專利名稱：：早期促腦發(fā)育用嬰兒代乳品的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及含有豐富乳清濃縮蛋白、二十二碳六烯酸和花生四烯酸精選組合物的嬰兒代乳品，以更好地模擬天然人乳成分并促進嬰兒早期大腦發(fā)育。
背景技術：
：當前市售的嬰兒代乳品普遍用作新生兒的營養(yǎng)補充或單獨的營養(yǎng)來源。這些代乳品都含有多種營養(yǎng)成分，以滿足生長中的嬰兒的營養(yǎng)需要，典型地包括脂肪、糖類、蛋白質、維生素、礦物質和其它有助于嬰兒最佳生長發(fā)育的營養(yǎng)成分。市售嬰兒代乳品被設計成盡可能地和人乳的成分和功能相接近。在美國，聯(lián)邦食品、藥物與化妝品法(FFDCA)將嬰兒代乳品定義為"一用于單獨作為嬰兒專門食品的食物"(FFDCA201(z))。按照FFDCA的準則，定義美國非免檢的市售嬰兒代乳品必須含有基礎營養(yǎng)成分。每100千卡路里代乳品中的這些營養(yǎng)成分包括蛋白質(相當于至少1.8-4.5g酪蛋白),脂肪(3.3-6.0g)，亞油酸(至少300mg),視黃醇等價物維生素A(75-225mcg),維生素D(40-100IU)，維生素K(至少4.0mcg)，維生素E(每g亞油酸至少0.7IU),維生素C(至少8.0mg)，維生素B！(至少40mcg),維生素B2(至少60mcg),維生素B6(至少35.0mcg，每g代乳品蛋白質中含15mcg),維生素B12(至少0.15mcg)，煙酸(至少250mcg),葉酸(至少4.0mcg),泛酸(至少300.0mcg)，生物素(至少1.5mcg)，膽堿(至少7.0mg),肌醇(至少4.0mg)，鈣(至少50.0mg),磷(至少25.0mg，鈣磷比為1.1-2.0),4美(至少6.0mg),鐵(至少0.15mg)，碘(至少5.0mcg),鋅(至少0.5mg),銅(至少60.0mcg),錳(至少5.0mcg),鈉(20.0-60.0mg)，鉀(80.0-200.0mg)和氯(55.0-150.0mg)。盡管有嚴格的管理控制，但市售的嬰兒代乳品與人乳相比，其成分和功能均不一致。在人乳中已鑒別出近200種不同的化合物，其中超過100種在市售代乳品中含量很少或根本沒有。這些化合物包括多種免疫球蛋白、酶、激素、某些蛋白質、乳鐵傳遞蛋白、神經(jīng)節(jié)苷脂、磷脂(鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇)等等。這些化合物中很多為人乳所獨有，或在牛奶和其他用于制造嬰兒代乳品的蛋白質原料中少量存在。因此，一直以來存在尋找新的含有更多人乳中天然成分的嬰兒代乳品的需求，為目前接受母乳喂養(yǎng)的嬰兒提供更多營養(yǎng)來源。本發(fā)明涉及具有精選的多種人乳中存在的天然成分及其濃縮物的嬰兒代乳品，包括二十二碳六烯酸、花生四烯酸、磷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂和唾液酸。由于這些精選成分及其相應濃縮物的優(yōu)點，該類代乳品的營養(yǎng)狀況和傳統(tǒng)嬰兒代乳品相比更接近人乳。然而，這些代乳品除了可以更好地模擬人乳中的天然成分，還可以促進3-4個月大的嬰兒的成神經(jīng)細胞遷移，因此可提供有助于促進大腦和認知發(fā)育的代乳品。有趣的是，代乳品的成神經(jīng)細胞遷移作用僅能發(fā)生在新生階段(詳見動物試驗部分)，提示在嬰兒早期有選擇地使用該類代乳品是重要的。發(fā)明概述本發(fā)明的第一個實施方案涉及嬰兒代乳品，其含有按風干基計至少約6.5g/L的豐富乳清濃縮蛋白、以總脂肪酸質量計至少約0，13%的二十二碳六烯酸、和以總脂肪酸質量計至少約0.25。/。的花生四烯酸。該類代乳品按風干基計還可以包括至少5mg/L的神經(jīng)節(jié)苷脂，至少150mg/L的磷脂，以及至少70mg/L的具有至少約2.5°/。脂質結合唾液酸的總唾液酸，上迷成分可以全部或部分由豐富乳清濃縮蛋白提供。本發(fā)明的第二個實施方案涉及促進2-4個月大的嬰兒成神經(jīng)細胞遷移的方法，所述方法包括口服給予嬰兒代乳品，該代乳品含有按風干基計至少約6.5g/L的豐富乳清濃縮蛋白，以總脂肪酸質量計至少約0.13%的二十二碳六烯酸，和以總脂肪酸質量計至少約0.25%的花生四烯酸。該類代乳品按風干基計還可以包括至少約5mg/L的神經(jīng)節(jié)苷脂，至少約50mg/L的磷脂，和至少約70mg/L的具有至少約2.5°/。脂質結合唾液酸的總唾液酸，上述成分可以全部或部分由豐富乳清濃縮蛋白提供。本發(fā)明的第三個實施方案涉及促進嬰兒，特別是2-4個月大的嬰兒認知發(fā)育的方法，所述方法包括口服給予嬰兒代乳品，該代乳品含有按風干基計至少約6.5g/L的豐富乳清濃縮蛋白，以總脂肪酸質量計至少約0.13。/。的二十二碳六烯酸和以總脂肪酸質量計至少約0.25%的花生四蹄酸。該類代乳品按風干基計還可以包括至少約5mg/L的神經(jīng)節(jié)苷脂，至少約150mg/L的磷脂，至少約70mg/L的具有至少約2.5%脂質結合唾液酸的總唾液酸，上述成分可以全部或部分由豐富乳清濃縮蛋白提供。發(fā)現(xiàn)這些代乳品不僅可更好地模擬人乳中已發(fā)現(xiàn)的天然成分，還可以促進嬰兒早期的成神經(jīng)細胞遷移，因此可提供有助于促進大腦和認知發(fā)育的嬰兒代乳品。有趣的是，代乳品的成神經(jīng)細胞遷移作用僅能發(fā)生在新生階段(詳見動物試驗部分)，提示在嬰兒早期有選擇地使用該類代乳品是重要的。還發(fā)現(xiàn)只有在組合物中使用豐富乳清濃縮蛋白以及更高含量水平的二十二碳六烯酸和花生四烯酸時才能產(chǎn)生成神經(jīng)細胞遷移作用。同樣成分，但二十二碳六烯酸和花生四烯酸濃度較低時，不會顯著改變所選模型動物的成神經(jīng)細胞遷移。還發(fā)現(xiàn)代乳品中含有的豐富乳清濃縮蛋白高于本發(fā)明中定義的閾值時才會產(chǎn)生對成神經(jīng)細胞遷移的作用。圖1.1顯示本發(fā)明所述動物實驗中豬腦截面的組織學測定(試驗1)。圖1.2是圖1.1中豬腦的放大區(qū)，顯示用血毒素:曙紅(H&E)染色的表皮下區(qū)域，顏色更深的點是核子，成神經(jīng)細胞遷移從表皮下部分向白質發(fā)展(試驗1)。圖1.3顯示圖1.2中用于核子計數(shù)的放大豬腦區(qū)中1、2、3區(qū)域；區(qū)域1是下胼肢體神經(jīng)束，成神經(jīng)細胞遷移和增殖區(qū)域；區(qū)域2是避免成神經(jīng)細胞聚集的遷移區(qū)域；區(qū)域3是靠近下胼肢體神經(jīng)束的白質(試驗1)。圖2三條曲線分別代表對豬仔按不同食物飼養(yǎng)本試驗所述的時間后其下胼肢體神經(jīng)束中區(qū)域1、2、3的核子計數(shù)。數(shù)據(jù)用平均值土標準偏差值表示。A:與初始時間存在顯著性差異，p<0.05;b:與8-9天時出現(xiàn)顯著性差異，p<0.05;*:與食物A存在顯著性差異，p<0.05(試驗1)。圖3.1包括豬仔服用不同食物(A、B、C)或豬奶后下胼肢體神經(jīng)束中用H&E染色的核子數(shù)量曲線(試驗II)。圖3.2包括豬仔服用不同食物(A、B、C)或豬奶后靠近下胼肢體神經(jīng)束的白質中用H&E染色的核子數(shù)量曲線(試驗II)。圖3.3包括豬仔服用不同食物(A、B、C)或豬奶后下胼肢體神經(jīng)束中BrdU陽性細胞數(shù)量曲線(試驗II)。圖4.1包括豬仔服用不同食物(A、B、C)或豬奶后靠近下胼肢體神經(jīng)束的白質中BrdU陽性細胞數(shù)量曲線(試驗II)。圖4.2包括豬仔服用不同食物(A、B、C)或豬奶后下胼肢體神經(jīng)束中Ki67陽性細胞數(shù)量曲線(試驗II)。圖4.3包括豬仔服用不同食物(A、B、C)或豬奶后靠近下胼肢體神經(jīng)束的白質中Ki67陽性細胞數(shù)量曲線(試驗II)。發(fā)明詳述本發(fā)明的組合物含有豐富乳清濃縮蛋白、二十二碳六烯酸和花生四烯酸的精選組合物，各成分將在下文中詳迷。本發(fā)明中提到的"嬰兒"是指一歲以下個體，包括0-4個月大的嬰兒、4-8個月大的嬰兒、8-12個月大的嬰兒、出生時體重低于2500g的低體重嬰兒、以及孕期不滿37周的早產(chǎn)兒，典型地，孕期26-34周的早產(chǎn)兒。本發(fā)明中提到的"風干基"，除非特別說明，是指適于直接給予嬰兒口服的液體代乳品，該代乳品為即食液體、可復溶粉末或稀釋物。本發(fā)明中提到的"嬰兒代乳品"，除非特別說明，是指含有脂肪、蛋白質、糖類、維生素、礦物質，以及適于嬰兒口服作為營養(yǎng)補充、主要營養(yǎng)來源或單獨營養(yǎng)來源的配方，其實施例包括但不限于，可復溶粉末、稀釋物和即食液體。本發(fā)明中所述用以特征化嬰兒代乳品的成分范圍，如未經(jīng)特別說明，是按風干基以嬰兒代乳品質量計。本發(fā)明中所用的百分比、分數(shù)、比例，如未經(jīng)特別說明，均是以組合物總質量計算。適合所列成分的所有質量，如未經(jīng)特別說明，均是基于活性水平，因此不包括市售原料中可能包括的溶劑或副產(chǎn)品。本發(fā)明中所迷嬰兒代乳品假如包含文中所要求的所有成分或特點，則可以基本不含有這里所說的其它可選、選定的基本成分或特點。本文中，如未經(jīng)特別說明，"基本不含"是指選定成分少于可選成分發(fā)揮功能的必須量，典型地是以質量計含量少于0.1%,還包括選定成分和可選成分含量為o。如未經(jīng)特別說明或未在參考中明確指出，所有關于本發(fā)明的獨特之處和限制條件都應包括相關的多種特點和限制，反之亦然。除非明確指出或清楚暗示與文中參考組合相反，本發(fā)明中所述方法或過程步驟可以按照任意順序進行組合。本發(fā)明中所述方法和組合物，包括其中的組分，可包含基本要素和本發(fā)明中限定的成分，也可由或主要由基本要素與任意添加或可選成分、組分或本發(fā)明中限定的成分或營養(yǎng)代乳品中其它有用成分組成。豐富乳清濃縮蛋白本發(fā)明所述的嬰兒代乳品含有選定濃度的豐富乳清濃縮蛋白作為代乳品中神經(jīng)節(jié)苷脂、磷脂和唾液酸的來源。