專利名稱：：非重組宿主中的乙醇生產的制作方法非重組宿主中的乙醇生產相關申請本申請要求2006年5月1日提交的美國臨時申請系列號60/796,652和2007年9月29日提交的60/848,234的優(yōu)先權，它們的所有內容并入本文作為參考。政府資助的研究本發(fā)明部分地得到美國能源部授權號DE-FG36-04GO14019的支持。因此，政府可以具有本發(fā)明的某些權利。發(fā)明背景乙醇是一種用于替代至少一部分石油的有吸引力的替代運輸燃料(Kheshgi等人，2000，Wooley等人，1999)。盡管目前在美國通過使用釀酒酵母發(fā)酵來自玉米淀粉的葡萄糖來生產乙醇(Bothast等人，2005),擴大該工藝來生產大部分的汽車燃料需求會不利地沖擊食品和飼料工業(yè)。木質纖維生物量是一種有吸引力的替代原料，其在適當預處理后可以發(fā)酵成乙醇，而不沖擊食品和飼料供給(Wyman等人，2003，Zaldivar等人，2001)。與玉米淀粉不同，生物量含有大量酵母難以發(fā)酵的戊糖。復合糖向乙醇的轉化需要可以有效地發(fā)酵己糖和戊糖的微生物生物催化劑。為此目的，已經(jīng)開發(fā)了重組生物，其中將異源基因加入平臺(platform)生物，例如酵母、運動發(fā)酵單胞菌(Zwo6!7")和大腸桿菌。例如，含有來自運動發(fā)酵單胞菌的/^c和aW基因的重組產乙醇大腸桿菌會以高速率和產率將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇(Ingram等人，1999)。另外，添加戊糖利用基因的酵母和運動發(fā)酵單胞菌基因工程已經(jīng)產生了與重組產乙醇大腸桿菌的戊糖發(fā)酵特征相匹配的生物催化劑(Kuyper等人，2005，Mohagheghi等人，2004)。ii發(fā)明概述如上所述，木質纖維原料向乙醇的轉化需要有效地發(fā)酵己糖和戊糖的微生物生物催化劑。這樣的微生物生物催化劑包括重組生物，其中將異源基因加入平臺生物，例如酵母和細菌，例如運動發(fā)酵單胞菌和大腸桿菌。但是，重組生物用于大規(guī)模燃料生產的用途被有些人視作商業(yè)化的屏障。非重組乙醇源(ethanologen)的開發(fā)可以減少從木質纖維底物商業(yè)化生產乙醇的已知屏障之一。因此，本發(fā)明至少部分地基于，通過微生物的否則不產乙醇(otherwisenon-ethanologenic)的高乙醇(homoethanol)途徑更改糖酵解的突變的發(fā)現(xiàn)，和基于該發(fā)現(xiàn)的在厭氧條件下將葡萄糖和木糖發(fā)酵成乙醇的非重組產乙醇微生物的開發(fā)。更具體地，/7說操縱子已經(jīng)被鑒別為高乙醇途徑的起源。更具體地，在/W操縱子內的//^基因已經(jīng)被鑒別為負責高乙醇發(fā)酵，所述發(fā)酵例如由大腸桿菌在厭氧條件下進行。因而，在一個方面，本發(fā)明提供了分離的包含突變的非重組細菌，其中所迷突變使該非重組細菌能在厭氧條件下生產4摩爾NADH/摩爾糖。在另一個方面，本發(fā)明提供了分離的非重組細菌，其包含具有一個或多個突變的//^/基因，其中所述突變使該非重組細菌能在厭氧條件下生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。本發(fā)明也提供了分離的核酸分子，其編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶(L尸D)多肽或其功能片段。當所述核酸分子在細胞(例如細菌)中表達時，所述細胞生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。因而，在另一個方面，本發(fā)明提供了選自下迷的分離的核酸分子:a)核酸分子，其包含與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苷酸序列至少60%同源的核苷酸序列，或其互補序列；b)核酸分子，其包含含有SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苷酸序列的核酸的至少100個核苷酸的片段，或其互補序列；c)核酸分子，其編碼包含與SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列至少約50%同源的氨基酸序列的多肽；d)核酸分子，其編碼包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽片段；其中所述片段包含SEQIDNO:2或SEQI&W:4的氨基酸序列的至少15個鄰接(contiguous)氨基酸殘基；e)核酸，其編碼包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽的天然存在的等位基因變體，其中所述核酸分子在嚴謹條件下與包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核酸分子的互補序列雜交；f)包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苷酸序列的核酸分子，或其互補序列；和g)核酸分子，其編碼包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽；其中所述核酸分子當在細胞中表達時，使所述細胞能生產乙醇作為基本(primary)發(fā)酵產物。本發(fā)明也提供了二氫硫辛酰胺脫氫酶多肽或其功能片段。當所述多肽在細胞(例如細菌)中表達時，所述細胞生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。因而，在另一個方面，本發(fā)明提供了選自下述的多肽a)包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽片段，其中所述片段包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的至少15個鄰接氨基酸；b)包含SEQIDNO;2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽的天然存在的等位基因變體，其中所迷多肽由在嚴謹條件下與包含SEQIDNO;1或SEQIDNO:3的核酸分子的互補序列雜交的核酸分子編碼；c)由與包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:3核苷酸序列的核酸至少50%—致的核酸分子編碼的多肽；d)包含與SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列至少90%一致的氨基酸序列的多肽；和e)包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的分離的多肽；且其中所述多肽在細胞中表達時，使所迷細胞能生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。在一個實施方案中，由細胞生產的乙醇包含大于50%的在厭氧條件下的總非氣發(fā)酵產物。在該方面的另一個實施方案中，所述多肽在厭氧條件下具有二氫硫辛酰胺脫氫酶活性。在另一個實施方案中，所述細胞是細菌細胞。在另一個方面，本發(fā)明提供了細菌宿主細胞，其包含編碼二氫硫辛酰胺脫氬酶多肽或其片段的分離的核酸分子。在另一個方面，本發(fā)明提供了生產選自下述的多肽的方法a)包含氨基酸序列SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的多肽；b)包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽片段；其中所述片段包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的至少15個鄰接氨基酸；和c)包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽的天然存在的等位基因變體，其中所述多肽由在嚴謹條件下與包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核酸分子的互補序列雜交的核酸分子編碼；該方法包括，在表達核酸分子的條件下，培養(yǎng)含有編碼二氫疏辛酰胺脫氫酶多肽或其片段的分離的核酸分子的細菌宿主細胞。在另一個方面，本發(fā)明提供了如上所述的非重組細菌，其包含上述的分離的核酸分子。本發(fā)明的另一個方面提供了非重組細菌，其包含具有一個或多個突變的//^基因，其中所述突變使該非重組細菌能在厭氧條件下生產乙醇作為基本發(fā)酵產物，且其中所述細菌通過包含下述步驟的方法來制備a)在厭氧生長條件下在富含糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)候選細菌突變體；和b)選擇生產乙醇作為主要發(fā)酵產物的突變體。在另一個方面，本發(fā)明提供了生產本發(fā)明的產乙醇非重組細菌的方法，其包含下述步驟a)在厭氧生長條件下在富含糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)候選細菌突變體；和b)選擇生產乙醇作為主要發(fā)酵產物的突變體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了任一個上述方面的分離的非重組細菌，其中//^基因中的突變造成NADH不敏感性。在上述方面的另一個實施方案中，所述突變體源自/pd基因中的突變。在一個特定實施方案中，//7d基因中的突變造成NADH不敏感性。在另一個方面，本發(fā)明提供了從寡糖源生產乙醇的方法。該方法包括，使寡糖接觸如上所述的本發(fā)明的非重組細菌或宿主細胞，從而從寡糖源生產乙醇。在該方法的一個特定實施方案中，所述寡糖選自木質纖維素、半纖維素、纖維素、果膠和其任意組合。在另一個方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含如上所述的本發(fā)明的非重組細菌或宿主細胞，和根據(jù)本文所述的方法和工藝生產乙醇的說明書。在一個實施方案中，所迷試劑盒包含糖源。在另一個方面，本發(fā)明提供了新的大腸桿菌菌株，包括菌林AH218(NRRLB-30967),AH241(NRRLB-30968),AH242(NRRLB-30969),SE2377(NRRLB-30970),SE2378(NRRLB曙30971),SE2382(NRRLB-30972),SE2383(NRRLB-30973),SE2384(NRRLB-30974)和SE2385(NRRLB-30975),它們于2006年9月27日保藏在農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心(AgriculturalResearchCultureCollection)(NRRL),1815N.UniversityStreet,Peoria,IL，USA。從下面的詳述和權利要求書中可以明白本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點。附圖簡述圖1(A)顯示了含有在堿基997處的突變的//^基因的核酸序列(SEQIDNO:l)和(B)對應的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。圖2(A)顯示了含有在堿基1093處的突變的/pd基因的核酸序列(SEQIDNO:3)和(B)對應的氨基酸序列(SEQIDNO:4)。圖3(A)顯示了野生型//^基因的核酸序列(SEQIDNO:5)和(B)對應的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。圖4顯示的圖描迷了大腸桿菌野生型菌抹W3110和產乙醇突變菌林SE2378在含有葡萄糖或木糖(50gL")的LB-培養(yǎng)基(37°C，pH7.0)中的生長和發(fā)酵特征。圖(A)顯示了在葡萄糖中生長的野生型W3110菌林；圖(B)顯示了在葡萄糖中生長的SE2"8菌株；圖(C)顯示了在木糖中生長的野生型W3110菌株；圖(D)顯示了在木糖中生長的SE2378菌林。圖5顯示了缺失型突變體(amP-"ce570(A)(Awo尸-ace570向菌林SE2378(B)中的轉導。通過與^c::Tn/0共轉導,繪制菌林SE2378中的突變圖i脊。當通過工轉導刪除aro/V^^-ace五尸基因時，轉導子(C)喪失在厭氧條件下在含有1%葡萄糖的LB中生長的能力，而在野生型背景中的相同缺失沒有影響厭氧生長。圖6顯示了來自野生型W3110菌抹和SE2378突變體的pc^/基因產物的氨基酸序列(A)。菌林SE2378的基因間區(qū)域的核酸序列如(B)所示。圖7顯示了用于在YK100宿主中表達W3110或SE2378/pc/的質粒。質粒pKY32(A)含有來自野生型菌林W3110的Z/^基因。質粒pKY33(B)含有來自產乙醇突變體SE2378的//^基因。圖8(A-C)的示意圖顯示了在大腸桿菌菌抹SE2378、天然大腸桿菌和其它產乙醇微生物中從丙酮酸鹽生產乙醇的提議途徑。圖9顯示了大腸桿菌K12MG1655的丄尸D與下述選擇的L尸D序列的多氨基酸序列比對(使用CLUSTAL多序列比對程序)即破傷風梭狀芽孢桿菌E88、嗜熱厭氧產乙醇桿菌、蠟樣芽孢桿菌ATCC10987、植物乳桿菌WCFS1、乳酸乳球菌乳脂亞種SKll、酒類酒球菌MCWPSU-1、鼠傷寒沙門氏菌LT2、費希爾氏弧菌ATCC700601、希瓦氏菌ANA-3、綠膿假單胞菌PAOl(ATCC15692)、球形紅細菌2.4.1，金屬還原地桿菌(Geobactermetallireducens)GS-15、不動桿菌ADP1、氧化葡萄糖酸桿菌621H、谷氨酸棒狀桿菌DSM20300、干酪乳桿菌ATCC334、天藍色鏈霉菌M145/A3(2)、變形鏈球菌ATCC700610、巴氏曱烷八疊球菌Fusaro。