專利名稱：：類異戊二烯的生產(chǎn)的制作方法類異戊二烯的生產(chǎn)交叉引用本申請要求2006年5月26日提交的美國臨時申請60/808,989和2006年12月18日提交的60/870,592的優(yōu)先權，這些臨時申請全文引入本文作為參考。
背景技術：
：類異戊二烯在自然界中普遍存在。它們包括不同家族的超過40,000種個體產(chǎn)物，其中許多對于活生物體是至關重要的。類異戊二烯用來維持細胞流動性、電子傳遞和其它代謝功能。大量的天然和合成類異戊二烯可用作藥物、化妝品、香料、色素和顏料、殺真菌劑、抗菌劑、營養(yǎng)品和精細化學中間體。類異戊二烯產(chǎn)物通常由重復的五碳異戊烯二磷酸(IPP)單元組成，盡管也曾報道了不規(guī)則的類異戊二烯和多薛。實際上，類異戊二烯是通過它們的前體IPP和其異構體二曱基烯丙基焦磚酸(DMAPP)連續(xù)縮合而合成的。已知這些前體有兩種途徑。除植物以外，真核生物通常利用依賴于曱羥戊酸(MEV)的途徑將乙酰輔酶A(乙酰-CoA)轉化為IPP，然后IPP纟皮異構化為DMAPP。除了部分例外以外，原核生物一般只利用不依賴于曱羥戊酸的途徑或脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑產(chǎn)生IPP和DMAPP。植物既利用MEV途徑又利用DXP途徑。參見Rohmer等人.(1993)歷ocA亂丄295:517-524;Lange等人.(2000)戶亂A^/.OS^97(24):13172-13177;Rohdich等人.(2002)尸roc.淑/.JcW.園99:1158-1163。傳統(tǒng)上，類異戊二烯通過從諸如植物、微生物和動物的天然來源中提取來生產(chǎn)。然而，由于許多嚴重的限制，提取的產(chǎn)率通常極低。首先，大多數(shù)類異戊二烯在自然中只少量積累。其次，來源生物體通6常不適合大規(guī)模培養(yǎng)，而大規(guī)模培養(yǎng)是商業(yè)生產(chǎn)有效量的所需類異戊二烯所必需的。第三，類異戊二烯提取需要某些有毒溶劑，這需要特殊的處理步驟，因此使類異戊二烯的商業(yè)生產(chǎn)變得復雜化。MEV和DXP代謝途徑的闡明已經(jīng)使得類異戊二烯的生物合成生產(chǎn)成為可行的。例如，已經(jīng)將微生物工程化為過量表達甲羥戊酸途徑的一部分或者全部，用于生產(chǎn)被稱為紫穗槐-4，11-二烯的類異戊二烯(美國專利7,172,886和7,192,751號)。其它努力集中于平衡甘油醛-3-磷酸和丙酮酸的集合，或者集中于提高l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs)和IPP異構酶(idi)的表達。參見Farmer等人.(2001)肌o&c/mo/.7V。g.17:57-61;Kajiwara等人.(1997)腸cA亂丄324:421-426;和Kim等人.(2001)所o化c/mo/.72:408-415。然而，鑒于許多商業(yè)應用需要極大量的類異戊二烯產(chǎn)物，仍然需要比現(xiàn)有技術產(chǎn)生更多類異戊二烯的表達系統(tǒng)和發(fā)酵方法。微生物代謝向類異戊二烯生產(chǎn)的最佳重定向需要將引入的生物合成途徑適當?shù)毓こ袒?，從而在持續(xù)的時間期限內既能使碳用于有效地產(chǎn)生類異戊二烯，又能阻止代謝中間體的毒性水平的建立。本發(fā)明滿足了這一需要并且也提供了相關的優(yōu)勢。
發(fā)明內容本發(fā)明提供用于在單獨的或者組合的至少一個異源調節(jié)物或發(fā)酵條件控制下利用異戊烯焦磷酸途徑酶大規(guī)模生產(chǎn)類異戊二烯的組合物和方法。合適的類異戊二烯的非限定性的例子包括半萜類(由l個異戊二烯單元衍生)如異戊二烯；單萜類(由2個異戊二烯單元衍生)如月桂烯；倍半碎類(由3個異戊二烯單元衍生)如紫穗槐-4,11-二烯；二萜類(由4個異戊二烯單元衍生)如紫杉二烯(taxadiene);三萜類(由6個異戊二烯單元衍生)如鯊烯；四碎類(由8個類異戊二烯衍生)如j3-胡蘿卜素；和多萜類(由8個以上的異戊二烯單元衍生)如多異戊二烯。一個方面，一種生產(chǎn)類異戊二烯的方法包括以下步驟(a)獲得多個包含產(chǎn)生異戊烯焦磷酸的酶途徑的宿主細胞，其中所有途徑酶都在至少一個異源轉錄調節(jié)物的控制之下；和(b)在與為宿主細胞提供最大比生長速率的條件相比為亞最佳的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細胞。在某些實施方案中，該途徑是甲羥戊酸途徑。在其它實施方案中，該途徑是DXP途徑。在其它實施方案中，該至少一種異源轉錄調節(jié)序列是可誘導的。在其它實施方案中，途徑酶處于單個轉錄調節(jié)物的控制之下。在其它實施方案中，途徑酶處于多個異源轉錄調節(jié)物的控制之下。在一些實施方案中，所述途徑包括編碼來自于具有內源曱羥戊酸途徑的原核生物的曱羥戊酸途徑酶的核酸序列。示例性的具有內源曱羥戊酸途徑的原核生物包括〗旦不限于腸^求菌屬(^Weracoccw)、j叚單月包菌屬(尸sewdowow(xy)禾口葡萄3求菌屬(^SV"/7/z少/ococcw51)。在一個實施方案中，甲羥戊酸途徑酶選自乙酰-CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA還原酶和曱羥戊酸激酶。在另一實施方案中，異源核酸序列編碼II類HMG-CoA還原酶。在另一實施方案中，宿主細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中營養(yǎng)物和/或溫度水平保持在低于為宿主細胞提供最大比生長速率的水平上。在另一實施方案中，宿主細胞在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中碳源保持在提供低于最大比生長速率的大約90%、75%、50%、25%、10%或介于90%和10%之間的水平上。在另一實施方案中，宿主細胞在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中氮源保持在提供低于最大比生長速率的大約90%、75%、50%、25%、10%或介于90%和10%之間的水平上。在另一實施方案中，宿主細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中溫度保持在提供最大比生長速率的低于大約90%、75%、50%、25%、10%或介于90%和10%之間的水平上。在另一實施方案中，培養(yǎng)基溫度保持在比提供最大比生長速率的溫度至少低約2°C、4°C、5°C、6°C、8°C、10。C、15。C或20。C。在又另一實施方案中，一種生產(chǎn)類異戊二烯或類異戊二烯前體的方法包括以下步驟(i)進行包含發(fā)酵培養(yǎng)基和多個產(chǎn)生類異戊二烯的遺傳修飾的宿主細胞的發(fā)酵反應，其反應條件使得(a)發(fā)酵培養(yǎng)基保持在低于提供所述宿主細胞的最大比生長速率的溫度的溫度下；(b)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的含量低于提供宿主細胞的最大比生長速率的量；和/或(C)發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的含量低于提供宿主細胞的最大比生長速率的量；(ii)回收在(a)至(c)所述的一個或多個條件下產(chǎn)生的類異戊二烯。在一個方面，類異戊二烯在(a)至(c)所述的至少兩個條件下產(chǎn)生。在另一方面，類異戊二烯在(a)至(c)所述的所有條件下產(chǎn)生。引用參考本說明書中提到的所有出版物和專利申請都引入本文作為參考，如果每一單獨的出版物和專利申請具體且單獨地引入本文作為參考。圖1A是產(chǎn)生異戊烯焦磷酸("IPP")的曱羥戊酸("MEV")途徑的示意圖。圖1B是產(chǎn)生異戊烯焦磷酸("IPP")和二甲基烯丙基焦磷酸("DMAPP")的l-脫氧-D-木酮糖5-二磷酸("DXP")途徑的示意圖。Dxs是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶；Dxr是l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶(也被稱為IspC);IspD是4-二磷酸胞苷酰-2C-曱基-D-赤蘚糖醇合成酶；IspE是4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合成酶；IspF是2C-曱基-D-赤蘚糖醇2，4-環(huán)二磷酸合成酶；IspG是1-羥基-2-曱基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶(IspG);ispH是異戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶。圖2是異戊烯焦磷酸("IPP")和二曱基烯丙基焦磷酸脂("DMAPP")向香葉基焦磷酸("GPP")、法尼焦磷酸("FPP")和香葉基香葉基焦磷酸("GGPP")轉化和各種類異戊二烯合成的示意圖。圖3顯示表達質粒pMBIS-gpps的圖譜。圖4顯示表達質粒pAM408的圖譜。圖5顯示表達質粒pAM424的圖譜。圖6顯示表達質粒pTrc99A-ADS、pTrc99A-FSA、pTrc99A-9LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-GTS、pTrc99A畫APS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A畫TS、pTrc99A畫CS、pTrc99A-SS和pAM373的圖"i普。圖7A-C是質粒pAM489-pAM498的構建和pAM328的圖示。圖8顯示與酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)截決豆HMG-CoA還原酶(tHMGR)相比，糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)HMGR-CoA還原酶(HMGR)的較高的比活性和提高的穩(wěn)定性。圖9顯示每升細胞干重("DCW")和OD60()之間的相關性。圖IOA-B顯示與攜帶釀酒酵母tHMGR和HMGS基因的宿主菌抹相比，攜帶金黃色葡萄5求菌(Stop/少/ococc^)HMGH和HMGS基因的宿主菌抹的紫穗槐-4,11-二烯體積產(chǎn)率和比產(chǎn)率提高。圖11A-B顯示較低的溫度對大腸桿菌宿主菌抹的紫穗槐-4,ll-二烯產(chǎn)率的影響。圖12A-B顯示降低的葡萄糖水平對大腸桿菌宿主菌株的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)率的影響。圖13A-B顯示較低的溫度和降低的葡萄糖水平對大腸桿菌宿主菌抹的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)率的聯(lián)合影響。圖14A-E和15A-E顯示較低的溫度和降低的葡萄糖水平和氮水平對大腸桿菌宿主菌林的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)率的聯(lián)合影響。圖16顯示大腸桿菌宿主菌林通過DXP途徑產(chǎn)生紫穗槐-4,ll-二發(fā)明詳述定義除非另外定義，此處使用的所有科技術語具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解的相同的含義。在此參考大量定義為具有以下含義的術語術語"任選的，，或"任選地"意思是隨后描述的特征或結構可以存在也可以不存在，或者隨后描述的事件或狀況可以存在也可以不存在，10并且這種描述包括存在具體特征或結構的情況和不存在該特征或結構的情況，或者發(fā)生該事件或狀況的情況以及不發(fā)生該事件或狀況的情況。此處使用的術語"代謝途徑"是指分解代謝途徑或合成代謝途徑。合成代謝途徑涉及由較小的分子構建較大的分子，這是需要能量的過程。分解代謝途徑涉及較大分子的分解，通常釋放能量。此處使用的術語"曱羥戊酸途徑"或"MEV途徑"是指將乙酰-CoA轉化為IPP的生物合成途徑。MEV途徑在圖1A中示意性地顯示。此處使用的術語"脫氧木酮糖5-磷酸途徑"或"DXP途徑"是指將甘油醛-3-磷酸和丙酮酸轉化為IPP和DMAPP的途徑。DXP途徑在圖1B中示意性地顯示。詞語"焦磷酸，，在此處與"二磷酸，，可以互換使用。術語"表達載體"或"載體"是指這樣一種核酸，它轉導、轉化或感染宿主細胞，從而使細胞產(chǎn)生除細胞天然的核酸和/或蛋白質以外的核酸和/或蛋白質，或者以對于細胞而言非天然的方式表達核酸和/或蛋白質。術語"內源"是指自然存在的，例如在非重組宿主細胞中存在的物質或過程。術語"生成異戊烯焦磷酸的酶途徑"是指任何能夠產(chǎn)生異戊烯焦磷酸的途徑，包括但不限于甲羥戊酸途徑或DXP途徑。術語"核酸，，是指任意長度的核普酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸，也可以是脫氧核苷酸。因此，該術語包括但不限于單鏈、雙鏈或多4連DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜合體或包含噤呤和嘧咬堿或其它天然的、化學或生物化學修飾的、非天然的、或衍生化的核苷酸堿基的聚合物。術語"操縱子"是指兩個或多個連續(xù)的核香酸序列，其中每一個編碼諸如RNA或蛋白質的基因產(chǎn)物，其表達被一個或多個控制元件(例如啟動子)協(xié)同調節(jié)。術語"基因產(chǎn)物"是指由DNA編碼的RNA(或者相反)，或者由RNA或DNA編碼的蛋白質，其中基因一般包含一個或多個編碼蛋白質的核香酸序列，并且也可以包含內含子和其它非編碼核苷酸序列。術語"蛋白質"是指任意長度的氨基酸的聚合形式，可以包括編碼的和非編碼的氨基酸、化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸和具有修飾的肽骨架的多肽。此處使用的術語"異源核酸"是指至少下述之一為事實的核酸(a)核酸對于給定宿主細胞來說是外來的("外源的")(即不是自然存在的)；(b)該核酸包含在給定宿主細胞中自然發(fā)現(xiàn)的(即，"內源的")核普酸序列，但是該核苷酸序列在細胞中以非自然的(例如高于預期或者高于自然發(fā)現(xiàn)的)量產(chǎn)生；(c)該核酸包含在序列上不同于內源核苷酸序列的核苷酸序列，但是該核苷酸序列編碼相同的蛋白質(具有相同或基本相同的氨基酸序列)并且在細胞中以非自然的(例如高于預期或者高于自然發(fā)現(xiàn)的)量產(chǎn)生；或者(d)該核酸包含兩個或多個核苷酸核酸是重組的)。"轉基因，，是指外源導入宿主細胞中的基因。它可以包含內源或外源的或者異源的核酸。術語"重組宿主"(也被稱為"遺傳修飾的宿主細胞"或"遺傳修飾的宿主微生物")是指包含本發(fā)明的異源核酸的宿主細胞。術語"外源核酸，，是指外源導入宿主細胞中的核酸，因此實際上在給定細胞中通常或自然地不存在和/或不產(chǎn)生。術語"調節(jié)元件"是指轉錄和翻譯控制序列，如啟動子、增強子、多腺苷酸信號、終止子、蛋白質降解信號等等，它們提供和/或調節(jié)宿主細胞中編碼序列的表達和/或編碼多肽的產(chǎn)生。術語"轉化"是指在導入新核酸后在細胞中誘導的持久的或瞬時的遺傳改變。遺傳改變("修飾")可以通過向宿主細胞基因組中摻入新DNA，或者通過瞬時或穩(wěn)定地維-持新DNA作為附加型元件(episomalelement)來實現(xiàn)。