代乳品中的神經(jīng)節(jié)苷脂、磷脂和唾液酸可全部或部分由豐富乳清濃縮蛋白提供。嬰兒代乳品中豐富乳清濃縮蛋白的濃度水平，按照風干基計，必須高于約6.5g/L。按風千基計，其在代乳品中的濃度范圍約6.5至約10.9g/L,包括約6.6至約8.5g/L，還包括約6.7-7.3g/L。本發(fā)明中所述嬰兒代乳品中的豐富乳清濃縮蛋白是指含有高濃度的乳脂肪球膜物質。乳脂肪球膜是在?；蚱渌溉閯游锶橹邪缓视腿サ娜橹厩虻哪せ蚰りP聯(lián)物質。這些乳脂肪球膜物質中已被鑒別的許多化合物在人乳中的濃度要高于市售嬰兒代乳品。通過在嬰兒代乳品中增加富含這類物質的乳清濃縮蛋白的濃度，所得到的代乳品，特別是其中神經(jīng)節(jié)苷脂、磷脂和唾液酸濃度的濃度與人乳更為相似。本發(fā)明中所述的"豐富乳清濃縮蛋白"，如未經(jīng)特別說明，一般是指其中磷脂質量百分比至少約3%，典型的至少約5%，其中鞘磷脂至少20%;唾液酸質量百分比至少約0.5%,典型的至少約1.2%;以及神經(jīng)節(jié)苷脂質量百分比至少約0.05%,特別是至少約0.1%的乳清濃縮蛋白。濃縮物中唾液酸總量的至少約2.5%為脂質結合唾液酸。本發(fā)明中所述豐富乳清濃縮蛋白的適宜來源包括具有上述富含成分濃度水平的所有乳清濃縮蛋白，非限制性實施例包括，LACPRODANMFGM-IO，乳清濃縮蛋白，可從丹麥阿拉食品公司(AriaFoodIngredients,Denmark)購得，該乳清濃縮蛋白按質量百分比計算含有6.5%磷脂、0.2°/。神經(jīng)節(jié)普脂、1.80%唾液酸(按總脂肪酸質量計至少2.5%的脂質結合唾液酸)和1.5°/。乳鐵傳遞蛋白。優(yōu)選地，豐富乳清濃縮蛋白可以提供嬰兒代乳品中所需磷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂和唾液酸總量的約10-100%，包括約50-100%，約50-90%,約60-85%。盡管這些物質可通過從哺乳動物乳脂或其它適宜來源分離獲得并人為添加，但優(yōu)選即使無法全部，也應大部分由豐富乳清濃縮蛋白提供。唾液酸以風干基計，本發(fā)明中所述的嬰兒代乳品可以含有濃度至少70mg/L,包括約卯mg/L至約4000mg/L,還包括約190至約2000mg/L，還包括約300mg/L至約900mg/L的唾液酸，其中按唾液酸質量計至少2.5%,包括約2.6%至約10%,約2.7%至約5%為脂質結合唾液酸。唾液酸可部分或全部由本文所述的豐富乳清濃所蛋白提供。嬰兒代乳品中的脂質結合唾液酸大部分典型地以神經(jīng)節(jié)苷脂的形式存在，神經(jīng)節(jié)苷脂中固有脂質結合唾液酸。因此，本發(fā)明中所述的神經(jīng)節(jié)苷脂組分可以是本發(fā)明中所述脂質結合唾液酸的主要或單獨來源。本發(fā)明中所述的"唾液酸"，如未經(jīng)特別說明，是指唾液酸的結合物或非結合物，包括唾液酸衍生物。因此，本發(fā)明中所述的嬰兒代乳品中的唾液酸可以包括游離唾液酸、蛋白質結合唾液酸、脂質結合唾液酸(包括神經(jīng)節(jié)苷脂)、糖類結合唾液酸及其組合物或衍生物。本發(fā)明中所述的所有唾液酸濃度是基于唾液酸化合物或去掉唾液酸結構中蛋白質、脂質、糖類、或其它結合部分后的唾液酸質量百分比。嬰兒代乳品中唾液酸可以進行添加或作為單獨成分獲得。然而，更為典型的是主要來自于乳清濃縮蛋白的固有組分，優(yōu)選本發(fā)明所述的豐富乳清濃縮蛋白。盡管次優(yōu)選，唾液酸可以作為單獨組分添加到嬰兒代乳品中，但這種情況下，添加的唾液酸與其它成分中的固有唾液酸相組合來提供嬰兒代乳品中的總唾液酸。作為一個獨立的化合物或部分，唾液酸是9碳氨基糖，其結構在化學文獻中易于描迷。N-乙酰神經(jīng)氨糖酸的其它通用名包括唾液酸、o-唾液酸、5-乙酰胺-3,5-二脫氧-D-葡萄糖-D-乳糖-2-神經(jīng)氨酸、5-乙酰胺-3,5-二脫氧-D-葡萄糖-D-乳糖神經(jīng)氨酸、醋紐拉酸、N-乙酰神經(jīng)氨酯、N-乙酰神經(jīng)氨酸、NANA、NANANeu5Ac和Neu5Ac。唾液酸可來自天然或合成，包括40余種已鑒別的天然唾液酸衍生物，其中包括游離唾液酸、低聚糖結合物(例如唾液酸寡糖)，脂質結合物(也就是糖脂類)，蛋白結合物(也就是糖蛋白)及其組合物。本發(fā)明中適用的唾液酸包括人乳中常見的唾液酸寡糖，不管是天然的還是合成的，含量最豐富的兩種是3'唾液酸乳糖(3'SL,NeuNAca2-3半乳糖P1-4-葡萄糖)和6，唾液酸乳糖(6，SL,NeuNAca2-6半乳糖pl-4-葡萄糖)。其它適宜的唾液酸寡糖包括含有一個或更多唾液酸分子與較大人乳寡糖或其它更為復雜寡糖的結合物。本發(fā)明中適用的其它唾液酸包括適用于嬰兒代乳品的相應糖脂，包括神經(jīng)節(jié)普脂在內(nèi)，如由脂肪酸、鞘氨醇、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰神經(jīng)氨酸分子組成的唾液酸-糖脂結合物。這些唾液酸化合物可以還包括一個或多個人乳中常見的幾種唾液酸化糖蛋白(如K-酪蛋白、a-乳白蛋白和乳鐵傳遞蛋白)。分離物、濃縮物或提取物,、包括人乳^牛奶。本發(fā)明中，;尤選牛奶作為唾液酸來源，包括本文所述的豐富乳清濃縮蛋白。本發(fā)明適用的唾液酸的個別來源包括LacprodanCGMP-10(含有4.2%唾液酸的酪蛋白糖巨肽)，可從丹麥阿拉食品^>司(AriaFoodIngredients,Denmark)購得；生物純化糖巨肽(含有7-8%唾液酸)，可從美國戴維斯食品公司(DaviscoFoodsInternational,EdenPrairie,明尼蘇達州，美國)購得。盡管嬰兒代乳品中可含有糖巨肽作為唾液酸的來源，但代乳品優(yōu)選充分降低糖巨肽含量。糖巨肽是牛奶中酪蛋白分子的一部分。脫脂奶中游離糖巨肽的量非常少，但乳清濃縮蛋白中游離糖巨肽的濃度較高。已有結果表明嬰兒對糖巨肽的耐受性比對其它唾液酸來源的耐受性差。因此，用乳清濃縮蛋白制造的嬰兒代乳品中游離糖巨肽的濃度較高，但可能對嬰兒耐受性不好。本文中，"充分降低，，是指按照風干基計算，嬰兒代乳品中糖巨肽的質量百分比優(yōu)選低于0.5%,包括低于0.4%，還包括低于0.35%，以及百分比為0。傳統(tǒng)的嬰兒代乳品由于使用干酪乳清制備的乳清濃縮蛋白，因此典型地含有0.6-0.8%的固有糖巨肽。神經(jīng)節(jié)芬脂本發(fā)明中所述的嬰兒代乳品還可以含有一種或多種神經(jīng)節(jié)苷脂的豐富濃縮物，是一類由一個或多個唾液酸(n-乙酰神經(jīng)氨酸)連接到寡糖鏈構成的鞘糖脂(神經(jīng)酰胺和寡糖)組成的化合物。神經(jīng)節(jié)苷脂可部分或全部由本發(fā)明中所述的豐富乳清濃縮蛋白提供。神經(jīng)節(jié)芬脂是哺乳動物細胞漿膜的一般組分，大量存在于神經(jīng)元膜。神經(jīng)節(jié)苷脂是酸性鞘糖脂，包含一個疏水性的神經(jīng)酰胺和一個親水性的含一個或多個唾液酸分子的寡糖鏈。神經(jīng)節(jié)苷脂的寡糖鏈部分由于有不同化學結構，因此是神經(jīng)節(jié)苷脂分離、識別單體的參考基礎。大多數(shù)神經(jīng)結苷脂的神經(jīng)酰胺部分具有不同的脂肪酸組成，通常為C18和C20的衍生物。神經(jīng)節(jié)苷脂通常命名時使用M、D和T作指示，分別代表單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂、二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂和三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，而數(shù)字1、2、3等代表了神經(jīng)節(jié)苷脂在薄層色譜中的遷移順序。例如，單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的遷移順序是GM3>GM2>GM1。為了指示基本結構之間的差異，在名字后添加了下標，例如GMla，GDlb,等等。本發(fā)明中所述的嬰兒代乳品可以含有至少約5mg/L的神經(jīng)節(jié)苷脂，包括約7mg/L至50mg/L，還包括約10至約30mg/L。這些神經(jīng)節(jié)苷脂的濃度與人乳中的相似，人乳中神經(jīng)節(jié)苷脂的典型濃度為至少約3mg/L，更典型的濃度為約3mg/L至約大約30mg/L。典型地，嬰兒代乳品中的神經(jīng)節(jié)苷脂含有神經(jīng)節(jié)苷脂GD3、0-乙?；?GD3和GM3中的一種或幾種，更為典型地，含有全部這三種。這些神經(jīng)節(jié)苷脂在本發(fā)明中所述的嬰兒代乳品中總神經(jīng)節(jié)苷脂質量百分比通常為至少約80%,更為典型地，占總神經(jīng)節(jié)苷脂的質量百分比為至少約90%。本發(fā)明中所用的神經(jīng)節(jié)苷脂的適宜來源包括哺乳動物乳汁或乳制品的分離物、濃縮物或提取物，包括人乳和牛奶。本發(fā)明中，優(yōu)選牛奶作為神經(jīng)節(jié)普脂的來源，包括本發(fā)明中所述的豐富乳清濃縮蛋白。本發(fā)明適用的神經(jīng)節(jié)苷脂的個別來源包括購自新西蘭恒天然公司的(Fonterra，NewZealand)神經(jīng)節(jié)苦脂500(含〉0.5%的GM3和<1.0%的GD3)和神經(jīng)節(jié)苷脂600(含〉1.2%的GD3)。定義本發(fā)明中所述嬰兒代乳品的神經(jīng)節(jié)苷脂濃度采用下文中描述的神經(jīng)節(jié)苷脂測定方法進行測定。磷脂本發(fā)明中所述的嬰兒代乳品也可以含有較高濃度的磷脂。其濃度高于傳統(tǒng)嬰兒代乳品，但與人乳中濃度接近。磷脂可部分或全部由本發(fā)明中所迷的豐富乳清濃縮蛋白提供。本發(fā)明中適用的磷脂包括在牛奶和其他哺乳動物乳汁中發(fā)現(xiàn)的磷脂。