專利名稱：：來自多甲藻屬物種的△-5去飽和酶及其在制備多不飽和脂肪酸中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體地講，本發(fā)明涉及編碼A-5脂肪酸去飽和酶的核酸片段的鑒定以及這種去飽和酶在制備長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)中的用途。
背景技術(shù)：
：PUFA的重要性無可爭議。例如，某些PUFA是健康細(xì)胞的重要生物成分并被公認(rèn)為是在哺乳動(dòng)物內(nèi)不能從頭合成、相反必須從膳食獲得或由亞油酸(LA;18:2co-6)或a-亞麻酸(ALA;18:3oo-3)通過進(jìn)一步去飽和和延伸而衍生得到的"必需"脂肪酸；細(xì)胞質(zhì)膜的組分，在質(zhì)膜中它們可以以諸如磷脂或三?；视椭惖男问酱嬖冢徽_發(fā)育(尤其是在發(fā)育中的嬰兒腦中)和組織形成及修復(fù)的必需物質(zhì)；以及哺乳動(dòng)物中幾種重要的具有生物活性的類二十烷酸(如前列環(huán)素、類花生酸、白細(xì)胞三烯和前列腺素)的前體。而且，攝入大量長鏈to-3PUFA產(chǎn)生心血管保護(hù)效果(Dyerberg,J.等人，Amer.J.Clin.Nutr.,28:958-966(1975);Dyerberg,J.等人,Lancet,2(8081):117-119(1978年，7月15日);Shimokawa,H.,WorldRev.Nutr.Diet,88:100-108(2001);vonSchacky,C.和Dyerberg,J.,WorldRev,Nutr.Diet，88:90-99(2001))。而且，大量的其它研究證明，針對(duì)多種癥狀和疾病(如哮喘、牛皮躊、濕滲、糖尿病和癌)施用co-3和/或co-6PUFA賦予了廣泛的健康益處。目前正在研究包括植物、藻類、真菌和酵母在內(nèi)的多種不同宿主作為商業(yè)化PUFA生產(chǎn)的手段?；蚬こ桃呀?jīng)證明，一些宿主(即便是天然受限于LA和ALA脂肪酸生產(chǎn)的那些宿主)的天然能力可以得到大幅改變，以導(dǎo)致高水平地產(chǎn)生多種長鏈co-3/co-6PUFA。無論這是天然能力的結(jié)果還是重組技術(shù)的結(jié)果，花生四烯酸(ARA;20:4co-6)、二十碳五烯酸(EPA;20:5co-3)和二十二碳六烯酸(DHA;22:6w-3)的產(chǎn)生可能都需要表達(dá)A-5去飽和酶。大部分目前為止所鑒定的△-5去飽和酶都具有將二高-Y-亞麻酸(DGLA;20:3w-6)轉(zhuǎn)化成ARA的主要能力，其次級(jí)活性是將二十碳四烯酸(ETA;20:4w-3)轉(zhuǎn)化成EPA(其中EPA隨后在與另外的<320/22延長酶(elongase)和A-4去飽和酶反應(yīng)后合成DHA)。A-5去飽和酶在A-6去飽和酶/A-6延長酶途徑(其主要存在于藻類、蘚類、真菌、線蟲和人中并且其特征在于產(chǎn)生y-亞麻酸(GLA;18:3co-6)w和/或十八碳四烯酸(STA;18:4w-3))co和△-9延長酶/A-8去飽和酶途徑(其在一些生物如類眼蟲物種中起作用并且其特征在于產(chǎn)生二十碳二烯酸(EDA;20:2w-6)co和/或二十碳三烯酸(ETrA;20:3co-3))co中都起作用(圖1)?；贏-5去飽和酶在如ARA、EPA和DHA合成中的作用，已經(jīng)付出了相當(dāng)大的努力來鑒定和表征來自多種來源的這些酶。同樣，在公開的文獻(xiàn)(如GenBank登錄號(hào)AF199596、AF226273、AF320509、AB072976、AF489588、AJ510244、AF419297、AF07879、AF067654和AB022097)和專利文獻(xiàn)(如美國專利5,972,664和6,075,183)中均已公開了4艮多種A-5去飽和酶。此外，臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)枮?0/801,172(于2006年5月17日提交)的共同擁有的、共同未決的申請(qǐng)公開了來自小眼蟲(Ewg/wagrac/fe)的△-5去々包和酶的氨基酸和核酸序列，而臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)枮?0/915733(BB1614)(于2007年5月3日提交)的共同擁有的、共同未決的申請(qǐng)公開了來自￡wg/e"a朋"6ae"a的△-5去飽和酶的氨基酸和核酸序列。本發(fā)明涉及從多甲藻屬物種(尸e/^/wwwsp.)CCMP626中鑒定和分離另外的編碼A-5去飽和酶的基因，該基因?qū)⑦m用于在多種宿主生物內(nèi)異源表達(dá)用于生產(chǎn)co-3/co-6脂肪酸。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其包括(a)編碼具有A-5去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中在基于ClustalW比對(duì)方法與SEQIDNO:2中示出的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，該多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的氨基酸同一性；(b)編碼具有A-5去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中在基于BLASTN比對(duì)方法與SEQIDNO:l或SEQIDNO:3中示出的核苷酸序列進(jìn)行比較時(shí)，該核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的序列同一性；(c)編碼具有A-5去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與在SEQIDNO:l或SEQIDNO:3中示出的核苷酸序列雜交；或(d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，其中該互補(bǔ)序列與所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且100%互補(bǔ)。在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重組DNA構(gòu)建體，其包含任何可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的本發(fā)明的分離的多核苷酸。在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在其基因組中包含本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體的細(xì)胞。這種細(xì)胞可以是植物細(xì)胞或酵母細(xì)胞。在第四個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，該方法包括用本發(fā)明的重組構(gòu)建體或本發(fā)明的分離的多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞并選擇用所述重組構(gòu)建體或分離的多核苷酸轉(zhuǎn)化了的那些細(xì)胞。在第五個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在其基因組中包含本發(fā)明重組4。所關(guān)注"還有從i種轉(zhuǎn)基因種子獲得的油或副產(chǎn)品。'