在真核細胞中，永久的遺傳改變通常通過向細胞基因組中導入DNA來實現(xiàn)。在原核細胞中，永久的遺傳改變可以被導入染色體中或者通過染色體外元件如質粒和表達載體導入，該染色體外元件可以含有一個或多個選擇性標記來幫助它們保持在重組宿主細胞中。術語"有效連接"是指一種并列，其中這樣描述的成分的關系允許它們以預期方式起作用。例如，如果啟動子影響核苷酸序列的轉錄或表達，則啟動子與該核苷酸序列有效連接。術語"宿主細胞"和"宿主微生物"在此可以互換使用，是指任何古細菌(archae)、細菌或真核活細胞，其中可以或者已經(jīng)插入了異源核酸。該術語也涉及原細胞的后代，由于自然的、意外的或故意的突變，它們在形態(tài)學上或者在基因組或總DNA互補上可能不一定與原親本完全相同。術語"合成的"在用于核酸時是指化學合成的寡核苷酸結構單元退火，形成基因片段，然后通過酶裝配，構建完整的基因。通過"化學方法"的核酸合成是指組成核苷酸在體外裝配。術語"天然的"在用于核酸、細胞或生物體時，是指在自然中發(fā)現(xiàn)的核酸、細胞或生物體。例如，可以從自然來源中分離的并且沒有在實驗室中人工故意修飾的存在于非病原(非致病)生物體中的多肽或多核苷酸序列，是天然的。術語"天然存在的"在用于核酸、酶、細胞或生物體時，是指天然發(fā)現(xiàn)的核酸、酶、細胞或生物體。例如，可以從自然來源中分離的并且沒有在實驗室中人工故意修飾的存在于生物體中的多肽或多核苷酸序列，是天然存在的。術語"生物活性片段"在用于蛋白質、多肽或酶時，是指蛋白質或多肽或酶的功能部分。功能等價物可以具有變異的氨基酸序列，可能由于例如已知在核酸序列和這樣編碼的蛋白質內天然存在的密碼子冗余和功能等價性而產(chǎn)生。或者，功能等價的蛋白質或肽可以通過應用DNA重組技術來構建，在該技術中基于對所交換的氨基酸性質的考慮，可以構建蛋白質結構的改變。術語"類異戊二烯"、"類異戊二烯化合物"、"類異戊二烯產(chǎn)物"、13"辟"、"辟化合物"、"類辟"和"類辟化合物"在此可互換使用。它們是指能夠由IPP衍生的化合物。單數(shù)形式，如"一種"，包括復數(shù)的所指物，除非上下文中清楚地表明不是這樣。因此，例如，提到"表達載體"包括一種表達載體以及多種表達載體，而提到"該宿主細胞"包括一種或多種宿主細胞，以此類推。進一步指出，權利要求可以撰寫為不包括任何任選的組件。這樣，該聲明作為在描述權利要求組件時使用如"單獨"、"僅僅"等排他性術語或者使用"負面"限制的前提基礎。除非另外指出，本發(fā)明不限于特定序列、表達載體、酶、宿主微生物或方法，因為這些可能根據(jù)本發(fā)明所屬領域的普通技術人員的理解考慮本文的教導而變化。此處使用的術語只是用于描述具體實施方案，而不是限制。任何合適的宿主細胞都可以在本發(fā)明的實施中使用。在一個實施方案中，宿主細胞是遺傳修飾的宿主微生物，其中核酸分子已經(jīng)插入、刪除或修飾(即突變；例如，通過核苷酸的插入、刪除、置換和/或倒置)，從而產(chǎn)生所需的類異戊二烯化合物或類異戊二烯衍生物，或者實現(xiàn)所需類異戊二烯化合物或類異戊二烯衍生物的提高的產(chǎn)率。在另一實施方案中，宿主細胞能夠在液體生長培養(yǎng)基中生長。相反，"對照細胞，，是實驗中用于比較目的的替代實驗對象或樣品，一般是不含對相應宿主細胞所做的修飾的親本細胞。合適的宿主細胞的說明性例子包括任何原始細胞(archaecell)、原核細胞或真核細胞。原始細胞的例子包括但不限于屬于以下屬的那些細胞氣熱菌屬(爿eropyrwm)、古生J求菌屬(^n:/meg/c^ws)、鹽桿菌屬(//a/c^a"en'wm)、曱烷3求菌屬(T^fe〃7"/70coc"")>曱-完才干菌屬(AfW/m"o/"c/e廠/w附)、火；求菌屬(尸少racoccws)、石?；~菌屬(5W/o/oZ)M)和熱原體屬(77^/7wo//wma)。原始細胞抹的說明性例子包括但不限于敏捷氣熱菌(;erm'x)、閃爍古生球菌(^4rc/meog7oZt^/w/g7'c/tw)、詹氏曱坑球菌(Afef/ia打ococct(s乂a打打osc/i")、熱自養(yǎng)甲》咒桿菌(Me/77冊o/)a"en'謂./7zermoflWoro//H'CMm)、尸yracoccw51a6j^s7'、P少racoccws/zor汰o5"/^'、口藍酉菱熱原體(T7^，o//(3扁flac^/op/H'/w/7),火山^^y^、體(T7zerwop/"smavo/caw/w附)。原核細胞的例子包括但不限于屬于以下屬的那些細胞土壤桿菌屬(」gra^ac""'wm)、月旨環(huán)酉臾才干菌屬(爿/z'qyc/o6ac/〃ws)>項圈藻屬y4wa6aewa)、纟且囊藍纟田菌屬(^wacj^/^)>節(jié)才干菌屬^W/zrc^ac/^廠)、固氮菌屬(Jzo6fl"er)>芽孑包#干菌屬Bac〃/rn1)>短桿菌屬(BreW6ac"",畫)、色素菌屬C7zrow"http://"m)、沖炎菌屬(C7ay^7.<i/wm)、才奉斥f菌屬C(90^7e^ac/^n'wm)、腸4干菌屬(EV^ero/^cer)、區(qū)欠文氏菌屬A，rw/m'a)、^矣希氏菌屬(^^c/^Wc/z/a)>專'L一干菌屬Lactohac〃/ws)、乳3求菌屬(丄actococcM)、才艮瘤菌屬M^or/z/zo/)/i,附)、曱基-干菌屬(Afc^y/o/"c,er/w/M)、孩t^干菌屬M/cra6acten'wm)、席藍纟田菌屬(P/zormzWwm)、布支單月包菌屬i^ew^omowfls)、纟工纟田菌屬(WAo<io/7a"￡r)、纟工々I單月包菌屬)、紅螺菌屬(i/o<ic>—n7/謂)、紅球菌屬W/zoti(9coccws)、沙、門氏菌屬(》Sa/mowe〃a)、Sce"e(iesmw"、沙、雷氏菌屬(^rra"fl)、志賀氏菌屬(57^'ge〃a)、葡萄球菌屬(^SVfl/7/z/ococcw6")、鏈球菌屬(^SV"ram少ces)>5y朋ecocc"5和發(fā)酵單月包菌屬(Z拜o附o冊s)。原核菌林的說明性例子包括但不限于枯草芽孢桿菌(^7"7/w>解淀粉芽孢桿菌(紐/〃m菌(Bre"W/(2cten'wwam附o"Zage"^s1)、5reW/)acten'ww/mm"rz'o//n7wm、拜氏才炎菌(C7oWnWwwhe,'geri"ch7)、阪崎腸沐干菌(￡>^era^"ersafa2za&")、大腸軒菌、乳酸乳球菌(丄a"ococci^1/"c"s)、A/^o廠/nio6/Mm/o"'>4同纟錄，支單月包菌(尸5^wc/omowas1aerwgiwos"a)、尸sei^omowos1meva/ow//、Pseudomonas/w^ca、莢月莫纟工4干菌(7/0(ic^ac,erca/ww/a/iM1)、J求形纟工沐干菌(iAo(i(9Z)a"e廠^s7/men^(ies)、；果纟工纟工蟲累菌(i^cxias^/n7/wmn/Zn/m)、腸沙、門氏菌(iS"/mowe〃")>i另寒;少門氏菌(Sa/wo"e〃a(y//n')、鼠"f另寒沙門氏菌(Sa/mowe〃a妙/n'mwn'畫)、痢疾志賀氏菌(5T〖ge〃a(ij^ewten'(2e)、弗氏志賀氏菌(S/z/ge〃"/7ex"en')、索氏志賀氏菌)等。通常，如果使用細菌宿主細胞，則優(yōu)選非病原菌^^。非病原菌才朱的說明性例子包括但不限于枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、嗜酸乳桿菌(丄"c/^a"'〃M5"a"Wo//n7ws)、瑞士乳才干菌(丄a"o6"c/〃ws/w/ve"'cw5)、^同纟錄斗叚單月包菌、/^ew(iomoway附eva/om'/、尸sewtio附o"a5、5求開j紅片干菌、i^c/o/(3"erca/^w/Wt^、；果纟工纟工蟲累菌，等等。真核細胞的例子包括但不限于真菌細胞。真菌細胞的例子包括但不限于屬于以下屬的那些細胞曲霉屬(j^erg///^)、假絲酵母屬(G3"AWa)>金小孑包子屬(C7z廠j^os^or/Mw)、CVyc^ococcws、嫌孑包屬(T^an'ww)、嫌刀菌屬(X7i(yvero/"ces)、7Veo妙/iO(i^m、鏈孑包霉屬(臉wms70ra)、青霉屬(Pew/"7/z.wm)、畢赤酵母屬(P/c/z/a)、酵母屬(5VzccAara，ce^)、木霉屬(7Hc/zo(ie，a)和Za"Z/zo;/^〃o附少c^s1(以前一爾為';去夫酵母屬(P/zq/^")),真核菌抹的說明性例子包括但不限于構巢曲霉(A^w^〃wmWw/a/w)、黑曲霉(A/erg7'〃ws)>米曲霉(v^erg〃/wsor少zae)、白寸叚絲酵母(Cawd/(i(3a/6/caws)、C7廠j^c^pon'wm/wc/(wowewse、禾^一牛*孑包(^Fwsar/wmgram/wea廠wm)、Fwsar/wm乳酸克魯維酵母(幻w"era附y(tǒng)cM/acto)、粗糙脈孢菌(7Vewmypora)、安格斯畢赤酵母(i^c/n'flawgw虛)、尸/c/H'a力'w/awAca、尸z'c/u'a^c(iam(3e、月菱醭畢赤酵母(P/c/n'amem/ra皿e/ac/ms")、尸Zc/n.ameAawo//ca、尸/c/n'"0/廳dae、巴斯德畢赤酵母(P/c/"'apaeon's)、皮杰普畢赤酵母(A'c/n'(3/^)》en')、才樂畢赤酵母(A'c/由《werc冊w)、柳畢赤酵母(尸/c/n'asa/z'Cz'")、尸z'c//",/ermc^o/er""s、喜》'每>菜4唐畢赤酵母(尸/c/n'aZre力〃/o/力z7")、才對干畢赤酵母(尸/c/n'a幼》/to)、產(chǎn)二素鏈霉菌(6^e/7tom少c^am/—cz'e/is1)、金霉素鏈霉菌(/SV，/owyc^薦re—c/e似)、金色鏈霉菌(/SV廠e/^o考c^鹿r6w)、Saccara考c^s16a，wws、iSaccaromyc&s16ow/aniz'、酉良酒酵母、殺真菌素4連審菌(5Vreptom少ce51/wwg/c/A'cws)、灰產(chǎn)色鏈霉菌(<SVrep,om_yce5gr&oc/ramoge"es1)、灰色鏈霉菌(5V廠e/^ow少cesgr&ews)、淺青紫鏈霉菌(iSVr一o"ces//v油ws)、撒攬灰鏈霉菌(o/zVogr^ws)、枝鏈霉菌(5^ep,o"ce51ra膨ws)、田無鏈霉菌(iSVr一cw少ces她os/n'e腺'5)、酒紅鏈霉菌(5V廠e/^o，ces)、JHcAo(ie削a廠ee^和vYa"^zo//^〃omycesc/e"(iroWzca"(以前稱為尸/a^ar/zcxiozjwa).通常，如果使用真核細胞，則優(yōu)選非病原林。非病原林的說明性例子包括^旦不限于禾本-牛鐮孑包、Fi^an'ww、巴斯德畢赤酵母、Saccwom少ces6ow/aniZ禾口酉良酒酵母。另外，某些菌抹已經(jīng)被食品和藥品管理局指定為GRAS或者通常被視為安全的。這些菌林包括枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌(Z^c/^ac〃/wsac/dop/H./i^)、^j士豸L斥干菌和酉良酒酵母。/尸P途徑本發(fā)明的宿主細胞包括利用MEV途徑、DXP途徑或這兩種途徑來合成IPP及其異構體DMAPP。通常，除植物以外的真核生物只利用MEV類異戊二烯途徑將乙酰-CoA轉化為IPP,IPP隨后被異構化為DMAPP。除了幾個例外以外，原核生物利用不依賴于曱羥戊酸的途徑或DXP途徑通過分支點分開產(chǎn)生IPP和DMAPP。通常，植物利用MEV和DXP兩種途徑來合成IPP。MfK途徑MEV途徑的示意圖在圖1A中顯示。通常，該途徑包括六步。第一步，兩個乙酰輔酶A分子通過酶組合，形成乙酰乙酰-CoA。已知催化該步驟的一種酶是，例如，乙酰-CoA硫解酶(也被稱為乙酰-CoA乙酰轉移酶)。核苷酸序列的"i兌明性例子包括^旦不限于以下GenBank登錄號和所述序列的來源生物(NC—000913REGION:172324131..2325315;大腸桿菌)、(D49362;脫氮副球菌(尸,coc，^""ny^aw))和(L20428;釀酒酵母)。MEV途徑的第二步，乙酰乙酰-CoA與另外一個乙酰-CoA分子酶促縮合，生成3-羥基-3-曱基戊二酰-CoA(HMG-CoA)。已知催化該步驟的一種酶是，例如，HMG-CoA合成酶。核苦酸序列的說明性例子包括但不限于(NC001145.互補19061..20536;釀酒酵母)、(X96617;酉良酒酵母)、(X83882;4以南芥(Jn^^fo;^^Aa/^ma))、(AB037907;A""a虛os^oragr&eo/a)、(BT007302;人(T7omosop/e似))和(NC—002758,基因座標簽SAV2546,基因ID1122571;金黃色葡萄球菌(/SVop/z少/ococcwsawrews))。第三步，HMG-CoA被酶促轉化為曱羥戊酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，HMG-CoA還原酶。核苷酸序列的"i兌明性例子包4舌但不限于(NM—206548;黑腹果蠅(Z>oso//n7flme/a"ogaWw))、(NC—002758，基因座標簽SAV2545,基因ID1122570;金黃色葡萄球菌)、(NM—204485;紅原雞(Gfl〃Mga〃w))、(AB015627;鏈霉菌屬的種d一謹yc^平)PCO3988),(AF542543;Mco"a麗a"e服(3to)、(AB037907;《"證鄉(xiāng)oragn',/a)、(AX128213，提供編碼截短HMGR的序列；釀酒酵母)和(NC—001145:互補(115734..118898;酉良酒酵母)。第四步，曱羥戊酸被酶促磷酸化，生成甲羥戊酸5-磷酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，甲羥戊酸激酶。核普酸序列的說明性例子包括但不限于(L77688;擬南芥)和(X55875;釀酒酵母)。第五步，向曱羥戊酸5-磷酸上酶促添加第二個磷酸基團，生成甲羥戊酸5-焦磷酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，磷酸曱羥戊酸激酶。核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(AF429385;巴西三葉膠(//ewa6m^7&似&))、(NM—006556;人)和(NC—001145.互補712315..713670;釀酒酵母)。第六步，曱羥戊酸5-焦磷酸被酶促轉化為IPP。已知催化該步驟的一種酶是，例如，曱羥戊酸焦磷酸脫羧酶。核苷酸序列的說明性例18子包括^旦不限于(X9乃57;釀酒酵母)、(AF290095;屎腸^求菌如果IPP被轉化為DMAPP,則需要第七步。已知催化該步驟的一種酶是，例如，IPP異構酶。核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(NC—000913，3031087..3031635;大腸桿菌)和(AF082326;雨生紅球藻(i/aew^ococc^))。如果需要轉化為DMAPP,貝'J才是高的IPP異構酶的表達確保了IPP向DMAPP的轉化不是整個途徑的限速步驟。DZP途徑DXP途徑的示意圖顯示在圖1B中。通常，DXP途徑包括七個步驟。第一步，丙酮酸與D-甘油醛3-磷酸縮合，生成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶。