(shí)，對(duì)每隔一 日的處理沒有觀察到顯著的功效增 加。然而，隨著更高的每日劑量(2.8mg/kg siRNA)，觀察到對(duì)轉(zhuǎn)移瘤形成 的更顯著抑制。這些數(shù)據(jù)顯示siRNA介導(dǎo)的抑制不受限于每日靜脈內(nèi)施 藥，且每隔一日的處理能夠獲得治療效果。
實(shí)施例13:在同位異種移植腫瘤模型中，用siRNA-PKN3 (3)-脂質(zhì)復(fù)合物 全身性處理小鼠不同劑量的影響
在同位異種移植腫瘤模型中進(jìn)行該試驗(yàn)，從而測(cè)試與用所述脂質(zhì)復(fù)合 物和更明確地siRNA-PKN3 (3)脂質(zhì)復(fù)合物(圖ll)和siRNA-PKN3-23-vltu 17)全身性處理小鼠相關(guān)的不同劑量。
在圖11A中描述了試驗(yàn)設(shè)置。存在3個(gè)處理組，其中每組由10只接 受蔗糖、siRNAPKN3脂質(zhì)復(fù)合物或僅脂質(zhì)復(fù)合物施藥的小鼠組成。在前 列腺內(nèi)腫瘤細(xì)胞接種后，從第28-46天，每隔一日進(jìn)行10x靜脈內(nèi)注射。siRNA脂質(zhì)復(fù)合物劑量如下0.7/1.4/2.8 mg/kg siRNA; 5.4/10.9/21.7 mg/kg 總脂質(zhì)(在所述脂質(zhì)復(fù)合物中，全部三種一起atuFect01/輔助子脂質(zhì)/1 % PEG)。每隔一 日通過靜脈內(nèi)注射施用三種劑量方案。
將結(jié)果描述為前列腺腫瘤的體積(圖11B)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤體積(圖 IIC)。在這兩種情形中，對(duì)每日劑量2,8mg或1,4mgsiRNA/kg均觀察到 顯著的抑制，這證明了這些siRNA分子的治療窗口 。
同樣，在包括PKN3-23-vl而非PKN3 (3)作為siRNA種類的siRNA PKN3脂質(zhì)復(fù)合物的情形中，存在三個(gè)不同的處理組，其中每組由7-8只 接受蔗糖、siRNAPKN3脂質(zhì)復(fù)合物或單獨(dú)的脂質(zhì)復(fù)合物施用的小鼠組成。 在前列腺內(nèi)腫瘤細(xì)胞接種后，從第7-63天，每隔三日進(jìn)行15x靜脈內(nèi)注射。 siRNA脂質(zhì)復(fù)合物劑量分別如下l,4mg/kg siRNA (10,9 mg總脂質(zhì)/kg)/和 0,7mg/kg siRNA (5,4mg總脂質(zhì)/kg)。
將結(jié)果描述為前列腺腫瘤的體積(圖17B)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤體積(圖 17C)。在這兩種情形中，對(duì)劑量1,4mg/kg禾(]0,7 mg/kg siRNA均分別觀察 到顯著的抑制，這證明了這些siRNA分子劑量的治療窗口 。
另外，記錄了細(xì)胞攻擊后的小鼠體重，并描述在圖17D中。由該圖可 知，在所述處理方案下，小鼠體重沒有減少，這證明沒有關(guān)于作為動(dòng)物健 康的通用指征的體重的總毒性作用。
參考文獻(xiàn)
在此本文參考了現(xiàn)有技術(shù)的不同文獻(xiàn)，將所述文獻(xiàn)，即如下閱讀的完 整參考文獻(xiàn)資料的全部引入本文作為參考。
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說明書、權(quán)利要求、序列表和/或附圖中公開的本發(fā)明特征是可以分別 地和組合地用于以其不同形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的材料。
權(quán)利要求
1. 包括雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸分子，其中，所述雙鏈結(jié)構(gòu)包括第一鏈和第二鏈，其中，所述第一鏈包括連續(xù)核苷酸的第一段序列，并且所述第一段序列至少部分地與靶核酸互補(bǔ)，和其中，所述第二鏈包括連續(xù)核苷酸的第二段序列，并且所述第二段序列至少部分地與所述第一段序列互補(bǔ)，其中，所述第一段序列包括這樣的核酸序列，所述核酸序列至少部分地與SEQ.ID.No.1(NM_013355)所述的核酸序列的核苷酸核心序列或其部分互補(bǔ)，其中，所述核苷酸核心序列包括來自下列各項(xiàng)的核苷酸序列來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置482-500(SEQ.ID.No.2)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置1555-1573(SEQ.ID.No.4)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置1556-1574(SEQ.ID.No.6)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置1559-1577(SEQ.ID.No.8)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置1566-1584(SEQ.ID.No.10)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置2094-2112(SEQ.ID.No.12)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置2102-2120(SEQ.ID.No.14)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置2286-2304(SEQ.ID.No.16)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置2761-2779(SEQ.ID.No.18)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置2763-2781(SEQ.ID.No.20)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置2764-