在氨基酸322處的組氨酸殘基、在氨基酸355處的脯氨酸殘基和在氨基酸356處的谷氨酸殘基用星號(*)突出顯示。圖10中的圖顯示了NADH對PDH活性的抑制。大腸桿菌野生型菌棘W3110或產乙醇突變菌林SE2378。在上圖中，對于菌林W3110和菌林SE2378而言，NAD濃度是2mM。在下圖中，對于來自菌林W3U0的天然酶而言，NAD濃度是2mMNAD,對于來自菌林SE2378的酶的突變形式而言，NAD濃度是lmM。圖11中的圖顯示了NADH對L尸Z)的抑制。測定L尸D的天然和突16變形式的酶活性與NADH/NAD比的關系。發(fā)明詳述為了清楚地理解本發(fā)明的全部范圍，提供下面的定義。I.定義本文使用的術語"非重組細菌"和"細菌"意在包括含有或不含有異源多核苷酸序列、且適合使用本發(fā)明的組合物和方法進一步修飾的細菌細胞，例如適合基因操作，例如其可以摻入異源多核苷酸序列,例如其可以被轉染。該術語意在包括最初轉染的細胞的后代。在具體實施方案中，所迷細胞是革蘭氏陰性細菌細胞或革蘭氏陽性細胞。在"源自細菌的多核普酸或基因"中的術語"源自"意在包括多核苷酸區(qū)段從指明的來源(即，細菌)的分離(完全或部分地)或多肽從指明的來源(即，細菌)的純化。在這方面，該術語意在包括，例如，從或基于與指明的多核苷酸來源有關的序列直接克隆、PCR擴增或人工合成。術語"厭氧條件"意在包括不含氧的條件；即，其中基本上不存在氧的條件。在本發(fā)明的某些實施方案中，厭氧條件包含密閉罐或容器，例如用塞子密閉的罐。為了建立不包含氧的條件，使用真空泵從罐或容器去除氣相，并用氮氣替換。當氧水平低得難以檢測時，氧基本上不存在。術語"好氧條件"意在包括含有氧的條件；即，其中存在氧的條件。術語"產乙醇的"意在包括微生物從碳水化合物生產乙醇作為基本發(fā)酵產物的能力。該術語意在包括天然存在的產乙醇的生物和具有天然產生的或誘導的突變的產乙醇的生物。術語"不產乙醇的"意在包括微生物不能從碳水化合物生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。該術語意在包括生產乙醇作為次要發(fā)酵產物的微生物，所述次要發(fā)酵產物包含小于40%的總非氣發(fā)酵產物。術語"發(fā)酵"意在包括復合糖的降解或解聚和糖殘基向乙醇、乙酸鹽和琥珀酸鹽的生物轉化。該術語意在包括從碳水化合物生成乙醇(更具體地，作為基本發(fā)酵產物)的酶促過程(例如細胞的或無細胞的，例如裂解物或純化的多肽混合物)。術語"基本發(fā)酵產物"和"主要發(fā)酵產物"在本文中互換使用，意在包括包含大于約50%的總非氣產物的非氣發(fā)酵產物?；景l(fā)酵產物是最豐富的非氣產物。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述基本發(fā)酵產物是乙醇。本文使用的術語"次要發(fā)酵產物"意在包括包含小于40%的總非氣產物的非氣發(fā)酵產物。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述次要發(fā)酵產物是乙醇。本文使用的術語"高乙醇發(fā)酵途徑"意在包括生物例如細菌中促進乙醇作為基本發(fā)酵產物的生產的發(fā)酵途徑。本文使用的術語"替代發(fā)酵途徑，，意在包括其中乙醇不是基本發(fā)酵產物的發(fā)酵途徑。本文使用的"基因"是可以指導酶或其它多肽分子的合成的核酸，例如可以包含編碼序列，例如，編碼多肽的鄰接開放讀碼框(ORF)，或可以自身在生物中起功能。生物中的基因可以在如本文所定義的操縱子中簇集，其中所述操縱子被基因間DNA與其它基因和/或操縱子分開。包含在操縱子中的單個基因可以在沒有基因間DNA的情況下在單個基因之間重疊。另外，術語"基因"意在包括用于選擇的目的特定基因?；蚩梢允撬拗骷毎麅仍吹?，或可以重組地導入宿主細胞中，例如作為附加體維持的質?；蚍€(wěn)定摻入基因組中的質粒(或其片段)。異源基因是導入細胞中且對于該細胞而言非天然的基因。術語"pdh操縱子"和"pdh基因座"可互換使用，意指作為一個群體表達的//7d和ace5"F基因簇，和它們的有關啟動子和操縱基因。按照常規(guī)，術語"/W操縱子"是指編碼操縱子的基因，而術語"PDH"是指由操縱子編碼的蛋白復合物。丙酮酸脫氫酶活性負栽生產用于三羧酸循環(huán)和能量生產的乙酰輔酶A。術語pW操縱子可以包括來自任意好氧生物的/^/操縱子。所有好氧生物，從真核生物到人類，都含有3個PDH組分。許多細菌具有編碼在操縱子中含有的PDH的基因。3個基因aceE、"ceF和/;^是PDH活性所必需的，這3個基因存在于所有好氧生物中，無論它們作為操縱子還是作為獨立基因來組織起來。術語"二氬硫辛酰胺乙酰轉移酶"(ace。意在包括丙酮酸脫氫酶基因基因座的E2乙酰轉移酶。按照常規(guī)，術語"aceF"是指二氪硫辛酰胺乙酰轉移酶基因，而術語"AceF，，是指aceF基因產物，即二氬硫辛酰胺乙酰轉移酶多肽或酶。術語"丙酮酸脫羧酶/PDH復合物脫氪酶"(aceE)意在包括丙酮酸脫氫酶基因基因座的El脫羧酶。按照常規(guī)，術語"aceE"是指丙酮酸脫羧酶/脫氬酶基因，而術語"AceE"是指ac^基因產物，即丙酮酸脫羧酶/脫氫酶多肽或酶。術語"丙酮酸脫氫酶阻抑物"(^//^)意在包括pdh操縱子的轉錄阻抑物。按照常規(guī)，術語'>//^"是指丙酮酸脫氫酶阻抑物基因，而術語"PdhR"是指/7cZ/^基因產物，即丙酮酸脫氫酶阻抑物多肽。術語"二氫疏辛酰胺脫氫酶，，(/;^/)意在包括作為丙酮酸脫氫酶基因基因座或"/^/2操縱子"的一部分的酶。按照常規(guī)，術語'7/^，是指二氫硫辛酰胺脫氫酶基因，而術語'1尸D"是指//7d基因產物，即二氫疏辛酰胺脫氫酶多肽或酶。野生型//^基因的核苷酸序列用圖3(A)所示的SEQIDNO:5表示，由野生型/;wf基因表達的多肽的氨基酸序列用圖3(B)所示的SEQIDNO:6表示。術語"乳酸脫氫酶"(/說/0意在包括在發(fā)酵條件下將丙酮酸鹽轉化成乳酸鹽的酶。按照常規(guī)，術語"/W/T是指乳酸脫氫酶基因，而術語"LDHA"是指W/U基因產物，即乳酸脫氫酶多肽或酶。術語"丙酮酸甲酸裂合酶"(p/)意在包括在發(fā)酵條件下將丙酮酸鹽轉化成乙酰輔酶A和甲酸鹽的酶。按照常規(guī)，術語"http://T是指丙酮酸甲酸裂合酶基因，而術語"PFL"是指/_/7基因產物，即丙酮酸曱酸裂合酶多肽或酶。術語"醇脫氫酶"(a說f)意在包括在發(fā)酵條件下將乙酰輔酶A轉化成乙醇的酶。按照常規(guī)，術語"a^^"是指醇脫氬酶基因，而術語"ADHE"是指a^五基因產物，即醇脫氫酶多肽或酶。術語"NADH不敏感性"是指PDH酶對NADH的敏感性的降低。該術語意在包括部分降低不敏感性或敏感性的完全缺失。術語"核酸"意在包括核酸分子，例如包括編碼多肽的開放讀碼框的多核苷酸，且可以進一步包括非編碼調節(jié)序列和內含子。另外，該術語意在包括繪圖成功能性基因座的一個或多個基因。另外，該術語意在包括用于選擇的目的特定基因。在一個實施方案中，多核苷酸區(qū)段的基因參與碳水化合物向乙醇的生物轉化的至少一步。因此，該術語意在包括編碼多肽的任意基因，所述多肽例如丙酮酸脫羧酶、醇脫氬酶、分泌性多肽或多糖酶例如葡聚糖酶或其組合。生物中的基因可以在如本文所定義的操縱子中簇集，其中所迷操縱子祐基因間DNA與其它基因和/或操縱子分開。包含在pdh操縱子中的單個基因可以在沒有基因間DNA的情況下在單個基因之間重疊。術語"同源的"意在包括，第一個氨基酸或核苷酸序列含有足夠或最小數(shù)目的與第二個氨基酸或核苷酸序列相同或等價的氨基酸殘基或核苷酸，例如具有類似側鏈的氨基酸殘基，使得第一個和第二個氨基酸或核苷酸序列具有共同的結構域和/或共同的功能活性。術語"異源多肽"意在包括可以由源自任意來源(例如真核生物,原核生物、古細菌、天外菌(virii))的異源核酸或合成核酸片段編碼的多肽或其片段。術語"分離的多肽"(例如分離的或純化的生物合成的酶)基本上不含有來自多肽來源微生物的細胞材料或其它污染多肽，或在化學合成時基本上不含有化學前體或其它化學試劑。在"核苷酸片段"或"多肽片段"中的術語"片段"意在指與它的來源序列的至少一部分基本上同一的核苷酸序列或多肽序列部分，且其中所述多肽保留它的來源序列的生物活性。術語"pH，，意在指溶液中氫離子摩爾濃度的度量，所以也是溶液酸度或堿度的度量。根據(jù)本領域的標準，術語pH用于限定溶液。常見的pH值范圍是0至14,O是濃鹽酸(lMHC1)的值，7是純水(中性pH)的值，14是濃氫氧化鈉(1MNaOH)的值。術語"pK，，意在指質子結合親和力的度量，經(jīng)常與pH互換使用。本領域技術人員會認識到，術語pK用于限定蛋白、氨基酸和肽。本領域技術人員也會認識到，氨基酸中羧基、氨基和可電離的R-基團的酸強度可以用締合常數(shù)Ka或更常見地用Ka的負對數(shù)pKa來限定。術語"栽體"意在包括適用于連接目標核苷酸序列和轉化進宿主細胞中的任意質粒栽體。術語"糖"意在包括包含糖分子的任意碳水化合物源。這樣的糖20是潛在糖源，其用于解聚(如果需要)，并根據(jù)本發(fā)明的產物和方法通過發(fā)酵隨后生物轉化成乙醛、再轉化成乙醇。糖源包括淀粉，大多數(shù)植物中燃料儲藏的主要形式，和纖維素，堅硬細胞壁的主要細胞外結構組分和植物的纖維和木質組織。該術語意在包括單糖(也稱作簡單糖)、寡糖和多糖。在某些實施方案中，所迷糖包括例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖和乳糖。在其它實施方案中，所述糖是葡萄糖。術語"革蘭氏陰性細菌細胞，，意在包括本領域公認的該術語的定義。示例性的革蘭氏陰性細菌包括不動桿菌、葡萄糖桿菌、埃希氏桿菌、地桿菌(Geobacter)、謝瓦納拉菌(Shewanella)、沙門氏菌、腸道細菌和克雷白桿菌。術語"革蘭氏陽性細菌"意在包括本領域公認的該術語的定義。示例性的革蘭氏陽性細菌包括芽孢桿菌、梭菌、棒狀桿菌、乳酸桿菌、乳球菌、酒球菌(Oenococcus)、鏈球菌和真細菌。短語"突變核酸分子"或"突變基因"意在包括具有包含至少一個改變(例如替換、插入、缺失)的核苷酸序列的核酸分子或基因，術語"氨基酸"意在包括在蛋白中常見的20種a-氨基酸。堿性帶電荷的氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸和賴氨酸。中性帶電荷的氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。術語"誘變劑"意在包括可以根據(jù)本發(fā)明的方法用于修改核苷酸序列的任意試劑。術語"自發(fā)突變"意在包括在沒有誘變原存在下發(fā)生的突變。該術語可以包括在沒有加入誘變劑時在本發(fā)明的方法中發(fā)生的突變。II.非重組細菌在混合酸發(fā)酵過程中，糖酵解酶將每摩爾葡萄糖轉化成2摩爾丙酮酸鹽+2摩爾NADH和凈2摩爾ATP。比丙酮酸鹽(乙醇、乳酸鹽等)更高還原的化合物的生產用作氧化NADH和再生NAD+的機理，這是繼續(xù)糖酵解所必需的。在涉及酵母、植物和細菌(即，運動發(fā)酵單胞菌)的唯一已知的高乙醇途徑中，丙酮酸鹽被非氧化性丙酮酸脫羧酶脫羧基，產生二氧化碳和乙醛。得到的乙醛在乙醇生產過程中用作醇脫氫酶進行NADH氧化的電子受體。在許多其它類型的細菌中存在一種完全不同的乙醇途徑，其中丙酮酸鹽首先被丙酮酸甲酸裂合酶轉化成乙酰輔酶A和曱酸鹽，這是其中還原當量包含在甲酸鹽中并被曱酸氬化酶分散為氫氣(和C02)的氧化脫羧。乙酰輔酶A隨后用作"c/Z^-編碼的眵-醇脫氫酶活性氧化2個NADH分子的電子受體。由于每個乙醇需要2個NADH，剩下一半乙酰輔酶A，被轉化成乙酸鹽和額外的ATP。因而，從乙酰輔酶A到乙醇的天然大腸桿菌途徑不能支持高乙醇發(fā)酵，因為從乙酰輔酶A每生成1個乙醇需要2個NADH。還原氧化平衡由乙酸鹽生成來維持。這是野生型大腸桿菌在發(fā)酵過程中生產等摩爾量的乙酸鹽和乙醇的主要原因。丙酮酸脫氬酶將丙酮酸鹽氧化脫羧成乙酰輔酶A,并將有關的還原劑轉化成NADH。這不同于PFL，其中有關的還原劑通過作為中間體的甲酸鹽分散為氫氣，在有葡萄糖存在下不能用于代謝活性。通過用PDH代謝丙酮酸鹽，每個丙酮酸鹽有一個額外的NADH可以用于將每個乙酰輔酶A完全還原成乙醇。盡管在大腸桿菌中編碼丙酮酸脫氬酶的基因通常在好氧和厭氧條件下都表達，在厭氧生長過程中該復合物的活性非常低。本發(fā)明至少部分地基于否則不產乙醇的微生物中通過高乙醇途徑更改糖酵解的突變的發(fā)現(xiàn)，和基于該發(fā)現(xiàn)的在厭氧條件下將葡萄糖和木糖發(fā)酵成乙醇的非重組產乙醇微生物的開發(fā)。根據(jù)該更改的糖酵解，本發(fā)明的非重組細菌在厭氧條件下生產4摩爾NADH/摩爾糖或2NADH/丙酮酸鹽。因而，在一個方面，本發(fā)明提供了包含突變的非重組細菌，其中所述突變使該非重組細菌能在厭氧條件下生產4摩爾NADH/摩爾糖。在一個實施方案中，所述突變位于；^/操縱子中。在一個特定實施方案中，所述pW操縱子包含/c//^，ace五F和/;^基因。在另一個實施方案中，所述突變是在/;^基因中。在另一個實施方案中，4摩爾NADH/摩爾糖的生產導致乙醇作為基本發(fā)酵產物的生產。在一個特定實施方案中，所述糖選自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖和乳糖。在另一個方面，本發(fā)明提供了非重組細菌，其包含具有一個或多個突變的/;^/基因，其中所述突變使該非重組細菌能在厭氧條件下生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。在一個實施方案中，生產的乙醇包含大于50%的在厭氧條件下的總非氣發(fā)酵產物。在另一個實施方案中，所迷非重組細菌在沒有突變時不產乙醇。