核苦酸序列的說明性例子包括但不限于(AF035440;大腸桿菌)、(NC_002947,基因座標簽PP0527;惡臭4艮單胞菌(尸化wJowo"^pw"t/a)KT2440)、(CP000026,基因座標簽SPA2301;腸沙門氏菌尸flra(y//〃；參見ATCC9150)、(NC一007493,基因座標簽RSP—0254;球形紅桿菌2.4.1)、(NC—005296，基因座標簽RPA0952;血色紅假單胞菌基因座標簽AT5G11380;擬南芥)。第二步，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸被轉化為2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(AB013300;大腸桿菌)、(AF148852;擬南芥)、(NC—002947,基因座標簽PP1597;惡臭假單胞菌KT2440)、(AL939124，基因座標簽SC05694;天藍色鏈霉菌(Ar印tomyc^coe"co/or)A3(2))、(NC—007493,基因座標簽RSP—2709;球形紅桿菌2.4.1)和(NC—007492，基因座標簽Pfl—1107;焚光々1單月包菌(i^ei^cwow^w/Zwor^cem1)PfO-l)。.第三步，2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸被轉化為4-二磷酸胞苷酰-(f".teracoccws/aec:wm))和(U49260;人)。PD1293;苛養(yǎng)木桿菌2C-甲基-D-赤蘚糖醇。已知催化該步驟的一種酶是，例如，4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合成酶。核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(AF230736;大腸桿菌)、(NC007493,基因座標簽RSP—2835;球形紅桿菌2.4.1)、(NC—003(T71,基因座標簽AT2G02500;擬南芥)和(NC一002947、基因座標簽PP1614;惡臭假單胞菌KT2440)。第四步，4-二磷酸胞苷酰-2C-曱基-D-赤蘚糖醇被轉化為4-二磷酸胞苦酰-2C-甲基-D-赤蘚糖醇-2-磷酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，4-二磷酸胞苷酰-2C-曱基-D-赤蘚糖醇激酶。核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(AF216300;大腸桿菌)和(NC—007493,基因座標簽RSP—1779;球形紅桿菌2.4.1)。第五步，4-二磷酸胞普酰-2C-曱基-D-赤蘚糖醇-2-磷酸被轉化為2C-甲基-D-赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，2C-曱基-D-赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸合成酶。核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(AF230738;大腸桿菌)、(NC_007493,基因座標簽RSP—6071;球形紅桿菌2.4.1)和(NC—002947,基因座標簽PP1618;惡臭假單胞菌KT2440)。第六步，2C-曱基-D-赤蘚糖醇2，4-環(huán)二磷酸被轉化為1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，1-羥基-2-曱基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶。核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(AY033515;大腸桿菌)、(NC—002947，基因座標簽PP0853;惡臭假單胞菌KT2440)和(NC—007493,基因座標簽RSP—2982;球形紅桿菌2.4.1)。第七步，l-羥基-2-曱基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸被轉化為IPP或其異構體DMAPP。已知催化該步驟的一種酶是，例如，異戊基/二曱基烯丙基二磷酸合成酶。核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(AY062212;大腸桿菌)和(NCJ)02947,基因座標簽PP0606;惡臭假單胞菌KT2440)。在某些實施方案中，宿主細胞自身的代謝過程和本發(fā)明提供的IPP產(chǎn)生相關過程之間的"串擾"(或干擾)最小化或者完全消除。例如，當宿主微生物只依賴DXP途徑合成IPP并且引入MEV途徑才是供另外的IPP時，串擾被最小化或者完全消除。這種宿主生物將不能改變MEV途徑酶的表達或者處理與MEV途徑有關的中間體。僅僅或主要依賴于DXP途徑的生物體包括，例如，大腸桿菌。在某些實施方案中，宿主細胞通過單獨的MEV途徑或MEV途徑與DXP途徑組合產(chǎn)生IPP。在其它實施方案中，宿主的DXP途徑在功能上失能，因此宿主細胞只通過異源引入的MEV途徑產(chǎn)生IPP。通過使基因表達失能或者滅活一種或多種DXP途徑酶的功能，可以使DXP途徑在功能上失能。G化合物本發(fā)明的Cs化合物通常由IPP或DMAPP衍生。這些化合物也被稱為半萜，因為它們來自于一個異戊二烯單元(IPP或DMAPP)。異戊二烯異戊二烯，其結構為在多種植物中發(fā)現(xiàn)。異戊二歸通過異戊二烯合成酶由IPP生成。合適的核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(AB198190;銀白楊("/z"))和(AJ294819;銀白楊)。C^化合物本發(fā)明的d?；衔锿ǔ碓从谟蒊PP與DMAPP縮合生成的香葉基焦磷酸(GPP)。已知催化該步驟的一種酶是，例如，香葉基焦磷酸合成酶。這些C10化合物也^C稱為單辟，因為它們來源于兩個異戊二烯單元。圖2示意地顯示了IPP和DMAPP如何生成GPP，GPP可進一步加工為單辟。香葉基焦磷酸合成酶的核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(AF513111;北美冷杉(廟^g認dis))、(AF513112;北美冷杉)、(AF513113;北美冷杉)、(AY534686;金魚草"濾7r/n,"謹m咖))、(AY534687;金魚草)、(Y17376;擬南芥)、(AE016877，基因座AP11092;蠟狀芽孢桿菌(Sa"7/wcwew);ATCC14579)、(AJ243739;甜橙(C"，W"畫^))、(AY534745;C/arAr^6re鄉(xiāng)n')、(AY953508;扭—)、(DQ286930;番(丄戶p簡.畫e廳/e幽m))、(AF182828;辣薄荷(臉《*xp—n',a))、(AF182827;辣薄荷)、(MPI249453;辣薄荷)、(PZE431697、基因座CAD24425;Pa廠flcoccwszea乂aw^z/m/"dew勻、(AY866498;-卩度古月黃連(i^,crar/n'加Awrao(3))、(AY351862;葡萄(Wm/era))和(AF203881,基因座AAF12843;運動發(fā)酵單胞菌(Z少momowwmo6///^))。GPP然后被轉化為多種Cm化合物。do化合物的說明性例子包括但不限于蒈烯蒈烯，其結構為在許多樹(特別是松樹)的樹脂中發(fā)現(xiàn)。蒈烯通過蒈烯合成酶由GPP生成。合適的核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(AF461460,REGION43..1926;歐洲云杉(PZcea))和(AF527416,REGION:78..1871;Sa/WflWewop/i_y//a)。香葉醇香葉醇(也被稱為rhodnol),其結構為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>是玫瑰油和掌玫油的主要成分。它也存在于天竺葵、檸檬和香茅中。香葉醇通過香葉醇合成酶由GPP生成。合適的核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(AJ457070;C/朋a歸聽m麵/p/Z謂)、(AY362553;羅勒(Oc,7mm^m///cmw))、(DQ234300;白蘇(尸eW〃a/h^e"'e似)1864抹)、(DQ234299;尸eW〃a1861才朱)、(DQ234298;尸er,〃"">Zodora4935抹)和(DQ088667;尸eh〃a芳樟醇芳樟醇，其結構為在許多花和香料植物如胡荽子中發(fā)現(xiàn)。芳樟醇通過芳樟醇合成酶由GPP生成。合適的核普酸序列的說明性例子包括但不限于(AF497485;擬南芥)、(AC002294，基因座AAB71482;擬南芥)、(AY059757;擬南芥)、(NM_104793;擬南芥)、(AF154124;黃花蒿(」故脂:"'"a朋冊))、(AF067603;CYm"A:/a6re，"')、(AF067602;C/fl/^/"c"'w7")、(AF067601;C7a油'a^wvve〃〕、(U58314;C7arh'a^ewen〕、(AY840091;番茄)、(DQ263741;薰衣草(""gwW,/o//a))、(AY083653;檸檬留蘭香(Afe"Aac"ra,e))、(AY693647;羅勒)、(XM—463918;水稻(C^zasa"va))、(AP0(M078,基因座BADOMO5;水稻)、(XM—463918、基因座XP—463918;水稻)、(AY917193;Pe函、(AF271259;白蘇)、(AY473623;歐洲云杉)、(DQ195274;西特喀云杉(尸,'ceaw7'c/ze腦^))和(AF444798;回回蘇(尸wz.〃",wtoceravar.crispa)栽培變種79號)。芋烯')';烯，其結構為23在柑桔類水果和薄荷的外皮中發(fā)現(xiàn)。苧烯通過苧烯合成酶由GPP生成。合適的核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(+)-苧烯合成酶(AF514287,REGION:47..1867;檸檬(C/環(huán)//歸"))和(AY055214，REGION:48..1889;藿香(^g"Wac/zen/gwa))和(-)-苧烯合成酶(DQ195275，REGION:1..1905;西特喀云杉)、(AF006193,REGION:73..1986;北美冷杉)和(MHC4SLSP，REGION:29..1828;留蘭香(MeW'/za—ca似))。月桂烯月桂烯，其結構為在多種植物(包括月桂樹、馬鞭草和由其得名的月桂)的精油中發(fā)現(xiàn)。月桂烯通過月桂烯合成酶由GPP生成。合適的核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(U87908;北美冷杉)、(AY195609;金魚草)、(AY195608;金魚草)、(NM一127982;擬南芥TPSIO)、(NM一113485;擬南芥ATTPS-CIN)、(NM—113483;擬南芥ATTPS-CIN)、(AF271259;白蘇)、(AY473626;歐洲云杉)、(AF369919;歐洲云杉)和(AJ304839;羅勒烯a-和P-羅勒烯，其結構分別為在多種植物和水果(包括羅勒)中發(fā)現(xiàn)，并且是通過羅勒烯合成酶由GPP生成的。合適的核苷酸序列的說明性例子包括但不限于:(AY195607;金魚草)、(AY195609;金魚草)、(AY195608;金魚草)、(AK221024;擬南芥)、(NM一U3485;擬南芥ATTPS-CIN)、(NM一113483;擬南芥ATTPS-CIN)、(NM—117775;擬南芥ATTPS03)、(NM—001036574;擬南芥ATTPS03)、(NM—127982;擬南芥TPS10)、(ABU0642;C,./簡騰/z/wCitMTSL4)和(AY575970;百脈才艮(丄o似scorm'cM/a/7^")y.o/om'cM5"變種)。24在松樹和桉樹中發(fā)現(xiàn)。a-蒗烯通過a-蒎烯合成酶由GPP生成。合適的核香酸序列的說明性例子包括但不限于(+)a-蒎烯合成酶(AF543530，REGION:1..1887;火炬*>(乃'm"to^/a))、(-)a-蒎烯合成酶(AF543527,REGION:32..1921;火炬松)和(+)/(-)a-蒎烯合成酶(AGU87909,REGION:6111892;北美冷杉)。P-蒗烯P-蒗烯，其結構為在松樹、迷迭香、歐芽、蒔蘿、羅勒和玫瑰中發(fā)現(xiàn)。(3-蒎烯通過P-蒗烯合成酶由GPP生成。合適的核普酸序列的說明性例子包括但不限于(_)(3-落烯合成酶(AF276072,REGION:1..1749;黃花蒿)和(AF514288,REGION:26..1834;檸檬)。檢辟檜辟，其結構為在黑胡椒、胡蘿卜子、鼠尾草和茶樹中發(fā)現(xiàn)。檜萜通過檜萜合成酶由GPP生成。合適的核苷酸序列的說明性例子包括但不限于來自藥用鼠尾草(5Vz/Wao，腦fo)的AF051901，REGION:26..1798。是柑桔類水果的精油的一種成分。在生物化學上，Y-萜品烯通過Y-辟品烯合成酶由GPP生成。合適的核苷酸序列的說明性例子包括(來自檸檬的AF514286,REGION:30..1832)和(來自C"ra5w"5/n'w的AB110640,REGION1..1803)。薛品油歸薛品油烯，其結構為在黑醋栗、柏樹、番石榴、荔枝、番木瓜、松樹和茶中發(fā)現(xiàn)。萜品油烯通過辟品油烯合成酶由GPP生成。合適的核苷酸序列的說明性例子包括但不限于來自花旗片公(mewz/as1//)的AY906866,REGION:10..1887。C^化合物本發(fā)明的C15化合物通常來源于通過兩分子IPP與一分子DMAPP縮合生成的法尼基焦磷酸(FPP)。已知催化該步驟的一種酶是，例如，法尼基焦磷酸合成酶。這些ds化合物也被稱為倍半萜，因為它們來源于三個異戊二烯單元。圖2示意地顯示了IPP和DMAPP如何組合生成FPP,其可以進一步加工成倍半辟。法尼基焦磷酸合成酶的核苷酸序列的說明性例子包括但不限于:(ATU80605;擬南芥)、(ATHFPS2R;擬南芥)、(AAU36376;黃花蒿)、(AF461050;黃牛(/mm^))、(D00694;大腸桿菌K-12)、(AE009951,基因座AAL95523;具核梭桿菌具核亞種(F^o^cten'wm26"wc/^"冊皿c/e^wm)ATCC25586)、(GFFPPSGEN;藤倉赤霉(GA&"〃a/"乂汰wroZ))、(CP000009,基因座AAW60034;氧化葡糖桿菌(G/wco/^6a"wox少(ia朋)621H)、(AF019892;向日葵(i^/^m^ms))、(HUMFAPS;人(//omo5"甲'ews))、(KLPFPSQCR;乳酸克魯維酵母)、(LAU15777;白羽扇豆(Zw;/"^a腸))、(LAU20771;白松(丄—脂a腸))、(AF309508;小鼠(AT^mw"w/M))、(NCFPPSGEN;粗糙脈孢菌)、(PAFPS1;銀膠菊(~"謂.應a廠爐她m))、(PAFPS2;銀膠菊)、(RATFAPS;大鼠(7a故"即n^gz'c^))、(YSCFPP;釀酒酵母)、(D89104;粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))、(CP000003,基因座AAT87386;酉良膿鏈球菌(^re;^ococct^;yogew^))、(CP000017,基因座AAZ51849;釀膿鏈球菌)、(NC—008022,基因座YP—598856;釀膿鏈J求菌MGAS10270)、(NC一008023，基因座YP—600845;酉良膿鏈球菌MGAS2096)、(NC一008024，基因座YP一602832;釀膿鏈球菌MGAS10750)和(MZEFPS;玉米(Zea))?？