2782(SEQ.ID.No.22)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置2843-2861(SEQ.ID.No.24)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置2844-2862(SEQ.ID.No.26)；或來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置2846-2864(SEQ.ID.No.28)；優(yōu)選地，所述核苷酸核心序列包括來自下列各項(xiàng)的核苷酸序列來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置1555-1573(SEQ.ID.No.4)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置1556-1574(SEQ.ID.No.6)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置1559-1577(SEQ.ID.No.8)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置1566-1584(SEQ.ID.No.10)；來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置2094-2112(SEQ.ID.No.12)；或來自SEQ. ID.No.1的核苷酸位置2286-2304(SEQ.ID.No.16)；其中，優(yōu)選地，所述第一段序列另外至少部分地與所述核苷酸核心序列5’末端前面的區(qū)域和/或與所述核苷酸核心序列3’末端后面的區(qū)域互補(bǔ)。
2. 按照權(quán)利要求1的核酸，其中所述第一段序列與所述核苷酸核心序 列或其部分互補(bǔ)。
3. 按照權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的核酸，其中所述第一段序列另外與所 述核苷酸核心序列3'末端后面的區(qū)域和/或所述核苷酸核心序列5'末端前
4. 按照權(quán)利要求1-3中任-一項(xiàng)的核酸，其中所述第一段序列以18-29 個(gè)核苷酸，優(yōu)選地，19-25個(gè)核苷酸，和更優(yōu)選地，19-23個(gè)核苷酸，與所 述靶核酸互補(bǔ)。
5. 按照權(quán)利要求4的核酸，其中所述核苷酸是連續(xù)的核苷酸。
6. 按照權(quán)利要求1的核酸，其中所述第一段序列和/或所述第二段序 列包括18-29個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選地，19-25個(gè)連續(xù)的核苷酸，和更優(yōu) 選地，19-23個(gè)連續(xù)的核苷酸。
7. 按照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的核酸，其中所述第一鏈由所述第一段 序列組成，和/或所述第二鏈由所述第二段序列組成。
8. 包括雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸分子，優(yōu)選地按照權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的核 酸分子，其中所述雙鏈結(jié)構(gòu)是通過第-一鏈和第二鏈形成的，其中所述第一 鏈包括連續(xù)核苷酸的第一段序列，且所述第二鏈包括連續(xù)核苷酸的第二段 序列，和其中所述第一段序列至少部分地與所述第二段序列互補(bǔ)，其中-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 3的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 2的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 5的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 4的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 7的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 6的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 9的核苷酸序列組成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No. 8的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 11的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 10的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No, 13的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 12的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 15的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 14的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 17的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 16的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 19的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 18的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.21的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 