優(yōu)選的磷脂包括鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸及其組合物。最優(yōu)選上迷5種磷脂的組合物，特別是以總磷脂質量計，鞘磷脂至少20%的磷脂組合物。本發(fā)明中所述的嬰兒代乳品中磷脂濃度可以至少約150mg/L,包括約200至約600mg/L，還包括約250至約450mg/L。相對比的，人乳中磷脂含量通常為約163至約404mg/L,總磷脂中鞘磷脂的含量約為51%。本發(fā)明中所述磷脂的適宜來源包括哺乳動物乳汁或奶制品的分離物、濃縮物或提取物，包括人乳和牛奶。本發(fā)明中，優(yōu)選牛奶作為磷脂的來源，包括本發(fā)明中所述的豐富乳清濃縮蛋白。其它適宜的磷脂來源包括大豆，例如大豆卵磷脂。然而，本發(fā)明中所述的嬰兒代乳品優(yōu)選基本不含大豆來源的磷脂。本發(fā)明中所述的嬰兒代乳品也優(yōu)選基本不含蛋黃卵磷脂。在本文中，"基本不含"是指嬰兒代乳品中大豆磷脂和卯磷脂含量少于0.5%，更優(yōu)選少于0.1%或為0，按大豆或蛋黃卵磷脂重量計。本發(fā)明中適用磷脂的適宜來源包括購自新西蘭恒天然公司的磷脂濃縮物600(其中鞘磷脂>18.0%，磷脂酰膽堿>36,0%，磷脂酰乙醇胺>9.0%，磷脂酰絲氨酸〉4.0%)。二十二碳六烯酸和花生四烯酸本發(fā)明中所迷的嬰兒代乳品中進一步含有二十二碳四烯酸和花生四烯酸或其來源，其中代乳品必須包含至少約0.13%的二十二碳六烯酸和至少約0.25%的花生四烯酸。在人乳中也發(fā)現(xiàn)了這兩種多聚不飽和脂肪酸。本發(fā)明中所述的嬰兒代乳品中因此必須包含花生四烯酸，以代乳品中總脂肪酸質量計，其最低濃度必須為至少約0.25%,優(yōu)選至少約0.3%,最優(yōu)選至少約0.4%。以代乳品中總脂肪酸質量計，嬰兒代乳品中花生四烯酸的濃度可以增加至約2.0%,包括增加至約1.0%,還包括增加至約0.6%。本發(fā)明中所述的嬰兒代乳品同樣必須包含二十二碳六烯酸，以代乳品中總脂肪酸質量計，其最低濃度必須為至少約0.13%,優(yōu)選至少約0.14%,更優(yōu)選至少約0.15%。以代乳品中總脂肪酸質量計，嬰兒代乳品中二十二碳六烯酸的濃度可以增加至約1.0%,包括增加至約0.5%,還包括增加至約0.25%?；ㄉ南┧岷?或)二十二碳四烯酸的適宜來源的非限制性實例包括海產(chǎn)油、蛋衍生油、奶脂肪、真菌油、海藻油、其它單細胞生物衍生油及其組合物。這些組合物優(yōu)選基本不含蛋書t生油，本文中指以這類蛋衍生油質量計，其濃度少于0.05%,包括0?；ㄉ南┧岷投剂┧峥梢杂眠m合嬰兒使用的任意形式加入到代乳品中，包括可以不同方式或在嬰兒服用后提供這些游離脂肪酸的化合物或物質，包括磷脂、多聚不飽和脂肪酸中的甘油酯(單甘油酯、雙甘油酯和三甘油酯)。其中，多聚不飽和脂肪酸和其來源在美國專利6080787(Carlson等)和美國專利6495599(Auestad等)中進行了描述，其描述在本專利中一起作為參考引用。為了定義本發(fā)明，花生四烯酸和二十二碳四烯酸的磷脂來源不包括在上文所述的磷脂組分內(nèi)。這些脂肪酸在美國專利6495599(Auestad等)中也進行了描述，這些描述在這里作為參考引用。其它營養(yǎng)成分本發(fā)明中所迷的嬰兒代乳品含有脂肪、蛋白質、糖類、維生素和礦物質，這些物質的種類和量都進行了選擇以滿足目標代乳品或被定義代乳品的營養(yǎng)需要。糖類、脂肪、蛋白質、礦物質和維生素的多種來源和種類都已知，假如它們與選定配方中其它添加成分相容，或者適用于嬰兒代乳品，那么這些成分可以用于這里所述的基礎代乳品。本發(fā)明中所述代乳品中適用的糖類可以是單糖或多糖、含乳糖或不含乳糖、或糖類組合物，非限制性的實例包括水解型、完整型、天然和/或化學修飾的玉米淀粉、麥芽糊精、葡萄糖聚合物、蔗糖、玉米糖漿、玉米糖漿固體、提取自大米或馬鈴薯的糖類、葡萄糖、果糖、乳糖、高果糖玉米糖漿和不吸收的寡糖，如低聚果糖(FOS)、低聚乳糖(GOS)及其組合物。本發(fā)明中所述的代乳品適用的蛋白質包括水解、部分水解和未水解或完整蛋白質或其來源，可以得自其它已知或適用的來源，如奶類(例如酪蛋白、乳清、人乳蛋白)、動物(例如肉、魚)、谷類(例如大米、玉米)、蔬菜(例如大豆)或其組合物。本發(fā)明中使用的蛋白質也可以包括，或全部或部分被已知用于或適用于嬰兒代乳品的游離氨基酸替代。非限制性實例包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰氨酸、肉毒^f威、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酸鹽、氨基乙酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、牛磺酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸及其中組合物。盡管營養(yǎng)等量時也可以使用上迷氨基酸的D-型異構體，但最典型的是以L型應用。還可使用外消旋體或異構體的混合物。本發(fā)明所述的代乳品中適用的脂肪包括椰子油、大豆油、橄欖油、紅花油、高油酸紅花油、海藻油、MCT油(中鏈三甘油酯)、葵花子油、高油酸葵花籽油、棕櫚油、棕櫚仁油、棕櫚甘油油酸酯、芥花籽油、海產(chǎn)油、棉花籽油及其組合物。本發(fā)明中所述的嬰兒代乳品包括以風干基計，奶脂肪少于約1%,包括少于約0.2%及0的實施方案。代乳品中適用的維生素和其他類似成分包括維生素A、維生素D、維生素E、維生素K、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、煙酸、葉酸、泛酸、生物素、維生素C、膽堿、肌醇及其鹽和衍生物、以及它們的組合物?；A代乳品中適用的礦物質包括媽、磷、鎂、鐵、鋅、錳、銅、鉻、碘、鈉、鉀、氯及其組合物。本發(fā)明中所述的嬰兒營養(yǎng)代乳品更適宜含有為目標消費群或使用人群制定的相關嬰兒代乳品指導原則相一致的營養(yǎng)物質。該類指導原則的一個實例即嬰兒代乳品法案U.S.C.350節(jié)(a)。代乳品中糖類、脂質和蛋白質的推薦濃度列于下表中。表l:常量營養(yǎng)元素范圍<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>所有數(shù)字前加"大約"為宜。每100千卡路里嬰兒代乳品還可以包括下列一種或多種維生素A(約250至約750IU)、維生素D(約40至約100IU)、維生素K(大于約4Mm)、維生素E(至少約0.3IU)、維生素C(至少約8mg)、維生素B1(至少約8)Lig)、維生素B12(至少約0.15Mg)、煙酸(至少約250Mg)、葉酸(至少約4Mg)、泛酸(至少約300mg)、生物素(至少約1.5jug)、膽堿(至少約7mg)和肌醇(至少約2mg)。每100千卡路里嬰兒代乳品還可以包括下列一種或多種鈣(至少約50mg)、磷(至少約25mg)、鎂(至少約6mg)、鐵(至少約0.15mg)、碘(至少約5Mg)、鋅(至少約0.5mg)、銅(至少約60mg)、錳(至少約5yg)、鈉(約20至約60mg)、鉀(約80至約200mg)、氯(約55至約150mg)和硒(至少約0.5mcg)。嬰兒代乳品可以進一步含有多聚乳糖，以風干基計，其質量濃度可以增加至約5%,包括從約0.05%至約3°/。，還包括從約0.1%至約2%。這些多聚乳糖可以是長鏈(例如菊粉)、短鏈(例如FOS或低聚乳糖)或其組合物，以及含有各種鏈長度結構的混合物，其中大多聚合度(degreepolymerization)為約2至大約60。嬰兒代乳品可進一步含有其它可以改變成分物理、化學、外觀或處理特征，或者當用于嬰兒時發(fā)揮藥品或額外營養(yǎng)成分作用的可選成分。多種這類可選成分已知或適用于營養(yǎng)產(chǎn)品，假如這類可選物質與本發(fā)明中所述的基本物質相容或適合用于嬰兒代乳品，那么可以用于營養(yǎng)品和本發(fā)明所迷的嬰兒代乳品。這些可選成分的非限制性實例包括額外抗氧劑、乳化劑、緩沖液、著色劑、矯味劑、乳鐵傳遞蛋白、額外oc-乳白蛋白、核苷酸和核苷、益生菌、益生元和相關衍生物、增稠劑和穩(wěn)定劑等。使用方法
技術領域：
：本發(fā)明還涉及通過制備本文中所述嬰兒代乳品并給予或指導護理員給不足2個月優(yōu)選不足4個月的嬰兒服用來促進嬰兒的大腦發(fā)育的方法。本發(fā)明還涉及通過制備本文中所述嬰兒代乳品并給予或指導護理員給不足2個月優(yōu)選不足4個月的嬰兒服用來促進嬰兒的成神經(jīng)細胞遷移的方法。本發(fā)明還涉及通過制備本文中所述嬰兒代乳品并給予或指導護理員給不足2個月優(yōu)選不足4個月的嬰兒服用來促進嬰兒的視力發(fā)育的方法。本發(fā)明還涉及通過制備本文中所述嬰兒代乳品并給予或指導護理員給不足2個月優(yōu)選不足4個月的嬰兒服用來促進嬰兒的認知發(fā)育的方法。本發(fā)明還涉及通過制備本文中所述嬰兒代乳品并給予或指導護理員給不足2個月優(yōu)選不足4個月的嬰兒服用來給嬰兒提供單獨營養(yǎng)、營養(yǎng)補充或主要營養(yǎng)來源的方法。本發(fā)明中所述的所有方法涉及對2-4月的嬰兒有選擇性的使用嬰兒代乳品，盡管這些方法可能包括額外服用，以使在度過最初2-4個月后嬰兒繼續(xù)服用同樣代乳品至9-12月。然而，即使是在超過4個月后還繼續(xù)服用本發(fā)明所述代乳品，也要認識到本發(fā)明的益處，必須在最初2-4個月進行月良用。本發(fā)明中所述的方法中，盡管作為單獨營養(yǎng)來源更佳，但嬰兒代乳品可以提供單獨的、主要的或補充的營養(yǎng)。對于粉末實施例，每種方法可以包括用含水輔料，最典型的是水和人乳，將粉末復溶(或指導護理員復溶)以得到預期的熱量密度，復溶液可口服給予或腸道給予嬰兒以提供預期的營養(yǎng)。粉末用一定量的水，或其他適宜液體如人乳進行復溶，從而產(chǎn)生一次服用所需的體積和營養(yǎng)狀況。本發(fā)明中所述的嬰兒代乳品含有一定的熱量密度，最典型的范圍是，以風干基計，約19至約24千卡路里/液體盎司，更具典型的是約20至約21千卡路里/液體盎司。神經(jīng)節(jié)苷脂分析方法
技術領域：