在另一個實施方案中，所述不產乙醇的細菌生產乙醇作為次要發(fā)酵產物。在一個實施方案中，生產的乙醇小于總非氣發(fā)酵產物的40%。在本發(fā)明的另一個實施方案中，在//^基因中的突變提供高乙醇途徑，細菌通過該途徑生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。在另一個實施方案中，滅活細菌中的一個或多個替代發(fā)酵途徑。在一個實施方案中，所述替代途徑被突變滅活。這樣的突變包括替代途徑中一個或多個基因的核苷酸的缺失、替換或添加。在另一個實施方案中，所述突變是在W/2基因例如W/l4基因中。在另一個實施方案中，所迷突變是在/^/7基因例如/7/7i5基因中。在另一個實施方案中，所述替代發(fā)酵途徑包括乳酸脫氫酶(W/z)的乳酸生產，丙酮酸甲酸裂合酶(//7)的乙酸(acetate)、乙醇、甲酸(formate)或142和C02轉化或琥珀酸(succinate)的生產。在本文所述非重組細菌和細菌細胞的不同實施方案中，所述細菌選自革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌。在某些實施方案中，所述細菌是革蘭氏陰性細菌。在具體實施方案中，所迷革蘭氏陰性細菌選自不動桿菌、葡萄糖酸桿菌、埃希氏桿菌、地桿菌、謝瓦納拉菌、沙門氏菌、腸道細菌和克雷白桿菌。在其它實施方案中，所述細菌是革蘭氏陽性細菌。在具體實施方案中，所述革蘭氏陽性細菌選自芽孢桿菌、梭菌、棒狀桿菌、乳酸桿菌、乳球菌、酒球菌、鏈球菌和真細菌。在其它實施方案中，所述細菌是大腸桿菌。如上所迷，本發(fā)明的非重組細菌包含一個或多個突變，例如在/;wf基因中的突變。在一個實施方案中，所述突變包含用另一個氨基酸替換一個氨基酸，從而該替換改變由突變的基因表達的多肽的pK。在某些實施方案中，//^基因中的突變造成NADH不敏感性。也就是說，攜帶這樣的突變的細胞表現(xiàn)出PDH酶對NADH的敏感性的降低。因而，NADH不敏感的細胞生產4個NADH分子/葡萄糖(2個來自糖酵解，2個來自PDH反應)，所有4個NADH可以用于將2個乙酰輔酶A還原成乙醇。在某些實施方案中，PDH對NADH的NADH不敏感性和它的甚至在高NADH/NAD比時起作用的能力，使得細胞例如細菌細胞成為高乙醇生產者。在一個實施方案中，所述多肽包含SEQIDNO:6,且所述突變包含用在下述位置的另一個氨基酸替換野生型氨基酸a)SEQIDNO:6中的位置322或在位置322的任一側約50個位置內的任意位置；或b)SEQIDNO:6中的位置354或在位置354的任一側約50個位置內的任意位置。在某些實施方案中，其它氨基酸是選自下迷的中性氨基酸丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。在其它實施方案中，其它氨基酸是選自下述的堿性氨基酸精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸和賴氨酸。在一個實施方案中，所述突變包含用任意氨基酸替換在位置322處的H，使得該氨基酸替換增加由突變的基因表達的多肽的酸度。在一個特定實施方案中，所述非重組細菌具有包含將SEQIDNO:6中位置322處的H替換為Y在內的突變。在一個實施方案中，所迷非重組細菌是大腸桿菌菌林SE2377,其由指定保藏號為NRRLB-30970的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表。在另一個實施方案中，所述非重組細菌是大腸桿菌菌林SE2383,其由指定保藏號為NRRLB-30973的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表。在另一個實施方案中，所述非重組細菌是大腸桿菌菌林SE2384,其由指定保藏號為NRRLB-30974的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表。在另一個實施方案中，菌林SE2377包含SEQIDNO:1或其片段。在另一個實施24方案中，菌株SE2383包含SEQIDNO:1或其片段。在另一個實施方案中，菌林SE2384包含SEQIDNO:1或其片段。在另一個實施方案中，所述突變包含用任意氨基酸替換在位置354處的E,使得該氨基酸替換降低由突變的//d基因表達的多肽的酸度。在一個特定實施方案中，所述非重組細菌具有包含將SEQIDNO:6中位置354處的E替換為K在內的突變。在一個實施方案中，所述非重組細菌是大腸桿菌菌株SE2378，其由指定保藏號為NRRLB-30971的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表。在另一個實施方案中，所述非重組細菌是大腸桿菌菌抹SE2382，其由指定保藏號為NRRLB-30972的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表。在另一個實施方案中，所述非重組細菌是大腸桿菌菌抹SE2385，其由指定保藏號為NRRLB-30975的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表。在另一個實施方案中，菌抹SE2378包含SEQIDNO:3或其片段。在另一個實施方案中，菌林SE2382包含SEQIDNO:3或其片段。在另一個實施方案中，菌抹2385包含SEQIDNO:3或其片段。包含上述一個或多個突變的非重組細菌適用于從糖生產乙醇。根據(jù)本發(fā)明，所述突變提供高乙醇發(fā)酵途徑。在某些實施方案中，生產的乙醇包含大于50%的在厭氧條件下的總非氣發(fā)酵產物。在一個實施方案中，所述突變源自自發(fā)突變。在另一個實施方案中，將細菌暴露于誘變劑。在一個特定實施方案中，所述誘變劑選自乙基曱磺酸、2-氨基。票呤、ICR-191、甲基甲磺酸、N-曱基-N，-硝基-N-亞硝基胍。在另一個特定實施方案中，所迷誘變劑是乙基曱磺酸(EMS)。在另一個實施方案中，細菌中的一個或多個替代發(fā)酵途徑被滅活。替代發(fā)酵途徑包括乳酸脫氫酶(W/2)的乳酸生產，從丙酮酸曱酸裂合酶(//7)和琥珀酸鹽開始的乙酸鹽、乙醇、曱酸鹽、H2和C02轉化。在一個實施方案中，所述替代發(fā)酵途徑被突變滅活。在具體實施方案中，所述替代發(fā)酵途徑通過在細菌中導入缺失突變來滅活。II.分離的核酸分子和基因本發(fā)明也提供了分離的核酸分子，其編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶(/p句多肽或其片段。本發(fā)明的核酸分子包含具有一個或多個突變的//7d基因，當在本發(fā)明的細菌中存在時，所述突變導致細菌在厭氧條件下生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。本發(fā)明的核酸分子包括DNA分子和RNA分子和使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但是有利地是雙鏈DNA。在一個方面，本發(fā)明提供了選自下述的分離的核酸分子a)核酸分子，其包含與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苷酸序列至少60%同源的核苷酸序列，或其互補序列；b)核酸分子，其包含含有SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苷酸序列的核酸的至少100個核苷酸片段，或其互補序列；c)核酸分子，其編碼包含與SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列至少約50%同源的氨基酸序列的多肽；d)核酸分子，其編碼包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽片段；其中所述片段包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的至少15個鄰接氨基酸殘基；e)核酸，其編碼包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽的天然存在的等位基因變體，其中所述核酸分子在嚴謹條件下與包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核酸分子的互補序列雜交；f)包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苷酸序列的核酸分子，或其互補序列；和g)核酸分子，其編碼包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽；其中所述核酸分子當在細胞中表達時，使所述細胞能生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。在一個實施方案中，在厭氧條件下由細胞生產的乙醇包含大于50%的總非氣發(fā)酵產物。在另一個實施方案中，所迷細胞是細菌細胞。在另一個實施方案中，所述細菌細胞在沒有表達所述核酸分子時不產乙醇。在一個特定實施方案中，所述不產乙醇的細菌細胞生產乙醇作為次要發(fā)酵產物；即，小于總非氣發(fā)酵產物的約40%。在另一個實施方案中，所述細菌細胞在厭氧條件下生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。在一個特定實施方案中，所述核酸分子在細菌細胞中的表達在細菌細胞中提供高乙醇發(fā)酵途徑，通過該途徑，生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。在本發(fā)明的該方面的另一個實施方案中，所迷核酸分子包含SEQIDNO:1的片段，其中所述核酸分子的長度是至少100個核苷酸，且含有在與SEQIDNO:l的位置997相對應的位置處的T。在另一個實施方案中，所述核酸分子包含SEQIDNO:3的片段，其中所述核酸分子的長度是至少100個核苷酸，且含有在與SEQIDNO:l的位置1023相對應的位置處的G。在一個實施方案中，本發(fā)明的//7d核酸分子與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列(例如當與核苷酸序列的全長相對比時)或其互補序列具有至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或更高的同一性。SEQIDNO:1和SEQIDNO:3分別顯示在圖l(A)和3(A)中。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含含有SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苷酸序列的核酸分子的至少100、150、200、250或300個核苷酸的片段，或其互補序列。在另一個特定實施方案中，本發(fā)明提供了核酸分子，其編碼包含與圖l(B)和圖2(B)所示的SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或更高同一性的氨基酸序列的多肽。在另一個實施方案中，所述核酸分子編碼包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽片段，其中所述片段包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的至少15、25、35、45、55、65個鄰接氨基酸殘基。在另一個方面，本發(fā)明提供了如上所述的非重組細菌，其包含上述的分離的核酸分子。在一個實施方案中，所述非重組細菌從糖生產乙醇。在另一個實施方案中，所述糖選自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖和乳糖。本文所迷(且按照常規(guī)斜體顯示)的//^基因包括核酸分子(例27如DNA分子或其區(qū)段)，例如，編碼多肽或RNA的核酸分子，其在生物中與另一個基因或其它基因之間;f絲因間DNA(即，插入或間隔DNA，其天然地側接所述基因和/或在生物的染色體DNA中分隔基因)隔開?；蚩梢灾笇富蚱渌嚯姆肿拥暮铣?例如可以包含編碼序列，例如，編碼多肽的鄰接開放讀碼框(ORF))，或可以自身是在生物中有功能的。生物中的基因可以在如本文所定義的操縱子中簇集，其中所述操縱子凈it4因間DNA與其它基因和/或操縱子分開。包含在操縱子中的單個基因可以在沒有基因間DNA的情況下在單個基因之間重疊。本發(fā)明的一個實施方案表征了突變的/pd核酸分子或基因。通常，本文所述的突變核酸分子或突變基因包括具有包含至少一個改變(例如替換、插入、缺失)的核苷酸序列的核酸分子或基因，使得多肽或:基因編碼的多肽的活性。有利地:突變核酸分^或突變基因(、例如突變基因)編碼具有提高的活性例如二氬硫辛酰胺脫氪酶活性的丄尸D多肽。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子在嚴謹條件下與具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所述核苷酸序列的核酸分子雜交。這樣的嚴謹條件是本領域技術人員已知的，且可以參見Cwre"f尸rofoco/jz'"M/ecw/ar腸/ogy,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。嚴謹(例如高嚴謹性)雜交條件的一個具體的非限制性實例是，在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45。C雜交，隨后在0.2XSSC、0.1%SDS中在50-65。C洗滌一次或多次。有利地，在嚴謹條件下與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3的序列雜交的本發(fā)明的分離的核酸分子對應著天然存在的核酸分子。