、土、在第六個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于在植物細(xì)胞中制備長鏈多不飽和脂肪酸的方法，該方法包括(a)用本發(fā)明的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及(b)選擇制備長鏈多不飽和脂肪酸的那些轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在第七個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于在油料種子植物細(xì)胞中產(chǎn)生至少一種多不飽和脂肪酸的方法，該方法包括(a)用笫一重組DNA構(gòu)建體和至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化油料種子植物細(xì)胞，所述第一重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的編碼至少一種△-5去飽和酶多肽的分離的多核苷酸，所述另外的重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的編碼選自由下列酶組成的組的分離的多核苷酸A-4去飽和酶、A-5去飽和酶、A-6去飽和酶、A-8去飽和酶、A-12去飽和酶、A-15去飽和酶、A-17去飽和酶、A-9去飽和酶、A-9延長酶、CwA6延長酶、016/18延長酶、ds/2。延長酶和C2。/22延長酶；(b)從步驟(a)中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生油料種子植物；以及(c)選擇從步驟(b)的植物獲得的、與從非轉(zhuǎn)化油料種子植物獲得的種子中的多不飽和脂肪酸水平比較時(shí)該水平改變的那些種子。在第八個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在其基因組中包含本發(fā)明的重組構(gòu)建體的油料種子植物。合適的油料種子植物包括但不限于大豆、蕓苔屬(Sra^/ca)物種、向日葵、玉米、棉花、亞麻和紅花。在第九個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及油料種子植物，其包含(a)第一重組DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的編碼至少一種△-5去飽和酶多肽的分離的多核苷酸；以及(b)至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的編碼選自由下列酶組成的組的多肽的分離的多核苷酸A-4去飽和酶、A-5去飽和酶、A-6去飽和酶、A-8去飽和酶、A-12去飽和酶、A-15去飽和酶、A-17去飽和酶、A-9去飽和酶、A-9延長酶、(:14/16延長酶、Q6A8延長酶、C18/2Q延長酶和C，22延長酶。轉(zhuǎn)基因種子獲得的油和副產(chǎn)品。優(yōu)選的副產(chǎn)曰品是^磷脂。、、在第十個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及摻入了本發(fā)明的油或種子的食物或飼料，或包含源于對(duì)種子進(jìn)行加工的成分的食物或飼料。在第十一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及從通過本發(fā)明方法制備的植物或本發(fā)明的油料種子植物獲得的后代植物。和序列表圖1示出了co-3/oo-6脂肪酸的生物合成途徑。圖2示出了如實(shí)施例1中描述的多甲藻屬物種CCMP626細(xì)胞提取物的脂質(zhì)概況的色譜圖。圖3示出了采用ClustalW分析方法(DNASTAR軟件中的MegAligiT程序)的A-5去飽和酶蛋白質(zhì)和A-8去飽和酶蛋白質(zhì)之間和之中的比對(duì)的一部分。圖4用圖示說明了SEQIDNo:1、2、4、5、6、8和10之間的關(guān)系，其中每一個(gè)序列都與多曱藻屬物種CCMP626A-5去飽和酶相關(guān)。圖5A示出了用于擴(kuò)增多甲藻屬物種CCMP626A-5去飽和酶基因(RD5)的克隆策略。圖5B為pZUF17的質(zhì)粒圖譜，而圖5C為pDMW368的質(zhì)粒圖鐠。圖6提供了下列質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜(A)pKUNF12T6E;(B)pRD5S;和(C)pZURD5S。圖7A和7B示出了多曱藻屬物種CCMP626△-5去飽和酶基因的DNA序列(稱為"RD5";SEQIDN0:1)與經(jīng)密碼子最優(yōu)化以用于在解脂耶氏酵母(I^rowzaZ^o"ca)中表達(dá)的合成基因的DNA序列(稱為"RD5S，，；SEQIDNO:3)的比4交。圖8A和8B示出了路氏巴夫藻(尸"v/ova/wf/zen')A-8去飽和酶(SEQIDNO:18)、鹽生巴夫藻(尸av/m;a^//朋)A-8去飽和酶(SEQID.NO:66)、小目艮蟲A-8去飽和酶(SEQIDNO:16)以及兩種不同的葡枝根霉(i/nzo;myWo/om/er)A-6脂肪酸去飽和酶(SEQIDNO:53和65)之間的ClustalV比對(duì)(使用默認(rèn)參數(shù))。圖9提供了PY98的質(zhì)粒圖譜。圖10A提供了表達(dá)pY98(SEQIDNO:76;包含稱作"MaD5"的高山被孢霉(A/o^we〃aa/;/加)△-5去飽和酶基因)或pDMW368(SEQIDNO:23;包含稱作"RD5"的多曱藻屬物種CCMP626A-5去飽和酶基因)并供給多種底物的解脂耶氏酵母的脂肪酸概況。圖10B提供了MaD5與RD5之間的co-3和co-6底物特異性的比較。圖11提供了下列質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜(A)pKR916、(B)pKR1038和(C)pKR328。圖12A提供了當(dāng)高山被孢霉酶(MaD5)轉(zhuǎn)化進(jìn)大豆胚時(shí)具有最高A-5去飽和酶活性的10次事件的平均脂肪酸概況。圖12B提供了當(dāng)多曱藻屬物種CCMP626酶(RD5)轉(zhuǎn)化進(jìn)大豆胚時(shí)具有最高△-5去飽和酶活性的10次事件的平均脂肪酸概況。脂肪酸被鑒定為16:0(椋櫚酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、SCI、DGLA、ARA、ERA、JUP、ETA和EPA。列為"其它"的脂肪酸包括18:2(5,9)、GLA、STA、20:0、20:1(11)、20:2(7,11)或20:2(8,11)和DPA。這些"其它，，脂肪酸中的每一種都以小于總脂肪酸的3.0%的相對(duì)豐度存在。個(gè)別胚的脂肪酸組成表示為總脂肪酸的重量百分比(重量％)，而平均脂肪酸組成是每一事件中6個(gè)個(gè)別胚的平均值。圖13提供了A-5去飽和酶對(duì)"正確"底物(即DGLA和ETA)和"錯(cuò)誤"底物(即EDA和ERA)的活性。對(duì)于MaD5(參見圖12A)或RD5(參見圖12B)，A-5去飽和酶對(duì)"正確，，底物的活性("正確Q/oA-5去飽和")繪制在x-軸上，而A-5去飽和酶對(duì)"錯(cuò)誤"底物的活性("錯(cuò)誤％^-5去飽和，，)繪制在y-軸上。根據(jù)下面的詳細(xì)描述和附帶的序列描述可以更充分地理解本發(fā)明，下面的詳細(xì)描述和附帶的序列描述形成了本申請(qǐng)的一部分。下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825("對(duì)含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公開內(nèi)容的專利申請(qǐng)的要求-序列規(guī)則，，("RequirementsforPatentApplicationsContainingNuceotideSequencesand/orAminoAcidS叫麗ceDisclosures-theS叫uenceRules")),并且符合世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WorldIntellectualPropertyOrganization,WIPO)ST.25標(biāo)準(zhǔn)(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(規(guī)則5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(AdministrativeInstructions)的208節(jié)和附錄C)。用于核普酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循在37C.F.R.§1.822中列出的規(guī)則。