商娲?，F(xiàn)PP也可以通過將IPP添加至GPP生成。編碼能夠進行該反應的酶的核苷酸序列的說明性例子包括但不限于(AE000657,基因座AAC06913;y^w/exaeo"ct^VF5)、(NM—202836;擬南芥)、(D84432，基因座BAA12575;枯草桿菌(5腦7/附w磁s))、(U12678基因座AAC28894;大豆十曼生才艮瘤菌(5ra^yr/^加&wmy"/om'cwm)USDA110)、(BACFDPS;Ge(9Zacz7/i"We"廠oAerwo//n7w^)、(NC—002940,基因座NP—873754;杜氏嗜血菌(Haem印/n7wdwcrej^)35000HP)、(L42023，基因座AAC23087;流感嗜血菌(//^mop/H7"s)RdKW20)、(J05262;人)、(YP—395294;丄acto/"c/〃^.vdW23K)、(NC—005823,基因座YP_000273;腎臟鉤端螺旋體血清型(丄一o—raz'"/^mga似serorar)Co戸"/agem.5/r:T^ocrwzLl-130)、(AB003187;藤黃樣￡3求菌(Tl^'crococcw5/w"^))、(NC—002946,基因座YP—208768;淋病奈瑟氏球菌(A^ier/aFA1090)、(U00090,基因座AAB91752;根瘤菌屬的種(腸.油'簡；)NGR234)、(J05091;釀酒酵母)、(CP000031,基因座AAV93568;^Hte廠po匿—DSS-3)、(AE008481,基因座AAK99890;月市炎鏈球菌(5Vr一ococcws戸e讓om'ae)R6)和(NC—004556,基因座NP779706;苛養(yǎng)木桿菌(A^/e〃G/a幼Wa^)FPP然后被轉化為多種ds化合物。ds化合物的說明性例子包括但不限于紫穗槐二烯紫穗槐二烯，其結構為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>是^r^脂;y^a"脂產(chǎn)生的青蒿素的前體。紫穗槐二烯通過紫穗槐二烯合成酶由FPP生成。合適的核苷酸序列的一個說明性例子是美國專利7,192,751的SEQIDNO.37。a-法尼烯a-法尼烯，其結構為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>在包括但不限于螞蟻杜氏腺的多種生物來源和蘋果和梨皮的外層中發(fā)現(xiàn)。a-法尼烯通過a-法尼烯合成酶由FPP生成。合適的核苷酸序列的說明性例子包括但不限于來自西洋梨(尸,wscowmwm'5)t/W"乂ow栽培變種的DQ309034(梨；基因名稱AFS1)和來自Ma/t"dome^ca的AY182241(蘋果；基因AFS1)。Pechouus等人，尸/""^219(1):84-94(2004)。(GenBank登錄號AF051901REGION:26..1798)作為模板。編碼P-蒗烯、檜烯和(3-水芽烯合成酶的核苷酸序列的側翼為前導A777"/限制酶切位點和末端J^a/限制酶切位點，編碼芳樟醇和蒈烯合成酶的核苷酸序列的側翼為前導Wco/限制酶切位點和末端Zma/限制酶切位點，編碼芋烯合成酶的核苷酸序列的側翼為前導Wco/限制酶切位點和末端尸W/限制酶切位點。DNA合成構建體用JTm"/和Zk/(用于f3-蒎烯、檜烯和(3-水芽烯合成酶構建體)、#co/和Xm"/限制酶(用于芳樟醇和蒈烯合成酶構建體)或A7)a/和尸W/限制酶(用于竽烯合成酶構建體)消化完全。反應混合物通過凝膠電泳分離，凝膠提取大約1.7-1.9kbDNA片段，將分離的I)NA片段連接到pTrc99A載體的義w"/限制酶切位點(用于p-蒗烯、檜烯和p-水芽烯合成酶插入片段)、iVco/Xwa/限制酶切位點(用于芳樟醇和蒈烯合成酶插入片段)或1/^/尸^/限制酶切位點(用于宇烯合成酶插入片段)內，產(chǎn)生表達質粒pTrc99A-LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A-CS和pTrc99A畫SS(質粒圖見圖6)。實施例6該實施例描述了在本發(fā)明中有用的大腸桿菌宿主菌株的產(chǎn)生。如表1所述，通過用一種或多種實施例1至5的表達質粒轉化化學感受態(tài)大腸桿菌親本細胞產(chǎn)生宿主菌抹。表1.大腸桿菌宿主菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>在含有如表1詳述的抗生素的LuriaBertoni(LB)瓊脂上篩選宿主細胞轉化體。將單菌落從LB瓊脂轉移到含有5mLLB液體培養(yǎng)基和抗生素的培養(yǎng)管中。B003、B617、B618、B619、B650、B651、B652和B653宿主細胞轉化體在30。C下在250rpm旋轉搖床上溫育30小時。所有其它宿主細胞轉化體在37°C下在250rpm旋轉搖床上溫育，直到生長達到穩(wěn)定期。通過用含有0.8%葡萄糖和抗生素的M9-MOPS培養(yǎng)基(M9-MOPS培養(yǎng)基的組成見表2)將細胞連續(xù)傳代4-5輪，使細胞適應基本培養(yǎng)基。將細胞以由400uL無菌50%甘油和600uL液體培養(yǎng)物組成的1mL儲備液等份在冷凍管中貯存在-80。C下。表2-M9-MOPS培養(yǎng)基的組成成分量(每L)Na2HP047H2012.8gKH2P043gNaCl0.5gNH4C1lgMgS042mmolCaC120.1mmol硫胺0.1ugMOPS緩沖液pH7.4100mmol(NH3)6Mo70244H20"ugH3B0425ugCoC127,1ugCuS042.4ugMnC1216ugZnS042.9ugFeS040.28mg實施例7該實施例證實了在不含抗生素的條件下表達質粒在攜帶包含RK2質粒復制、隔離和保持系統(tǒng)的表達質粒的大腸桿菌宿主菌林中的穩(wěn)定性。通過將菌抹的儲備液等份添加到含有40mLM9-MOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和如表1所詳述的抗生素的125mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物生長過夜，建立宿主菌抹B255的種子培養(yǎng)物。在初始OD,為大約0.05時，用種子培養(yǎng)物接種兩個各自含有40mLM9-MOPS培養(yǎng)基、2%葡萄糖和0.5%酵母提取物的250mL搖瓶。1號培養(yǎng)物還含有100ug/mL羧芐青霉素和34ug/mL氯霉素。2號培養(yǎng)物不接受任何抗生素。兩種培養(yǎng)物都在37°C下在250rpm旋轉搖床上溫育，直到它們達到大約0.2的OD6。。，此時通過向培養(yǎng)基中加入40uL1MIPTG在宿主細胞中誘導紫穗槐-4,ll-二烯的產(chǎn)生。誘導時，在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機覆蓋層，以捕獲紫穗槐-4,ll-二烯。在總共72小時的時間內定時采樣。2個培養(yǎng)物中宿主菌抹產(chǎn)生紫穂槐-4,11-二烯如實施例10所述通過GC/MS證實。為了評價質粒在兩種細胞培養(yǎng)物中的穩(wěn)定性，在72小時時取每種培養(yǎng)物的樣品，在LB瓊脂平板(不含抗生素)上劃線。在37。C下過夜溫育后，將來自每個培養(yǎng)物的50個菌落復制接種到LB瓊脂+抗生素(34ug/mL氯霉素、100ug/mL羧千青霉素)平板上和LB瓊脂減抗生素(不含抗生素)平板上。在37。C下再過夜溫育后，LB瓊脂+抗生素和LB瓊脂減抗生素平板均發(fā)現(xiàn)含有大約50個菌落，表明在培養(yǎng)基中存在和不存在抗生素的情況下，質粒保留均接近100%。實施例8該實施例證實了在大腸桿菌宿主菌4朱中糞腸J求菌HMGR比釀酒酵母tHMGR提高的比活性和穩(wěn)定性。宿主菌抹B61和B62的種子培養(yǎng)物如下建立將每個菌株的儲備液等份加入到含有20mLM9-MOPS培養(yǎng)基、0.8%葡萄糖和如表5所詳述的抗生素的125mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物生長至飽和。種子培養(yǎng)物以1:100稀釋到500mL燒瓶中的140mL新鮮培養(yǎng)基中，再生長到0055。大約為0.1,此時向每個培養(yǎng)物中加入140uL1MIPTG誘導紫穗槐-4,ll-二烯的產(chǎn)生。在誘導后4、12、20、28、36和49小時，從每個培養(yǎng)物中采樣，離心沉淀細胞。細胞沉淀物在干冰上驟凍，然后貝'±存在—80。C。為了進行酶測定，在冰上融化細胞沉淀物，然后用含有蛋白酶抑70制齊'h'昆合物弁3(Calbiochem，SanDiego，CA)、benzonase(20fiLoer5mLbugbuster;Novagen,Madison,WI)和溶菌酶(30ug/mL)的Bugbuster(Novagen,Madison,WI)裂解。釀酒酵母tHMGR的酶活性在50mMTrisHCl(pH7.5)、0.2mMNADPH(Sigma,St,Louis,MO)和0.3mMDL-3-羥基-3-曱基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)鈉鹽(Sigma，St.Louis,MO)中測定。通過加入細胞裂解液開始測定，才艮據(jù)340nM處的吸光度監(jiān)測NADPH的消失。為了說明NADPH的非特異性消失，從試驗樣品中獲得的結果中減去缺乏HMG-CoA的對照試驗中獲得的結果。類似地測定糞腸^t菌HMGR的酶活性，不同之處在于測定M^沖液含有100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5)、0.4mMNADPH、1.0mMEDTA和100mMKCl。蛋白質測定利用Bradford((1976)J腦/歷oc/^m.72:248-254)的方法進行。比活性計算為AnmolNADPH/min/mg蛋白質。如圖8所示，與釀酒酵母tHMGR相比，糞腸5求菌HMGR顯示較高的比活性和提高的穩(wěn)定性。實施例9該實施例描述了用細胞干重("DCW")對OD,的校正。為了獲得DCW和OD600之間的關系，代表性菌4朱B32在類似于實施例10-14中所述的高細胞密度過程中生長。在整個運行期間采樣，測定每個樣品的OD6oo和DCW。為了確定DCW,將細胞沉淀并棄去上清液。細胞沉淀物用水洗一次，然后在80。C烤箱中干燥至少3天。將含有細胞沉淀物的試管稱重，從稱得的重量中減去試管的重量，剩余的重量除以每個樣品的初始體積(0.0015L),得到DCW。圖9顯示在這些實驗中測量的DCW和OD60()之間的關系。實施例10該實施例證實了紫穗槐-4,11-二烯在表達金黃色葡萄球菌HMGR和HMGS的大腸桿菌宿主菌4朱中比在表達釀酒酵母tHMGR和HMGS的宿主菌抹中的產(chǎn)量增加。通過將每個菌4朱的儲備液等卩分加入到含有25mLM9-MOPS培養(yǎng)基、0.8%葡萄糖和如表1所詳述的抗生素的125mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物生長過夜，由此建立宿主菌抹B32、B153、B210、B282、B292、B86、B255和B256的種子培養(yǎng)物。在初始OD,大約為0.05時用種子培養(yǎng)物接種單獨的含有40mLM9-MOPS培養(yǎng)基、2%葡萄糖和抗生素的250mL搖瓶。培養(yǎng)物在30°C下在250rpm旋轉搖床上溫育，直到它們達到大約0.2的OD6(K),此時通過向培養(yǎng)基中加入40uL1MIPTG在宿主細胞中誘導紫穗槐-4,ll-二烯的產(chǎn)生。在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機覆蓋層(例如，十二烷、油酸曱酯或肉豆蔻酸異丙酯)。有機覆蓋層和培養(yǎng)液的樣品每天采樣一次，共72小時。利用培養(yǎng)液樣品測量OD6QQ。通過將5uL有機覆蓋層轉移到含有500uL摻有作為內標的P-或反式丁香烯的乙酸乙酯的干凈玻璃瓶中，測定紫穗槐-4,11-二烯的濃度。有機覆蓋物/乙酸乙酯樣品在Hewlett-Packard6890氣相色譜/質譜儀(GC/MS)上分析，只掃描兩種離子分子離子(204m/z)和189m/z離子，^口Martin等人.(2001)B^^c/mo/,5Zoe"g.75:497-503,斤述。為了加快運行時間，改變溫度程序和柱基質以達到最佳峰值分辨率和最短的總運行時間。利用DB-XLB柱(獲自AgilentTechnologies,Inc.,PaloAlto，CA)和氦載氣在GC上分離1|dL樣品。用于分析的溫度程序如下100°C0.75分鐘，以60。C/分鐘升高溫度至300。C，于300°C保持0.5分鐘。解析的樣品用監(jiān)測離子189和204m/z的Hewlett-Packard5973型質量選擇檢測器分析。以前的質譜證實紫穗槐-4,11-二烯合成酶的產(chǎn)物是紫穗槐-4,11-二烯，使用該GC方案，紫穗槐-4,11-二烯的保留時間為3.7分鐘。使用P-或反式丁香烯作為定量的內標?；诩兓淖纤牖?4,ll-二烯(0.63-10mg/LKJF17-109-3)在加有丁香烯的乙酸乙酯中的定量校準曲線，利用內標與紫穗;隗-4,11-二烯峰面積的比例，計算紫穂槐-4,11-二烯的滴度。如圖10A和10B所示，與表達釀酒酵母tHMGR和HMGS的B32、B210、B255、B256和B292抹相比，表達金黃色葡萄球菌HMGR和HMGS的B153和B282菌林產(chǎn)生水平升高的紫穗槐-4,11-二實施例11該實施例證實了在亞最佳溫度下生長的大腸桿菌宿主菌抹產(chǎn)生紫穗槐-4，ll-二烯增多。將菌抹的0.5mL儲備液等份加入到含有50mLM9-MOPS培養(yǎng)基和如表1所詳述的抗生素的250mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物在37。C下在250rpm旋轉搖床上生長過夜。由此建立宿主菌4朱B32的種子培養(yǎng)在初始OD6。。大約為0.05時用種子培養(yǎng)物4妻種4個250mL搖瓶，每個均含有40mL發(fā)酵分批培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成見表6)、100mMMOPS緩沖液pH7.1和抗生素。培養(yǎng)物在30。C或37。C下在250rpm旋轉搖床上溫育，直到它們達到0.18-0.22的OD6Qo,此時通過向培養(yǎng)基中加入40uL1MIPTG在宿主細胞中誘導紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)生。在誘導時，在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機覆蓋物，以捕獲紫穗槐-4,11-二烯。每天采樣一次，如實施例10所述分析。如圖IIA和IIB所示，30°C的發(fā)酵不影響細胞生長，但是導致大腸桿菌宿主菌林產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯的比產(chǎn)率增長接近50%。實施例12該實施例證實了在限制碳源條件下生長的大腸桿菌宿主菌抹產(chǎn)生紫穗槐—4，11-二烯增多。