通常，天然存在的核酸分子包括具有在自然界中產生的核苷酸序列的RNA或DNA分子。本發(fā)明的核酸分子(例如具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:3的核苷酸序列的核酸分子)可以使用標準的分子生物學技術和本文提供的序列信息來分離。例如，核酸分子可以使用標準的雜交和克隆技術(例:i口4笛述在Sambrook,J.,Fritsh,E,F.,和Maniatis，T.A^o/ecw/arCVom"g,.JZ/a60naf/0A7A^"wwa/.2w《ec/.，Co/c/S/W"g//<ar6orZ/a60/"a/10/^,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989)來分離，或可以使用在SEQIDNO:1、SEQIDNO:3序列基礎上設計的合成寡核苷酸引物通過聚合酶鏈式反應來分離。根椐標準的PCR擴增技術，使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板和適當寡核苷酸引物，可以擴增本發(fā)明的核酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含作為SEQIDNO:1、SEQIDNO:3所示核苷酸序列的互補序列的核酸分子。其它核酸序列是這樣的核酸序列，其包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3的核苷酸序列，且編碼具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所述氨基酸序列的多肽的同系物(例如編碼與具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4所述氨基酸序列的多肽具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%年更高同一性且具有與該多肽基本上相同的活性的多肽)，其在嚴謹條件下與具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:3的核苷酸序列的核酸分子的全部或片段雜交，或與編碼具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽的核酸分子的全部或片段雜交，或與本文所述//^核苷酸序列互補，使得所述/;^核酸序列當在細胞中表達時，導致細胞在厭氧條件下生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。在一個實施方案中，所述核酸分子編碼包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽或多肽的生物活性片段，其中所迷多肽或生物活性片段保留在宿主細胞中生產乙醇的能力。在另一個實施方案中，/;^核酸分子或基因編碼具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的丄尸D多肽的同系物。通常，術語"同系物，，包括與野生型多肽或本文所迷多肽的氨基酸序列具有至少約30-35%、有利地至少約35-40%、更有利地至少約40-50%、更有利地至少約60%、70%、80%、90%或更高同一性、且具有與野生型多肽基本上等價的功能或生物活性的多肽。例如，丄尸D同系物與具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所迷氨基酸序列的多肽具有至少約60%、有利地至少約60%、70%、75%、80%、85。/。、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或更高同一性，且具有與具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所述氨基酸序列的多肽基本上等價的功能或生物活性(例如具有基本上等價的二氫硫辛酰胺脫氫酶活性)(即，是功能等價物)。在一個實施方案中，/;7d核酸分子或基因包含編碼SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所述多肽的核苷酸序列。在另一個實施方案中，//^/核酸分子與具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所述核苷酸序列的核酸分子的全部或片段雜交，或與編碼具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:4中任一個氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的核酸分子的全部或一部分雜交。這樣的雜交條件是本領域技術人員已知的，且可以參見Cw/reW尸ro/ocoA//iWb/ecw/^r5z'o/ogy,Ausubel等人，纟扁.，JohnWiley&Sons,Inc.(1995)，第2、4和6部分。其它嚴謹條件可以參見A/o/ecw/wC/o幽g..爿Z^60mm/7Mwwa/，Sambrook等人，ColdSpringHarborPress:ColdSpringHarbor,NY(1989),第7，9和11章。嚴謹雜交條件的一個具體的非限制性實例包括，在4X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約65-70°C雜交(或在4XSSC+50。/。甲酰胺中在約42-50。C雜交)，隨后在IXSSC中在約65-70。C洗滌一次或多次。高嚴謹雜交條件的一個具體的非限制性實例包括，在1XSSC中在約65-70。C雜交(或在1XSSC+50。/。曱酰胺中在約42-50°C雜交)，隨后在0.3XSSC中在約65-70°C洗滌一次或多次。低嚴謹雜交條件的一個具體的非限制性實例包括，在4XSSC中在約50-60°C雜交(或在6XSSC+S0。/o甲酰胺中在約40-45°C雜交)，隨后在2XSSC中在約50-60。C洗滌一次或多次。本發(fā)明也意在包括在上述值中間的范圍，例如在65-70。C或在42-50。C。SSPE(1XSSPE是0.15MNaCl,10mMNaH2P04>1.25mMEDTA，pH7,4)可以替換雜交和洗涂緩沖液中的SSC(IXSSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉)；在雜交結束后，洗滌各自進行15分鐘。預期長度小于50個堿基對的雜合體的雜交溫度應當比雜合體的解鏈溫度(Tm)低5-10。C，其中Tm根據(jù)下述方程來確定。對于長度小于18個堿基對的雜合體，Tm(°C)=2(A+T堿基的數(shù)目)+4(G+C堿基的數(shù)目)。對于長度在18至49個堿基對的雜合體，Tm(°C)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N),其中N是雜合體中堿基的數(shù)目，且[Na+]是雜交緩沖液中鈉離子的濃度(lXSSC的[Nal-0.165M)。技術人員也會認識到，可以將其它試劑加入雜交和/或洗滌緩沖液中，以降低核酸分子對膜例如硝酸纖維素或尼龍膜的非特異性雜交，包括但不限于阻斷劑(例如BSA或鮭魚或鄉(xiāng)魚精子栽體DNA)、去污劑(例如SDS)、螯合劑(例如EDTA)、菲柯爾、PVP等。當使用尼龍膜時，具體地，嚴謹雜交條件的一個另外的非限制性實例是在0.25-0.5MNaH2P04、7%SDS中在約65。C雜交，隨后在0.02MNaH2P04、1%SDS中在65°C洗涂一次或多次，參見例如Church和Gilbert(1984)尸麼.麵.JcadSc/.脂81:1991-1995(或者，0，2XSSC,1%SDS)。在另一個實施方案中，分離的核酸分子包含與本文所述/pc/核苷酸序列互補的核普酸序列(例如是SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所述核苷酸序列的完全互補序列)。III.多肽本發(fā)明表征了多肽(例如，突變的產乙醇的酶，例如，二氫硫辛酰胺脫氬酶(丄尸D))。當所述多肽在細胞(例如細菌)中表達時，所述細胞在厭氧條件下生產乙醇作為基本發(fā)酵產物.因而，在另一個方面，本發(fā)明提供了選自下述的多肽a)包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽片段，其中所述片段包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的至少15個鄰接氨基酸；b)包含SEQIDNO;2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽的天然存在的等位基因變體，其中所述多肽由在嚴謹條件下與包含SEQIDNO;1或SEQIDNO:3的核酸分子的互補序列雜交的核酸分子編碼；c)由與包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:3核苷酸序列的核酸至少50%—致的核酸分子編碼的多肽；d)包含與SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列至少90%一致的氨基酸序列的多肽；和e)包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的分離的多肽；且其中所述多肽在細胞中表達時，使所述細胞能生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。在一個實施方案中，由細胞生產的乙醇包含大于50%的在厭氧條件下的總非氣發(fā)酵產物。在該方面的另一個實施方案中，所述多肽在厭氧條件下具有二氫硫辛酰胺脫氫酶活性。在另一個實施方案中，所述細胞是細菌細胞。在另一個實施方案中，所迷細菌細胞在不表達該多肽時不產乙醇。在一個特定實施方案中，所述不產乙醇的細菌細胞生產乙醇作為次要發(fā)酵產物；即，小于總非氣發(fā)酵產物的約40%。在另一個實施方案中，所述細菌細胞在厭氧條件下生產乙醇作為基本發(fā)酵產物，且在另一個實施方案中，生產的乙醇包含大于50%的在厭氧條件下的總非氣發(fā)酵產物。在一個特定實施方案中，所述多肽在細菌細胞中的表達在所述細菌細胞中提供高乙醇發(fā)酵途徑。在另一個實施方案中，本發(fā)明的分離的多肽是包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽片段，其中所述片段包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的至少15、25、35、45、55或65個鄰接氨基酸殘基。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離的多肽，其與SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少約50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或更高同一性(例如當與氨基酸序列的總長度相對比時)。在另一個方面，本發(fā)明提供了細菌宿主細胞，其包含編碼二氬硫辛酰胺脫氫酶多肽或其片段的分離的核酸分子。在一個實施方案中，所述細菌宿主細胞包含含有SEQIDNO:l或SEQIDNO:3的核普酸序列或其片段的載體。在另一個實施方案中，所述細菌宿主細胞包含的栽體是pKY33。本發(fā)明也提供了生產選自下述的多肽的方法a)包含氨基酸序列SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的多肽；b)包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽片段；其中所述片段包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的至少15個鄰接氨基酸；和c)包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽的天然存在的等位基因變體，其中所述多肽由在嚴謹條件下與包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核酸分子的互補序列雜交的核酸分子編碼；該方法包括，在表達核酸分子的條件下，培養(yǎng)含有編碼二氫疏辛酰胺脫氬酶多肽或其片段的分離的核酸分子的細菌宿主細胞。在一個實施方案中，所述A尸Z)多肽或基因產物源自非重組產乙醇的革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌。在示例性的實施方案中，所述丄尸D多肽或基因產物源自選自下述的產乙醇的革蘭氏陰性微生物不動桿菌、葡萄糖酸桿菌、埃希氏桿菌、地桿菌、謝瓦納拉菌、沙門氏菌、腸道細菌和克雷白桿菌。在另一個實施方案中，所述丄尸Z)多肽或基因產物源自選自下述的產乙醇的革蘭氏陽性微生物芽孢桿菌、梭菌、棒狀桿菌、乳酸桿菌、乳球菌、酒球菌、鏈球菌和真細菌。在本發(fā)明的范圍內包括丄尸Z)多肽或基因產物，它們是大腸桿菌衍生的多肽或由天然存在的細菌基因編碼的基因產物。在本發(fā)明的范圍內還包括細菌衍生的多肽或基因產物，它們不同于天然存在的細菌和/或大腸桿菌基因(例如/p力，例如，具有突變的、插入的或缺失的核酸、含二氬硫;酰胺脫氬酶S性)的^因。工''容易理解，本領域技術人員可以改變(例如替換)編碼保守氨基酸替換的核酸。還容易理解，本領域技術人員可以在某種程度上替換、添加或刪除氨基酸，并與天然存在的基因產物相比基本上不影響基因產物(例如二氬硫辛酰胺脫氫酶)的功能，其中的每種情況有意包含在本發(fā)明的范圍內。