SEQIDNo.l-26、50、51、53-56、63-72和75-76是編碼基因或蛋白質(zhì)(或其部分)的ORF或質(zhì)粒，如表l中所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>小眼蟲△-8去飽和酶(PCT專利公開No.WO2006/012325和No.WO2006/012326)"16(421AA)路氏巴夫藻(CCMP459)A-8去飽和酶17(1269bp)18(423AA)保守區(qū)1—19(7AA)保守區(qū)2—20(7AA)假微型海鏈藻(77/cz/aw/ow>a;wra^"a"a)A-8鞘脂去飽和酶(GenBank登錄號(hào)AAX14502)—21(476AA)質(zhì)粒pZUF1722(8165bp)—質(zhì)粒pDMW36823(84織p)—質(zhì)粒pKUNF12T6E24(12,649bp)—來源于金黃色破囊壺菌(77raw加c一r/歸awre歸)(美國專利6,677,145)的、經(jīng)密碼子最優(yōu)化以用于在解脂耶氏酵母表達(dá)的合成的(:18/2()延長酶基因("EL2S")25(819bp)26(272AA)質(zhì)粒pRD5S50(4H2bp)—質(zhì)粒pZURD5S51C8480bp)—葡枝根霉△-6脂肪酸去飽和酶(NCBI登錄號(hào)AAX22052)—53(459AA)路氏巴夫藻A-8去飽和酶—來自epslc.pk002.f22克隆的cDNA插入片段的部分(cDNA插入片段的5'端)54(695bp)—路氏巴夫藻△-8去飽和酶-完整測序的ESTepslc.pk002.f22:fis(完整插入序列)55(1106bp)—路氏巴夫藻△-8去飽和酶-完整測序的ESTepslc.pk002.f22:fis(完整插入序列;SEQIDNO:55)的核苷酸1-864的翻i奪56(287AA)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>質(zhì)粒pKR19784(4359bp)—質(zhì)粒pKR91185(5147bp)—質(zhì)粒pKR68086(6559bp)—質(zhì)粒pKR91387(9014bp)—質(zhì)粒pKR76788(5561bp)—質(zhì)粒pKR91689(11,889bp)—質(zhì)粒pKR97490(5661bp)—異絲水霉(Sa/ro/eg"za)△-5去飽和酶("SdD5，，)91(1413bp)—質(zhì)粒pKR103392(5621bp)—質(zhì)粒pKR103893(11,949bp)—質(zhì)粒pKR32894(8671bp)—SEQIDNO:27-29分別對(duì)應(yīng)AP引物、SmartIV寡核苦酸引物和CDSIII5'引物，用于多甲藻屬物種CCMP626cDNA的合成。SEQIDNO:30-33分別對(duì)應(yīng)編碼保守區(qū)1的簡并寡核苷酸引物5-lA、5-lB、5-1C和5畫1D。SEQIDNO:34-37分別對(duì)應(yīng)編碼保守區(qū)2的簡并寡核苷酸引物5-4AR、5國4BR、5國4CR和5-4DR。SEQIDNO:38國42分別對(duì)應(yīng)引物ODMW520、ODMW521、DNRCDS5'、ODMW541和ODMW542，用于5'RACE。SEQIDNO:43-45分別對(duì)應(yīng)引物ODMW523、AUAP和ODMW524，用于3'RACE。SEQIDNO:46-49分別對(duì)應(yīng)引物YL807、YL810、YL808和YL809，用于擴(kuò)增RD5的全長cDNA。SEQIDNO:52對(duì)應(yīng)引物T7,用于對(duì)路氏巴夫藻(CCMP459)cDNA文庫進(jìn)行測序。SEQIDNO:57和58分別對(duì)應(yīng)引物SeqE和S叫W,用于對(duì)路氏巴夫藻(CCMP459)克隆進(jìn)行測序。SEQIDNO:59和60分別對(duì)應(yīng)通用引物API和引物GSPPvDES,用于擴(kuò)增路氏巴夫藻(CCMP459)基因組DNA。SEQIDNO:61和62分別對(duì)應(yīng)引物M13-28Rev和PavDESs叫，用于對(duì)路氏巴夫藻(CCMP459)基因組插入片段進(jìn)行測序。SEQIDNO:73和74分別對(duì)應(yīng)引物GPDsense和GPDantisense,用于擴(kuò)增GPD啟動(dòng)子。SEQIDNO:79和80分別對(duì)應(yīng)引物oEugELl-l和oEugELl-2，用于擴(kuò)增小眼蟲A-9延長酶(EgD9e)。具體實(shí)施例方式本文所引用的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物均以引用的方式將其全文并入本文。這具體包括如下申請(qǐng)人的受讓人共同未決的申請(qǐng)美國專利7,125,672、美國專利7,189,559、美國專利7,192,762、美國專利7,198,937、美國專利7,202，356、美國專利申請(qǐng)No.10/840579和No,10/840325(提交于2004年5月6日)、美國專利申請(qǐng)No.10/869630(提交于2004年6月16日)、美國專利申請(qǐng)No.lO/882760(提交于2004年7月1日)、美國專利申請(qǐng)No.10/985254和No.10/985691(提交于2004年11月10日)、美國專利申請(qǐng)No.11/024544(提交于2004年12月29日)、美國專利申請(qǐng)No.11/166993(提交于2005年6月24日)、美國專利申請(qǐng)No.11/183664(提交于2005年7月18日)、美國專利申請(qǐng)No.ll/185301(提交于2005年7月20日)、美國專利申請(qǐng)No.ll/190750(提交于2005年7月27日)、美國專利申請(qǐng)No.ll/198975(提交于2005年8月8日)、美國專利申請(qǐng)No.ll/225354(提交于2005年9月13日)、美國專利申請(qǐng)No.l1/253882(提交于2005年10月19日)、美國專利申請(qǐng)No.11/264784和11/264737(提交于2005年11月1日)、美國專利申請(qǐng)No.11/265761(提交于2005年11月2日)、美國專利申請(qǐng)No.11/737,772(提交于2007年4月20日)、美國專利申請(qǐng)No.ll/787,772(提交于2007年4月17日)、美國專利申請(qǐng)No.11/740,298(提交于2007年4月26日)、美國專利申請(qǐng)No.60/801172和No.60/801119(提交于2006年5月17日)、美國專利申請(qǐng)No.60/853563(提交于2006年10月23日)、美國專利申請(qǐng)No.60/855177(提交于2006年10月30日)、美國專利申請(qǐng)No.11/601563和11/601564(提交于2006年11月16日)、美國專利申請(qǐng)No.11/635258(提交于2006年12月7日)、美國專利申請(qǐng)No.ll/613420(提交于2006年12月20日)、美國專利申請(qǐng)No.60/909790(提交于2007年4月3日)、美國專利申請(qǐng)No.60/911925(提交于2007年4月16日)、美國專利申請(qǐng)No.60/910831(提交于2007年4月10日)和美國專利申請(qǐng)No.60/915733(BB1614)(提交于2007年5月3日)。還另外包括如下申請(qǐng)人的受讓人共同未決的申請(qǐng)涉及在植物中產(chǎn)生PUFA的PCT專利公開No.US2004/0172682;以及涉及膜聯(lián)蛋白啟動(dòng)子及它們在植物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)中的用途的美國專利No.7,129,089。如本文使用的和在附帶權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，提及"一種植物"時(shí)是包括多種這樣的植物，提及"一個(gè)細(xì)胞"時(shí)是包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞及其為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等價(jià)物等等。