用于發(fā)酵運行050608-1和050629-1的宿主菌4朱B32的種子培養(yǎng)物如下建立將0.25uL菌抹儲備液等份加入到含有50mLM9-MOPS培養(yǎng)基和如表1所詳述的抗生素的250mL搖瓶中，并且將培養(yǎng)物在37。C下在250rpm旋轉搖床上溫育，直到00600達到1-2。用于發(fā)酵運行060403-3的宿主菌^朱B32的種子培養(yǎng)物如下建立將菌抹的儲備液等份加入到含有50mLM9-MOPS培養(yǎng)基和如表1所詳述的抗生素的250mL搖瓶中，并且將培養(yǎng)物在37。C下在250rpm旋轉搖床上溫育過夜。在初始OD6。。約為1時用種子培養(yǎng)物接種含有50mLM9-MOPS培養(yǎng)基和抗生素的250mL搖瓶，培養(yǎng)物再次73在37。C下在250rpm旋轉搖床上溫育，直到OD6。o達到3-5。對于所有發(fā)酵過程，KH2P04,K2HP043H20、EDTA、檸4蒙酸和(NEU)2S04都在生物反應器(2LApplikonBioconsoleADI1025s,具有ADI1010控制器，ApplikonBiotechnology,FosterCity,CA)中力口熱滅菌。將其余的培養(yǎng)基成分過濾除菌作為儲備溶液，并且通過磁頭板注射。表3顯示了用于發(fā)酵運行050608-1和050629-1的最終的培養(yǎng)基組成。表4顯示了用于發(fā)酵運行060403-3的最終的培養(yǎng)基組成。運行050608-1的開始體積為0.8L,050629-1的開始體積為1.2L，060403-3的開始體積為1L。所有運行都通過經(jīng)》茲頭板注射50mL種子培養(yǎng)物進行接種。表3-用于發(fā)酵運行050608-1和050629-1的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>表4-用于發(fā)酵運行060403-3的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分分批培養(yǎng)基(每L)料液(每L)葡萄糖15g副gKH2P04—K2HP043H2015.7g一檸檬酸1.7g一(NH4)2S042g一MgS047H201.2g12gEDTA8.4mg13mgCoCl26H202.5mg4mgMnCl24H2015mg23.5mgCuCl22H201.5mg2.5mgH3B043mg5mgNa2Mo042H202.5mg4mgZn(CH3COO)22H2013mg16mg水合檸檬酸Fe(III)100mg40mg硫胺HC14.5mg-羧芐青霉素100ug100ug四環(huán)素5ug5ug氯霉素34ug34ug對于發(fā)酵運行050608-1(過量的碳)，在誘導時開始進料，手動調節(jié)進料速度，以提供圖12C所示濃度的葡萄糖。對于發(fā)酵運行050629-1(碳限制)，根據(jù)表5所示的方案將物料運送到發(fā)酵罐中。對于發(fā)酵運行060403-3(最少的碳)，當初始葡萄糖丸(15g)耗盡并且溶解氧達到峰值時，自動開始進料?？蛇_27.6g/hr的最大值，根據(jù)以下方程計算進料速度其中/。是初始葡萄糖被消耗的時間。在達到最大速率時，葡萄糖進料限制為9.5g/hr的速率，并且在剩余的運行中保持恒定在該速率。表5-發(fā)酵運行050629-1的進料方案運行時間(小時)葡萄糖進料速度(g/hr)0070.37100.74121.11141.48162.22182.96203.69224.80245.91317.39335.54473.69運行050608-1和050629-1在37°C下進行。生物反應器中的氣流設置為1-2L/min;使用氫氧化銨和/或氫氧化鈉將pH保持在7;開始的4覺拌為500-600rpm;用止泡劑B(Sigma-Aldich,St.Louis，MO)控制泡沫；利用攪拌級聯(lián)使溶解氧水平保持高于30%。培養(yǎng)5-6小時后，通過向運行050608-1加入0.8mL1MIPTG,以及向050629-1運行加76入1.2mLIPTG，誘導宿主細胞產(chǎn)生紫穗槐-4,ll-二烯。誘導時，培養(yǎng)溫度降至30。C。運行060403-3在30°C下進行。生物反應器中的氣流設置為1-2L/min;使用氫氧化銨將pH保持在7。利用攪拌級聯(lián)和氧富集使溶解氧水平保持高于30%。在OD,接近28時(接種19小時后)，通過加入1mL1MIPTG誘導宿主細胞產(chǎn)生紫穗槐-4,ll-二烯。按照兩個不同的方案捕獲和提取紫穗槐-4，11-二烯。對于運行050608-1和050629-1，使廢氣通過含有200mL庚醇的氣體洗滌器排出，由此捕獲廢氣中存在的揮發(fā)性的紫穗槐-4,11-二歸。然后將庚醇稀釋到乙酸乙酯中，直到樣品中紫穗槐-4,ll-二烯的濃度介于0.63mg/L和20mg/L之間。對于運行060403-3,在誘導時向發(fā)酵罐中加入200mL有機覆蓋物在生物反應器中捕獲紫穗槐-4，11-二烯。產(chǎn)物濃度如下測定合并25uL培養(yǎng)液加有才幾覆蓋物和975uL乙腈，在FisherVortexGenie2TM'/'昆合器(ScientificIndustries,Inc.,Bohemia,NY)上以最大速度振搖樣品至少3分鐘，通過離心從樣品中除去細胞，用乙酸乙酯稀釋乙腈溶液，直到樣品中紫穗槐-4，11-二烯的濃度介于0.63和20mg/L之間。如實施例10所述通過GC/MS分析乙酸乙酯樣口C。如圖12A和12B所示，發(fā)酵運行050608-1(過量的碳)分別導致低最大細胞密度和低紫穗槐-4，ll-二烯產(chǎn)量，這至少部分與乙酸水平的相對快速增長有關(圖12D)。相比而言，發(fā)酵運行050629-1(碳限制)導致紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量提高(圖12B)和乙酸產(chǎn)生的出現(xiàn)延遲。這些結果符合過量葡萄糖進料導致快速乙酸產(chǎn)生和早期細胞死亡的假說。發(fā)酵運行060403-3(最低碳)達到的進一步的葡萄糖限制導致超過100小時的低乙酸產(chǎn)生(圖12D),和顯著較高的最大細胞密度和紫穗槐-4,ll-二烯產(chǎn)量(圖12A和12B)。實施例13該實施例證實了在限制碳源條件下和亞最佳溫度下生長的大腸桿菌宿主菌林產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯增多。宿主菌抹B153的種子培養(yǎng)物如下建立將菌林儲備液等份加入到含有50mLM9-MOPS培養(yǎng)基和如表1所詳述的抗生素的250mL搖瓶中，并且將培養(yǎng)物在37。C下在250rpm旋轉搖床上溫育，直到OD,達到3.5-4.5。建立2升的生物反應器(BiocontrollerADI1010，具有BioconsoleADI1025,ApplikonBiotechnology,FosterCity，CA),對于運行060403-3，除了菌4朱和誘導時間不同以外，以與實施例12所述相同的方式運4亍。通過向培養(yǎng)基中加入1mL1MIPTG誘導宿主細胞中紫穗斗鬼-4,11-二烯的產(chǎn)生。在圖13A所示的發(fā)酵運行中，在OD6加接近2時誘導紫穗槐_4,11_二烯合成，而發(fā)酵罐仍然含有過量的葡萄糖。在圖13B所示的發(fā)酵運行中，在OD6。q接近33時誘導紫穗槐-4,ll-二烯合成，這在開始葡萄糖限制進料之后。按照兩個不同的方案捕獲和提取紫穗槐-4,11-二烯。對于圖13A所示的發(fā)酵運行，使廢氣通過含有200mL庚醇的氣體洗滌器排出，由此捕獲廢氣中存在的揮發(fā)性的紫穗槐-4,ll-二烯。然后用乙酸乙酯稀釋庚醇，直到樣品中紫穗槐-4,ll-二烯的濃度介于0.63mg/L和20mg/L之間。對于圖13B所示的發(fā)酵運行，通過在誘導時向發(fā)酵罐中加入200mL有機覆蓋物捕獲紫穗槐-4,ll-二烯。從培養(yǎng)基中提取紫穗槐-4,ll-二烯，包括合并25uL培養(yǎng)液和975uL乙月青,在FisherVortexGenie2TM)'昆合器(ScientificIndustries,Inc.,Bohemia,NY)上以最大速度振搖樣品至少3分鐘，通過離心從樣品中除去細胞，用乙酸乙酯稀釋乙腈溶液，直到樣品中紫穗槐-4,11-二烯的濃度介于0.63和20mg/L之間。如實施例10所述通過GC/MS分析乙酸乙酯樣品。對于圖13A所示的發(fā)酵運行，紫穗槐-4,11-二烯的總量是通過將廢氣中存在的量加上培養(yǎng)基中存在的量并用總和除以發(fā)酵罐體積而獲得的。圖13A中所示的發(fā)酵達到93的最大OD60()和3.2g/L的最大紫穗槐-4,ll-二烯濃度。相反，圖13B中所示的發(fā)酵達到245的最大OD600和15g/L的最大紫穂槐-4,11-二烯濃度。對于在兩個培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的培養(yǎng)生長和紫穂槐-4,11-二烯產(chǎn)生水平的差異，一種可能的解釋是在圖13A所示的發(fā)酵運行中，在消耗過量的葡萄糖之前誘導紫穗槐-4,ll-二烯產(chǎn)生，并且由于甲羥戊酸途徑中間物的毒性水平能夠積累，未限制的葡萄糖可獲得性導致了細胞死亡。在圖13B所示的發(fā)酵運行中，葡萄糖輸送后發(fā)生的誘導受到限制，這阻止了途徑中間物的積累，導致更高的細胞密度和紫穗槐-4，11-二烯產(chǎn)生水平。實施例14該實施例證實了在限制碳源和氮源條件下和亞最佳溫度下生長的大腸桿菌宿主菌抹產(chǎn)生紫穗槐-4，11-二烯增多。宿主菌抹B86的種子培養(yǎng)物如下建立將菌抹儲備液等份加入到含有50mLM9-MOPS培養(yǎng)基和如表1所詳述的抗生素的250mL搖瓶中，并且將培養(yǎng)物在37°C下在250rpm旋轉搖床上溫育，次日早晨在OD6oo接近1時亞培養(yǎng)到相同的培養(yǎng)基中，并在37。C和250rpm下再次生長，直到OD6。。為3-5.建立4個2L生物反應器(BiocontrollerADI1010,具有BioconsoleADI1025,ApplikonBiotechnology,FosterCity,CA)，對于運行060403-3，除了限制氮的運行在物料中不含硫酸銨以外，以與實施例12所述相同的方式運行。當開始時的葡萄糖丸(15g)耗盡并且溶解氧達到峰值時，自動啟動具有6小時加倍時間的指數(shù)葡萄糖進料。最高達30.4g/hr的最大值，根據(jù)以下方程計算進料速度=0.12min—1其中p是比生長速率，A)是最初的葡萄糖丸被消耗的時間。在達到最大速率時，葡萄糖進料降為11.4g/hr的速率，并且在剩余的運行中保持恒定在該速率。在發(fā)酵運行060710-4、060724-5和060619-5(石友限制和氮限制)中，當氨限制導致培養(yǎng)基中葡萄糖積累時，進一步減少葡萄糖進料。發(fā)酵在降低的溫度30°C下進行。生物反應器中的氣流設置為1vvm;開始的4覺4半為700rpm;用止泡劑B(Sigma-Aldich,St.Louis，MO)控制泡沫；利用攪拌級聯(lián)(700-1,200rpm)和富氧使溶解氧水平保持在40%。在發(fā)酵運行060327-3(碳限制)中，用20%NH4OH使pH保持在7;在發(fā)酵運行060710-4、060724-5和060619-5(碳限制和氮限制)中，開始時使用20%NH4OH,從72小時開始使用2.5NNaOH和10NNH4OH的50/50混合物，使pH保持在7,以進一步限制通往發(fā)酵罐的氨的量。在OD6oo接近30時通過向培養(yǎng)基中加入1mL1MIPTG誘導宿主細胞中產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯。通過在培養(yǎng)基上覆蓋10%(v/v)的有機覆蓋物捕獲紫穗槐-4,11-二烯。然后通過合并25uL培養(yǎng)液和975uL曱醛，在FisherVortexGenie2TM混合器(ScientificIndustries,Inc.,Bohemia,NY)上以最大速度振搖樣品至少15分鐘，通過離心從樣品中除去細胞，并向990uL含有10uL/L反式丁香烯的乙酸乙酯中加入10uL曱醇溶液，提取紫穗槐-4,11-二烯。如實施例10所述通過GC/MS分析樣品。圖14A-E顯示來自發(fā)酵運行060327-3(碳限制)的數(shù)據(jù)。發(fā)酵產(chǎn)生16g/L的紫穗槐-4,11-二烯最大濃度(圖14A)。宿主菌抹的最大體積生產(chǎn)率大于200mg/L/h(圖14B)。宿主菌林的最大比生產(chǎn)率〉2mgZL/h/OD600(圖14C)。培養(yǎng)基中氨的濃度在發(fā)酵運行開始時大約為30mM，在指數(shù)生長期加入料液后上升到大約76mM，運行的其余時間保持高于60mM(圖14D)。達到的最大OD6。Q大約為2卯(圖14D),對應于116gDCW/L。培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度在不到20小時內從15g/L下降至低于1g/L,并且保持低水平(圖14E)。乙酸水平在整個發(fā)酵過程中都很低(圖14E)。圖15A-E顯示發(fā)酵運行060710-4、060724-5和060619-5(碳限制和氮限制)的數(shù)據(jù)。發(fā)酵產(chǎn)生的紫穗槐-4,ll-二烯最大濃度為約20g/L至30g/L(圖15A)。在所有三個發(fā)酵運行中，宿主菌4朱的最大體積生產(chǎn)率大于400mg/L/h(圖15B)，這顯著高于在不限制氮的發(fā)酵中獲得的最大體積生產(chǎn)率(圖14B)。對于所有運行，宿主菌林的最大比生產(chǎn)率>2mg/L/h/OD6(X),并且在整個運行中保持高水平(圖15C)。在發(fā)酵運行開始時培養(yǎng)基中氨的濃度為大約35mM至50mM，在指數(shù)生長過程中加入料液后下降，在運行的其余時間保持低于10mM(圖UD)。(氨水平低于發(fā)酵運行060327-3(圖MD)是由于在料液中缺少氨，并且在用來保持pH的石威中氨減少。發(fā)酵運行060710-4和060619-5在運行結束時顯示氨濃度峰值，但是峰值出現(xiàn)在紫穗槐-4,11-二烯大量生產(chǎn)之后)。達到的最大OD,為170-220(圖15D)，對應于68g-88gDCW/L。培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度在不到20小時內/人15g/L下降至低于1g/L,并且保持低水平(圖15E)。乙酸水平在整個發(fā)酵過程中都很低(圖15E)。實施例15該實施例描述了在大腸桿菌宿主菌抹中通過DXP途徑產(chǎn)生紫穗槐-4，ll-二烯。宿主菌林B003、B617、B618和B619的種子培養(yǎng)物如下建立將每種菌抹的儲備液等份加入到含有25mLM9-M0PS培養(yǎng)基和如表1所詳述的抗生素的單獨的125mL搖并瓦中，并且使培養(yǎng)物生長過夜。在初始OD6o。4妻近0.05時用種子培養(yǎng)物4妻種單獨的250mL搖瓶，每個搖瓶均含有40mLM9-MOPS培養(yǎng)基、45ug/mL硫胺、微量營養(yǎng)物、1.00E-5mol/LFeS04、0.1MMOPS、0.5%酵母提取物、20g/LD-葡萄糖和抗生素。培養(yǎng)物在30。C下在250rpm潮濕溫育搖床上溫育，直到OD,達到0.2-0.3，此時通過向培養(yǎng)基中加入40uL1MIPTG在宿主細胞中誘導紫穂槐-4，11-二烯的產(chǎn)生。