在本發(fā)明的范圍內包括非重組細菌，其包含含有突變的//^基因，其中替換是，在野生型//^基因(SEQIDNO:6)的位置322處的H或在位置354處的E突變成任意氨基酸，使得該氨基酸改變該區(qū)域的酸度。在其它實施方案中，所述氨基酸是在生理pH下中性帶電荷的氨基酸。在其它實施方案中，所述氨基酸是在生理pH下堿性帶電荷的氨基酸。在一個實施方案中，本發(fā)明的分離的多肽(例如分離的二氫疏辛酰胺脫氬酶)具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所示的氨基酸序列在其它實施方案中，本發(fā)明的分離的多肽是SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所述多肽中的至少一個的同系物(例如包含與SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少約30-40%同一性、有利地約3340-50%同一性、更有利地約50-60%同一性、和更有利地約60-70%、70-80%、80-90%、90-95%或更高同一性的氨基酸序列，且具有分別與由SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列編碼的多肽基本上類似的活性)。為了確定2個氨基酸序列或2個核酸的同一性百分比，為了最佳對比目的比對序列(例如可以將缺口引入第一個氨基酸序列或核酸序列，用于與第二個氨基酸或核酸序列最佳比對)。當?shù)谝粋€序列中的位置被與第二個序列中對應位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占椐時，則分子在該位置是同一的。2個序列之間的同一性百分比隨序列共有的相同位置的數(shù)目而變化(即，％同一性-相同位置的數(shù)目/位置總數(shù)x100)，有利地考慮生成最佳比對必需的缺口數(shù)目和缺口大小。使用數(shù)學算法，可以對比序列和確定2個序列之間的同一性百分比。用于序列對比的數(shù)學算法的一個具體的非限制性實例是Karlin和Altschul(1990)TVoc.A^/.』cac/.Sc/.(/&487:2264-2268的算法，如Karlin和Altschul(1993)/Voc.A^/.^cad90:5873-5877所述進行改進。這樣的算法整合在Altschul等人(1990)/Mo/.AW.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中?？梢杂肗BLAST程序進行BLAST核苷酸搜索，評分=100,字長=12,以得到與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？梢杂肵BLAST程序進行BLAST多肽搜索，評分=50，字長=3,以得到與本發(fā)明的多肽分子同源的氨基酸序列。為了得到用于對比目的的缺口比對，可以使用如Altschul等人(1997)核酸Aejean^25(17):3389-3402所迷的缺口BLAST。當使用BLAST和缺口BLAST程序時，可以使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參見http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列對比的數(shù)學算法的另一個具體的非限制性實例是Myers和Miller(1988)Cow;wf/I;//Ao化/.4:11-17的算法。這樣的算法整合在ALIGN程序中，該程序可以在例如GENESTREAM網(wǎng)絡服務器，IGHMontpellier,FRANCE或在ISREC服務器得到。當使用ALIGN程序來對比氨基酸序列時，可以使用PAM120加權殘基表，缺口長度罰分為12，缺口罰分為4。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，使用在NCBI的Blast服務器或在歐洲生物4支術研究所(EuropeanBiotechnologyInstitute)的ClustalW，確定2個氨基酸序列之間的同一性百分比。例如，將來自不同生物的二氫硫辛酰胺脫氬酶的氨基酸序列與大腸桿菌Lpd蛋白的氨基酸序列相對比，從2個數(shù)據(jù)庫中的任一個可以得到特定序列與大腸桿菌序列的同一性百分比。表7和圖9解釋了這些對比。括號中的值代表特定蛋白與大腸桿菌Lpd的總相似性，并包括相同的氨基酸位置以及發(fā)生保守替換的位置。對于枯草芽孢桿菌，在對比中包括2種二氫硫辛酸脫氫酶，一種來自PDH復合物，另一種來自3-羥基丁酮脫氫酶。本領域普通技術人員會認識到，基于前述計算，多種細菌物種中的Z^D存在高保守度，包括在系統(tǒng)發(fā)育上彼此遠離的細菌(基于16S核糖體RNA(DNA)序列)，例如革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌、古細菌和鏈霉菌。丙酮酸脫氫酶存在于所有好氧生物中，是葡萄糖向能量轉化的關鍵酶。二氬硫辛酰胺脫氫酶(LPD)是PDH復合物的3個亞基之一。LPD含有2個獨特的基序黃素結合基序(氨基酸15-45)和吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶基序(氨基酸347-456)(大腸桿菌Lpd編號)。由于它們在PDH復合物中的獨特作用，來自幾種生物的Lpd蛋白的氨基酸序列具有顯著的同源性。大腸桿菌Lpd和其它細菌Lpd之間的氨基酸序列同一性范圍是從30%至99%。在來自大腸桿菌和人的Lpd的極端情況下，序列中42%的氨基酸是相同的。在Lpd的黃素結合區(qū)(氨基酸15-45),該序列同一性增加至67%。在該序列的一個18氨基酸子部分(位置28-55),除了一個氨基酸以外，所有氨基酸在大腸桿菌、人和小鼠的Lpd序列中是保守的。這些蛋白中在322處的組氨酸和在354處的谷氨酸也是保守的。由于該非常高的序列保守度，預期在本發(fā)明中所述的大腸桿菌Lpd突變在引入來自其它生物的Lpd蛋白后具有類似的表型。因而，本發(fā)明的方法不限于本文教導的菌林。IV.制備非重組細菌的方法本發(fā)明的另一個方面提供了非重組細菌，其包含具有一個或多個突變的//7d基因，其中所迷突變使該非重組細菌能在厭氧條件下生產乙醇作為基本發(fā)酵產物，且其中所述細菌通過包含下述步驟的方法來制備a)在厭氣生長條件下在富含糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)候選細菌突變體；和b)選擇生產乙醇作為主要發(fā)酵產物的突變體。在該方法的一個實施方案中，生產的乙醇包含大于50%的在厭氧條件下的總非氣發(fā)酵產物。在另一個方面，本發(fā)明提供了生產本發(fā)明的產乙醇非重組細菌的方法，其包含下述步驟a)在厭氧生長條件下在富含糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)候選細菌突變體；和b)選擇生產乙醇作為主要發(fā)酵產物的突變體。在本發(fā)明的前述方法和工藝的實施方案中，富含糖的培養(yǎng)基中的糖選自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖和乳糖。在本發(fā)明的一個實施方案中，具有前述屬性的非重組細菌也是產乙醇'的。因此，本發(fā)明提供了制備產乙醇非重組細菌的方法。此外，本發(fā)明提供了篩選希望的產乙醇表型的方法。本發(fā)明的親本菌林的特征在于，當在富含糖的培養(yǎng)基中生長時，在厭氧條件下低乙醇生產水平。這樣的菌株的一個實例是菌林AH242;但是，特征在于在厭氧條件下低乙醇生產水平的任意菌林適用于該方法。根據(jù)本領域已知方法(Dastenko和Wanner,2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645.)對親本菌抹進行其它突變，以提供在所有培養(yǎng)基中不能厭氧生長(缺陷型)的親本菌林。另外，根據(jù)本領域眾所周知的實踐，為選擇目的添加抗生素抗性的表達盒。通常，如下進行選擇在好氧條件下培養(yǎng)生長缺陷型菌株，直到達到指數(shù)生長期中期，將培養(yǎng)物涂布在瓊脂上，將培養(yǎng)物暴露于誘變劑。本領域普通技術人員會認識到，可以使用許多誘變劑，包括乙基曱磺酸、2-氨基噪呤、ICR-191、甲基甲磺酸、N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍，或已知會造成核苷酸序列變化的任意其它試劑。在厭氧條件下暴露于誘變劑后，將培養(yǎng)物轉換到好氧條件，然后返回厭氧條件。選擇生長的菌落，在新鮮平板上劃線，并在厭氧條件下生長。可以分開培養(yǎng)每個菌落，并在適當抗生素平板上生長，以證實攜帶親本抗生素抗性的突變體。本領域普通技術人員會理解，根據(jù)本領域的標準方法進行細菌培養(yǎng)操作。高效液相色語可以用于測定分離的突變體的用過的培養(yǎng)基中發(fā)酵產物的產率。例如，通過HPLC可以檢測乙醇、乙酸鹽、曱酸鹽和琥珀酸鹽。本領域普通技術人員可以認識到，基于前迷實例和基于細菌菌抹之間的同源性，本發(fā)明的方法不限于本申請中教導的菌林。V.生產乙醇的方法在另一個方面，本發(fā)明提供了從寡糖源生產乙醇的方法。該方法包括，使寡糖接觸如上所述的本發(fā)明的非重組細菌或宿主細胞，從而從寡糖源生產乙醇。在該方法的一個特定實施方案中，所述寡糖選自木質纖維素、半纖維素、纖維素、果膠和其任意組合。本發(fā)明的宿主細胞的特征在于，在厭氧條件下低乙醇生產水平。野生型大腸桿菌在厭氧生長過程中以1:1的比例生產乙醇和乙酸鹽。在生長的靜止期，野生型大腸桿菌生產乳酸鹽作為主要產物，總發(fā)酵產物中乙醇的比例是約20%。所有這些發(fā)酵的產物包含各種酸，因而產生術語"混合酸發(fā)酵"。在一個方面，本發(fā)明提供了非重組細菌，其包含具有一個或多個突變的//7c/基因，其中所迷突變使該非重組細菌能在厭氧條件下生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。基本發(fā)酵產物意在包括包含大于50%的總非氣產物的非氣發(fā)酵產物。所述基本發(fā)酵產物是最豐富的非氣產物。通常，選擇能提供促進宿主細胞生產菌抹的最好生長動力學和培養(yǎng)物生成的酶的催化條件的最適pH和溫度的發(fā)酵條件(Doran等人,(1993)Ao"c/mo/.尸rogre肌9:533-538)。例如，對于克雷伯氏菌，例如P2菌抹，最適條件確定在35-37。C和pH5.0-pH5.4。在這些條件下，甚至外源性地加入的真菌內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶是非常穩(wěn)定的，并繼續(xù)起作用長時間段。在實施例中討論了其它條件。此外，技術人員會明白，只需要常規(guī)試驗，使用本領域已知的技術，來優(yōu)化本發(fā)明的特定發(fā)酵反應。參見，例如，美國專利號5,424,202和5,916,787，它們提供參考特此并入本文。在另一個方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含如上所述的本發(fā)明的非重組細菌或宿主細胞，和根椐本文所述的方法和工藝生產乙醇的說明書。在一個實施方案中，所述試劑盒包含糖源。VI.例證下面實施例進一步解釋了本發(fā)明，它們不應當理解為限制性的。在實施例中，使用下述材料和方法，除非另有說明。材料和方法細菌菌林在該研究中使用大腸桿菌K-12菌林W3110(ATCC27325)和衍生菌林AH242，其由指定保藏號為NRRLB-30967(AW/l4和A(/bc^-;/^))的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表。菌抹SE2378是菌株AH242的產乙醇突變體。按照Dastenko等人，刪除基因和aceF。在將轉座子TnlO引入W/l4后，枸建W/l4缺失菌林，隨后在鐮刀菌酸培養(yǎng)基(Klekner等人1991;Maloy等人1981)中選擇。其它菌林的構建使用標準的遺傳和分子生物學技術(Maniatis等人1982;Miller等人1972)。在下面所示的表l中，列出了本文使用的菌林的基因型。表1:細菌菌林和相關基因型菌林相關基因型來源W3110野生型ATCC27325AH240厶(/bcv4-py^)-FRT-Km-FRT本研究AH241本研究AH242厶拜/4)A(/bd//5)-FRT-Km-FRT本研究SE2378AH242,厭氧生長陽性本研究YK1SE2378,Kms本研究YK29AH242,Kms本研究YK91YK1,A(a必^)-FRT-Km-FRT本研究YK93YK1，A(flrce"-FRT-Km-FRT本研究YK96YK1,)-FRT-Km-FRT本研究YK152YK29,A(orce/0-FRT-Km-FRT本研究YK153W3110,A(ac樸FRT-Km-FRT本研究YK157YK152,aC(W3U0)YKl52xPI(W3U0)YK158YK152，aceF"(W3U0)YK152xPl(SE2378)生長培養(yǎng)基和發(fā)酵豐富培養(yǎng)基(L-肉湯)含有(每升)，胰蛋白酶解酪蛋白蛋白胨(IOg)，酵母浸出物(5g)和NaCl(5g)(Lee,etal.1985)。礦物鹽培養(yǎng)基如前所述(Lee,etal.1985)根據(jù)需要加入葡萄糖或木糖。如前所述(Hasona，etal.2004)在37。C進行發(fā)酵。通過加入KOH，將培養(yǎng)pH維持在7.0。如前所述(Patel等人2006),在裝至頂部的13x100mm螺旋帽試管裝進行分批發(fā)酵。載體和轉化根據(jù)本領域所述的標準操作，克隆和表達/;d以及在；^區(qū)中的基因。