根據(jù)本發(fā)明，申請(qǐng)人鑒定了新的多甲藻屬物種CCMP626厶-5去飽和酶和編碼該酶的基因，該酶和編碼該酶的基因可用于操縱產(chǎn)生有益于健康的PUFA的生化途徑。因此，本發(fā)明有許多應(yīng)用。通過本文所公開的方法學(xué)制備的PUFA或其衍生物可用作膳食替代品或補(bǔ)充劑，尤其是嬰兒代乳品(formula),可用于接受靜脈內(nèi)營養(yǎng)法的病人或用來預(yù)防或治療營養(yǎng)不良。備選地，可以將純化的PUFA(或其衍生物)摻入食用油、脂肪或調(diào)配的人造黃油中，以便食用者在正常使用中將獲得所需量的膳食補(bǔ)充。PUFA還可以摻入嬰兒代乳品、營養(yǎng)補(bǔ)充劑或其它食品中，并且可用作抗炎或降膽固醇試劑。任選地，該組合物可以用于藥用(人藥或獸藥)。給人或動(dòng)物補(bǔ)充以重組手l殳產(chǎn)生的PUFA可導(dǎo)致加入的PUFA以及它們的代謝物的水平升高。例如，用EPA處理不但可以導(dǎo)致EPA的水平升高，而且還可以導(dǎo)致EPA的下游產(chǎn)物如類二十烷酸(即前列腺素、白細(xì)胞三烯和血栓素)的水平升高。復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制使得期望組合多種PUFA或者添加不同的PUFA綴合物，以預(yù)防、控制或克服這種機(jī)制來在個(gè)體中實(shí)現(xiàn)所需水平的特定PUFA。定義在本公開中，使用了大量術(shù)語和縮寫。給出了如下定義。"可讀框"縮寫為ORF。"聚合酶鏈反應(yīng)"縮寫為PCR。"美國典型培養(yǎng)物保藏中心"縮寫為ATCC。"多不飽和脂肪酸"縮寫為PUFA。"三?；视?縮寫為TAG。如本文所用的，術(shù)語"發(fā)明"或"本發(fā)明"無意于局限于本發(fā)明的任一具體實(shí)施方案，而是在一般情況下適用于如權(quán)利要求和說明書中所描述的本發(fā)明的任何實(shí)施方案和所有實(shí)施方案。術(shù)語"脂肪酸"指各種鏈長的長鏈脂族酸(鏈烷酸)，鏈長大約為Cu至C22(盡管更長和更短鏈長的酸兩者都是已知的)。主要的鏈長在。16和。22之間。脂肪酸的結(jié)構(gòu)可用簡單的記號(hào)系統(tǒng)"X:Y"來表示，其中X表示具體脂肪酸中碳(C)原子的總數(shù)，且Y表示雙鍵的數(shù)目。另外的關(guān)于"飽和脂肪酸"與"不飽和脂肪酸"、"單不飽和脂肪酸"與"多不飽和脂肪酸"(或"PUFA")以及"oo-6脂肪酸，，(co-6或n-6)與"co-3月旨肪S臾"(00-3或n-3)之間的區(qū)別的詳細(xì)信息在美國專利公開No.2005/0136519中有提供。脂肪酸在本文中用簡單的記號(hào)系統(tǒng)"X:Y"表示，其中X表示具體脂肪酸中碳(C)原子的數(shù)目，且Y表示雙鍵的數(shù)目。脂肪酸名稱后面的數(shù)字表示從脂肪酸羧基端計(jì)數(shù)的雙鍵的位置，其中詞綴"c"表示雙鍵的順式-構(gòu)型(如棕櫚酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:l,9c)、巖芽酸(18:1,6c)、LA(18:2,9c,12c)、GLA(18:3,6c,9c,12c)和ALA(18:3,9c,12c,15c))。除非另外說明，否則18:1、18:2和18:3分別指油酸、LA和ALA脂肪酸。如果沒有另外明確地寫明，則雙鍵被認(rèn)為是順式構(gòu)型的。例如，18:2(9,12)中的雙鍵將被認(rèn)為是順式構(gòu)型。在本公開內(nèi)容中用于描述PUFA的命名在下面的表2中示出。在標(biāo)題為"簡化符號(hào)"一欄中，co-指代系統(tǒng)用于表明碳數(shù)目、雙鍵的數(shù)目和最接近CO碳的雙鍵位置，雙鍵位置的計(jì)數(shù)從CO碳開始(為此CO碳的編號(hào)為1)。該表的其余部分匯總了oo-3和co-6脂肪酸及其前體的俗名、將在整個(gè)說明書中使用的縮寫以及每種化合物的化學(xué)名稱。表2多不飽和脂肪酸及其前體的命名法<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>術(shù)語"三酰基甘油"、"油"和"TAG"指由與甘油分子酯化的三個(gè)脂肪酰殘基組成的中性脂質(zhì)(并且這些術(shù)語在本公開內(nèi)容中將可以互換使用)。這些油可含有長鏈PUFA以及較短的飽和的和不飽和的脂肪酸以及較長鏈的飽和脂肪酸。因而，"油的生物合成"一般指細(xì)胞中TAG的合成。"總脂質(zhì)和油級(jí)分中的PUFA百分比(％)，，指PUFA相對(duì)于在那些級(jí)分中的總脂肪酸的百分比。術(shù)語"總脂質(zhì)級(jí)分，，或"脂質(zhì)級(jí)分"兩者均指含油生物內(nèi)所有脂質(zhì)(即中性和極性脂質(zhì))的總和，因此包括位于磷脂酰膽堿(PC)級(jí)分、磷脂酰乙醇胺(PE)級(jí)分和三酰基甘油(TAG或油)級(jí)分中的那些脂質(zhì)。然而，術(shù)語"脂質(zhì)，，和"油"將可在整個(gè)說明書中互換使用。代謝途徑或生物合成途徑在生物化學(xué)意義上可以認(rèn)為是發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)由酶催化的一系列化學(xué)反應(yīng)，用以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞待使用的或待貝er存的代謝產(chǎn)物的形成，或啟動(dòng)另一代謝途徑(因而稱作流量產(chǎn)生步驟)。很多此類途徑都很精細(xì)，并涉及對(duì)起始物質(zhì)的逐步修飾以使之形成具有期望的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。術(shù)語"PUFA生物合成途徑"指將油酸轉(zhuǎn)化成LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的代謝過程。該過程在文獻(xiàn)中已有很好的描述(如參見PCT公開No.WO2006/052870)。簡而言之，該過程涉及通過添加石友原子來延長石灰鏈和通過加入雙鍵來使分子去飽和，這通過存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)的一系列特異性去飽和酶和延長酶(即"PUFA生物合成途徑酶")進(jìn)行。更具體地講，"PUFA生物合成途徑酶"指如下與PUFA生物合成相關(guān)的任何酶(以及編碼該酶的基因)，包括A-4去飽和酶、A-5去飽和酶、A-6去飽和酶、A-12去飽和酶、A-15去飽和酶、A-17去飽和酶、A-9去飽和酶、A-8去飽和酶、A-9延長酶、CwA6延長酶、C!6A8延長酶、C比/20延長酶和/或C2Q/22延長酶。術(shù)語"w-3/00-6脂肪酸生物合成途徑"指在合適條件下表達(dá)時(shí)編碼催化w-3和co-6脂肪酸二者之一或兩者產(chǎn)生的酶的一組基因。通常，參與co-3/oo-6脂肪酸生物合成途徑的基因編碼PUFA生物合成途徑酶。圖1示出了一條代表性途徑，提供了從肉豆蔻酸經(jīng)過多種中間產(chǎn)物向DHA的轉(zhuǎn)化，演示了co-3和co-6脂肪酸兩者是如何可以從共同來源產(chǎn)生。自然，該途徑分成兩部分，其中一部分將產(chǎn)生co-3脂肪酸而另一部分只產(chǎn)生oo-6脂肪酸。只產(chǎn)生w-3脂肪酸的部分在本文中將稱作co-3脂肪酸生物合成途徑，而只產(chǎn)生co-6脂肪酸的部分在本文中將稱作co-6脂肪酸生物合成途徑。如本文中關(guān)于w-3/co-6脂肪酸生物合成途徑所用的，術(shù)語"功能性的"指該途徑中的一些(或全部)基因表達(dá)活性酶，導(dǎo)致體內(nèi)催化或底物轉(zhuǎn)化。應(yīng)該了解，"oo-3/co-6脂肪酸生物合成途徑"或"功能性co-3/oo-6脂肪酸生物合成途徑"并不意味著上面段落中列出的所有基因都是必需的，因?yàn)樵S多脂肪酸產(chǎn)物將僅需要表達(dá)該途徑中的一亞組基因。術(shù)語"A-6去飽和酶/A-6延長酶途徑"將指最低程度包括至少一種A-6去飽和酶和至少一種ds/2o延長酶的PUFA生物合成途徑，從而使得能分別從LA和ALA開始，以GLA和/或STA作為脂肪酸中間產(chǎn)物生物合成DGLA和/或ETA。