在誘導時，在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機覆蓋物，以捕獲紫穗槐-4,11-二烯。在不同的時間點采樣，提取紫穗槐-4,ll-二烯，并如實施例10所述通過GC/MS分析。每個宿主菌株用2個獨立的克隆進行實驗，結果取平均值。發(fā)現(xiàn)樣品之間的偏差小于10%。81如圖16所示，含有編碼完全工程化的DXP途徑酶的核苷酸序列的大腸桿菌宿主菌抹B619產(chǎn)生大約45mg/gDCW的紫穗槐-4,ll-二實施例16該實施例描述了在大腸桿菌宿主菌林中產(chǎn)生3-甲基-丁-3-烯-l-醇和3-甲基-丁-2-烯-1-醇。宿主菌抹B286、B287、B288和B291的種子培養(yǎng)物如下建立用每個菌林的儲備液等份在含有如表1詳述的抗生素的LB瓊脂上劃線。每個菌抹挑取三個獨立的菌落，每個菌落接種到7mL含有抗生素的LB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在37°C下在250rpm旋轉搖床上生長過夜，直到對數(shù)晚期。然后在OD,接近0.05時將培養(yǎng)物接種到含有40mlM9-MOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和抗生素的250mL搖瓶中。培養(yǎng)物在37°C下在250rpm旋轉搖床上生長過夜，直到它們達到大約0.2的OD,,此時加入40uL1MIPTG誘導。培養(yǎng)物在30。C下在250rpm旋轉搖床上生長72小時。每天1-2次，測量每個培養(yǎng)物的OD6(K),取700uL樣品。為了從培養(yǎng)液中提取3-甲基-丁-3-烯-l—醇和3-曱基-丁-2-烯-l-醇，向300uL每個取出的樣品中加入600uL乙酸乙酯。然后將樣品渦旋振蕩15分鐘，將400uL上層的乙酸乙酯相轉移到干凈玻璃瓶中進行分析。樣品在Hewlett-Packard6890氣相色譜/質譜儀(GC/MS)上分析。用DB-5柱(AgilentTechnologies,Inc.，PaloAlto，CA)和氦載氣在GC上分離1uL樣品。用于分析的溫度程序如下60。C3分鐘，以60。C/分鐘升高溫度至300°C，于300°C保持2分鐘?？傔\行時間為9分鐘。解析的樣品用Hewlett-Packard5973型質量選4和險測器分析。以前的質譜證實，使用該GC方案，3-曱基-3-丁烯-l-醇和3-曱基-2-丁歸-1—醇的保留時間為2.067分鐘。為了集中檢測3-甲基-丁-3-烯-l-醇和3-曱基-丁-2-烯-l-醇,采用只監(jiān)測3-曱基-丁-3-烯-1-醇和3-甲基-丁-2—烯-1—醇中的離子56和68的選4,性離子監(jiān)測方法。82實施例17該實施例描述了釀酒酵母宿主菌林產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯。宿主菌抹EPY224的產(chǎn)生在Ro等人.(A^wre440:940-943;2006)和PCT專利公開WO2007/005604中描述。宿主菌抹EPY224由表達質粒pRS425ADS通過在YPD培養(yǎng)基中生長而復原(MethodsinYeastGenetics:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual,2005ed.,ISBN0-87969-728-8)，將單菌落接種到YPD瓊脂上，然后將單菌落轉印(patching)到CSM-MetHis瓊脂和CSM-MetLeu瓊脂上。在CSM-MetHis瓊脂上生長但在CSM-MetLeu瓊脂上不生長的克隆復原(即，已經(jīng)失去了質粒pRS425ADS)。一個這樣的克隆纟皮命名為EPY300。用表達質粒pRS425-ADS-LEU2d轉化EPY300,這是一種除了含有LEU2d選擇性標記而不是LEU2以外與pRS425-ADS完全相同的質粒(Erhart和Hollenberg(1983)/.^"en'o/.156:625-635),產(chǎn)生宿主菌4朱Y185。在含有2%葡萄糖和除組氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸以外的所有氨基酸的合成確定成分培養(yǎng)基(CSM-葡萄糖；MPBiomedicals,Solon，OH)上篩選Y185宿主細胞轉化體。宿主菌林EPY300對于亮氨酸生物合成來說是營養(yǎng)缺陷的(/ew2),但是Y185中的表達質粒pRS425-ADS-LEU2d恢復了亮氨酸原養(yǎng)型(丄五t/2)。將單菌落轉印到選擇性培養(yǎng)基上(CSM-葡萄糖-組氨酸、亮氨酸和曱硫氨酸)，生長2天。從平板上刮下細胞，并轉移到凍存管中的1mL25%(v/v)甘油中。將懸浮液混合，然后貯存在-80。C。宿主菌抹Y185的種子瓶如下建立將菌株的儲備液等份加入到含有25mLCSM-葡萄糖、缺少亮氨酸和曱硫氨酸的125mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物生長過夜。在初始OD6。o接近0.05時用培養(yǎng)物接種含有40mL缺少亮氨酸的合成確定成分培養(yǎng)基并且含有0.2%葡萄糖、1.8%半乳糖和1mM曱硫氨酸的250mL帶有檔板的搖瓶。培養(yǎng)物在30°C下在200rpm的旋轉搖瓶上溫育。由于培養(yǎng)基中存在葡萄糖阻止了半乳糖對04丄7啟動子的誘導，紫穗槐-4,ll-二烯產(chǎn)生不能被誘導，直到細胞用完了培養(yǎng)基中的葡萄糖并且切換為使用半乳糖作為其主要碳源。在接種時，在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機覆蓋物，以捕獲紫穗槐-4，11-二烯。在72小時時通過將5uL有機溶劑層轉移到含有500uL乙酸乙酯的干凈玻璃瓶中采樣，其中含有已知濃度的(3-或反式丁香烯作為內標。如實施例IO所述，有4幾覆蓋物/乙酸乙酯樣品在Hewlett-Packard6890氣相/質語儀(GC/MS)上分析。生長72小時后，發(fā)現(xiàn)3個酵母培養(yǎng)物產(chǎn)生60.68、54.48和59.25mg/L的紫穗槐-4，1l-二烯。實施例18該實施例描述了釀酒酵母宿主菌抹產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯，其中該宿主菌林包含天然曱羥戊酸途徑以及處于異源調節(jié)控制之下的異源曱羥戊酸途徑。酵母抹CEN.PK2-1C(Y002)(MATA;ura3-52;trpl-289;leu2-3,112;his3Al;MAL2-8C;SUC2)和CEN.PK2-ID(Y003)(MATalpha;ura3-52;trpl-289;leu2-3,112;his3Al;MAL2-8C;SUC2)(J.P.vanDijken等人，￡，膨M/cra/>Tec/mo/26,706(Jun1,2000)在標準豐富培養(yǎng)基(YPD)中或在缺少允許篩選整合轉化體、質粒保持和減數(shù)分裂后代的適當營養(yǎng)物的確定成分合成培養(yǎng)基(.D.Rose,F.Winston,P.Heiter,Me/^ot/s&yeastge"e"c&'a/a^orafo廠少cow廠sem"wwa/.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1990)中培DNA-介導的向釀酒酵母中的轉化用如R.H.Schiestl,R.D.Gietz，Cwrr16，339(Dec,1989)所述的醋酸鋰法進行。所有基因石皮壞和替換都通過表型分析、菌落聚合酶鏈反應("PCR")和對擴增的基因組DNA進行測序來證實。質粒pAM489-pAM498用pCR2.1(Invitrogen,CarlsbadCA)構建，并且在圖7A-C和表6中顯示。HISMX標記序列在M.S.Longtine等人，14，953(Jul,1998)中描述。質粒DNA的擴增在大腸桿菌DH5a抹中進行。表6菌抹5，HR基因#1Crick啟動子Watson啟動子基因#2遺傳標記3，HRpAM柳TRP1t畫GRGAUGAUOERG20TRP1TRP1pAM4卯TRP1t畫GRCUP1CUP1ERG20TRP1TRP1pAN491URA3t固GRGAUGAIJOERG13URA3URA3pAM492URA3IDI1CUP1CUP1tHMGRURA3URA3pAM493ADE1t畫GRGAL1GAIJOIDI1ADE1URA3pAM494ADE1t固GRCUP1CUP1IDI1ADE1ADE1pAM495HIS3ERG12GAL1GAL10ERG10HISMXHIS3pAM496HIS3ERG12CUP1CUP1ERG10HISMXHIS3pAM497LEU2ERG19GAL1GAUERG8HISMXLEU2pAM498LEU2ERG19CUP1CUP1ERG8HISMXLEU2如下制備釀酒酵母抹Y002和Y003用于引入可誘導的曱羥戊酸途徑基因。通過使用與天然￡7G9啟動子具有45個堿基對的同源性的引物50-56-pwlOO-G(SEQIDNO:44)和50-56-pwl01-G(SEQIDNO:45)PCR擴增pAM328的KanMX-PMET3區(qū)(SEQIDNO:43)，將E尺G9啟動子替換為釀酒酵母ikffiT3啟動子。使用40。/。w/w聚乙二醇3350(Sigma-AldrichStLouis,MO)、100mM醋酸鋰(Sigma)、10|iig鮭精DNA(Invitrogen)將10嗎得到的PCR產(chǎn)物轉化到指數(shù)生長的Y002和Y003抹中，在30。C溫育30分鐘，然后于42。C熱休克30分鐘(如Schiestl&Gietz,C紅r,16:339(1989)所述)。陽性重組子根據(jù)它們在含有0.5|ag/ml遺傳霉素(InvitrogenCo，Carlsbad，CA)的豐富培養(yǎng)基上生長的能力進行確定，并且通過診斷PCR證實。得到的克隆命名為Y93(MATA)和Y94(MATa)。然后，將AD五7開i文閱讀框替換為光滑念珠菌(C""AWag/Wra^)基因(Cg丄五"2)。使用與開放閱讀框(ORF)有50個堿基對側翼同源性的引物61-67-CPK066-G(SEQIDNO:46)和61-67-CPK067-G(SEQIDNO:47),由85光滑念珠菌基因組DNA(ATCC，Manassas,VA)擴增3.5KBCgZ￡t/2基因組基因座。將10pg得到的PCR產(chǎn)物轉化到指數(shù)生長的如上所述的Y93和Y94內。為了在不存在亮氨酸添加的條件下生長，選擇a^/-抹，并通過診斷PCR證實。得到的克隆命名為Y176(MATA)和Y177(MATa)。為了產(chǎn)生釀酒酵母抹Y188,分別用Pmel(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)消化2|iig來自pAM491(SEQIDNO:48)和pAM495(SEQIDNO:49)的質粒DNA過夜，并且導入指數(shù)生長的如上所述的Y176內。為了在缺乏尿嘧啶和組氨酸的培養(yǎng)基中生長，選擇陽性重組子。向正確的基因組基因座中的整合通過診斷PCR證實。為了產(chǎn)生釀酒酵母抹Y189,分別用Pmel消化2pg來自pAM489(SEQIDNO:50)和pAM497(SEQIDNO:51)的質粒DNA過夜，并且導入指數(shù)生長的如上所述的Y177內。為了在缺乏色氨酸和組氨酸的培養(yǎng)基中生長，選擇陽性重組子。向正確的基因組基因座中的整合通過診斷PCR證實。大約1X107來自Y188和Y189的細胞在室溫下在YPD培養(yǎng)基平板上混合6小時，以允許繁殖。然后將混合的細胞培養(yǎng)物接種到缺乏組氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培養(yǎng)基上，以對二倍體細胞的生長進行選擇。用Pmel消化2pg來自pAM493(SEQIDNO:52)的質粒DNA過夜，并且導入指數(shù)生長的如上所述的二倍體細胞內。為了在缺乏腺噤呤的培養(yǎng)基中生長，選擇陽性重組子。向正確的基因組基因座中的整合通過診斷PCR證實。得到的菌抹被命名為Y238。為了產(chǎn)生含有導入基因的完全互補體的單倍體菌抹，Y238在2%乙酸鉀和0.02%棉子糖液體培養(yǎng)基中生成孢子。采用SingerInstrumentsMSM300系列顯微操作器(SingerInstrumentCo，LTD.Somerset,UK)分離大約200個遺傳四分體(四分體是生成四個孑包子的減數(shù)分裂產(chǎn)物)。含有所引入的遺傳物質的適當互補體的獨立的遺傳分離株根據(jù)它們在缺乏腺。票呤、組氨酸、尿嘧啶和色氨酸的條件下生長的能力來確定。所有引入的DNA的整合都通過診斷PCR來證實。得到的菌4朱^皮命名為Y210(MATA)和Y211(MATa)。將2嗎來自pAM426的質粒DNA(SEQIDNO:53)導入指數(shù)生長的如上所述的Y210和Y211內，該質粒DNA含有從釀酒酵母啟動子表達的釀酒酵母密碼子優(yōu)化的紫穗槐二烯合成酶(ADS)。根據(jù)它們在不存在亮氛酸補充的條件下生長的能力篩選含有pAM426質粒的釀酒酵母抹。得到的菌抹命名為Y225(MATA)和Y227(MATa)。將2嗎來自pAM322的質粒DNA(SEQIDNO:54)導入指數(shù)生長的如上所述的Y210和Y211內，該質粒DNA含有從釀酒酵母表達的釀酒酵母密碼子優(yōu)化的紫穗槐二烯合成酶(ADS)和細胞色素P450單加氧酶(AMO)和從釀酒酵母啟動子表達的細月包色素P450氧化還原酶(CPR)。根據(jù)它們在不存在亮氨酸補充的條件下生長的能力篩選含有pAM322質粒的釀酒酵母抹。得到的菌株命名為Y222(MATA)和Y224(MATa)。實施例19該實施例描述了在大腸桿菌宿主菌4朱中產(chǎn)生a-法尼歸或(3-法尼烯。宿主菌抹B552和B592的種子培養(yǎng)物如下建立將每個菌抹的儲備液等份加入到含有25mLM9-MOPS、0.8%葡萄糖、0.5%酵母提取物和如表1所詳述的抗生素的125mL搖瓶中，并iU吏培養(yǎng)物生長過在初始OD6oq接近0.05時用種子培養(yǎng)物接種含有40mLM9-MOPS培養(yǎng)基、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和抗生素的250mL搖瓶。培養(yǎng)物在30。C下在250rpm潮濕溫育搖床上溫育，直到它們達到大約0.2的OD6()o，此時通過加入40uL1MIPTG在宿主細月包中"i秀導a-法尼烯或(3-法尼烯的產(chǎn)生。誘導時，在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機覆蓋物，以捕獲a-法尼烯。每24小時通過將2-10uL有機溶劑層轉移到含有加有作為內標的反式丁香烯的1mL乙酸乙酯的干凈玻璃瓶中，采樣一次。另外，離心培養(yǎng)物的1mL等份，將細胞沉淀物重懸浮在250uL無菌水中，將細胞懸浮液轉移到含有摻有作為內標的反式87丁香烯的1mL乙酸乙酯的玻璃瓶中。整個培養(yǎng)液樣品通過渦^走振蕩玻璃瓶10分鐘用乙酸乙酯萃取，之后將600uL乙酸乙酯萃取物轉移到干凈的玻璃瓶中。有機覆蓋物/乙酸乙酯樣品和乙酸乙酯萃取的整個培養(yǎng)液樣品在裝備有Agilent5975質譜儀的Agilent6890N氣相色譜儀(GC/MS)上以全掃描模式(50-500m/z)分析。