除了其它普遍已知的栽體以外，在轉化中采用的栽體可以包括pTrc99a(GE)、pCR2.1-TOPO、pBR322、pUC19、pACYC184、pBAD24。根據(jù)Maniatis等人(1989)的標準操作，使用基于CaCl2的化學轉化方法。分析方法通過HPLC(Underwood,etal.2002),測定糖和發(fā)酵產物。如前所述(Talarico,etal.2001),在破碎的細胞制品中測量丙酮酸脫羧酶活性。實施例1產乙醇非重組大腸桿菌菌抹SE2377、SE2378、SE2382、SE2383、SE2384、SE2385的分離在此實施例中，描述了細菌大腸桿菌的非重組產乙醇菌林的分離。起始菌林AH242用于分離大腸桿菌的所迷高乙醇生成突變體。由于分別編碼乳酸脫氫酶(LDH)和丙酮酸甲酸裂合酶CPFL)的W//和39基因中的突變，菌林AH242不能在含糖的豐富培養(yǎng)基中厭氧生長(Mat-Jan等人，1989)。盡管有這些突變，AH242的好氧生長不受影響。AH242的厭氧生長缺陷是NADH向NAD+再氧化的缺陷的結果，所述NAD+是關鍵糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶和有關的ATP生產的必要底物。通過將丙酮酸鹽還原成乳酸鹽，LDH的缺失會排除NADH氧化。在缺失通常由PFL生產的乙酰輔酶A的情況下，沒有足夠的乙酰輔酶A用于天然醛的有效NADH氧化和醇脫氫酶活性。在本發(fā)明中，使用以前所述的方法(Datsenko和Wanner,2000),從H242菌林開始，構建/bd-和-;/^(丙酮酸甲酸裂合酶)缺失。單缺失突變體AH240,-(/^」-/7/^)和AH241-(/^」)是雙突變的AH242菌林的親本菌抹。在缺失的位置，插入FRT-Km-FRT盒，從而為菌林AH242提供卡那霉素抗性。由于2個突變，菌林AH242在所有培養(yǎng)基中是厭氧生長缺陷型。下面的表2列出了具有好氧發(fā)酵途徑中的突變的大腸桿菌突變體的生長特征。表2:具有好氧發(fā)酵途徑中的突變的大腸桿菌突變體的生長特征菌抹基因型_比(specific)生長速率(h'1)_好氧厭氣LB最低最低(+Ace,Succ)LB最低最低(+Ace,Succ)W3II0野生型1.311.050.970.980.510.51AH240滿1.230.950.990.79NG0.26AH2411.350.960.940.810,390.30AH242/風編1.211.180.97NGNGNGSE23781.180.510.820.46NGNG(0.21)LB,L-肉湯；最小-沒有添加或添加乙酸鹽和琥珀酸鹽(各自lmg/ml)的葡萄糖最小培養(yǎng)基NG-不生長括號中的值是在含有乙酸鹽、琥珀酸鹽和谷氨酸鹽(lmg/ml)的葡萄糖最小培養(yǎng)基中的生長速率在搖床中在200RPM、在37。C、在好氧條件下，在5mlL-肉湯中培養(yǎng)得到的厭氧生長缺陷型菌抹AH242。在指數(shù)生長期中期，從搖床取出培養(yǎng)物，涂布在含有葡萄糖的L-瓊脂或含有葡萄糖+中性紅還原氧化染料的L-瓊脂上。將Whatman紙過濾器置于每個瓊脂培養(yǎng)基的表面上。向盤中加入誘變劑乙基甲磺酸(EMS)，將平板轉移至厭氧罐，該罐裝有外被鈀催化劑的H2+C02發(fā)生器，以建立無02環(huán)境。在本發(fā)明中可以采用適用于誘變的其它標準試劑。將裝有平板的厭氧罐在37。C溫育5天。5天后，在指定的培養(yǎng)基上沒有檢測到可見生長。隨后，在好氧條件下溫育2個盤約20小時。在該溫育結束時，在2種培養(yǎng)基中除了圍繞含有EMS的紙盤的放置位置的區(qū)域以外的所有區(qū)域中觀察到細菌細胞菌苔。通過影印培養(yǎng)，將每種培養(yǎng)基表面上的細胞轉移至相同組成的新鮮培養(yǎng)基，并置于厭氧罐中5天。5天后，每個平板在除了EMS的放置位置以外的所有區(qū)域具有超過100個菌落。從每個葡萄糖(15個菌落)和葡萄糖+中性紅平板(16個菌落)選擇31個菌落，在新鮮的L-瓊脂+葡萄糖上劃線。在厭氧條件下培養(yǎng)平板。所有菌落生長在厭氧條件下。將31個突變體接種進L-肉湯+葡萄糖培養(yǎng)物，在生長后，將每個轉移至L-瓊脂+卡那霉素平板的表面。所有突變體在卡那霉素存在下生長，表明它們攜帶親本菌抹AH242的抗生素抗性。將31個突變體轉移至在螺旋帽試管中的L-肉湯+葡萄糖中，在不混合情況下在37。C溫育。在檢測到可見生長后，將培養(yǎng)基與細胞分離，使用高效液相色語測定廢培養(yǎng)基中的發(fā)酵產物(Underwood等人，2002)。表3表明，31個突變體中的30個生產乙醇作為基本的或主要的發(fā)酵產物(73%)。其它產物是琥珀酸鹽和乙酸鹽的組合。這些結果表明，已經(jīng)從在厭氧環(huán)境中不能生長的AH242親菌林分離出非重組突變體，其能在厭氧條件中生長，并生產乙醇作為主要發(fā)酵產物。表3:大腸桿菌菌林AH242的產乙醇突變衍生物的發(fā)酵特性分離物編消耗的發(fā)酵產物乙醇總產物號葡萄糖琥珀酸乳酸鹽甲酸鹽乙酸鹽乙醇(%)產率(mM)鹽(%)SE213819.73.722.03,57.28.220-119.72.8--3.131.18490218.72,1--3.128.4849419.72.7--3.630.68392419.7---5.430.785925(SE2383)19.73.3-3.929.48093619.72.9--3.030.88493719.71.7--4.830.38293819.72.80.53.33.426.88185919.72.4-3.130.4859110(SE2384)5.62.0--2.65.856931119.72.8-3.232.084961219.73.30.2-3.030.783941319.72.50.2-2.432.4869514(SE2376)19.72.3--2.933.3869815(SE2385)19.72.6--3.132.785981715.01.8--2.424.859618(SE2377)19.72.3-2,74.031.2839519(SE2378)19.72.6--2.733.8698209.90.97,6-2.211.4521002119,51.9-2.631.988932219.72.54,92.928.273982319.72.6一2.933.286982419.72.53,8-3,029.276982519.73.1--2.732.685982619.72.44.5-2.727.474932719.72.10.2-2.532.087932818.73.30,63,54.926.378902919.73.1-—3.632.2811003014.52.1一-2.823.5839831(SE2382)19.72.3-2.832.887963219.72.9_一3.032.08496實施例2產乙醇非重組細菌的生長速率和發(fā)酵特性在此實施例中，描述了產乙醇非重組細菌的生長速率和發(fā)酵特性。選擇來自上述研究的能在厭氧條件下生長并生產乙醇作為主要發(fā)酵產物的突變菌林SE2378用于進一步研究。生長特性檢查了具有好氧發(fā)酵途徑突變的大腸桿菌突變體的生長特征。在如上面表2所述的豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，菌抹SE2378的好氧生長與野生型大腸桿菌菌林W3110或單或雙(/bc」)或W/l4突變體中的任一個相當。在最小培養(yǎng)基中，菌抹SE2378的好氧生長速率是親本菌抹AH242的約一半。給生長培養(yǎng)基添加乙酸鹽和琥珀酸鹽，會使生長速率恢復至接近親本菌株。盡管菌林SE2378可以好氧生長，甚至在豐富培養(yǎng)基中的生長速率僅是AH240和AH241單突變體的約50%(參見上面表2)。菌林SE2378不能在葡萄糖-最小培養(yǎng)基中好氧生長，這是與戶/i^突變有關的表型(Clark等人，1989)。給最小培養(yǎng)基添加乙酸鹽會支持突變菌抹AH240的生長，但是產乙醇的衍生菌林SE2378不能。除了乙酸鹽以外，菌林SE2378也需要谷氨酸才能在葡萄糖-最小培養(yǎng)基中厭氧生長。以前的研究已經(jīng)證實，產乙醇大腸桿菌菌抹KOll也需要谷氨酸來最佳發(fā)酵木糖(Underwood等人，2004)。該谷氨酸需求可以通過向培養(yǎng)基中加入保護性滲透物甜菜堿來克服。但是，菌林SE2378在最小培養(yǎng)基中厭氧生長的谷氨酸需求不能被甜菜堿所抑制，這暗示著乙酰輔酶A流向(fluxto)2-酮戊二酸鹽(一種谷氨酸前體)的生物合成缺陷，而不是滲透需求。認為乙酰輔酶A會被該乙醇源快速轉化成乙醇，且乙酰輔酶A是生物合成的限速。利用這些添加物，菌株SE2378在最小培養(yǎng)基中的生長速率達到//^親本菌林AH240的生長速率。對于菌株SE2378在葡萄糖-最小培養(yǎng)基中的生長，玉米漿(一種低成本培養(yǎng)基添加物)可以替代谷氨酸。葡萄糖發(fā)酵在pH控制的50g1"葡萄糖發(fā)酵(Hasona等人，2004)中，菌抹43SE2378在約6小時滯后后以0.46h"的比生長速率生長，并生產乙醇作為基本產物(圖3和下面的表4)。由于直接的親本菌株AH242不能好氧生長，將菌株SE2378的發(fā)酵與野生型菌抹W3110的發(fā)酵相對比。W3110在24小時內結束50gl"葡萄糖發(fā)酵，而突變菌林需要約72小時。該差別主要歸因于細胞密度的差異(野生型的干重是2.5mg/ml，而突變體的干重是1.7mg/ml)、2種菌林的糖代謝最大比速率(野生型和突變體分別是4.1-3.3§葡萄糖h"g細胞_1;下面的表5)。菌林SE2378生產約480mmo11"乙醇(22gr1)，占總產物的88%，所迷總產物包含小量的乙酸鹽、乳酸鹽和琥珀酸鹽。這不同于菌林W3U0發(fā)酵，其中乙醇僅占產物的27%,為6.6gl"(表4),與酵母分批發(fā)酵報道的1.6gh"g細胞"值(Smits等人，2000)相比，用菌株SE2378觀察到的最大比生產率(specificproductivity)是1.34gh"g細胞"(表5)。表4:大腸桿菌菌抹SE2378和野生型菌林W3110a的發(fā)酵特征<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>'在添加了50gl"糖、pH7.0的L-肉湯中在37。C進行發(fā)酵。b乙醇產率作為理論最大值(0.51g乙醇/g糖)的分數(shù)，e乙醇作為每摩爾發(fā)酵的葡萄糖的總產物的摩爾分數(shù)，表5:在葡萄糖或木糖上生長的大腸桿菌菌抹SE2378的生長和乙醇生產_<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>Qs'g;消耗的糖L"h";QP,g乙醇L/V;YP/,，g乙醇(g底物)'1q"g消耗的糖(g細胞干重)"h'';qP,(g細胞千重)-'h"木糖發(fā)酵在50g1"木糖好氧發(fā)酵過程中，野生型W3110和突變體SE2378菌林以類似地速率生長，盡管菌林SE2378滯后約8小時(圖3和上面的表4和5)。在木糖上的比生長速率是葡萄糖的80%，這與以前公開的報道相一致(Gonzalez等人2002)。突變菌林比野生型W3110更快地發(fā)酵木糖。48小時后，菌抹SE2378的木糖利用超過了葡萄糖利用。用菌林SE2378回收的發(fā)酵產物的約88%是乙醇；20gr1來自50g1"的木糖。菌林SE2378利用木糖的乙醇最大比生產率是2.23gh"g細胞"。W3110和SE2378利用木糖的乙醇比生產率均高于利用葡萄糖，如表5所示。這可以指示來自木糖代謝的更低的能量產量(Hasona等人，2004)。對于野生型，來自木糖的凈ATP產率是僅約1.5/木糖，不同于3.0/葡萄糖。這需要細胞使用更多的木糖來生產相同量的細胞質量。但是，野生型的木糖消耗比速率僅輕微高于葡萄糖(4.93對比4.10gh"g細胞")，如上面表5所示，因而解釋了與葡萄糖發(fā)酵相比更低的細胞產率和更長的發(fā)酵時間。相反，菌林SE2378缺少丙酮酸甲酸裂合酶，該酶對于在最小培養(yǎng)基中的木糖發(fā)酵而言是關鍵的(Hasona等人2004)。由于該突變，菌林SE2378中來自木糖發(fā)酵的凈計算ATP產率是僅0.67/木糖顯然，該更低的ATP產率驅動該產乙醇突變體中的高木糖流量。2.23gh"g細胞"的來自木糖的乙醇比生產率高于酵母在葡萄糖上的1.6gh"g細胞"值(Smits等人2000)，和攜帶運動發(fā)酵單胞菌/^c一a說基因的產乙醇大腸桿菌菌林KOll在葡萄糖和木糖上(約2gh.1g細胞")。這些結果表明，非重組SE2378突變體從葡萄糖和木糖生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。此外，乙醇生產速率與其它產乙醇生物相當。實施例3來自非重組產乙醇大腸桿菌的突變型lpd基因的鑒別在此實施例中，描述了來自大腸桿菌菌株SE2377、SE2378、SE2382、SE2383、SE2384、SE2385的突變型lpd基因的鑒別。通過zac::Tn/0共轉導，描繪非重組產乙醇大腸桿菌突變菌林中的突變圖鐠。當通過共轉導刪除^0尸-/^/^-""￡尸基因時(圖5),轉導子喪失在厭氧條件下在含有1%葡萄糖的LB中生長的能力，而在野生型背景下的相同缺失不會影響厭氧生長。這些結果暗示著丙酮酸脫氫酶在菌抹SE2378的厭氧生長中的作用。引起鑒別的SE2377、SE2378、SE2382突變菌株中的產乙醇表型的突變繪制在丙酮酸脫氫酶基因基因座中。丙酮酸脫氫酶復合物(PDH)由3個酶組成丙酮酸脫氫酶/脫羧酶(酶1，El),硫辛酸轉乙?；?酶2，E2)，和二氫硫辛酰胺脫氫酶(酶3，E3)亞基。已知pdhR啟動子是/^/^-ace￡F-//^基因轉錄的啟動子，盡管存在aceEF和/戶W基因的獨立啟動子(Quail等人，1995)。