：本發(fā)明中所述的神經(jīng)節(jié)苷脂濃度采用下述分析方法測定。從LacprodanMFGM-10或嬰兒代乳品樣品中用氯仿甲醇水的混合物提取總磷脂。用二異丙酯(DIPE)/1-丁醇/水相部分和C18固相萃取柱的組合從總磷脂中純化神經(jīng)節(jié)苷脂。純化神經(jīng)節(jié)苷脂中的脂質結合唾液酸(LBSA)通過與間苯二朌反應用分光光度法測定。樣品中神經(jīng)節(jié)苷脂的量通過LBSA量與轉化因子相乘而得到。該轉化因子通過神經(jīng)節(jié)苷脂與唾液酸分子量之比計算。由于神經(jīng)節(jié)苷脂是一類帶有不同分子量和一定量唾液酸殘基的化合物，因此采用HPLC分離的方法來測定單個神經(jīng)節(jié)苷脂的分布以得到更精確的轉化因子。標準P口.雙唾液酸神經(jīng)節(jié)普脂GDla,取自牛腦，最低濃度95%(TLC)SIGMA公司G-2392.單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM1，取自牛腦，最低濃度95%(TLC)SIGMA公司G-7641.雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD3銨鹽，取自牛酪乳，最低濃度98。/。(TLC)Calbiochem公司345752或Matreya公司1503.單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM3銨鹽，取自牛酪乳，最低濃度98。/。(TLC)Calbiochem公司345733或Matreya公司〗504.N-乙酰神經(jīng)氨酸(唾液酸、NANA),取自埃希氏大腸桿菌，最低濃度98%，Sigma公司A-2388由于供應商無法保證其產(chǎn)品濃度，因此神經(jīng)節(jié)苷脂標準品不能當作真實標準品。薟于此，采用間苯二酚的方法測定LBSA濃度，并估計神經(jīng)節(jié)苷脂濃度。根據(jù)神經(jīng)節(jié)苷脂的種類將標準品用氯仿甲醇(C:M)體積比k1混合液稀釋至理論上的1-2.5liig/m!。取整數(shù)的10、20和40Ml,用N2吹干，按上述方法測定(見LBSA的測定方法)。三個樣品的平均濃度用LBSA表示，作為神經(jīng)節(jié)苷脂標準品的實際濃度。將LBSA與轉化因子相成，可得到神經(jīng)節(jié)苷脂濃度。轉化因子按照分子量之比計算。(轉化因子，其中n-唾液酸分子個數(shù))。試劑-氯仿，色語純，Prolabo公司-甲醇，色譜純，Merck公司-二異丙酯，色譜純，Prolabo公司乙酸丁酯，分析純，Merck公司-l-丁醇，分析純，Merck公司設備.分析天平，精度0.1mg--液相用進樣瓶、螺帽、內(nèi)塞，Waters公司.微量進樣器，Hamilton(50、100、250、500、1000)a1)..高效液相色諮4義，Alliance^卯，Waters公司'高效液相紫外檢測器，2487,Waters公司高效液相數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)WatersMillennium32■Solvac濾膜固定裝置(聚丙烯)，No.4020-微孔濾膜，0.45(am,No.VLP04700■石雄酸氬二鈉，分析純，Panreac7〉司35%鹽酸，分析純，Panreac公司石危酸銅，分析純，Panreac公司,間笨二酚，99%,Merck氯化銅,分析純，Panreac公司I.離心機i.超聲波機I.固相萃取裝置24孔I無油真空泵I'三重Reacti-ThermIII氮氣吹干儀，jPierce公司W(wǎng)aters真空泵I-玻璃巴斯德移液管I-有機溶劑分送器(2.5-25ml可調)'Reax渦旋混勻器，Heidolph公司電子移液管(2-20,5-50,40-200，200-1000pi)圓底玻璃離心試管10ml圓底玻璃離心試管50ml'玻璃移液管(5,10,25ml)-分光光度計(ThermoSpectronic公司UV500)'-渦旋混勻器，Heidolph公司水浴40-100°C圓底玻璃離心試管40ml-500mgC-18柱(5ml'Supelco公司52604-U)-Reacti-VapIII型氮氣吹頭(Pierce)程序脂質提取按照下述方法制備脂質提取物取lg代乳品或100mgLacprodanMFGM-10樣品，稱定后置于圓底玻璃離心試管中(代乳品置于50ml管，LacprodanMFGM-10置于10ml管)。按照25ml氯仿曱醇水(C:M:W)50:50:10(體積比)混合液/克樣品的比例加入混合液，用混勻器使樣品完全分散于溶液中，超聲1分鐘。將離心管在室溫下連續(xù)渦旋孵化45分鐘(2000rpm)，并每15分鐘超聲l分鐘。離心樣品(1500xg，10min,15°C)。取上清液置于40ml錐形玻璃離心管中，37。C下用氮氣吹干。同時，按照C:M:W混合液12.5m1/克樣品的比例加入混合液再提取顆粒，室溫下渦旋混勻15分鐘(2000rpm)，并每7.5分鐘超聲1分鐘。離心后取上清液置于上述同個40ml錐形玻璃離心管中，繼續(xù)用氮氣吹干。顆粒用C:M(l:1，體積比)混合液洗滌，在同樣條件下孵化10分鐘，每5分鐘超聲一次。離心后，上清液置于上述同個40ml錐形玻璃離心管中，揮干。從總脂質中進行神經(jīng)節(jié)苷脂的純化是采用LadischS.和GillardB描述的二異丙酯(DIPE)/1-丁醇/含水相組合液的分配過程(LadischS.，GillardB.,Asolventpartitionmethodformicro-scalegangliosidepurification,Anal.Biochem,1985，146:220-231)。之后，按照WilliamsM和McCluerR描述的方法稍加改變進行經(jīng)C18柱的固相萃取(WUliamsM,McCluerRTheuseofSep-PakTMCI8cartridgesduringtheisolationofgangliosides,J.Neurochem，1980，35:266-269)。二異丙酯〃l-丁醇/NaCi水溶液分配過程取4mlDIPE/l-丁醇(60:40，體積比)溶液加入上述干燥脂質提取物中。渦旋混勻并超聲，得到脂質提取物的極細混懸液。加入2ml0.1%的NaCl水溶液，渦旋混勻2分鐘，其間間隔超聲15秒，之后15。C下離心IO分鐘(1500xg)。用巴斯德移液管小心移去上層有機相(包含中性脂質和磷脂)，注意不要移去中間相。包含神經(jīng)節(jié)磷脂的下層含水相用與初始體積相同的新鮮有機溶劑提取兩次。所得樣品在37。C下用氮氣吹干30-45分鐘至剩余液體積為初始體積的一半(接近2ml)。經(jīng)反相C18柱的固相萃取(SPE):將500mgC18柱固定于24孔固相萃取裝置中，分別用5ml甲醇、5mlC:M混合液(2:1，體積比)和2.5ml甲醇按序洗滌活化。用0.1。/。NaCl:甲醇(60:40,體積比)混合液2.5ml平衡C18柱。測定上述部分吹干后的下層相體積，用水補至l或2ml，加入0.8ml甲醇，離心除去不溶物后，分兩次上樣至C18柱中。固相萃取柱用10ml蒸餾水除去鹽類和水溶性污染物，之后真空抽干30秒。用5ml甲醇和5mlC:M混合液(2:1，體積比)洗脫神經(jīng)節(jié)苷脂，所得溶液用氮氣吹干，殘留物用2mlC:M混合液(1:1,體積比)復溶。樣品和溶劑在重力作用下或真空減壓作用下以1-1.5ml/分鐘的速度過柱。所得神經(jīng)節(jié)苷脂在-30。C下保存待測。以LBSA測定總神經(jīng)節(jié)苷脂。取500Ml置于10ml玻璃離心管中，氮氣吹干，用間苯二酚分析法測定(3)。LBSA測定加入1ml間苯二酚試劑和1ml水。試管具塞，于100。C沸水浴中加熱15分鐘。冰浴中冷卻，加入2ml乙酸丁酯/丁醇混合液(85:15，體積比)，渦旋1分鐘，離心10分鐘(750xg)取上層相用分光光度法在580nm波長下測定，NANA的標準液(濃度分別為0、2、4、8、16、32和64pg/ml)同法處理，用于計算樣品中唾液酸的濃度。間苯二酚試劑的制備方法如下取用二次去離子水配成的2%間苯二酚溶液10ml，加入O.lM疏酸銅溶液0.25ml、濃鹽酸80ml,加水至100ml。制備過程應避光。高效液相色鐠分離神經(jīng)節(jié)苷脂用配備有雙波長吸收檢測器、Luna-NH2色謙柱(250x4.6mm，5IOOA，購自菲羅門公司，00G-4378-EO)的Alliance2690液相系統(tǒng)分離神經(jīng)節(jié)苷脂。后者在室溫下用以下溶劑系統(tǒng)進行洗脫不同體積比和不同離子強度的乙腈-磷酸緩沖液，根據(jù)GazzottiG.,SonnionS.,GhidoniaR.Normal-phasehigh-performanceliquidchromatographicseparationofnon-derivatizedgangliosidemixture,JChromatogr.1985，348:371-378中的方法。使用了兩種流動相梯度溶劑A:乙腈-5mM磷酸緩沖液，pH5.6(83:17),緩沖液的配制方法為0.6899gNaH2P04.H20加水至1L后，調pH至5.6。溶劑B:乙腈-20mM磷酸緩沖液，pH5.6(1:1),緩沖液的配制方法為2.7560gNaH2P04.H20加水至1L后，調pH至5.6。使用了下表中的洗脫程序:<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>相提取、分配和固相萃取方法處理。自2mlC:M混合液(l:1,體積比)樣品中取0.5ml，氮氣吹干，殘留物用0.150ml水復溶。為了更好復溶，可渦旋混勻及超聲。最終溶液轉移至液相進樣瓶中。樣品和標準品進樣體積為30yl。GD3和GM3標準品釆用間苯二酚分析法測定并按照上述方法計算真實濃度。用水配制了包含GD3、GM3的四種標準品溶液及空白溶液。GD3和GM3的標準曲線濃度范圍分別約為0-0.5mg/ml和0-0.2mg/ml。每組標準液的準確濃度可能隨標準品的純度發(fā)生變化。系統(tǒng)每次重設時，如更換色譜柱，都進行一組標準液進樣。通過對某一中間濃度標準液連續(xù)10次進樣以考查色語系統(tǒng)的適應性。如果測得濃度超出理論濃度的95%-105%范圍，則需重新測定新的系列標準液進行校正。生產(chǎn)方法