為了加快運行時間，改變溫度程序和柱基質以達到最佳峰值分辨率和最短的總運行時間。利用HP-5MS柱(AgilentTechnologies,Inc.,PaloAlto,CA)禾口氦載氣分離1iiL才羊品。用于分析的溫度程序如下150。C保持3分鐘，以25。C/分鐘升高溫度至200。C,以60。C/分鐘升高溫度至300。C，于300。C保持1分鐘。以前的質譜證實p-法尼烯合成酶的產(chǎn)物是(3-法尼烯，使用該GC方案，卩-法尼烯的保留時間為4.33分鐘。通過比較產(chǎn)生的峰面積和純化p-法尼烯(Sigma-AldrichChemicalCompany,St.Louis,MO)在力口有反式丁香烯的乙酸乙酯中的定量校準曲線，計算法尼烯的滴度。宿主林B592在120小時時產(chǎn)生大約400mg/L的p-法尼烯(平均3個以上的獨立克隆)，并且具有約46mg/L/OD6Q。的最大比生產(chǎn)率。宿主菌林B552在120小時時產(chǎn)生大約1.1g/L的P-法尼烯(平均3個以上的獨立克隆)，并且具有約96mg/L/OD6。。的最大比生產(chǎn)率(1個代表克隆)。實施例20該實施例描述了大腸桿菌宿主菌株中通過DXP途徑產(chǎn)生P-法尼宿主菌抹B650、B651、B652和B653的種子培養(yǎng)物如下建立將每個菌林的儲備液等份加入到單獨的含有25mLM9-MOPS和如表1所詳述的抗生素的125mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物生長過夜。在初始OD6。。接近0.05時用種子培養(yǎng)物接種含有40mLM9-MOPS基本培養(yǎng)基、45ug/mL硫胺、微量營養(yǎng)物、1.00E-5mol/LFeS〇4、0.1MMOPS、0.5%酵母提取物、20g/LD-葡萄糖和抗生素的單獨的250mL搖瓶。培養(yǎng)物在30。C下在潮濕溫育搖床上250rpm88溫育，直到它們的OD6oo達到0.2-0.3,此時向培養(yǎng)基中加入40uL1MIPTG誘導在宿主細胞中產(chǎn)生P-法尼烯。誘導時，在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機覆蓋物以捕獲p-法尼烯。在不同時間點通過將100uL有機覆蓋上層的樣品轉移到干凈試管中采樣。離心該試管以分離出任何剩余的細胞或培養(yǎng)基，并將10uL有機覆蓋層樣品轉移到千凈玻璃GC瓶中的加入P-或反式丁香烯作為內標的500uL乙酸乙酯中。將混合物渦旋振蕩30秒，然后如實施例18所述分析。大腸桿菌宿主菌才朱B653產(chǎn)生大約7mg/gDCW(3-法尼烯。實施例21該實施例描述了釀酒酵母宿主菌抹中a-法尼婦或P-法尼烯的產(chǎn)生。菌林EPY300的產(chǎn)生是通過在豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)而從釀酒酵母EPY224抹中除去表達質粒(Ro等人.(2006)A^wre440:940-943;PCT專利公開WO2007/005604)。然后用表達質粒pRS425-FSA或pR425-FSB轉化菌4朱EPY300，分別產(chǎn)生宿主菌林Y166和Y164。宿主細胞轉化體在含有2%葡萄糖和除亮氨酸以外的所有氨基酸的合成的確定成分培養(yǎng)基(SM-glu)上篩選。宿主菌林EPY300對于亮氨酸生物合成來說是營養(yǎng)缺陷的(7ew2)，但是表達質粒pRS425-FSA或pRS425-FSB恢復了亮氨酸原養(yǎng)型f^72)。將單菌落轉移到含有5mL缺乏亮氨酸的液體SM-glu的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)物通過在30°C振搖溫育，直到生長達到穩(wěn)定期。細胞以由40050%甘油和600/iL液體培養(yǎng)物組成的lmL冷凍等份，在凍存管中貯存于-80。C。種子培養(yǎng)物如下建立將儲備液等份加入到含有25mL缺乏亮氨酸的SM-glu的125mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物生長過夜。在00600約為0.05時用種子培養(yǎng)物接種含有40mL缺乏亮氨酸的合成的確定成分培養(yǎng)基、0.2%葡萄糖和1.8%半乳糖的250mL帶檔板的搖瓶中。培養(yǎng)物在30。C下在200rpm的旋轉搖床上溫育。由于培養(yǎng)基中存在葡萄糖阻止了半乳糖對G"〃啟動子的誘導，法尼烯的產(chǎn)生不能被誘導，直到細胞用完了培養(yǎng)基中的葡萄糖并且切換為使用半乳糖作為其主要碳源。在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的油酸曱酯或豆蔻酸異丙酯。每24小時通過將2-10uL有機溶劑層轉移到含有500uL乙酸乙酯的干凈玻璃瓶中采樣，該乙酸乙酯中摻有已知濃度的(3-或反式丁香烯作為內標。另外，將整個培養(yǎng)液的0.5mL等份加入到含有摻有作為內標的反式丁香烯的1mL乙酸乙酯的玻璃瓶中。整個培養(yǎng)液樣品通過渦旋才展蕩玻璃瓶10分鐘用乙酸乙酯中萃取，之后將600uL乙酸乙酯萃取物轉移到干凈的玻璃瓶中。宿主4朱Y166在120小時時產(chǎn)生大約9.8mg/L的a-法尼烯(平均超過3個獨立克隆)，并且具有大約3mg/L/OD6(K)的最大比生產(chǎn)率(1個代表性克隆)。宿主菌抹Y164在120小時時產(chǎn)生大約56mg/L的P-法尼烯(平均超過3個獨立克隆)，并且具有大約20mg/L/OD6。o的最大比生產(chǎn)率(l個代表性克隆)。實施例22該實施例描述了在大腸桿菌宿主菌抹中產(chǎn)生y-萜品烯、a-蒎烯和薛品油歸。用于產(chǎn)生y-萜品烯(大腸桿菌DH1-Tlr[pMevT，pMevB-Gpps，pAM445])、a-蒗烯(大腸桿菌DH1-Tlr[pMevT,pMevB-Gpps,pAM443或pAM442])或碎品油烯(大腸桿菌DH1-Tlr[pMevT,pMevB-Gpps,pAM444]的宿主菌株的種子培養(yǎng)物通過將每種菌抹的貯備液等份加入到單獨的含有25mLM9-MOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和如表1所詳述的抗生素的125mL搖^f瓦中，并且通過將培養(yǎng)物生長過夜至對數(shù)后期而建立。種子培養(yǎng)物用來以大約0.05的初始OD,接種含有40mLM9-MOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和抗生素的250mL搖瓶。在接種時，培養(yǎng)物上也覆蓋有4mL十六烷。培養(yǎng)物在200-250rpm的旋轉搖床上30。C溫育，直到它們達到大約0.2的OD6QQ,此時添加40uL1MIPTG誘導在宿主細胞中產(chǎn)生目標化合物。每天通過將200uL十六烷層轉移到0.6mL微量離心管中采樣一次，共96小時。為進行分析，在1.8mLGC瓶中將十六烷層用摻有作為內標的反式丁香烯90的乙酸乙酯1:1或1:10稀釋。另外，離心每J分1mL的培養(yǎng)物，將細胞沉淀物重懸浮在250uL無菌水中，并將細胞懸浮液轉移到加有作為內標的反式丁香烯的1mL乙酸乙酯的玻璃瓶中。通過渦旋振蕩玻璃瓶15分鐘將細胞沉淀物在乙酸乙酯中提取，之后將500uL乙酸乙酯提取物轉移到干凈的玻璃瓶中。十六烷/乙酸乙酯樣品和乙酸乙酯提取的細胞沉淀物樣品在全掃描模式(50-500m/z)的裝備有Agilent5975質譜4義的Agilent6890N氣相色譜儀(GC/MS)上分析。為了加快運行時間，改變溫度程序和柱基質以達到最佳峰值分辨度和最短的總運行時間。分成1樣品(基于樣品濃度選4奪1:2至1:50的分配比)，然后用HP-5MS柱(AgilentTechnologies,Inc.,PaloAlto,CA)和氦載氣分離。用于分析的溫度程序如下75。C保持3分析，以20。C/分鐘升高溫度至115。C,以60。C/分鐘升高溫度至300。C，于300。C保持0.5分鐘。各種產(chǎn)物，y-萜品烯、oc-蒗烯和碎品油烯，分別在5.4、4.1、5.4和5.9分鐘時觀察。通過將產(chǎn)生的峰面積與純化標準在加有反式丁香烯的乙酸乙酯中的定量校準曲線比較，計算滴度。實施例23該實施例描述了在大腸桿菌宿主菌抹中生產(chǎn)芳樟醇、芋烯、P-蒗烯、P-水芽烯、蒈烯或檜烯。種子培養(yǎng)物如下建立將每種菌林的儲備液等份加入到含有25mLM9-MOPS培養(yǎng)基、0.5%酵母提取物、2%葡萄糖和如表1所詳述的抗生素的單獨的125mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物生長過夜。在初始OD6。。接近0.05時用種子培養(yǎng)物接種250mL帶有檔板的搖瓶，每個搖瓶均含有40mLM9-MOPS培養(yǎng)基、0.5%酵母提取物，2%葡萄糖和抗生素。培養(yǎng)物在30°C下在250rpm旋轉搖床上溫育，直到它們達到大約0.2的OD6。。，此時通過向培養(yǎng)基中加入40uL1MIPTG在宿主細胞中誘導目標化合物的產(chǎn)生。通過溶劑-溶劑萃取從培養(yǎng)基中分離目標化合物，或者如果目標化合物的滴度大到足以使培養(yǎng)基飽和并且形成第二相，則通過沉降和潷析分離目標化合物。序列表SE(JIDNO:1MevT66操縱子AGCAAAAGCGTGAAGTCTGTCTTAATGCAGCTGTTCGGCGAGAACACGGATGTCGAGGGTATCGACACCGCGTCTTACATGGAGCACGCCTACGACTTTTACAAGCCGGACTTCACGAGCGAATACCCGTACGTGG92ACATGCAGCGAATCTGGTTACGGCGGTTTTCTTAGCCTTAGGTCAGGACCCAGCCCAAAATGTCGAGAATCGAGGTCGGCACGATCGGCGGCGGCACCGTTTTAGAACCGCAAGGTGCGATGCTGGA丁CTGCTGGGSE(JIDNO:2引物4-49mvaASpelSEQIDNO:3引物4-49mvaARXbal5'-GCTTCTAGACTATTGTTGTCTAATTTCTTGTAAAATGCG-3'SEQIDNO:4引物HMGS5'SamvaS-SSE(JIDNO:5引物HMGS.3'SanwaS-AS93SEQIDNO:6引物19-25atoBSfil-S5'-GCTAGGCCATCCTGGCCATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTG-3'SEQIDNO:7引物19-25mvaA-AsiSI-AS5'-GCTTGCGATCGCCGGCGGATTTGTCCTACTCAG-3'SE<JIDNO:8引物9-70C5'-CCACCTCGAGATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTG-3'SE(IDNO:9引物26-39B5，-TGGTGGAGCTCTTATTTAAGCTGGGTAAATGCAGATAATCG-3'SECJIDNO:10引物26-39A5'-TTCTTGAGCTCTTATTCCTTTGGTAGACCAGTCTTTGCG-3'SEQIDNO:11引物4-40nwaEFBamHISEQIDNO:12引物4-40mvaERHindIII5'-AGCTAAGCTTTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC—3，SEQIDNO:13引物4-40mvaSFBglIISEQIDNO:14引物4-39mvaSRBamHI5'-TTTGGATCCTTAGTTTCGATAAGAGCGAACGG—3'SEQIDNO:15用于PCR擴增dxs基因的編碼序列的引物67-1A-CSE(JIDNO:1694用于PCR擴增dxs基因的編碼序列的引物67-1B-CSEQIDNO:17用于PCR擴增dxr基因的編碼序列的引物67-1C-CSEQIDNO:18用于PCR擴增dxr基因的編碼序列的引物67-1D-CSE(JIDNO:19用于PCR擴增ispD基因的編碼序列的引物67-1E-CSEQIDNO:20用于PCR擴增ispD基因的編碼序列的引物67-1F-C5'-TATTGTTCATATGTTATGTAT丁CTCCTGATGGATGGTTCG-3'SEgIDNO:21用于PCR擴增ispE基因的編碼序列的引物67-1G-CSEQIDNO:22用于PCR擴增ispE基因的編碼序列的引物67-1H-C5'-TGTTAGTTACGCGTTTAAAGCATGGC'SEQIDNO:23用于PCR擴增ispF基因的編碼序列的引物67-2A-C5'-SEQIDNO:24用于PCR擴增ispF基因的編碼序列的引物67-2B-C5'-TTTAGTTGGGCCCTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAGCGCC-3'SECIDNO:25用于PCR擴增ispG基因的編碼序列的引物67-2C-CSECIDNO:26用于PCR擴增ispG基因的編碼序列的引物67-2D-C95SEQIDNO:27用于PCR擴增ispH基因的編碼序列的引物67-2E-CSEqIDNO:28用于PCR擴增ispH基因的編碼序列的引物67-2F-CSEQIDNO:29用于PCR擴增idi基因的編碼序列的引物67-2G-CSEQIDNO:30用于PCR擴增idi基因的編碼序列的引物67-2H-CSE(JIDNO:31用于PCR擴增ispA基因的編碼序列的引物67-2l-C5'-CAGTAAAGCTTAGGAGGAAATAATGGACTTTCCGCAGCAACTCG-3'SEgIDNO:32用于PCR擴增ispA基因的編碼序列的引物67-2J-C5'-TAGTTCCATGGTTATTTATTACGCTGCSEQIDNO:33用于PCR擴增RK2par基因座的引物9-156A5'-ACATAGACGTCGGGAAAGCGAGGATCTAGGTAGGG-3'SEQIDNO:34用于PCR擴增RK2par基因座的引物9-156B5'-TTCCCGCTCGAGGTGGCGGACCATATAGGCAGATCAG-3'SE(JIDNO:35引物19-137cml-pAM37-AS5'-GACGTCGATATCTGGCGAAAATG-3'SE(IDNO:36引物19-137cml-pAM37-S5，—TACTAGTGCTTGGATTCTCACC-3'SEQIDNO:37用于PCR擴增編碼P-法尼烯合成醉的核苷酸序列的引物5'-CCATGGACACTCTGCCGATCTCTTCCGTAAGC-3'SE(JIDNO:38用于PCR擴增編碼P-法尼烯合成酶的核苦酸序列的引物5'-GAGCTCTCATACGACCATAGGG丁GTACG-3'SEQIDNO:39用于PCR擴增編碼a-法尼烯合成酶的核苷酸序列的引物5'-CCATGGACCTGGCAGTAGAAATTGC'3'SEQIDNO:40用于PCR擴增編碼a-法尼烯合成醉的核苦酸序列的引物5，-GAGCTCTTACATCGGTACCGGCTCCAG-3'SEQIDNO:41atofl(opt),//A/G>S(opt),/nvI^操縱子GATGGTCAGGTGTACGACGTCATCTTACGCGATGGCTTAATGTGCGCGACCCACGGTTACCACATGGGGAATCAGACTGGCGGATTTAAAACGGTATCTTCTGAACGTATTATGATAGGTCAAATCGTCTTTGATGACGATTTTAGAGGCCATAACTGCATTTTTAAAAAATGAATCTCCACAAAGCGACATTTTAATGAGTATTSE(JIDNO:42rt'CA8(opt).