通過其它去飽和酶和延長酶的表達(dá)，還可以合成ARA、EPA、DPA和DHA。術(shù)語"A-9延長酶/A-8去飽和酶途徑"將指最低程度包括至少一種A-9延長酶和至少一種A-8去飽和酶的PUFA生物合成途徑，從而使得能分別從LA和ALA開始，以EDA和/或ETrA作為脂肪酸中間產(chǎn)物生物合成DGLA和/或ETA。通過其它去飽和酶和延長酶的表達(dá)，還可以合成ARA、EPA、DPA和DHA。術(shù)語"脂肪酸中間產(chǎn)物"指在脂肪酸代謝途徑中產(chǎn)生的任何脂肪酸，其可以通過其它代謝途徑酶的作用進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成本途徑的目的脂肪酸產(chǎn)物。例如，當(dāng)利用A-9延長酶/A-8去飽和酶途徑產(chǎn)生EPA時(shí)，可以產(chǎn)生EDA、ETrA、DGLA、ETA和ARA并祐_認(rèn)為是"脂肪酸中間產(chǎn)物，，，因?yàn)檫@些脂肪酸可通過其它代謝途徑酶的作用進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成EPA。術(shù)語"脂肪酸副產(chǎn)物"指在脂肪酸代謝途徑中產(chǎn)生的既非該途徑的目的脂肪酸產(chǎn)物又非該途徑的"脂肪酸中間產(chǎn)物，，的任何脂肪酸。例如，當(dāng)利用△-9延長酶/△-8去飽和酶途徑產(chǎn)生EPA時(shí)，sciadonicacid(SCI)和juniperonicacid(JUP)也可通過A-5去飽和酶分別作用于EDA或ETrA而產(chǎn)生。它們被認(rèn)為是"脂肪酸副產(chǎn)物"，因?yàn)閮烧呔荒芡ㄟ^其它代謝途徑酶的作用進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成EPA。術(shù)語"去飽和酶"指可以在一種或多種脂肪酸中去飽和(即引入雙鍵)而產(chǎn)生所關(guān)注的脂肪酸或前體的多肽。盡管在整個(gè)說明書中使用oo-指代系統(tǒng)來指代特定的脂肪酸，但使用A-系統(tǒng)從底物的羧基端計(jì)數(shù)來表示去飽和酶的活性更方便。本文特別關(guān)注的是催化DGLA轉(zhuǎn)化成ARA和/或催化ETA轉(zhuǎn)化成EPA的△-5去飽和酶。其它去飽和酶包括l.)使脂肪酸在從該分子的羧基末端計(jì)數(shù)的第17和第18個(gè)碳原子之間去飽和并且(例如)催化ARA轉(zhuǎn)化成EPA和/或催化DGLA轉(zhuǎn)化成ETA的△-17去飽和酶；2.)催化LA轉(zhuǎn)化成GLA和/或催化ALA轉(zhuǎn)化成STA的A-6去飽和酶；3.)催化油酸轉(zhuǎn)化成LA的A-12去飽和酶；5.)催化DPA轉(zhuǎn)化成DHA的△-4去飽和酶；6.)催化EDA轉(zhuǎn)化成DGLA和/或催化ETrA轉(zhuǎn)化成ETA的△-8去飽和酶；和7.)催化棕櫚酸轉(zhuǎn)化成棕櫚油酸(16:1)和/或催化硬脂酸轉(zhuǎn)化成油酸的A-9去飽和酶。在本領(lǐng)域中，基于A-15和A-17去飽和酶將co-6脂肪酸轉(zhuǎn)化成它們的co-3對(duì)應(yīng)物的能力(如分別將LA轉(zhuǎn)化成ALA和將ARA轉(zhuǎn)化成EPA),偶爾也將它們稱作"oo-3去飽和酶"、"w-3去飽和酶"和/或"oo-3去飽和酶"。在一些實(shí)施方案中，最理想的是，通過用脂肪酸去飽和酶的基因轉(zhuǎn)化合適的宿主并測定它對(duì)該宿主脂肪酸概況的作用來經(jīng)驗(yàn)性地測定特定脂肪酸去飽和酶的特異性。術(shù)語"A-5去飽和酶"指使脂肪酸在從該分子羧基末端計(jì)數(shù)的第五個(gè)和第六個(gè)碳原子之間去飽和的酶。優(yōu)選地，^-5去飽和酶將二高-Y-亞麻酸[20:3，DGLA]轉(zhuǎn)化成花生四烯酸[20:4,ARA]或?qū)⒍妓南┧醄20:4，ETA]轉(zhuǎn)化成二十碳五烯酸[20:5,EPA]。就本文的目的而言，術(shù)語"RD5"指由本文中的SEQIDN0:1編碼的分離自多甲藻屬物種CCMP626的A-5去飽和酶(SEQIDN0:2)。類似地，術(shù)語"RD5S，，指來源于多曱藻屬物種CCMP626的經(jīng)密碼子最優(yōu)化以用于在解脂耶氏酵母中表達(dá)的合成的A-5去飽和酶(即SEQIDN0:3和2)。術(shù)語"轉(zhuǎn)換效率"和"底物轉(zhuǎn)換百分比"指特定酶(如去飽和酶)能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化成產(chǎn)物的效率。轉(zhuǎn)換效率根據(jù)下面的公式測量([產(chǎn)物]/[底物+產(chǎn)物])xi00,其中"產(chǎn)物"包括中間產(chǎn)物和該途徑中來源于它的所有產(chǎn)物。術(shù)語"延長酶，，指能延長脂肪酸碳鏈從而產(chǎn)生比該延長酶作用在其上的脂肪酸底物長2個(gè)碳原子的酸的多肽。該延長過程在與脂肪酸合酶相關(guān)的多步驟機(jī)制中發(fā)生，如在美國專利公開No.2005/0132442和PCT公開No.WO2005/047480中所描述的。由延長酶體系催化的反應(yīng)的實(shí)例是將GLA轉(zhuǎn)化成DGLA、將STA轉(zhuǎn)化成ETA和將EPA轉(zhuǎn)換成DPA。通常，延長酶的底物選擇性有些廣泛，但由鏈長度和不飽和的程度及類型兩者來區(qū)分。例如，(:14/16延長酶將會(huì)利用014底物(如肉豆蔻酸)，016/18延長酶將會(huì)利用C16底物(如棕櫚酸)，ds/2。延長酶(又稱為A-6延長酶，兩個(gè)術(shù)語可以互換使用)將利用C18底物(如GLA和STA),而C2o,22延長酶將利用C加底物(如EPA)。以類似方式，△-9延長酶能夠催化LA和ALA分別轉(zhuǎn)化成EDA和ETrA。重要的是，須注意一些延長酶具有廣泛的特異性并因而單個(gè)延長酶可能能催化幾種延長酶反應(yīng)(如，從而既可作為d6A8延長酶，又可作為Cl8/20延長酶)。術(shù)語"含油的"指那些趨于以脂質(zhì)形式貯存它們的能源的生物(Weete,FungalLipidBiochemistry,第二版,Plenum,1980)。術(shù)語"含油酵母"指那些能夠產(chǎn)油并被歸類為酵母的微生物。通常，含油微生物的細(xì)胞油或TAG含量符合S形曲線，其中脂質(zhì)濃度增加直至在晚對(duì)數(shù)生長期或早穩(wěn)定生長期時(shí)它達(dá)到最高濃度，隨后在晚穩(wěn)定生長期和死亡期期間逐漸下降(Yongmanitchai和Ward,Appl.Environ.Microbiol.，57:419-25(1991))。含油微生物積累油超過它們的干細(xì)胞重量的約25%的情形并不鮮見。含油酵母的實(shí)例包括但不限于如下屬耶氏酵母屬(K^rawa)、假絲酵母屬(QmA*)、紅酵母屬(A/zc^oforw/a)、紅冬孢屬(W/zodo^on^i/m)、隱球酵母屬(C，tococ譜)、絲孢酵母屬(7Wc/zo，謂)和油月旨酵母屬(myces)。術(shù)語"保守氨基酸置換"指將給定蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基用另一種氨基酸置換，而不改變該蛋白質(zhì)的化學(xué)或功能性質(zhì)。例如，在本領(lǐng)域中熟知，導(dǎo)致在給定位點(diǎn)產(chǎn)生化學(xué)等價(jià)的氨基酸(但不影響所編碼、折疊蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性)的基因改變是常見的。為了本發(fā)明目的，將"保守氨基酸置換，，定義為如下五組中的一組內(nèi)的互換1.小的脂族非極性或有輕微極性的殘基Ala[A]、Ser[S]、Thr[T](Pro[P]、Gly[G]);2.極性帶負(fù)電荷殘基和它們的酰胺Asp[D]、Asn[N]、Glu[E]、Gln[Q];3.極性帶正電荷殘基His[H]、Arg[R]、Lys[K〗；4.大的脂族非極性殘基Met[M]、Leu[L]、Ile[I]、Val[V](Cys[C]);和5.大的芳族殘基Phe[F]、Tyr[Y]和Trp[W]。