技術領域：
：本發(fā)明中所述的嬰兒代乳品可以采用已知的或有效的技術、適于制作和配制嬰兒或其他類似代乳品的方法進行制備。對任意給定的代乳品，這些技術和變更易于通過嬰兒營養(yǎng)配方的一個普通技術或制備本發(fā)明所述代乳品的生產(chǎn)工藝進行確定和應用。本發(fā)明中所述嬰兒代乳品的生產(chǎn)方法可以包括用一種或多種溶液形成漿液。這些溶液可以包含水和下列一種或多種糖類、蛋白質、脂質、穩(wěn)定劑、維生素和礦物質。漿液是均一的冷乳劑?？梢栽谌閯┬纬汕?、過程中或之后加入其他各種溶液、混合物或物質。所得乳劑可進一步稀釋、滅菌、包裝制成即食液體或濃縮液體，或者可以經(jīng)滅菌和相應過程(例如，噴霧干燥、干混合、凝聚法)后包裝制成可復溶粉末。其它適宜制作嬰兒代乳品的方法在美國專利6365218(Borschel)和20030118703Al(Nguyen等)中進行了描述，這兩篇專利在本文中作為參考引用。試驗1本研究的目的是比較新生豬仔在分別以對照代乳品、一種或兩種含有高濃度神經(jīng)節(jié)苷脂、磷脂和唾液酸及不同濃度花生四烯酸和二十二碳六烯酸的代乳品飼養(yǎng)后的效果。背景新生豬仔構成了設計和執(zhí)行人體臨床實驗前評價營養(yǎng)干涉作用的適當模型。其適宜性在于豬仔胃腸道生理與人類新生兒的相似性(Miller,E.R.,Ullrey,Thepigasmodelforhumannutrition,AnnuRevNutrl987,7:361-382.)。另外，豬仔與人類一樣，在出生前期至出生后早期內(nèi)大腦生長迅速，這也構成了這一動物模型的極大優(yōu)勢(PondWGetal.Perinatalontogenyofbraingrowthinthedomesticpig.PSEBM2000，223:102-108)。要考慮的關鍵時期是懷孕后70-140天(生產(chǎn)發(fā)生在孕后大約112-113天)。本研究的目的是對三種受試代乳品的效果進行生理學評估，其中一種為傳統(tǒng)嬰兒代乳品對照品。才既述研究數(shù)據(jù)表明，新生豬仔在12-13天時發(fā)生顯著的神經(jīng)遷移。豬仔的這段時間相應于人類嬰兒的3-4個月(Miller.E.R.，Ullrey,Thepigasmodelforhumannutrition,AnnuRevNutr1987,7:361-382)。試-瞼設計試驗為縱向進行，包括分別以試驗食物A、B和C飼養(yǎng)并于飼養(yǎng)期8-9天、15-16天和29-30天處死的3組豬仔。另有一組，在研究開始時處死，作為參比。本研究分為兩個試驗。研究所用豬仔由同一農(nóng)場供應。在本研究的第一個試驗中，33只雄性家養(yǎng)豬仔(4-5天大)飼養(yǎng)于不銹鋼籠中(2只/籠)，飼養(yǎng)室空調溫度為27-30°C。根據(jù)它們的營養(yǎng)需求，按適應期食物每天喂食4次。3天適應期后，處死3只豬仔。處死時間記為本研究的"0時"。其余豬仔根據(jù)重量和窩進行配對，并分成3組(分別為11=10,n=10，n=10)按照下列食物每天喂食4次。食物A:與SimilacAdvance嬰兒代乳品相似，購自雅培實驗室(哥倫比亞，俄亥俄州，美國)，按總脂肪酸質量計，含0.4%花生四烯酸、0.15%二十二碳六烯酸和傳統(tǒng)乳清濃縮蛋白。食物B:本發(fā)明中所述嬰兒代乳品，按總脂肪酸質量計，含0.4%花生四烯酸和0.15%二十二碳六烯酸，以風千基計，含濃度水平為7.1g/L的豐富乳清濃縮蛋白。食物C:與食物B相似，除了花生四烯酸和二十二碳六烯酸濃度降低(按總脂肪酸質量計，分別為0.2%和0.1%),以風千基計，含濃度水平為7.1g/L的豐富乳清濃縮蛋白。食物A、B、C是根據(jù)新生豬仔對于微量營養(yǎng)成分(礦物質類和維生素類)的特殊需求使用。下表顯示標準豬食物和食物A、B、C的成分。表2:試驗食物<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>所有食物一經(jīng)制成即立刻使用或貯存于4'C的內(nèi)置空氣罐中，并于24小時內(nèi)使用。食物均是粉末型，改編的豬食物用水復溶至質量百分比18.8%,食物A、B、C用水復溶至質量百分比為12.85%。復溶的液體食物倒入籠子的食槽中。在下次喂食前將槽中剩余液體倒掉并測量，清洗食槽。在用對照食物(食物A)或試驗代乳品(食物B和C)分別銅養(yǎng)8-9天、15-16天及29-30天時每組取3或4只豬仔處死。在本研究的第二個試驗中，將44只雄性家養(yǎng)豬仔(4-5天大)單獨按照試驗一中所述飼養(yǎng)環(huán)境進行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)方案同上，適應期結束后處死4只豬仔作為參比組，剩余豬仔按照體重和窩配對，分成3組(分別為n-13,n-13和n=14)分別用食物A、B、C飼養(yǎng)。每組中包括1到2只豬仔用于替換。對每只豬仔一天4次飲食攝取監(jiān)控，每兩周監(jiān)控體重增加。在適當?shù)臅r間，對豬仔禁食過夜后用Ketamine/Domtor麻醉，頸靜脈穿刺末端放血處死。進而評價大腦成分和組織學。樣品制備豬仔禁食過夜并在麻醉狀態(tài)下經(jīng)頸靜脈穿刺》t血處死。用EDTA-3鉀(2.7mmol/L)作為抗凝劑收集血液，在4'C下以1500xg離心io分鐘。開顱取出大腦稱重。左腦半球分割后分別浸泡于4%pH7.4曱醛溶液和70°C乙醇中一周進行組織學分析。右腦半球貯存于-8(TC條件下用于生化分析。取眼球，左眼浸于甲醛溶液中，2小時后用解剖刀分離眼前極，剩余部分繼續(xù)浸于曱醛溶液中18小時。右眼解剖取出視網(wǎng)膜，稱重。血漿、右腦半球和視網(wǎng)膜在-8(TC條件下保存待分析。血漿的脂肪酸成分血漿樣品采用Lepage和Roy的方法(6)進行甲基化并用氣相色譜分析。取200pl血漿，加十五烷酸作為內(nèi)標(0.04mg/每樣品)，2ml甲醇正己烷混合液(4:1)和0.2ml乙酰氯。試管具塞后在IO(TC加熱1小時。用水浴冷卻，加入511116%的K2C03,1500xg離心io分鐘。從上清液正己烷中取3jal進樣，色譜條件為Hewlett-Packard6890色譜儀、火焰電離監(jiān)測器、SP2330毛細管柱，管長60m,內(nèi)徑0.32mm，壁厚0.2Mm(Supelco)。栽氣為氦氣，流速1ml/min,分流率1:40。升溫程序為165°C3分鐘；以2。C/分鐘的速度升溫至195°C,持續(xù)2分鐘；以3。C/分鐘的速度升溫至2irC，持續(xù)10分鐘。進樣器和檢測器溫度為250°C。通過比較與可信對照品(Sigma)的保留時間確定脂肪酸。結果用峰面積歸一化百分數(shù)或每種脂肪酸甲酯濃度表示。大腦成分右腦半球在Heidolph均質機中均質。取lg均質后大腦，力。15mlPBS,在分散機中繼續(xù)均質1分鐘，用PBS稀釋至lOOml。取10yl，一式三份，與Hoechst試劑反應并用分子探針kitF-2962測定熒光強度。蛋白質含量采用增加了多孔板的SigmakitTP0300，按照Lowry程序取1g/100ml組織勻漿液按照1:4稀釋后測定。簡要地講，取20ml樣品或標準品，一式三傷\置于96孔板中，加入80Ml水和lOOm1Lowryi式劑，〉、昆合聘4匕20分4中。力口入50m1Folin-Ciocalteau試劑，混合孵化30分鐘，在690nm波長處測定吸光度。膽固醇在用有機溶劑對樣品提取后，通過分光光度法和比色法進行測定。取200mg均質后大腦，力。lmi水在Heidolph均質機中繼續(xù)均質。樣品中加入5ml正己烷異丙醇(3:2)，渦旋混勻1分鐘，超聲5分鐘，在4。C下以1500xg離心10分鐘。收集上清液，下層液用3ml溶劑進行再提取，收集上清液與第一次的合并，氮氣吹干。提取物用3ml氯仿溶解，取20pl進行膽固醇分析，重復測定一次。剩余溶劑吹干，加入100Ml異丙醇。用RandoxkitnCH201按照供應商說明進行膽固醇測定。膽固醇標準曲線為0.25-2mg/ml濃度范圍。脂肪酸成分用上述血漿中測定方法進行，取40mg均質后大腦，不加內(nèi)標。結果以峰面積歸一化法表示每種脂肪酸甲酯的比例。神經(jīng)節(jié)苷脂含量在對脂質進行提取、分配和純化后采用HPLC和分光光度法測定脂質結合唾液酸(LBSA)的量進行計算。取1.250g均質后大腦用18ml氯仿甲醇混合液(C:M，1:1，體積比)提取，混合物在4。C下攪拌45分鐘，在4。C下離心IO分鐘(1500xg)。收集上清液，分別用18ml和12ml上述混合溶劑提取顆粒兩次。三次上清液合并，加混合溶劑至50ml，取20ml兩份，在-30'C下孵化過夜。孵化后，離心，收集上清液，氮氣吹干。用二異丙酯(DIPE)/1-丁醇/含水相(Ladisch和Gillard文獻描迷,Asolventpartitionmethodformicroscalegangliosidepurification,AnalBiochem，1985，46:220-231)從總脂質提取物中純化神經(jīng)節(jié)苷脂，之后用C18柱按照Williams和McCluer的方法稍加改變進行固相萃取(根據(jù)WilliamsM,McCluerRTheuseofSep-PakTMCI8cartridgesduringtheisolationofgangliosides，J.Neurochem，1980,35:266-269的方法)。在干燥脂質提取物中加入4mlDIPE/l-丁醇混合液(60:40,體積比)。渦旋，超聲得到脂質^L細混懸液。加入2ml0.3Q/。含水氯化鈉，渦旋2分鐘，其間間隔超聲15秒，離心。用巴斯德移液管小心移去上層有機相(包含中性脂質和磷脂)，注意不要移去中間相。包含神經(jīng)節(jié)磷脂的下層含水相用與初始體積相同的新鮮有機溶劑提取兩次。