20的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照8￡(^.10^0.23的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 22的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 25的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 24的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 27的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 26的核苷酸序列組成；或-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 29的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No.28的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No.31的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 30的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 33的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 32的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 35的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 34的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 37的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 36的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 39的核苷酸序列組成，且所述第二段序列由按照SEQ.ID.No. 38的核苷酸序列組成；優(yōu)選地，-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 5的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No.4的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 7的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 6的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 9的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 8的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 11的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 10的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 13的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 12的核苷酸序列組成；-所述第一段序列由按照SEQ.ID.No. 17的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 16的核苷酸序列組成；或-所述第一段序列由按照8￡0.10^0.31的核苷酸序列組成，且所述第 二段序列由按照SEQ.ID.No. 30的核苷酸序列組成；
9. 按照權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述第一段序列和/ 或第二段序列包括多個(gè)在2'位處具有修飾、并形成規(guī)則的優(yōu)選地交替位置 模式的被修飾的核苷酸組，其中，優(yōu)選地在該段序列中，每個(gè)被修飾的核 苷酸組在一端或兩端都側(cè)鄰側(cè)翼核苷酸的組，其中，形成側(cè)翼核苷酸組的 側(cè)翼核苷酸是未修飾的核苷酸或具有與所述被修飾核苷酸的修飾不同的 修飾的核苷酸。
10. 按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的核酸，其中所述第一段序列和/或所 述第二段序列包括被修飾的核苷酸組的模式和/或側(cè)翼核苷酸組的模式。
11. 按照權(quán)利要求1-10，優(yōu)選地權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的核酸，其中 所述第一段序列和/或所述第二段序列在3'末端包括二核苷酸，其中所述 二核苷酸優(yōu)選地是TT。
12. 按照權(quán)利要求11的核酸，其中所述第一段序列和/或所述第二段序 列的長(zhǎng)度由19-21個(gè)核苷酸組成。
13. 按照權(quán)利要求1-10，優(yōu)選地權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的核酸，其中所述第- --段和/或第二段序列在3，末端包括1-5個(gè)核苷酸的突出端。
14. 按照權(quán)利要求13的核酸，其中所述雙鏈結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度是約16-24個(gè) 核苷酸對(duì)，優(yōu)選地，20-22個(gè)核苷酸對(duì)。
15. 按照權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的核酸，其中所述第一鏈和所述第二 鏈彼此共價(jià)連接，優(yōu)選地，所述第一鏈的3，末端共價(jià)連接于所述第二鏈的 5'末端。