保守氨基酸置換通常保持1)置換區(qū)內(nèi)多肽主鏈的結(jié)構(gòu)；2)分子在靶位點(diǎn)處的電荷或疏水性；或3)側(cè)鏈體積。此外，在許多情形中，改變蛋白質(zhì)分子的N-末端和C-末端部分也將預(yù)計(jì)不會(huì)改變蛋白質(zhì)的活性。如本文所用的，"核酸"意指多核苷酸并包括單鏈或雙鏈的脫氧核糖核普酸或核糖核普酸堿基聚合物。核酸也可以包括片段和經(jīng)修飾的核苷酸。因此，術(shù)語"多核香酸"、"核酸序列"、"核苷酸序列"或"核酸片段"可互換使用，并且是作為單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。核苷酸(通常以它們的5'單磷酸形式存在)可以用如下它們的單個(gè)字母名稱指代"A"表示腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別針對(duì)RNA或DNA)，"C"表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，"G"表示鳥苷酸或脫氧鳥香酸，"U"表示尿苷酸，"T'，表示脫氧胸苷酸，"R"表示噤呤(A或G)，"Y"表示嘧啶(C或T)，"K"表示G或T，"H，，表示A或C或T,'T，表示肌普，"N"表示任何核苷酸。術(shù)語"在功能上等價(jià)的亞片段，，和"功能等價(jià)的亞片段"在本文中可互換使用。這些術(shù)語指分離的核酸片段的一部分或子序列，其中無論所述片段或亞片段是否編碼活性酶，其都保留有改變基因表達(dá)或產(chǎn)生某些表型的能力。例如，所述片段或亞片段可用于設(shè)計(jì)嵌合基因以在轉(zhuǎn)化的植物中產(chǎn)生理想的表型。通過將核酸片段或其亞片段(無論它是否編碼活性酶)以相對(duì)于植物啟動(dòng)子序列的有義或反義的方向連接，可以設(shè)計(jì)嵌合基因用于抑制作用。術(shù)語"保守結(jié)構(gòu)域，，或"基序"意指進(jìn)化上相關(guān)的蛋白質(zhì)的比對(duì)序列上在特定位置處保守的一組氨基酸。雖然同源蛋白質(zhì)之間在其它位置的氨基酸可以發(fā)生變化，但在特定位置高度保守的氨基酸表示對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或活性來說是必需的氨基酸。因?yàn)樗鼈兺ㄟ^它們在蛋白質(zhì)同源物家族的比對(duì)序列中的高度保守來鑒定，所以它們可用作識(shí)別標(biāo)記或"簽名，，來確定具有新測定序列的蛋白質(zhì)是否屬于以前鑒定的蛋白質(zhì)家族。術(shù)語"同源"、"同源的"、"基本相似的"和"基本對(duì)應(yīng)的"在本文中可互換使用。它們指這樣的核酸片段，即其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基改變并不會(huì)影響該核酸片段介導(dǎo)基因表達(dá)或產(chǎn)生某種表型的能力。這些術(shù)語也指本發(fā)明的核酸片段的修飾(例如缺失或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸)，相對(duì)于初始的未經(jīng)修飾的核酸片段，所述修飾基本上不會(huì)改變所得核酸片段的功能特性。因此正如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的，本發(fā)明涵蓋的不僅僅是具體的示例性序列。此外，技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明所涵蓋的基本相似的核酸序列也通過它們(在中等嚴(yán)格條件如0.5xSSC，0.1%SDS,60。C下，)與本文所示例的序列雜交的能力，或雜交至本文所公開的核普酸序列的任何部分和與本文所公開的任何核酸序列功能等價(jià)的序列的能力所限定。可以調(diào)節(jié)嚴(yán)格性條件以篩選中度相似的片段(例如來自遠(yuǎn)緣生物的同源序列)，到篩選高度相似的片段(例如從近緣生物復(fù)制功能性酶的基因)。雜交后的洗滌可確定嚴(yán)格條件。術(shù)語"選擇性雜交"包括指在嚴(yán)格雜交條件下，核酸序列與特定核酸把序列以比其與非粑核酸序列的雜交更高的可檢測程度(如，至少兩倍于背景)雜交，并指基本排除了非靶核酸序列。選擇性雜交的序列通常彼此具有約至少80%的序列同一性，或90%的序列同一性，最多并包括100%的序列同一性(即完全互補(bǔ))。術(shù)語"嚴(yán)格條件"或"嚴(yán)格雜交條件"包括指探針將選擇性雜交至其靶序列的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，并將因不同的環(huán)境而異。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可鑒定與探針100%互補(bǔ)的耙序列(同源探測)。作為另一種選擇，可調(diào)節(jié)嚴(yán)格條件以允許序列中的一些錯(cuò)配，以便檢測到更低程度的相似性(異源探測)。通常，探針的長度少于約1000個(gè)核苷酸，任選長度少于500個(gè)核苷酸。一般地，嚴(yán)格條件將是如下那些條件在pH7.0-8.3下鹽濃度低于約1.5M鈉離子，通常約0.01-1.OM鈉離子濃度(或其它鹽)，并且對(duì)于短探針(如10-50個(gè)核苷酸)溫度為至少約3(TC而對(duì)于長的探針(如多于50個(gè)核苷酸)溫度為至少約60°C。嚴(yán)格條件也可以通過加入諸如甲酰胺之類的去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)。示例性的低嚴(yán)格條件包括在37。C下于含30-35%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖液中雜交，以及在50-55。C下用lx至2xSSC(20xSSC=3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)洗滌。示例性的中等嚴(yán)格條件包括在37。C下于40-45%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中雜交，以及在55-60。C下用0.5x至lxSSC洗滌。示例性的高嚴(yán)格條件包括在37。C下于50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS中雜交，以及在60-65。C下用0.1xSSC洗滌。特異性通常取決于雜交后洗滌，最后的洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度是關(guān)鍵因素。對(duì)于DNA-DNA雜交體，Tm可以用Meinkoth等人，Anal.Biochem.138:267-284(1984)中的等式估算:Tm=81.5°C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L;其中M是單價(jià)陽離子的體積摩爾濃度，％GC是DNA中鳥苷和胞嘧咬核苦酸的百分比，。/oform是雜交溶液中甲酰胺的百分比，而L是以堿基對(duì)表示的雜交體的長度。Tm指(在確定的離子強(qiáng)度和pH下)50%的互補(bǔ)靼序列與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度。每出現(xiàn)1%的錯(cuò)配，Tm降低約rC;因此，可調(diào)節(jié)Tm、雜交和/或洗滌條件以與具有期望同一性的序列雜交。例如，如果要尋求具有>90%同一性的序列，則可將Tm降低10。C。通常，在確定的離子強(qiáng)度和pH下，嚴(yán)格條件選擇為比特定序列及其互補(bǔ)序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C。然而，極嚴(yán)格條件可采用在比熱解鏈溫度(Tm)低1、2、3或4。C下雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可采26用在比熱解鏈溫度(Tm)低6、7、8、9或1(TC下雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可采用在比熱解鏈溫度(Tm)低11、12、13、14、15或20。C下雜交和/或洗滌。