所得樣品在37°C下用氮氣吹干30-45分鐘至剩余液體積為初始體積的一半(接近2ml)。將500mgC18柱固定于24孔固相萃取裝置中，分別用5ml甲醇、5mlC:M混合液(2:1，體積比)和2.5ml曱醇按序洗滌活化。用0.1%NaCl:曱醇(60:40,體積比)混合液2.5ml平衡C18柱。測定上迷部分吹干后的下層相體積，用水補至1或2ml，加入0.8ml甲醇，離心出去不溶物后，分兩次上樣至C18柱中。固相萃取柱用10ml蒸餾水除去鹽類和水溶性污染物，之后真空抽干30秒。用5ml曱醇和5mlC:M混合液(2:1,體積比)洗脫神經(jīng)節(jié)苷脂，所得溶液用氮氣吹干，殘留物用2mlC:M混合液(1:1,體積比)復溶。用LBSA計算總神經(jīng)節(jié)苷脂。取50y1置于10ml玻璃離心管中，氮氣吹干，用間苯二酚分牙斤法測定(SvennerholmL.,Quantitativeestimationofsialicacid:Acolorimetricresorcinol-hydrochloricacidmethod,Bioche'm.Biophys.Acta.,1957,24:604-611)。加入1ml間笨二酚試劑和1ml水，試管具塞，于100'C沸水浴中加熱15分鐘。水浴中冷卻，加入2ml乙酸丁酯/丁醇混合液(85:15，體積比)，渦旋1分鐘，750xg離心10分鐘取上層相用分光光度法在580nm波長下測定，NANA的標準液(濃度范圍為2-64yg/ml)同法處理，用于計算樣品中唾液酸的濃度。間苯二酚試劑的制備方法如下取用二次去離子水配成的2%間苯二酚溶液10ml，加入0.1M硫酸銅溶液0.25ml、濃鹽酸80ml，加水至100ml。制備過程應避光。從剩余純化后脂質提取物中取150mcg進行神經(jīng)節(jié)苷脂的高效液相分析。用配備有雙波長吸收檢測器、Luna-NH2色譜柱(250x4.6mm，5jum,IOOA,購自菲羅門公司)的Alliance2690液相系統(tǒng)分離神經(jīng)節(jié)苷脂。在室溫下用以下溶劑系統(tǒng)進行洗脫不同體積比和不同離子強度的乙腈-磷酸緩沖液。(GazzottiG.，SonnionS.,GhidoniaR.Normal-phasehigh-performanceliquidchromatographicseparationofnon-derivatizedgangliosidemixture,JChromatogr,1985，348:371-378)使用了兩種流動相梯度溶劑A:乙腈-5mM磷酸緩沖液，pH5.6(83:17)溶劑B:乙腈-20mM磷酸緩沖液，pH5.6(1:1)使用了下表中的洗脫程序:<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>濃度范圍0-0.4mg/ml的GD3溶液被作為標準曲線，牛腦溶液被用于確定神經(jīng)節(jié)苷脂種類。-現(xiàn)網(wǎng)膜成分視網(wǎng)膜用3.5mlC:M混合液(1:1,體積比)分散機中分散1分鐘，渦旋混勻45分鐘，離心。收集上清液，用2ml上述混合溶劑對顆粒進行2次重提取。三次上清液合并，氮氣吹干，提取物用1ml氯仿溶解，取IOOy1用于脂肪酸和磷脂分析。剩余液體再吹干，重復大腦樣品的分配和純化過程。純化后提取物用lmlC:M(l:1,體積比)溶解，取0.5ml按間笨二酚測定法測定，0.5ml用于神經(jīng)節(jié)苷脂的高效液相分析。脂肪酸成分按照上迷血漿中測定方法取100Ml進行測定，結果以峰面積歸一化法表示每種脂肪酸甲酯的比例。用以下溶劑系統(tǒng)采用Spherisorb硅膠柱(150x4.6mm,5m)對視網(wǎng)膜樣品中的磷脂含量進行高效液相測定不同比例和不同離子強度的乙腈-磷酸緩沖液。使用了兩種流動相梯度溶劑A:乙腈溶劑B:乙腈-5mM磷酸緩沖液，pH5(80:20)使用了下表中的洗脫程序，柱溫55。C:<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>取IOOMl注入色語系統(tǒng)(Alliance2690,雙波長檢測器，Waters)。測定波長為201nm。使用混合了多種磷脂(磷脂酰絲氨酸PS、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰膽堿PC、神經(jīng)磷脂SM)的標準溶液，濃度范圍為0.2-5mg/ml。由于磷脂酰肌醇和磷脂酰乙醇胺可結合形成污染物，因此磷脂酰肌醇單獨配制溶液進樣，濃度范圍不變。大腦和眼球的組織學分析大腦半球按橫切向切成50mm厚的標本。在初步分析后，選擇中間塊(根據(jù)大腦尺寸選擇4、5或6塊)進行定量。橫切向制備最小長度為5mm的視神經(jīng)樣品，置入福爾馬林液中3小時，于4-6。C保存在磷酸緩沖液(pH7.4)中。眼球額切面制成3樣本。標注并埋入石蠟中。利用石蠟塊制成連續(xù)切片用于后面的染色。在用顯微鏡用薄片切片機進行連續(xù)切片并加栽免疫組織化學程序用普通和特殊涂片后，用經(jīng)典染色法蘇木素伊紅染色、碘酸雪夫氏反應PAS染色、Kluver-BarreraLFB髓鞘染色法。對同系列組織切片進行免疫組織化學染色。使用下述標記物單克隆抗體S100蛋白Ab-l。S100屬于鈣結合蛋白家族，如鈣調蛋白和肌朽蛋白C,S100蛋白作在抗原呈遞細胞，如皮膚的朗格漢斯細胞、淋巴結副皮質的指突狀網(wǎng)狀細胞和染色星形神經(jīng)膠質細胞中也有表達。所用免疫原是純化牛腦S100蛋白(種群活性人，牛，大鼠，小鼠)?？股窠?jīng)細胞核抗體(NeuN)。NeuN和大多數(shù)神經(jīng)細胞發(fā)生反應。神經(jīng)元有絲分裂短期內(nèi)即可觀察到免疫活性，但未觀察到增殖區(qū)染色。免疫組織化學染色主要發(fā)生在神經(jīng)元細胞的細胞核，胞漿染色較淺。種群活性人，小鼠，大鼠，豬，雪貂，雞和火浙蜴。單克隆抗體bcl-2。bcl-2oc人癌蛋白的表達可以抑制細胞程序性死亡(即細胞凋亡)。種群活性人和豬。用黑白SonyXC-ST500CE攝影機(Sony公司，東京，日本)和帶有MTV-3適配器(Olympus光學有限公司，東京，日本)的OlympusBH-2顯微鏡(20瓦)拍攝了30張下胼肢體神經(jīng)束及其附近白質的圖片。用20倍和60倍顯微鏡OlympusPLCN60X(60x/0.8)產(chǎn)生600倍的放大效果。圖片用Visilog6.0軟件(NoesisS.A.Courteboeuf,法國)進行處理。結果替換試驗l:A組中有一只豬仔在出生時體重過輕，趕不上其他豬仔的重量。C組中一只豬仔在登記后10天時死亡。在試驗結束時確認C組中另有一只豬仔為雌性。因此，A組在29-30天時樣本數(shù)為3,而不是4,同理，C組在同一時間樣本數(shù)為2,而不是4。試驗2:在適應期內(nèi)一只豬仔死亡。B組中另有一只豬仔在登記6天后死亡。A組和B組分別有2只和1只豬仔由于出生時體重過輕，生長速度慢于其它豬仔而未參加本研究。因此，本研究在每一時間點研究目標為7只豬仔，只有A組在29-30天時不滿足這一數(shù)字(n=6)。體重和食物攝取以不同食物喂養(yǎng)的3個組豬仔的體重和食物攝取評價非常相似。在試驗期間組間體重評價無差異。16-28天期間，C組的食物攝取要顯著高于A和B組。其余時間組間無差異。若以累積攝取量計算，則組間不存在差異。類似的，3組間的食物效能(按照g體重/100千卡路里攝取量)相似。不管是在單獨飼養(yǎng)間隔還是整個研究期間，3組間均無差異。血漿中脂肪酸成分在8-9天時，總脂肪酸趨于降低，但隨后開始增加直至飼養(yǎng)期29-30天。這可能是由于在研究最初的一個星期中出現(xiàn)腹瀉和(或)適應性問題導致對代乳品的較低攝入。對于長鏈多聚不飽和脂肪酸，在任意時間點時均不存在組間顯著性差異。然而，C組在研究結束時這類脂肪酸濃度最低，與代乳品的成分一致。腦成分以蛋白質質量、細胞數(shù)量(DNA)和髓鞘化(膽固醇)為指標測定了大腦中蛋白質、DNA和膽固醇含量。在任意時間點均不存在組間顯著性差異。然而，從數(shù)椐中可以總結出一些證據(jù)。大腦中DNA的量并不增加，但蛋白質趨于增加，表明在試驗期間豬仔大腦細胞密度相似，細胞增殖是大腦生長的結果。當分別以每g組織和大腦整體計算時，膽固醇均增加，表明至少在研究期間就發(fā)生了髓鞘化。關于脂肪酸成分，在任意時間點各種脂肪酸濃度不存在組間顯著性差異。隨時間發(fā)展各組存在某種共同的趨勢16:0和20:4n-6是下降，而在二曱基縮醛，18:ln-9，和18:2n-6時是上升?？偵窠?jīng)節(jié)苷脂和脂質結合唾液酸(LBSA)濃度，以每器官表示，不隨時間和分組改變，低濃度神經(jīng)節(jié)苦脂的變化性較大。然而3組的LBSA和神經(jīng)節(jié)苷脂的總含量均隨時間延長而增加。因此，大腦中LBSA和神經(jīng)節(jié)苷脂的增加是大腦生長的功能性結果，且隨時間延長，每克組織中這兩種物質的量不增加。視網(wǎng)膜成分視網(wǎng)膜中脂肪酸成分不存在組間顯著性差異。視網(wǎng)膜中脂肪酸百分含量的時間過程與腦中相似，22:6n-3的百分含量則隨時間延長而增加。這一結果與脂肪酸對于視網(wǎng)膜發(fā)育的重要性相一致。不管是在任意時間點或是從整個時間過程看，視網(wǎng)膜中LBSA、總神經(jīng)節(jié)苷脂和主要神經(jīng)節(jié)苷脂的含量均不存在組間顯著性差異。磷酯總含量和幾種主要磷酯(磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺)含量亦如此。盡管缺乏顯著性差異，但這些重要磷脂成分隨時間延長而增加以及B組詞養(yǎng)一周后磷脂濃度更高這一現(xiàn)象仍然值得注意。腦組織學神經(jīng)元遷移、發(fā)育和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成熟也進行了評價。對大腦的肉眼觀測和顯微鏡分析均未發(fā)現(xiàn)損傷(出血、萎縮區(qū)域、畸形或癌癥損傷)或疾病跡象。的細胞總數(shù)進行定量。