由于PDH操縱子的表達受到pdhR蛋白的負調節(jié)(Quail等人，1995),對SE2377、SE2378、SE2382的pdhR基因測序(圖6A)。菌抹SE2378的序列分析揭示了在pdhR的編碼區(qū)內的2個突變1個氨基酸替換(S12P)和1個亮氨酸氨基酸插入作為氨基酸118。在/^//^基因和"ce五基因之間的基因間區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了G至A的另一種核苷酸替換(圖6B)。菌林SE2377和SE2382不攜帶在基因組DNA的pdhR-aceEF區(qū)域中的任何突變。但是，這些菌株、以及菌抹SE2383、SE2384和SE2385都具有在/;c/基因中的單個突變(圖5A)。PdhR蛋白是/^/^-//^/操縱子的丙酮酸鹽響應性調節(jié)物，因而該蛋白中的突變不在意料之外。除了在轉錄的/7t^/幵始處的起始位點以外，可以含有它自己的"^￡^-//^轉錄起始位點。因而，基因間區(qū)域中的突變也可以支持厭氧細胞中高水平的ace五/^/;^表達。以前已經(jīng)報道，好氧生長的大腸桿菌中PDH復合物的丙酮酸脫氬酶/脫羧酶活性的水平比厭氧生長的細胞高約5倍(deGraef等人,1999)。這些結果提供了在本發(fā)明的鑒別出的產乙醇大腸桿菌菌株中的突變的位置。實施例4lpd基因中的突變負責產乙醇表型在此實施例中，證實了PDH復合物、具體而言//^/基因中的突變是產乙醇表型的成因。菌林SE2378的初步基因分析揭示，引起厭氧生長和高乙醇生產的突變位于編碼PDH復合物的基因(pdh基因座://7句處或其附近。為了證實菌林SE2378的產乙醇表型需要PDH，將aceF基因(二氫硫辛酸乙酰轉移酶；PDH的E2酶)中的突變轉導進菌抹YK1,即缺少卡那霉素抗性基因的菌抹SE2378的衍生物。轉導子菌抹YK93喪失了厭氧生長能力，如下面的表6所示。表6:具有基因座(aceF)中的突變的產乙醇大腸桿菌菌林SE2378的生長特征菌抹基因型比生長速率(h")好氧厭氣LB最低最低(+Ace,Succ)LB最低W3U0野生型1.311.050.970.980.51YK1530.46NG0.551.070.44YK29諷,1.290.990.99NGNG47YK152YK29'arceF0.83NG0.50NGNGYK1，，固,加+1.140.510.830.41NG*YK93YK1'acef0.68NG0.46NGNGYK157YK152，"C(W3110)1.320.960.87NGNGYK158YK152,鵬F"(SE2378)1.170.510.800.45NG*最小-沒有添加或添加乙酸鹽和琥珀酸鹽(各自lmg/ml)的葡萄糖最小培養(yǎng)基。NG-不生長*2種產乙醇衍生物需要乙酸鹽和琥珀酸鹽用于菌抹SE2378在最小培養(yǎng)基中的厭氣生長。該厭氧負表型的菌抹YK93類似于菌抹AH242，即菌抹SE2378的親本。盡管^eF突變體在最小培養(yǎng)基中是好氧負型的，這是由于該細胞不能生產乙酰輔酶A用于生物合成，在厭氧生長條件下該功能由PFL催化，因而，aceF突變不會影響大腸桿菌(菌株YK153,具有突變的W3110，如表6所示)的厭氧生長。菌林YK93的厭氧生長在測試的所有培養(yǎng)基中是有缺陷的。通過含有來自W3110(野生型)或SE2378(乙醇源)的基因的噬菌體P1，將菌抹YK152中的aceF突變轉導進"ce,，選擇轉導子在好氧條件下在最小培養(yǎng)基中的生長。也測試轉導子的厭氧生長和發(fā)酵產物。接受來自野生型菌林W3110的ace/^基因的轉導子在最小培養(yǎng)基中好氧生長，但是不能在任意測試的培養(yǎng)基中厭氧生長，這是由于存在/c/Z^和；/^突變。接受來自菌抹SE2378的aceF+基因的所有轉導子都厭氧生長，且所有測試的轉導子生產乙醇作為主要發(fā)酵產物。這些結果表明，菌株SE2378的產乙醇表型需要完整的p^基因座和PDH活性，且與PDH-依賴性的乙醇生產途徑相一致(參見圖8C)。在該高乙醇生產途徑中，丙酮酸鹽被PDH氧化脫羧成乙酰輔酶A，并被醇脫氬酶進一步還原成乙醛和乙醇(圖8C)。乙酰輔酶A生產所需的aceF(PDH-負型；菌抹YK93)或乙醇生產所需的ad/^(ADH負型；菌林YK91)的缺失會導致厭氧生長負表型，這支持了該途徑在缺少發(fā)酵乳酸脫氫酶和丙酮酸甲酸裂合酶的菌株SE2378的高乙醇生產和還原氧化平衡中的作用。在下一組實驗中，證實了//^/基因是產乙醇表型的成因。將來自野生型菌抹W3110和來自產乙醇突變菌抹SE2378的//c/基因克隆進表達栽體，用于從trc啟動子生產Lpd蛋白，以IPTG作為誘導物。將這些質粒轉化進具有下述3個缺失的菌林YK100:W/zJ，(/b"-;^5)，和除了3個突變以外，菌林YK100類似于W3U0菌林。由于這3個缺失，菌林YK100在測試的所有培養(yǎng)基中是厭氧生長缺陷的，在最小培養(yǎng)基中是好氧生長缺陷的。如前面所討論的，丙酮酸脫氫酶復合物(PDH)由3個酶組成丙酮酸脫氫酶/脫羧酶(酶l)，硫辛酸轉乙酰基酶(酶2)，和硫辛酰胺脫氬酶(酶3)。大腸桿菌的好氧生長受到PDH復合物的3個組分中的任一個的突變的損傷。將含有來自菌林W3110的//7"基因(//^+)的質粒pKY32(圖7A)或含有來自菌林SE2378的突變型//^基因(//^*)的質粒pKY33(圖7B)轉化進菌林YK100,并選擇氨節(jié)西林抗性的轉化體。這些轉化體是PDH-陽性的，如通過在最小培養(yǎng)基中的好氧生長所觀察到的；PDH復合物的酶1和酶2來自染色體，//7d來自質粒。僅具有攜帶來自產乙醇SE2378菌林的//^基因的質粒pKY33的轉化體能在厭氧條件下生長。乙醇是來自菌抹YK100/pKY33(稱作YK129)的廢培養(yǎng)基中的主要發(fā)酵產物。相反，具有攜帶來自W3U0的天然//^基因的質粒pKY32的菌林YK100不能在厭氧條件下生長?？傊?，這些結果表明，LPD蛋白引起了觀察到的丙酮酸脫氬酶復合物在厭氧生長條件下的活性，并進一步表明，Lpd的突變形式足以支持大腸桿菌的高乙醇生產。大腸桿菌的//^突變體產乙醇的原因是它的生產4NADH/葡萄糖的能力。實施例5//d基因中的突變負責NADH不敏感性在此實施例中，證實了//^基因中的突變會造成NADH不敏感性。更具體地，發(fā)現(xiàn)在野生型(天然)酶中NADH敏感的二氫硫辛酰胺脫氫酶(LPD)活性在突變體中變成NADH-不敏感的，如圖IO和圖ll所示。因為LPD是丙酮酸脫氫酶復合物(PDH)的一種組分，LPD的該NADH不敏感性從產乙醇突變體攜帶至PDH。在葡萄糖-礦物鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌野生型菌株W3110或產乙醇突變菌株SE2378至指數(shù)生長期中期。然后收獲細胞，并制備提取物。用丙酮酸鹽和NAD作為底物，用不同濃度的NADH作為酶活性的抑制劑，測定細胞提取物中的酶活性。圖10顯示了NADH對PDH活性的抑制。在上圖中，對于野生型菌抹W3110和產乙醇突變菌林SE2378，NAD濃度是2mMNAD。在下圖中，對于來自菌林W3110的天然酶，NAD濃度是2mMNAD;對于來自菌林SE2378的突變形式的酶，是1mM。通過PCR擴增來自大腸桿菌野生型菌林W3U0和產乙醇突變菌林SE2378的//^基因，并克隆進蛋白表達栽體pET15b。通過對插入DNA測序，驗證選擇的質粒中//7d基因的DNA序列。誘導質粒中//7t/基因的表達，并純化蛋白。在逆反應中測定酶活性，其中2種底物是硫辛酰胺(3mM)和NADH(0.1mM),在含有1.5mMEDTA的0.1M磷酸鉀緩沖液pH8.0中。圖11顯示了NADH對LPD的抑制。在這些條件下，天然酶不具有可檢測的活性，如圖11中的圖所示。NAD(即反應產物)是酶活性的必需激活劑，且活性隨著NAD濃度的增加而增加。為天然和突變形式的酶測定NADH/NAD比對酶活性的影響，結果如圖11所示。PDH由所有好氧生物(從細菌到人類)生成。該酶將丙酮酸鹽氧化脫羧成乙酰輔酶A、C02和NADH，然后乙酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)，用于進一步氧化和隨后的能量生產。在大腸桿菌中，PDH在好氧和厭氧條件下生成。但是，在厭氧條件下，由于NADH對PDH的抑制，該酶是無活性的。NADH通常以更高的濃度存在于厭氧細胞中，從而預防不能被缺少外部電子受體的細胞氧化的NADH的產生。結果，細胞僅生產2NADH/葡萄糖，第二組還原劑作為氫氣釋放。因為一個乙酰輔酶A還原成乙醇需要2個NADH,野生型細胞不能生成2個乙醇/葡萄糖。在本發(fā)明的產乙醇突變菌株中，PDH對NADH更不敏感。該降低的敏感性允許酶甚至在厭氧條件下在更高的NADH池下起作用。由于該生化變化，細胞可以生產4個NADH分子/葡萄糖(2個來自糖酵解，2個來自PDH反應)。所有4個NADH用于將2個乙酰輔酶A還原成50乙醇，使突變體成為高乙醇生產者。在生化上和生理上，所述細胞是高乙醇生產者，這是因為PDH對NADH的敏感性的降低，和它的甚至在高NADH/NAD比下起作用的能力。最后，在另一個實驗(數(shù)據(jù)未顯示)中，將在菌林SE2378中發(fā)現(xiàn)的LPD的突變(E354K)在類似位置導入?yún)捬跎锟莶菅挎邨U菌的LPD中。E356K突變支持突變體(MR1)的厭氧生長。實施例6來自其它生物的LPD序列的對比比對在此實施例中，進行了來自不同生物的二氫疏辛酰胺脫氫酶(LPD)的氨基酸序列的對比比對。丙酮酸脫氪酶(PDH)存在于從細菌到人類的所有好氧生物中。LPD是PDH酶復合物的基本組分，它存在于PDH復合物和2-酮戊二酸脫氫酶復合物中。在大腸桿菌中，lpd由這2種酶復合物共有，由于該需求，除了位于/^/^基因上游的啟動子以外，//^基因從一個獨立啟動子轉錄。Lpd同系物存在于所有生命領域中。在細菌菌林中，Lpd蛋白是從458至581個氨基酸，無水分子量為49000至62000Da。在下面的表7中顯示了來自不同種系發(fā)生分類的細菌的20種Lpd同系物的氨基酸序列同一性。使用在NCBI的Blast服務器或在歐洲生物技術研究所的ClustalW，將來自不同生物的二氫硫辛酰胺脫氫酶的氨基酸序列與大腸桿菌LPD蛋白的氨基酸序列相對比。從2個數(shù)據(jù)庫中的任一個，得到特定序列與大腸桿菌序列的同一性百分比。括號中的值代表特定蛋白與大腸桿菌Lpd的總相似性，并包括相同的氨基酸位置以及發(fā)生保守替換的位置。對于枯草芽孢桿菌，在對比中包括2種二氫硫辛酸脫氫酶，一種來自PDH復合物，另一種來自3-羥基丁酮脫氫酶。序列同一性從巴氏甲烷八疊球菌(一種古細菌(archaeon))的低值24。/。至鼠傷寒沙門氏菌菌林LT2(—種革蘭氏陰性細菌)的98%。鼠傷寒沙門氏菌LT2LPD蛋白與大腸桿菌LPD最密切相關，這與兩種細菌分類為同一科腸桿菌科中的革蘭氏陰性細菌相一致。將大腸桿菌菌林51W3U0或MG1655Lpd氨基酸序列與來自不動桿菌ADP1、蠟樣芽孢桿菌ATCC10987、枯草芽孢桿菌菌林168、破傷風梭菌菌抹麻薩諸塞/E88、谷氨酸棒狀桿菌菌林ATCC13032、金屬還原地桿菌GS-15、氧化葡萄糖酸桿菌621H、干酪乳桿菌ATCC334、乳酸乳球菌乳脂亞種SKll、植物乳桿菌WCFS1、巴氏甲烷八疊球菌菌林Fusaro、酒類酒球菌MCWPSU-1、綠膿假單胞菌PA01(ATCC15692)、球形紅細菌2.4.1、鼠傷寒沙門氏菌LT2、希瓦氏菌ANA-3、變形鏈球菌ATCC700610、天藍色鏈霉菌M145、嗜熱厭氧產乙醇桿菌、費希爾氏弧菌菌林ATCC700601的已知Lpd序列相比對。同源性比對如圖9所示[該圖將重新編號]。當對比總同一性百分比時，大腸桿菌LPD似乎與其它革蘭氏陰性LPD最相似；但是，當基于保守替換計算同一性百分比時，表4反映了檢查的不同生物的LPD蛋白之間更高的同源性百分比。例如，枯草芽孢桿菌菌林168LPD蛋白與大腸桿菌LPD蛋白相比較的氨基酸序列同一性是34%。但是，考慮保守替換，同一性評分增加至57%。從比對圖可以看出，幾個氨基酸在來自非常多樣的生物群體的20種丄尸D同系物組中是高度保守的。生物之間共有的殘基用星號突出顯示。目標區(qū)域標有下劃線。在分析的不同生物的序列中，序列同一性在N-末端區(qū)域最高。在氨基酸40至55(大腸桿菌LPD編號)之間可以看到序列同一性，它代表可能的黃素位點。另一個相似性區(qū)域是在氨基酸180至1卯。在序列中存在幾個位置，這里的氨基酸殘基在來自分析的不同生物的所有20種LPD中是保守的。值得注意的是，氨基酸位置322編碼組氨酸(H)，在本發(fā)明的3個菌株(SE2377、SE2383和SE2382)中，存在在位置322的組氨酸向酪氨酸(Y)的突變。在位置322的組氨酸在來自從革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細菌至古細菌的所有20種LPD中是保守的。在該不同范圍內保守的其它殘基包括在位置355的脯氨酸(18/20LPD)和在位置356的谷氨酸(17/20LPD)。