利用所述等式、雜交和洗滌組合物以及理想的Tm,一般技術(shù)人員將會(huì)理解，雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格性的變化已經(jīng)在本質(zhì)上得以描述。如果所需的錯(cuò)配程度導(dǎo)致Tm低于45°C(水溶液)或32°C(甲酰胺溶液)，則優(yōu)選增加SSC的濃度以便能使用更高的溫度。對(duì)核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可在以下文獻(xiàn)中找到Tijssen,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分,第2章"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays",Elsevier,NewYork(1993);以及CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2章，Ausubel等人編輯,GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1995)。雜交和/或洗滌條件可進(jìn)行至少10、30、60、90、120或240分鐘。氨基酸或核苷酸序列的"基本部分"指這樣的部分，該部分包含的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通過推定而鑒定所述多肽或基因，所述鑒定或者可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過人工評(píng)價(jià)序列來完成，或者可以利用諸如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool;Altschul,S.F.等人，J.Mol.Biol.,215:403-410(1993))之類的算法通過計(jì)算機(jī)自動(dòng)化序列比較和鑒定來完成。通常，為了推測鑒定多肽或核酸序列是否與已知的蛋白質(zhì)或基因同源，需要有IO個(gè)或更多鄰接氨基酸或者30個(gè)或更多核苷酸的序列。此外，就核苷酸序列而言，包含20-30個(gè)鄰接核苷酸的基因特異性寡核普酸探針可以用于序列依賴性的基因鑒定(如DNA雜交)和基因分離(如細(xì)菌菌落或噬菌體斑的原位雜交)方法。此外，12-15個(gè)堿基的短寡核普酸可在PCR中用作擴(kuò)增引物以獲得包含該引物的特定核酸片段。因此，核苦酸序列的"基本部分"包含的序列足以特異性地鑒定和/或分離包含該序列的核酸片段。本說明書教導(dǎo)了編碼特定藻類蛋白質(zhì)的完整的氨基酸和核苷酸序列。利用本文所報(bào)道的序列，技術(shù)人員現(xiàn)在可以使用所公開的序列的全部或基本部分用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的目的。因此，本發(fā)明包含在所附序列表中報(bào)道的完整序列，以及如上面定義的那些序列的基本部分。術(shù)語"互補(bǔ)的，，用于描述核普酸堿基之間能夠彼此雜交的關(guān)系。例如，就DNA而言，腺苷與胸腺嘧啶互補(bǔ)而胞嘧啶與鳥嘌呤互補(bǔ)。因此，本發(fā)明也包含與所附序列表中報(bào)道的完整序列互補(bǔ)的分離的核酸片段，以及那些基本相似的核酸序列。術(shù)語"同源，，和"同源的，，在本文中可以互換使用。它們指其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基的變化不影響核酸片段介導(dǎo)基因表達(dá)或產(chǎn)生某種表型的能力的核酸片段。這些術(shù)語也指本發(fā)明的核酸片段的修飾(例如缺失或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸)，相對(duì)于初始的未經(jīng)修飾的核酸片段，所述修飾基本上不會(huì)改變所得核酸片段的功能特性。因此正如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的，本發(fā)明涵蓋的序列不僅僅是具體的示例性序列。而且，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明所涵蓋的同源核酸序列也通過它們在中等嚴(yán)格條件(例如0.5xSSC,0.1%SDS,6(TC)下與本文所例示的序列雜交的能力，或雜交至本文所公開的核苷酸序列的任何部分和與本文所公開的任何核酸序列功能等價(jià)的序列的能力所限定。"密碼子簡并性"指允許核苷酸序列在不影響所編碼的多肽的氨基酸序列的情況下發(fā)生變化的遺傳密碼的性質(zhì)。因此，本發(fā)明涉及編碼氨基酸序列的全部或基本部分的任何核酸片段，所述氨基酸序列編碼在SEQIDNO:2中示出的藻類多肽。技術(shù)人員非常了解具體宿主細(xì)胞在使用核苷酸密碼子以指定給定氨基酸時(shí)所表現(xiàn)出的"密碼子偏倚"。因此，當(dāng)合成基因用以改善在宿主細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)，希望設(shè)計(jì)基因以使得其密碼子使用頻率與該宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子使用頻率接近。與DNA序列有關(guān)的"化學(xué)合成"指在體外對(duì)組分核苷酸進(jìn)行裝配?？梢圆捎猛晟平⒌姆椒▉硗瓿蒁NA的手工化學(xué)合成，或者可使用許多種可商業(yè)獲得的機(jī)器的其中一種來完成自動(dòng)化學(xué)合成。"合成的基因，，可由使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法化學(xué)合成的寡核苷酸構(gòu)件裝配而成。將這些構(gòu)件進(jìn)行連接并退火以形成基因節(jié)段，該基因節(jié)段隨后在酶促作用下裝配而構(gòu)建成完整的基因。因此，基于最優(yōu)化核苷酸序列以反映宿主細(xì)胞的密碼子偏倚，可以定制基因用以最優(yōu)化基因表達(dá)。如果密碼子使用偏向于宿主偏好的那些密碼子，則技術(shù)人員理解成功的基因表達(dá)的可能性。優(yōu)選的密碼子的確定可基于對(duì)來源于宿主細(xì)胞的基因(其中序列信息可獲得)的檢測。"基因，，指表達(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，并且該核酸片段可以指單獨(dú)的編碼區(qū)或可以包含位于編碼序列之前的調(diào)節(jié)序列(5'非編碼區(qū))和之后的調(diào)節(jié)序列(3'非編碼區(qū))。"天然基因"指天然存在的具有其自身調(diào)節(jié)序列的基因。"嵌合基因"指任何不是天然基因的基因，其包含在天然情況下不會(huì)一起存在的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。因此，嵌合基因可以包含源于不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或者包含源于同一來源，但以不同于天然存在的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。"內(nèi)源基因"指位于生物的基因組內(nèi)它的天然位置的天然基因。"外來"基因指通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入到宿主生物內(nèi)的基因。外來基因可包括插入到非天然生物內(nèi)的天然基因、導(dǎo)入到天然宿主內(nèi)的新位置的天然基因，或嵌合基因。"轉(zhuǎn)基因"指已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入到基因組內(nèi)的基因。"經(jīng)密碼子最優(yōu)化的基因"是其密碼子使用頻率經(jīng)設(shè)計(jì)用以模仿宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子使用頻率的基因。"編碼序列"指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。"