謂flS(opt).，"操縱子98<formula>formulaseeoriginaldocumentpage99</formula>SEQIDNO:43pAM328-ERG9-KANMX-MET3啟動子-ERG9(不包括載體骨架)CAA丁ACCGACT丁ACCATCCTATTTGCITTGCCCTTTTTCTTTTCCACTGCATGGCGGCGTTAGTATCGAAGTGAGTCTTTTCCTTACCCATGGTTGTTTATGTTCGGATGTGATGTGAGAACTGTATCCTAGCAAGATTATACTATTACACTTCATTTACCACCCTCTGATCTAGATTTTCCAACGATATGTACGTAGTGGTATAAGG:TTTTTTAGCTGCAATGCCAATTGTAATAGCTTTCCCATGTTAATTATACTTTATTCTTSE(JIDNO:44SEQIDNO:45CGTGTATACGTTTTCCGCTTCTGCTCTTCGTCTTTTCTCTTCTTCCGATATCACAACTGTTACGASE(JIDNO:46GGTAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAACAATCACAGGAAACAGCTATGACCSE(JIDNO:47SE(JIDNO:48pAM491序列(不包括栽體骨架)101AAAGTTCCJGAAAUJCJAt;TA(J'丄'CJ(JUUJ'r(JTmi.(JATAC:(JA'lXJ(J'r丄'A(J丄丄AAAA(JAUirU'r丄'Ci(JA(JUALC;CAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCGACGTCCAACATATTATCAAGGAATTAGATATTACTAACAAATTAGCCAAGAGAATCACCGAAACTCCTTTTGGCAGCCTGCTTmTTAGCTGTCA'rn'AA'l'AUAUTAUTrn丁丄'AA.l'(J.l'AiA'JA(jrA(JUAAAA(J.l'CJAGCCGCTAAAGGCATTATCCGCCAAGTACAATTTTTTACTCTTCGAAGACAGAAAATTTGCTGACATTGGGGTTTAAACSEQIDNO:49pAM492序列(不包括栽體骨架)TAAGAAGAGTATTGAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTCATGGATCTGCACATGAACAAACACCAGAGGGGCGCTATACGTGCATATGTTCATGTATGTATCTGTATTTAAAACACTTTTGTATTATTTTTCCTCATA104<formula>formulaseeoriginaldocumentpage105</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage106</formula>SE(JIDNO:51pAM497序列(不包括栽體骨架)丁ATTTTAATCAAATCi—iTACiCG]'(JArrJ'AM'ATn.n.i.n.L'UCXTL'UAUA'l.(JA'JL'J'UUJUAUA-i'"UUAAUTJ'UTGCTACn.A(JCiCiUAU丄AAA(Ji(JUUCiC;ATlTU"l'lAA'llJAAUAACjAL'ICj(JAAlAlAACUAJ1AAAAU1SEQIDNO:52pAM493序列(不包括栽體骨架)ATrCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGCAGGAT109CCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGTTGATGACGAATTAGGTTTGAAGGGTAAGCTAGACGATAAGATTAAGGGCGCTATTACTGCGGCGGTGTGGGTTTCACCAAATGATTTGAAAACTATGTTTGCTGACCCAAGTTACAAGTTTACGCCTTGGTTTAAGAAATCC'n'A(JTAATA'lXiTAAA(JTri.ATn-l'UriTAm'AUJ(JtJ(JUAU丄(JA(Ji'CrUAC丄C'riUCJUAUAUAAGGTAGACGCTGGTACGTTGCTGTTTGTTGCTACGGATCGTATCTCTGCATATGACGTTATTATGGAAAAAGGAGAAGGGCATCATCATCGCAGACACTAAATTGTTTAAACSEQIDNO:53pAM426序列AAAGTTTATGTACAAATATCATAAAAAAAGAGAATCTTTTTAAGCAAGGATTTTCTTAACTTCTTCGGC1TGGTCACCTGGCAAAACGACGATCTTCTTACiCiCiCiCAUAC:A.ri'ACAA'j;CiU-l'A'rA'l'(J(J'ri'UAAAiA.rATAATCAGGAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTGATGGGGAAAGAGAAAAGAAAAAAATTGATCTATCGATTTCAATTCAATTCAATTTATTTCmrCGGGGATCGTGCTCTTCAGTTGTCGGTATGTGTCCTTCATTAGCCCATTTCGCTTCTACCATTAGATTCCTTACCATTTCTGTGTAGGTATCCATGAATAATTTGTAAATAGGCTTCATGTATTCCGGCAACGTGTCTAAGCAGATTGAACTCCAGTTTAGCTAACTTTAGCAGAGTTTTATTATGGGAGTCTTGTTGCTGATAGAAGGGTCAACTGTCTTACTTCCT丁CTTTAGATCGTTTAC丁ATTTGCTCCACACCCTGTTCAACTTGTTTCTCATAAAAGGCCATTGTTTTCTGCAGATCCGGGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGCiTTA(JTCiCX'AA'rnTr(JCT(JT丄IJA'丄AA(JC;Al'AAAACJ(JJlAU'iA1—m丄'A(JATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAG丁GG八ACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGSEQIDNO:54pAM322序列〕TTGATAAATGTATGTAGATTGCGTATATAGTTTCGTCTACCCTATGAACATATTCCATTTTGTAATTTCGTGTCGTTTCTATTATGAATTTCATTTATrCTTCGGC114TGGTCACCTGGCAAAACGACGATCTTCTTAGGGCiCAqAL'ATTACAATUCi'丄.ATA丄CCJ'rrUAAATATATAATAAGAAAGCAACACCTGGCAATTCCTTACCTTCCAATAATTCCAAAGAAGCACCACCACCAGTAGAGATAACAGCCATAAGTAAAGGTCTTGGGATATTCTTTGTTGTTAAATACTCTCTGTTTATGTCTTTCCAA<formula>formulaseeoriginaldocumentpage116</formula>.ri'AA'lA'rAUJ丄'e;丄'ArA(jrriAAL"丄UftA"UAAjAAAAAAU^HAA(jLTJ!LCACAGGGAATTGCTTATGATATTAACAACCAGTGTGGCCGTTTTAATTGGTTGTGTGGTTGTATTGGTATTTACACAGTCCCTTATCCGATAGGAGTTGTACTCATTTAGAATTTGATATTTCCAATACTGGACTATCGATTCTATTCTTTGGTTGTCGTAATAGAAAAGTTGACTTTATATACGAAGATGAGTTAAACAACTTCGTTATGTTTGGTGAGCTAGCTAAGATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTAGGTTAGAAGAAGGCTACTTTGGTGTCTATTTTCTCTrCCATAAAAAAAGCCTGACTCCACTTCCCGCGTTTACTGATTACTAGCGAAGCTGCGGGTGCATTTTTTCAAGATAAAGGCATCCCCGATTATATTCTATA、TTGGTCAGAAATTCGATTCACTCTATGAATAGTTCTTACTACAATTTTTTTGTCTAAAGAGTAATACTAGAGATAAACATGGATATAGCACAGAGATATATAGCAAAGAGATACTTTTGAGCAATGTTTGTGGAAGCGGTATTCGCAACCATTCCATGCGGGGTATCGTATGCTTCCTTCAGCACTACCCTTTAGCTGTTCTATATGCTGCC八CTCCTCAATTGGATTAGTCTCATCCTTCAATGCTATCATTTCCTTTGATATTCiCJATCATACTAAUAAACCATTAT118權利要求1.一種生產(chǎn)類異戊二烯的方法，包括(a)獲得多個宿主細胞，該宿主細胞包含用于生成異戊烯焦磷酸的酶途徑，并且其中所有的途徑酶都在至少一個異源轉錄調節(jié)物的控制下；和(b)在與提供該宿主細胞的最大比生長速率的條件相比為亞最佳的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細胞。2.權利要求l的方法，其中所述途徑是曱羥戊酸途徑。3.權利要求l的方法，其中所述途徑是DXP途徑。4.權利要求1的方法，其中所述至少一種異源轉錄調節(jié)物是可誘導的。5.權利要求1的方法，其中所述途徑酶在單個轉錄調節(jié)物的控制下。6.權利要求1的方法，其中所述途徑酶在多個轉錄調節(jié)物的控制下。7.權利要求l的方法，其中所述宿主細胞是原核生物。8.權利要求7的方法，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。9.權利要求l的方法，其中所述宿主細胞是真核生物。10.權利要求l的方法，其中所述宿主細胞是真菌。11.權利要求9的方法，其中所述宿主細胞是釀酒酵母。12.權利要求2的方法，其中所述途徑包括編碼來自具有內源曱羥戊酸途徑的原核生物的曱羥戊酸途徑酶的核酸序列。13.權利要求12的方法，其中所述原核生物是選自腸球菌屬、假單胞菌屬和葡萄球菌屬的屬的原核生物。14.權利要求13的方法，其中所述核酸序列選自乙酰-CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA還原酶和曱羥戊酸激酶。15.權利要求12的方法，其中所述核酸序列編碼II類HMG還原酶。16.權利要求1的方法，其中所述宿主細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中營養(yǎng)物或溫度或此兩者的水平保持低于提供該宿主細胞的最大比生長速率的水平。17.權利要求1的方法，其中培養(yǎng)基的溫度至少比提供最大比生長速率的溫度低大約2-20。C。18.權利要求17的方法，其中所述宿主細胞在至少比提供最大比生長速率的溫度低大約5°C的溫度下培養(yǎng)。19.權利要求17的方法，其中培養(yǎng)基的溫度至少比提供最大比生長速率的溫度低大約10。C。20.權利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基包含碳源，并且碳源的量將提供最大比生長速率的大約90%或更低。21.權利要求20的方法，其中所述碳源的量將提供最大比生長速率的大約75%或更低。22.權利要求20的方法速率的大約50%或更^^。23.纟又利要求20的方法速率的大約25。/?；蚋黬氐。24.權利要求20的方法速率的大約75%-10%。25.權利要求1的方法其中所述碳源的量將提供最大比生長其中所述碳源的量將提供最大比生長其中所述碳源的量將提供最大比生長其中所述培養(yǎng)基包含氮源，氮源的含量低于提供最大比生長速率的大約90%或更低的量。26.權利要求25的方法，其中所述氮源的量將提供最大比生長速率的大約75%或更低。27.權利要求25的方法，其中所述氮源的量將提供最大比生長速率的大約50%或更低。28.權利要求25的方法，其中所述氮源的量將提供最大比生長速率的大約25%或更{氐。29.權利要求25的方法，其中所述氮源的量將提供最大比生長速率的大約75%-10%。30.權利要求1的方法，其中所述類異戊二烯以大于大約每升培養(yǎng)基IO克的量產(chǎn)生。31.權利要求1的方法，其中所述類異戊二烯以高于大約每克細胞千量50mg的量產(chǎn)生。32.權利要求30或31任一的方法，其中所述類異戊二烯的量在不到大約150小時的時間內產(chǎn)生。33.權利要求30或31任一的方法，其中所述類異戊二烯的量在不到大約96小時的時間內產(chǎn)生。34.權利要求30或31任一的方法，其中所述類異戊二烯的量在不到大約72小時的時間內產(chǎn)生。35.權利要求1的方法，其中所述宿主細胞在低于提供最大比生長速率的溫度的溫度下培養(yǎng)，并且其中所述宿主細胞在碳源水平保持低于提供最大比生長速率的水平的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。36.權利要求1的方法，其中所述類異戊二烯選自半萜、單辟、二辟、三薛、四莊和多碎。37.權利要求1的方法，其中所述類異戊二烯不是類胡蘿卜素。38.權利要求1的方法，其中所述類異戊二烯是C5-C2o類異戊39.權利要求1的方法，其中所述類異戊二烯選自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、a-法尼烯、(3-法尼烯、法尼醇、香葉醇、香葉基香葉醇、異戊二烯、芳樟醇、苧烯、月桂烯、橙花叔醇、羅勒烯、薄荷醇、(3-蒗烯、檜薛、y-碎品烯、萜品油烯和瓦4侖烯。40.—種生產(chǎn)類異戊二烯的方法，包括(a)荻得多個宿主細胞，該宿主細胞包含編碼來自具有內源曱羥戊酸途徑的原核生物的甲羥戊酸途徑酶的核酸序列；和(b)在與為宿主細胞提供最大比生長速率的條件相比為亞最佳的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細胞。41.一種宿主細胞，當其在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時能夠以大于每升培養(yǎng)基大約IO克的量產(chǎn)生類異戊二烯。42.—種宿主細胞，當其在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時能夠以大于每克細胞干重大約50mg的量產(chǎn)生類異戊二烯。43.權利要求40或41任一項的方法，其中所述類異戊二烯的量在不到大約150小時的時間內產(chǎn)生。全文摘要本發(fā)明提供通過一種或多種生物合成途徑大量生產(chǎn)類異戊二烯的方法。本發(fā)明還提供用于實施所述方法的核酸、酶、表達載體和遺傳修飾的宿主細胞。本發(fā)明還提供從遺傳修飾的宿主細胞高產(chǎn)率地生產(chǎn)類異戊二烯的發(fā)酵方法。文檔編號C12P7/40GK101484584SQ200780019353公開日2009年7月15日申請日期2007年5月25日優(yōu)先權日2006年5月26日發(fā)明者C·J·帕登,J·紐曼,K·K·賴林,N·S·倫寧格,R·里根廷申請人:阿米瑞斯生物技術公司