由于成神經(jīng)細胞通過室管膜(見圖、1.1和1^2)后的層狀遷移和分化，因此選定這一區(qū)域。在下胼肢體神經(jīng)束的三個不同區(qū)域進行核子計數(shù)(見圖1.2和1.3)。區(qū)域l:靠近側腦室的遷移和增殖區(qū)域區(qū)域2:去掉室管膜中成神經(jīng)細胞聚集區(qū)后的區(qū)域1區(qū)域3:下胼肢體神經(jīng)束附近的白質區(qū)域l中，不考慮食物分組，在伺養(yǎng)8-9天時出現(xiàn)核子數(shù)量峰值。這一峰值是由于B組在該時間點時核子數(shù)量較高，盡管B組與其它兩組的核子數(shù)量不存在顯著性差異(與C組對比，p=0.108)。這可能是由于染色核子聚集在側腦室邊緣，導致變化性增大。去掉核子聚集區(qū)域(在區(qū)域2進行測定)后仍得到上述結果，但變化性減小，此時B組的核子數(shù)量比其它組高，且與A組間存在顯著性差異。區(qū)域3未發(fā)現(xiàn)組間差異。結論在任意時間點，腦中蛋白質、DNA和膽固醇含量均不存在組間顯著性差異。腦中蛋白質和膽固醇含量隨時間的增加分別反映了研究期間大腦生長和髓鞘化的一般過程。視網(wǎng)膜中脂肪酸成分的變化趨勢與腦中相似，不存在組間顯著性差異，脂肪酸百分比隨時間的變化過程相似，而22:6n-3則隨時間延長增加。視網(wǎng)膜中脂質結合唾液酸、神經(jīng)節(jié)苷脂、磷脂、多種單獨神經(jīng)節(jié)苷脂和多種單獨磷脂的總含量，在任意時間點不存在組間顯著性差異，同組在不同時間點亦不存在顯著性差異。盡管缺乏顯著性差異，但需要指出B組在伺養(yǎng)8-9天時磷脂總含量更高。實際上，刪除試驗設計并在8-9天時對A、B、C組進行單因素方差分析，可發(fā)現(xiàn)總磷脂和脂肪酸含量存在組間顯著性差異，磷脂酰乙醇胺、20:4n-6和22:6n-3脂肪酸也同樣。在對下驕肢體神經(jīng)束及其附近白質(即成神經(jīng)細胞遷移區(qū)域)的選定區(qū)域進行細胞總數(shù)的腦組織血分析中，發(fā)現(xiàn)B組具有更高的核子數(shù)量。這一暫時性效果是由于在飼養(yǎng)8-9天時以食物B飼養(yǎng)的動物腦內(nèi)成神經(jīng)細胞遷移較高，該食物包含LacprodanMFGM-10和更高濃度的花生四烯酸和二十二碳六烯酸。上述結論2和3種所述表明了食物B(包含LacprodanMFGM-10和更高濃度的花生四烯酸和二十二碳六烯酸)在神經(jīng)和視覺發(fā)育中的潛在作用。而在包含LacprodanMFGM-10的食物C和包含同樣濃度水平花生四烯酸和二十二碳六烯酸的食物A飼養(yǎng)組中未觀察到這種作用，指出了兩種成分之間(LacprodanMFGM-10以及花生四烯酸和二十二碳六烯酸)的協(xié)同作用只能發(fā)生在花生四烯酸和二十二碳四烯酸至少為食物B中的濃度水平條件下。這暗示了食物B中成分(神經(jīng)節(jié)苷脂、磷脂、n-乙酰神經(jīng)氨酸、高濃度的花生四烯酸和二十二碳六烯酸(特別是神經(jīng)節(jié)苷脂和二十二碳六烯酸))是神經(jīng)遷移和神經(jīng)突生長方面的重要原因。試驗2進行了第二項動物研究，除了考察的是以下詞養(yǎng)條件的效果外，試驗方案與試-瞼1相似。食物A(A組)本發(fā)明中所迷的嬰兒代乳品，按總脂肪酸質量計，含0.4%花生四烯酸和0.2%二十二碳六烯酸，以風干基計，含濃度水平為6.4g/L的豐富乳清濃縮蛋白。食物B(B組)SimilacAdvance嬰兒代乳品，購自雅培實驗室(哥倫比亞，俄亥俄州，美國)，按總脂肪酸質量計，含0.4%花生四烯酸、0.15%二十二碳六烯酸和傳統(tǒng)乳清濃縮蛋白。食物C(C組)Enfalac⑧泰國產(chǎn)嬰兒代乳品，購自Bristol-MyersSquibb(泰國)(按總脂肪酸質量計，含0.65%花生四烯酸、0.35%二十二碳六烯酸和傳統(tǒng)乳清濃縮蛋白。)對照組以豬奶喂養(yǎng)。概述研究數(shù)據(jù)表明豬奶對14-16天大的新生豬仔具有顯著的神經(jīng)增殖作用。數(shù)據(jù)也表明含有較低水平豐富乳清濃縮蛋白(6.4g/L,以風干基計)的代乳品對成神經(jīng)細胞遷移的促進作用低于第一項研究(試驗1)中較高水平豐富乳清濃縮蛋白(7.1g/L,以風干基計)。試驗設計試驗為縱向進行，包括分別以試驗食物A、B和C(見表4)飼養(yǎng)并于詞養(yǎng)期7-8天、14-15天處死的3組豬仔。另有一組以豬奶喂養(yǎng)的豬仔作為參比。本研究分為兩個試驗。研究所用豬仔由同一農(nóng)場供應。參比組中動物與試-瞼組中處死時間點的動物年齡相當。參比組中動物于試-瞼前，分別在14-16天大和23-24天大時處死。60只家養(yǎng)豬仔(3-4天大)均由同一農(nóng)場供應。參比組中取8只豬仔處死。48只根據(jù)體重、窩和性別配對并分成3組(分別為n=16，n=16,n=16)。剩余4只豬仔分配到三組中(A組1只，B組1只，C組2只)。豬仔飼養(yǎng)于不銹鋼籠中，飼養(yǎng)室空調溫度為27°C。據(jù)它們的營養(yǎng)需求，按改編的食物伺養(yǎng)3天，每天喂食4次。三天適應期后，改用試驗食物進行飼養(yǎng)。首次給予試驗食物的時間記為本研究的"0時"。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>4-15天時，A組n-6，B組n-4，C組n=6。體重和食物攝取以不同食物喂養(yǎng)的3個組豬仔的體重和食物攝取評價非常相似。在試驗期間組間體重評價無差異。以累積攝取量計算時，組間不存在差異。按照g體重/100千卡路里攝取量計算，C組的食物效能在飼養(yǎng)第7-14天期間高于A和B組，但無顯著性差異。飼養(yǎng)第0-6天期間，變化性較大，但無顯著性差異。腦組織學應用常規(guī)組織學技術對下胼肢體神經(jīng)束及其附近白質選定區(qū)域中的細胞總數(shù)進行定量?？拷码葜w神經(jīng)束的白質區(qū)不存在組間顯著性差異(見圖3.2，圖4.1和圖4.3)。下胼肢體神經(jīng)束區(qū)域H&E染色細胞數(shù)量在任意時間點不存在組間顯著性差異(圖3.1)。然而，豬奶飼養(yǎng)組在豬仔14-16天大時，下胼肢體神經(jīng)束中BrdU和Ki67染色的細胞數(shù)量較高(圖3.3和圖4.2)。豬奶飼養(yǎng)組和B組的BrdU陽性細胞數(shù)量存在顯著性差異。結論試驗1和2的數(shù)據(jù)表明，豐富乳清濃縮蛋白、二十二碳六烯酸和花生四烯酸的特定組合物具有協(xié)同作用，特別是觀察到下述現(xiàn)象試驗1顯示含豐富乳清濃縮蛋白(7.1g/L,以風干基計)、二十二碳六烯酸(0.15%)和花生四烯酸(0.4%)的嬰兒代乳品(食物B)促進成神經(jīng)細胞遷移。試驗1顯示含豐富乳清濃縮蛋白(7.1g/L，以風干基計)、低濃度二十二碳六烯酸(0.1%)和花生四烯酸(0,2%)的嬰兒代乳品(食物C)不能促進成神經(jīng)細胞遷移。試驗2顯示含二十二碳六烯酸(0.2%)、花生四烯酸(0.4%)和較低豐富乳清濃縮蛋白(6.4g/L,以風干基計)的嬰兒代乳品(食物A)不能促進成神經(jīng)細胞遷移。試驗2還顯示含二十二碳六烯酸(0.15%)、花生四烯酸(0.4%),但不含豐富乳清濃縮蛋白的嬰兒代乳品(食物B)不能促進成神經(jīng)細胞遷移。因此，兩個試驗均顯示，假如三者在代乳品中的濃度高于本發(fā)明中定義的閾值，則豐富乳清濃縮蛋白、二十二碳六烯酸和花生四烯酸的特定組合物具有促進成神經(jīng)細胞遷移的作用。相反地，這些試驗也顯示DHA/ARA和豐富乳清濃縮蛋白這些組分單獨應用時對上述參數(shù)指標無效。實施例下述實施例代表本發(fā)明中所述的特定實施方案，每個實施例僅供說明用，不作為本發(fā)明的局限解釋，在不偏離本發(fā)明的宗旨和范圍時可進行多種變化。所有舉例的數(shù)量，如未特別說明，均為根據(jù)成分總質量計算的質量百分比。嬰兒代乳品粉末下面范例是本發(fā)明中所述代乳品粉末實施方案，包括嬰兒服用方法。每種代乳品的成分都列在下表中。表6:實施例1-4<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>AA和DHA是按照代乳品中總脂肪酸計算的百分比每個范例都可以按照同樣的方法制作分別制成至少兩個獨立的漿液，之后混合，熱處理，標準化，蒸發(fā)，干燥，包裝。開始時，在油料混合罐內(nèi)，同入氮氣，將高油酸葵花籽油、大豆油、椰子油混合制成油漿，隨后加入維生素c棕櫚酸酯、p-胡蘿卜素、維生素A、DXE、K和混合維生素E。攪拌20分鐘，質量分析。質量分析合格后，在處理ARA油之前迅速向油料混合罐中加入DHA油。所得油漿在室溫下(<3(TC)中速攪拌至于另一個漿液混合。將混合油漿液加入到35。C的40%液體脫脂奶中，持續(xù)攪拌，加入豐富乳清濃縮蛋白，制得脫脂奶-油漿液。將油-蛋白質漿液加熱至65-70。C,在154-190/25-45bars下勻質兩個階段，冷卻到3-6。C,貯存于貯窖中。將乳糖和脫脂奶粉末溶于60-75'C下約60。/。的液態(tài)脫脂奶中制得脫脂奶-糖漿液。在溶解罐內(nèi)攪拌此漿液2分鐘，傾入板式交換器中，冷卻至3-6°C,轉移到貯窖中與脫脂奶-油漿液混合。礦物質漿液1是將氯化鎂、氯化鈉、氯化鉀和檸檬酸鉀溶于室溫下的水中，至少攪拌5分鐘后得到。將礦物質漿液1加入貯窖中。礦物質漿液2是將磷酸鈣、碳酸鈣溶于40-6(TC的水中，至少攪拌5分鐘后得到。將礦物質漿液2加入貯窖中。低聚果糖漿液是將低聚杲糖溶于40-6(TC的水中，至少攪拌5分鐘后得到。將低聚果糖漿液加入貯窖中。^窖中的液體至少攪拌45分鐘后進行質量分析。根據(jù)質量控制檢測的分析結果，進行適當?shù)臉藴驶幚怼＞S生素C漿液是將擰檬酸鉀和維生素C溶于室溫下的水中，至少攪拌5分鐘后得到。將維生素C漿液加入貯窖中。水溶性維生素-肌醇漿液是將檸檬酸鉀、水溶性維生素復合物和肌醇溶于40-6(TC的水中，至少攪拌5分鐘后得到。將水溶性維生素-肌醇漿液加入貯窖中。