16. 按照權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的核酸，其中所述分子由下列兩條鏈 的每一條組成，且其中滯下劃線的核苷酸是2，-0-甲基PKN3 (1):agc^g§aga^agg^ggg(SEQ. ID. No. 2) (SEQ. ID. No. 3)PKN3 (2):(SEQ. ID. No. 4) (SEQ. ID. No. 5)PKN3 (3):(SEQ. ID. No. 6) (SEQ. ID. No. 7)PKN3 (4):(SEQ. ID. No. 8) (SEQ. ID. No. 9)PKN3 (5):(SEQ. ID. No. 10) (SEQ. ID. No. 11)PKN3 (6):g鵬cac,卿aagguc(SEQ. ID. No. 12) (SEQ. ID. No. 13)PKN3 (7):uyggg§agffljcgugcaggu(SEQ. ID. No. 14〕 (SEQ. ID. No. 15〕PKN3 (8):aaagcaggga鵬c;uggag(SEQ. ID. No. 16〕 (SEQ. ID. No. 17〕PKN3 (9):(SEQ. ID. No. 18; (SEQ. ID. No. 19〕PKN3 (10):cuucuggaggagcuucuga(SEQ. ID. No. 20: (SEQ. ID. No. 21:P副(11):(SEQ. ID. No. 22: (SEQ. ID. No. 23:PKN3 (12):(SEQ. ID. No. 24: (SEQ. ID. No. 25:<formula>formula see original document page 7</formula>
17. 包括按照權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的核酸的脂質(zhì)體制劑。
18. 包括按照權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的核酸和脂質(zhì)體的脂質(zhì)復(fù)合物。
19. 按照權(quán)利要求18的脂質(zhì)復(fù)合物，其中所述脂質(zhì)體由下列各項(xiàng)組成a) 約50摩爾％的(3-精氨?；?2,3-二氨基丙酸-N-棕櫚基-N-油基-酰胺 三鹽酸，優(yōu)選地，(P-(L-精氨?；?-2,3-L-二氨基丙酸-,棕櫚基-,油基-酰 胺三鹽酸)；b) 約48-49摩爾％的1,2-二植垸酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺 (DPhyPE);禾口c) 約1—2摩爾％的1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇， 優(yōu)選地，N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-l,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺鈉鹽。
20. 按照權(quán)利要求19的脂質(zhì)復(fù)合物，其中所述脂質(zhì)復(fù)合物的；-電勢(shì)是 約3540-6055 mV，優(yōu)選地，約45-50 mV。
21. 按照權(quán)利要求19或20的脂質(zhì)復(fù)合物，其中如通過QELS確定， 所述脂質(zhì)復(fù)合物具有約50-400nm，優(yōu)選地，約100-140nm，和更優(yōu)選地， 約110-130nm的尺寸。
22. 載體，優(yōu)選地，表達(dá)載體，其包括或編碼按照權(quán)利要求1-16中任 一項(xiàng)的核酸。
23. 包括按照以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸或按照以上權(quán)利要求中任 一項(xiàng)的載體的細(xì)胞。
24. 組合物，優(yōu)選地，藥物組合物，其包括按照權(quán)利要求1-16中任一 項(xiàng)的核酸，按照權(quán)利要求17的脂質(zhì)體制劑，按照權(quán)利要求18-21中任一項(xiàng) 的脂質(zhì)復(fù)合物，按照權(quán)利要求22的載體和/或按照權(quán)利要求23的細(xì)胞。
25. 按照權(quán)利要求24的組合物，其中所述組合物是藥物組合物，其任 選地進(jìn)一步包括藥用賦形劑。
26. 按照權(quán)利要求25的組合物，其中所述組合物是藥物組合物，并且 所述藥物組合物用于治療血管發(fā)生-依賴性疾病，優(yōu)選地，由不足、異?；?過度血管發(fā)生所表征或引起的疾病。
27. 按照權(quán)利要求26的藥物組合物，其中所述血管發(fā)生是脂肪組織、皮膚、心臟、眼睛、肺、腸、生殖器官、骨和關(guān)節(jié)的血管發(fā)生。
28. 按照權(quán)利要求26或27的藥物組合物，其中所述疾病選自包括下列各項(xiàng)的組傳染病、自體免疫病癥、血管畸形、動(dòng)脈粥樣硬化、移植動(dòng)脈病、肥胖、銀屑病、疣、變應(yīng)性皮炎、玻璃體持續(xù)增生綜合征、糖尿病 性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、與年齡相關(guān)的黃斑疾病、脈絡(luò)膜新血管形 成、原發(fā)性肺動(dòng)脈高血壓、哮喘、鼻息肉、炎性腸和牙周疾病、腹水、腹 膜粘連、子宮內(nèi)膜異位、子宮出血、卵巢囊腫、卵巢、卵巢過度刺激、關(guān) 節(jié)炎、滑膜炎、骨髓炎、骨贅形成。
29. 按照權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)，優(yōu)選地權(quán)利要求25的藥物組合物， 所述藥物組合物用于治療腫瘤疾病，優(yōu)選地癌癥疾病和更優(yōu)選地實(shí)體腫癇 田。
30. 按照權(quán)利要求25-29中任一項(xiàng)，優(yōu)選地權(quán)利要求29的藥物組合物， 所述藥物組合物用于治療選自包括下列各項(xiàng)的組中的疾病骨癌、乳腺癌、 前列腺癌、消化系統(tǒng)癌癥、結(jié)腸直腸癌、肝癌、肺癌、腎癌、泌尿生殖器 癌、胰腺癌、垂體癌、睪丸癌、眶癌、頭頸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥和呼吸 系統(tǒng)癌癥。