表7:大腸桿菌LPD蛋白與來自其它生物的LPD同系物的氛基酸序列同一性<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>a代表同一氨基酸以及保守氨基酸變化參考文獻BothastRJandSchlicherMA.2005.Biotechnologicalprocessesforconversionofcomintoethanol,Appl.Microbiol.Biotechnol.67:19-25.Clark，DP.1989.ThefermentationpathwaysofEscAer/c/^aco/Z.FEMSMicrbiol.Rev.5:223-234.DatsenkoandWanner.2000.One-stepinactivationofchromosomalgenesin￡Wzm'ctoco//K-12usingPCRproducts.PNASUSA97:6640-6645.DeGraefMR，AlexeevaS，SnoepJL,TeixeiradeMattosMJ.1999.Thesteadystateinternalredoxstate(NADH/NAD)reflectstheexternalredoxstateandiscorrelatedwithcatabolicadaptationinEscherichiacoli.J.Bacteriol.181:2351-2357.GonzalezR，TaoH,ShanmugamKT，YorkSW，IngramLO.2002,GlobalgeneexpressiondifferencesassociatedwithchangesinglycolyticfluxandgrowthrateinEsc/zmcteco/zduringfermentationofglucoseandxylose.Biotechnol.Prog.18:6-20.HasonaA,KimY，HealyFG，IngramLOandShanmugamKT.2004.Pyruvateformatelyaseandacetatekinaseareessentialforanaerobicgrowthof^c/jm'c/n'aco/ionxylose.J.Bacteriol.186:7593-7600.IngramLO,AldrichHC,BorgesAC,CauseyTB，MartinezA，MoralesF，SalehA，UnderwoodSA,YomanoLP,YorkSW,ZaldivarJ，ZhouS.1999.Entericbacterialcatalystsforfuelethanolproduction.Biotechnol.Prog.15:855-866.KhesghiHS，PrinceRC，MarlandG.2000.Thepotentialofbiomassfuelsinthecontextofglobalclimatechange:focusontransportationfuels.Ann.Rev.EnergyEnv.25:199-244.KuyperM，ToirkensMJ,DiderichJA,WinklerAA,vanDijkenJP，PronkJT(2005)Evolutionaryengineeringofmixed-sugarutilizationbyaxylose-fermentingSacc/zaro/nyc&scerev濾estrain.FEMSYeastRes.5:925-934.LeeJH，PatelP,SankarP，ShanmugamKT(1985)IsolationandcharacterizationofmutantstrainsofEsc/zen'c/^'aco//alteredinH2metabolism.J.Bacteriol.162:344-352.MaolySandNunnWD.1981.Selectionforlossoftetracyclineresistanceby￡Wzmctoco/z.丄Bacteriol.145:1110-1112.ManiatisT,"a/.MolecularCloning.A.LaboratoryManual.CSHLab.N.Y.(1989)Mat-JanF,AlamKY,ClarkDP(1989)Mutantsof5"油〃c/naco//deficientinthefermentativelactatedehydrogenase.丄Bacteriol.171:342-348.MohagheghiA，DoweN，SchellD,ChouY,EddyC，ZhangM(2004)PerformanceofanewlydevelopedintegrantofZ;ymomowoswo敲sforethanolproductiononcornstoverhydrolysate.Biotechnol,Lett26:321-325.Patel，MA,OuMS,HarbruckerHC，AldrichML，BuszkoML，IngramLO,ShanmugamKT.2006.Isolationandcharacterizationofacid-tolerant,thermophilicbacteriaforeffecti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或權利要求36的細菌宿主細胞，其中所述革蘭氏陰性細菌選自不動桿菌、葡萄糖酸桿菌、埃希氏桿菌、地桿菌、謝瓦納拉菌、沙門氏菌、腸道細菌和克雷白桿菌。48.權利要求1-7中任一項的分離的非重組細菌、權利要求18的分離的核酸分子、權利要求27的分離的多肽或權利要求36的細菌宿主細胞，其中所述細菌是革蘭氏陽性細菌。49.權利要求1-7中任一項的分離的非重組細菌、權利要求18的分離的核酸分子、權利要求27的分離的多肽或權利要求36的細菌宿主細胞，其中所述革蘭氏陽性細菌選自芽孢桿菌、梭菌、棒狀桿菌、乳酸桿菌、乳球菌、酒球菌、鏈球菌和真細菌。50.權利要求1-7中任一項的分離的非重組細菌、權利要求18的分離的核酸分子、權利要求27的分離的多肽或權利要求36的細菌宿主細胞，其中所迷細菌是大腸桿菌。51.權利要求4或7的分離的非重組細菌，其中所述突變包含用另一個氨基酸替換突變的//^基因表達的多肽中的一個氬基酸,其中所述替換改變所述多肽的pK。52.權利要求51的分離的非重組細菌，其中所述多肽包含SEQIDNO:6,且所述突變包含在下述位置用另一個氨基酸替換野生型氨基酸a)SEQIDNO:6中的位置322或在位置322的任一側約50個位置內的任意位置；或b)SEQIDNO:6中的位置354或在位置354的任一側約50個位置內的任意位置。53.權利要求51或52的分離的非重組細菌，其中所述另一個氨基酸是選自下述的中性氨基酸丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。54.權利要求51或52的分離的非重組細菌，其中所述另一個M酸是選自下述的堿性氨基酸精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸和賴氨酸。55.權利要求52的分離的非重組細菌，其中所迷突變包含用任意M酸替換在位置322處的H,使得該氨基酸替換增加由突變的/pd基因表達的多肽的酸度。56.權利要求55的分離的非重組細菌，其中所述突變包含將SEQIDNO:6中位置322處的H替換為Y。57.權利要求52的分離的非重組細菌，其中所述突變包含用任意氨基酸替換在位置354處的E,使得該氨基酸替換降低由突變的/;^基因表達的多肽的酸度。58.權利要求57的分離的非重組細菌，其中所述突變包含將SEQIDNO:6中位置354處的E替換為K。59.權利要求56的分離的非重組細菌，其中所述細菌是大腸桿菌菌抹SE2377。60.權利要求59的分離的非重組細菌，其中所述細菌包含SEQIDNO:l或其片段。61.權利要求58的分離的非重組細菌，其中所述細菌是大腸桿菌菌林SE2378。62.權利要求61的分離的非重組細菌，其中所述細菌包含SEQIDNO:3或其片段。63.權利要求58的分離的非重組細菌，其中所述細菌是大腸桿菌菌抹SE2382。64.權利要求63的分離的非重組細菌，其中所述細菌包含SEQIDNO:3或其片段。65.權利要求56的分離的非重組細菌，其中所述細菌是大腸桿菌菌抹SE2383。66.權利要求65的分離的非重組細菌，其中所迷細菌包含SEQIDNO:1或其片段。67.權利要求56的分離的非重組細菌，其中所述細菌是大腸桿菌菌抹SE2384。68.權利要求67的分離的非重組細菌，其中所述細菌包含SEQIDNO:l或其片段。69.權利要求58的分離的非重組細菌，其中所述細菌是大腸桿菌菌抹SE2385。70.權利要求69的分離的非重組細菌，其中所述細菌包含SEQIDNO:3或其片段。71.權利要求56-70中任一項的分離的非重組細菌，其中所迷細菌適用于從糖生產乙醇。72.分離的非重組細菌，其包含具有一個或多個突變的/;^基因，其中所述突變使該非重組細菌能在厭氧條件下生產乙醇作為基本發(fā)酵產物，其中所述細菌通過包括下述步驟的方法來制備a)在厭氧生長條件下在富含糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌的候選突變菌林；和b)選擇生產乙醇作為主要發(fā)酵產物的突變體。73.權利要求72的方法，其中生產的乙醇在厭氧條件下包含大于50%的總非氣發(fā)酵產物。74.生產權利要求1-8中任一項的非重組細菌的方法，其包括下述步驟a)在厭氧生長條件下在富含糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌的候選突變菌株；和b)選擇生產乙醇作為主要發(fā)酵產物的突變體。75.權利要求72的方法，其中生產的乙醇在厭氧條件下包含大于50%的總非氣發(fā)酵產物。76.權利要求72的分離的非重組細菌或權利要求74的方法，其中所述突變體源自自發(fā)突變。77.權利要求72的分離的非重組細菌或權利要求74的方法，其中所述細菌暴露于誘變劑。78.權利要求72的分離的非重組細菌或權利要求74的方法，其中所迷誘變劑選自乙基甲磺酸、2-氨基嘌呤、ICR-191、甲基甲磺酸、N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍。79.權利要求78的分離的非重組細菌或方法，其中所述誘變劑是乙基80.權利要求72的分離的非重組細菌或權利要求74的方法，其中富含糖的培養(yǎng)基中的糖選自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖和乳糖。81.權利要求72的分離的非重組細菌或權利要求74的方法，還包括滅活細菌中的替代發(fā)酵途徑的步驟。82.權利要求72的分離的非重組細菌或權利要求74的方法，其中所述替代發(fā)酵途徑通過向細菌中導入缺失突變來滅活。83.權利要求72的分離的非重組細菌，其中所述細菌在沒有突變時不產乙醇。84.權利要求83的分離的非重組細菌，其中乙醇是次要發(fā)酵產物，且包含小于40%的總非氣發(fā)酵產物。85.權利要求72的分離的非重組細菌，其中細菌在厭氧條件下生產乙醇作為基本發(fā)酵產物。86.權利要求85的分離的非重組細菌，其中生產的乙醇在厭氧條件下包含大于50%的總非氣發(fā)酵產物。87.權利要求72的分離的非重組細菌，其中所述突變提供高乙醇發(fā)酵途徑。88.權利要求87的分離的非重組細菌，其中細菌中的一個或多個替代發(fā)酵途徑被滅活。89.權利要求88的分離的非重組細菌，其中所述替代發(fā)酵途徑被突變滅活。90.權利要求88的分離的非重組細菌，其中所述替^R發(fā)酵途徑包括乳酸脫氬酶(W/0的乳酸生產，從丙酮酸甲酸裂合酶(R/0開始的乙酸、乙醇、甲酸、H2和C02，以及琥珀酸。91.從寡糖源生產乙醇的方法，其包括，使所述寡糖接觸權利要求1-8中任一項的分離的非重組細菌或權利要求36的細菌宿主細胞，從而從寡糖源生產乙醇。92.權利要求91的方法，其中所述寡糖選自木質纖維素、半纖維素、纖維素、果膠和其任意組合。93.試劑盒，其包含權利要求1-8中任一項的分離的非重組細菌和用于生產乙醇的說明書。94.權利要求93的試劑盒，其還包含糖源。95.由保藏號為NRRLB-30967的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表的大腸桿菌菌株AH218。96.由保藏號為NRRLB-30968的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表的大腸桿菌菌林AH241。97.由保藏號為NRRLB-30969的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表的大腸桿菌菌株AH242。98.由保藏號為NRRLB-30970的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表的大腸桿菌菌株SE2377。99.由保藏號為NRRLB-30971的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表的大腸桿菌菌林SE2378。100.由保藏號為NRRLB-30972的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表的大腸桿菌菌林SE2382。101.由保藏號為NRRLB-30973的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表的大腸桿菌菌抹SE2383。102.由保藏號為NRRLB-30974的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表的大腸桿菌菌抹SE2384。103.由保藏號為NRRLB-30975的農業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心的保藏材料代表的大腸桿菌菌株SE2385。104.權利要求4、7或72的分離的非重組細菌，其中//^/基因中的突變造成NADH不敏感性。105.權利要求72、74或91的方法或權利要求93的試劑盒，其中所述突變體源自//7d基因中的突變。106.權利要求105的方法或試劑盒，其中/;wf基因中的突變造成NADH不敏感性。全文摘要公開了生產乙醇作為基本發(fā)酵產物的非重組細菌，有關的核酸和多肽，使用所述細菌生產乙醇的方法，和試劑盒。文檔編號C12P7/06GK101657541SQ200780025274公開日2010年2月24日申請日期2007年4月26日優(yōu)先權日2006年5月1日發(fā)明者K·桑穆加姆,L·O·因格拉姆,Y·金申請人:佛羅里達大學研究基金會