疏酸鐵漿液是將檸檬酸鉀和硫酸鐵溶于室溫下的水中，至少攪拌5分鐘后得到。核苷酸-膽堿漿液是將核苷酸-膽堿復合物溶于室溫下的水中，至少攪拌5分鐘后得到。將核苷酸-膽堿漿液加入貯窖中。最后，將貯窖中的漿液至少攪拌60分鐘后進行分析檢測。根據(jù)質量控制檢測的分析結果，可能需要加入適當?shù)木S生素C和pH值調節(jié)。最后漿液在3-6'C下持續(xù)中速攪拌。在等待不超過7天時間后，將所得混合物預熱到90-96°C，維持U0-130。C3分鐘。使熱混合物通過閃蒸冷卻儀，溫度降至93-97。C,之后蒸干得到預期的固體。之后將產(chǎn)品加熱到75-78'C，泵入噴霧干燥塔。收集得到的粉末產(chǎn)品，貯存于大型粉末貯窖中，質量檢驗。最后產(chǎn)品置于適宜的容器中。上述過程中可隨行和最終產(chǎn)品階段中取樣進行微生物和分析檢測。備選方法每個范例都可以按照同樣的方法制作分別制成至少兩個獨立的漿液，之后混合，熱處理，標準化，干燥，干混合，包裝。開始時，將約80%的脫脂奶粉末溶于60-65。C的去離子水中，加入檸檬酸鉀和氫氧化鉀制得脫脂奶-礦物質漿液。用氫氧化鉀或檸檬酸將該混合物的pH調為7.7-8.7。將剩余脫脂奶粉末和氯化鎂加入到上述混合物中。所得混合物用氫氧化鉀或檸檬酸調pH為6.7-7.2。在另一混合槽內(nèi)將氯化膽堿和肌醇溶于室溫下的去離子水中制得新漿液。將其與脫脂奶-礦物質漿液相組合，在60-65'C下中速攪拌不超過1小時至加入其它成分。在第3個混合槽內(nèi)將?；撬崛苡?(TC的去離子水中。所得漿液與脫脂奶-礦物質漿液組合，在60-65。C下中速攪拌不超過1小時至加入其它成分。在脫脂奶-礦物質漿液中加入豐富乳清濃縮蛋白后，加入乳糖和低聚乳糖。所得漿液于分析檢測前在貯窖中至少攪拌30分鐘。用氫氧化鉀或檸檬酸將混合物的pH調為6.5-7.1。在油處理槽內(nèi)，通入氮氣，將高油酸葵花籽油、大豆油和椰子油混合后，加入維生素A/D/E/K、|3-胡蘿卜素、復合維生素E、維生素C棕櫚酸酯、ARA油和DHA油制得油漿液。所得由漿液在室溫下中速攪拌不超過6小時至加入蛋白質-糖-礦物質漿液。在等待不低于30分鐘而不超過6小時的時間后，蛋白質-糖-礦物質漿液在70-80。C脫氣，并繼續(xù)加熱到84-86°C。此時注入50-80°C的油漿液。所得混合物冷卻至68-72°C,并先后分別在145-155bars和30-40bars下均質一個階段以進行乳化。熱混合物經(jīng)過板式交換器冷卻至3-5。C,貯存于貯窖中。礦物質和維生素C溶液是將下面成分分別加入到混合物中得到。礦物質溶液是將下列成分加入到足量去離子水中，邊加邊攪拌制得檸檬酸、硫酸錳、硒酸鈉和硫酸鋅。檸檬酸溶液是將檸檬酸加入到足量去離子水中并溶解制得。所得混合物在3-5。C下中速攪拌不超過48小時。取樣，分析檢測。將冷的混合物在69-73。C下加熱，在60-70bars/30-40bars下均質，之后送入噴霧干燥塔。收集基礎粉末產(chǎn)品，貯存于大型粉末容器中。取樣進行微生物和分析檢測。在相應的分析和微生物檢測完成后，將基礎粉末產(chǎn)品與其它成分進行干混合。為了得到最終粉末產(chǎn)品，剩余成分所需要的量進行測定并輸入自動化稱重系統(tǒng)。該系統(tǒng)對干混合過程的預混料(乳糖、碳酸釣、氯化鉀、氯化鈉、水溶性預混合料、5-磷酸胞苷、5-磷酸二鈉-尿苷、5-磷酸二鈉-烏苷、5-磷酸二鈉-腺苷、疏酸銅和磷酸鈣)中的每個成分稱重u基礎粉末產(chǎn)品和干混合預混料轉移至混合器中?；旌衔飻嚢璨簧儆?0分鐘。混合完成后，最終產(chǎn)品轉移至包裝器，放入適宜的容器內(nèi)。取樣進行微生物和分析檢測。本發(fā)明的粉末代乳品實施方案不限于上述代乳品范例(實施例1-4)。每個代乳品在使用前用水復溶，以使熱量密度為約19_24千卡路里/液體盎司，之后給予不足4個月的嬰兒作為單獨營養(yǎng)來源，包括不足2個月的嬰兒。代乳品有助于促進嬰兒的神經(jīng)遷移、大腦發(fā)育和認知發(fā)育。液體嬰兒代乳品對實施例1-4用傳統(tǒng)方法修改可得到本發(fā)明的即食液體代乳品實施方案(實施例5-8)。實施例5-8中的成分分別與實施例l-4種成分相對應。作為范例給出的代乳品(實施例5-8)不作為本發(fā)明中液體代乳品實施方案的限制實施例。每一代乳品的熱量密度調節(jié)為約19-24千卡路里/液體盎司。完成后的代乳品給予不足4個月，包括不足2個月的嬰兒作為單獨營養(yǎng)來源。代乳品有助于促進嬰兒的神經(jīng)遷移、大腦發(fā)育和i/v知發(fā)育。權利要求1.一種嬰兒代乳品，其含有(A)以風干基計，至少約6.5g/L的豐富乳清濃縮蛋白，(B)以總脂肪酸質量計，至少0.13％二十二碳六烯酸，和(C)以總脂肪酸質量計，至少0.25％花生四烯酸。2.—種權利要求1所述的嬰兒代乳品，其包括至少約5mg/L神經(jīng)節(jié)苷脂，至少約150mg/L磷脂，以及至少約70mg/L的具有按唾液酸質量計至少2.5%脂質結合唾液酸的總唾液酸。3.—種權利要求2所述的嬰兒代乳品，其中以神經(jīng)節(jié)苷脂、磷脂和唾液酸組合物的質量計，約50%-100%來自于豐富乳清濃縮蛋白。4.一種權利要求2所述的嬰兒代乳品，其中以總唾液酸質量計，至少約2.7%至約5%為脂質結合唾液酸。5.—種權利要求2所述的嬰兒代乳品，以風干基計，其含有(A)約7mg/L至約50mg/L神經(jīng)節(jié)苷脂，(B)約200mg/L至約600mg/L磷脂和(C)約90mg/L至約250mg/L唾液酸。6.—種權利要求1所述的嬰兒代乳品，以總脂肪酸質量計，其含有約0.4%至約2.0%花生四烯酸和約0.15%至約1.0%二十二碳六烯酸。7.—種權利要求2所迷的嬰兒代乳品，以鞘磷脂質量計，其中總磷脂中含有至少20%鞘磷脂。8.—種權利要求7所述的嬰兒代乳品，其中磷脂含有鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸。9.一種權利要求2所述的嬰兒代乳品，其以風干基計，含有質量少于約0.5%的游離糖巨肽。10.—種權利要求2所述的嬰兒代乳品，其中基本不含大豆磷脂、蛋黃卯磷脂及其組合物。11.一種權利要求2所述的嬰兒代乳品，其中以奶脂肪質量計，包含少于約0.2%奶脂肪。12.—種權利要求1所述的嬰兒代乳品，其為粉末。13.—種權利要求1所迷的嬰兒代乳品，其為即食液體。14.一種權利要求2所迷的嬰兒代乳品，其以風干基計，含有至少約190mg/L的按唾液酸質量計具有至少約2.5。/。脂質結合唾液酸的總唾液酸。15.—種促進嬰兒大腦發(fā)育的方法，包括(A)制作含有以下成分的嬰兒代乳品(i)以風干基計，至少約6.5g/L豐富乳清濃縮蛋白，(ii)以總脂肪酸質量計，至少約0.13%二十二碳六烯酸，和(iii)以總脂肪酸質量計，至少約0.25%花生四烯酸，以及(B)給予或指導護理員給予出生不足2個月的嬰兒上述代乳口O。16.—種權利要求15所述的方法，其中以風干基計，嬰兒代乳品包括(A)至少約5mg/L神經(jīng)節(jié)苷脂，(B)至少約150mg/L磷脂，和(C)至少約70mg/L的按唾液酸質量計具有至少約2.5%脂質結合唾液酸的總唾液酸。17.—種權利要求15所述的方法，其中給予不足4個月的嬰兒該代乳品。18.—種權利要求16所述的方法，其中以神經(jīng)節(jié)苷脂、磷脂和唾液酸組合物的質量計，約50°/。-100%來自于豐富乳清濃縮蛋白。19.一種權利要求16所述的方法，其中以總唾液酸質量計，約2.7%至約5%為脂質結合唾液酸。20.—種權利要求16所述的方法，以風干基計，其中嬰兒代乳品含有(A)約7mg/L至約50mg/L神經(jīng)節(jié)苷脂，(B)約200mg/L至約600mg/L磷脂和(C)約90mg/L至約250mg/L唾液酸。21.—種權利要求15所述的方法，以總脂肪酸質量計，其中嬰兒代乳品含有約0.4%至約2.0%花生四烯酸和約0.15至約1.0%二十二碳六烯酸。22.—種權利要求16所述的方法，其中以鞘磷脂質量計，總磷脂中含有至少20%鞘磷脂。23.—種權利要求16所述的方法，其中磷脂含有鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸。24.—種權利要求16所述的方法，以奶脂肪質量計，其中代乳品含有少于約0.2%奶脂肪。25.—種權利要求16所述的方法，以游離糖巨肽質量計，其中代乳品含有少于0.5%的游離糖巨肽。26.—種權利要求16所述的方法，其中嬰兒代乳品基本不含大豆磷脂和蛋黃卵磷脂。27.—種權利要求16所述的方法，以風干基計，其中嬰兒代乳品包括至少約190mg/L的按唾液酸質量計具有至少約2.5%脂質結合唾液酸的總唾液酸。28.—種促進嬰兒神經(jīng)移行的方法，包括給予或指導護理員給予出生不足4個月的嬰兒權利要求1所述嬰兒代乳品作為單獨營養(yǎng)來源。29.—種促進嬰兒視覺發(fā)育的方法，包括給予或指導護理員給予出生不足4個月的嬰兒權利要求1所述嬰兒代乳品作為單獨營養(yǎng)來源。30.—種促進嬰兒認知發(fā)育的方法，包括給予或指導護理員給予出生不足4個月的嬰兒權利要求1所述嬰兒代乳品作為單獨營養(yǎng)來源。全文摘要本發(fā)明公開了嬰兒代乳品，其包含按風干基計算至少約6.5g/L的豐富乳清濃縮蛋白、按總脂肪酸質量計算至少0.13％的二十二碳六烯酸、以及按總脂肪酸質量計算至少0.25％的花生四烯酸。該類代乳品同時典型地包括至少約5mg/L的神經(jīng)節(jié)苷脂，至少約150mg/L的磷脂，和至少約70mg/L的具有至少2.5％脂質結合唾液酸的總唾液酸，這些成分全部或部分由豐富乳清濃縮蛋白提供。本發(fā)明還公開了通過給2-4月大的新生兒服用該類嬰兒代乳品來促進其大腦發(fā)育、神經(jīng)遷移和認知發(fā)育的方法，優(yōu)選將該類嬰兒代乳品作為單獨營養(yǎng)來源。文檔編號A23L1/29GK101484025SQ200780025058公開日2009年7月15日申請日期2007年6月29日優(yōu)先權日2006年6月30日發(fā)明者A·巴蘭科,E·瓦茲奎茲,E·瓦爾維德,M·多赫納列,M·拉米雷斯,P·普里托,R·呂達-卡布雷拉申請人:艾博特公司