31. 按照權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的核酸、按照權(quán)利要求17的脂質(zhì)體 制劑、按照權(quán)利要求18-21中任一項(xiàng)的脂質(zhì)復(fù)合物、按照權(quán)利要求22的載 體和/或按照權(quán)利要求23的細(xì)胞用于制造藥物的用途。
32. 按照權(quán)利要求31的用途，其中所述藥物用于治療如權(quán)利要求26-30 中任一項(xiàng)所定義的任意疾病。
33. 按照權(quán)利要求32的用途，其中所述藥物與一種或數(shù)種其他治療法 組合使用。
34. 按照權(quán)利要求33的用途，其中所述治療法選自包括下列各項(xiàng)的組 化學(xué)療法、冷凍療法、高熱、抗體療法、放射療法和抗-血管發(fā)生療法。
35. 按照權(quán)利要求34的用途，其中所述治療法是抗體療法，且更優(yōu)選 地，利用抗-VEGF抗體或抗-血管生成素(anti-angi叩oetin)抗體的抗體療 法。
36. 按照權(quán)利要求34的用途，其中所述抗-血管發(fā)生療法使用激酶受 體抑制劑，優(yōu)選地，酪氨酸激酶受體抑制劑，其中所述受體選自包括VEGF受體、PDGF受體、Tie-2、 FGFR和EGFR的組。
37.按照權(quán)利要求36的用途，其中所述抑制劑選自包括下列各項(xiàng)的 組siRNA、反義分子、適體、spiegelmer、高親和性結(jié)合肽、肽適體、抗 促成素和抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸分子，其中，所述雙鏈結(jié)構(gòu)包括第一鏈和第二鏈，其中，所述第一鏈包括連續(xù)核苷酸的第一段序列，并且所述第一段序列至少部分地與靶核酸互補(bǔ)，和其中，所述第二鏈包括連續(xù)核苷酸的第二段序列，并且所述第二段序列至少部分地與所述第一段序列互補(bǔ)，其中，所述第一段序列包括這樣的核酸序列，所述核酸序列至少與按照SEQ.ID.No.1(NM_013355)的核酸序列的核苷酸核心序列或其片段互補(bǔ)，其中，所述核苷酸核心序列包括來自下列各項(xiàng)的核苷酸序列來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置482-500(SEQ.ID.No.2)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1555-1573(SEQ.ID.No.4)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1556-1574(SEQ.ID.No.6)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1559-1577(SEQ.ID.No.8)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1556-1584(SEQ.ID.No.10)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2094-2112(SEQ.ID.No.12)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2102-2120(SEQ.ID.No.14)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2286-2304(SEQ.ID.No.16)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2761-2779(SEQ.ID.No.18)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2763-2781(SEQ.ID.No.20)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2764-2782(SEQ.ID.No.22)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2843-2861(SEQ.ID.No.24)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2844-2863(SEQ.ID.No.26)；或來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2846-2864(SEQ.ID.No.28)；優(yōu)選包括來自下列各項(xiàng)的核苷酸序列的核苷酸核心序列來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1555-1573(SEQ.ID.No.4)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1556-1574(SEQ.ID.No.6)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1559-1577(SEQ.ID.No.8)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置1556-1584(SEQ.ID.No.10)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2094-2112(SEQ.ID.No.12)；來自SEQ.ID.No.1的核苷酸位置2286-2304(SEQ.ID.No.16)；其中，優(yōu)選地，所述第一段序列另外至少部分地與所述核苷酸核心序列5’末端前面的區(qū)域和/或與所述核苷酸核心序列3’末端后面的區(qū)域互補(bǔ)。
文檔編號(hào)C12N9/12GK101490253SQ200780026982
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2007年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月21日
發(fā)明者奧利弗·凱爾, 安斯加爾·桑特爾, 約爾格·考夫曼 申請(qǐng)人:賽倫斯治療公司