合適的調(diào)節(jié)序列"指位于編碼序列上游(5'非編碼序列)、之內(nèi)或下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列，并且其可影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯。調(diào)節(jié)序列可以包括啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、多腺苦酸化識(shí)別序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)子結(jié)合位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。術(shù)語"等位基因"指占據(jù)染色體上給定基因座的基因的幾種備選形式中的一種。當(dāng)存在于染色體上給定基因座上的所有等位基因都相同時(shí)，則該植物在此基因座處是純合的。如果存在于染色體給定基因座上的等位基因不同，則該植物在此基因座處是雜合的。"啟動(dòng)子"指能夠控制編碼序列或功能性RNA表達(dá)的DNA序列。通常，編碼序列位于啟動(dòng)子序列的3'。啟動(dòng)子可以全部來源于天然基合成的DNA節(jié)段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解，不同的啟動(dòng)子可以引導(dǎo)基因在不同的組織或細(xì)胞類型中、或在不同的發(fā)育階段、或響應(yīng)不同的環(huán)境或生理?xiàng)l件而表達(dá)。導(dǎo)致基因在大部分時(shí)間內(nèi)在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為"組成型啟動(dòng)子'，。還應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，由于在大多數(shù)情況下調(diào)節(jié)序列的確切邊界尚未完全確定，因此不同長度的DNA片段可能具有相同的啟動(dòng)子活性。啟動(dòng)子序列可以由鄰近的和更遠(yuǎn)處的上游元件組成，后一類元件常稱為增強(qiáng)子。因此，"增強(qiáng)子"是能刺激啟動(dòng)子活性的DNA序列，并且可以是啟動(dòng)子的固有的元件或插入的異源元件，用以增強(qiáng)啟動(dòng)子的水平或組織特異性。正不斷發(fā)現(xiàn)可用于植物細(xì)胞的多種類型的新啟動(dòng)子；大量的實(shí)例可以在Okamuro,J.K.和Goldberg，R.B.,BiochemistryofPlants,15:1-82(1989)的匯編中找到。"翻譯前導(dǎo)序列"指位于基因的啟動(dòng)子序列和編碼序列之間的多核苷酸序列。翻譯前導(dǎo)序列存在于完全加工的mRNA的翻譯起始序列的上游。翻譯前導(dǎo)序列可以影響mRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的加工、mRNA的穩(wěn)定性或翻譯效率。翻譯前導(dǎo)序列的實(shí)例已有描述(Turner,R.和Foster,G.D.,Mol.Biotechnol.,3:225-236(1995))。術(shù)語"3'非編碼序列"和"轉(zhuǎn)錄終止子"指位于編碼序列下游的DNA序列。這包括多腺苷酸化識(shí)別序列和編碼能影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號(hào)的其它序列。多腺普酸化信號(hào)通常表征為影響多腺普酸片添加到mRNA前體的3'末端。3'區(qū)可影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯。"RNA轉(zhuǎn)錄物"指由RNA聚合酶催化的DNA序列的轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是DNA序列的完全互補(bǔ)的拷貝時(shí)，它被稱為初級(jí)轉(zhuǎn)錄物，或者它可以是源自初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄后加工的RNA序列并^L稱作成熟RNA。"信使RNA"或"mRNA"指無內(nèi)含子并且可以由細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA。"cDNA"指與mRNA互補(bǔ)并源于mRNA的雙鏈DNA。"有義"RNA指包含mRNA并因而能由細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物。"反義RNA，，指與靶初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分互補(bǔ)并且可阻斷靶基因的表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物(美國專利5,107,065;PCT公開No.W099/28508)。反義RNA可以與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即5'非編碼序列、3'非編碼序列或編碼序列互補(bǔ)。"功能性RNA"指反義RNA、核酶RNA或其它不能翻譯可是對(duì)細(xì)胞過程有作用的RNA。術(shù)語"可操作地連接"指單個(gè)核酸片段上核酸序列的關(guān)聯(lián)，使得其中一個(gè)核酸序列的功能受到另一個(gè)核酸序列的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)(即，該編碼序列受到該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制)時(shí)，則該啟動(dòng)子與該編碼序列可操作地連接。編碼序列可以以有義或反義的方向可操作地連接至調(diào)節(jié)序列。如本文所用的，術(shù)語"表達(dá)"指源于本發(fā)明的核酸片段的有義RNA(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積聚。表達(dá)也可指mRNA翻譯成多肽。"成熟，，蛋白質(zhì)指經(jīng)翻譯后加工的多肽，即已經(jīng)去除了存在于初始翻譯產(chǎn)物中的任何前肽或肽原的多肽。"前體"蛋白質(zhì)指mRNA的初級(jí)翻譯產(chǎn)物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和肽原可以是(但不限于)細(xì)胞內(nèi)定位信號(hào)。"轉(zhuǎn)化"指將核酸分子轉(zhuǎn)移至宿主生物中，導(dǎo)致在遺傳上穩(wěn)定遺傳。例如，核酸分子可以是自主復(fù)制的質(zhì)粒，或者它可以整合進(jìn)宿主生物的基因組中。含有轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物稱作"轉(zhuǎn)基因"或"重組"或"轉(zhuǎn)化"生物。術(shù)語"質(zhì)粒"、"載體，，和"盒，，指通常攜帶有不屬于細(xì)胞中心代謝的部分的基因的染色體外元件，并且常常是環(huán)狀雙鏈DNA片段的形式。這種元件可以是源于任何來源的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或者單鏈或雙鏈DNA或RNA的核苷酸序列(線狀或環(huán)狀)，其中許多核苷酸序列已經(jīng)連接或重組為一種獨(dú)特構(gòu)建體，該構(gòu)建體能夠?qū)⑺x基因產(chǎn)物的啟動(dòng)子片段和DNA序列連同合適的3'非翻譯序列一起導(dǎo)入細(xì)胞中。"表達(dá)盒"指包含外來基因并且除該外來基因以外還具有使得該基因在外來宿主中的表達(dá)增強(qiáng)的元件的特定載體。如本領(lǐng)域已知的，術(shù)語"百分比同一性"是兩條或更多條多肽序列之間或者兩條或更多條多核苷酸序列之間的關(guān)系，其通過比較序列測定。在本領(lǐng)域中，"同一性"也表示多肽或多核苷酸序列之間序列關(guān)聯(lián)的程度，根據(jù)具體情況而定，其由這些序列串之間的匹配確定。"同一性"和"相似性"可以通過已知方法^f艮容易計(jì)算出來，所述方法包括但不限于下列文獻(xiàn)中所述的那些方法1.)ComputationalMolecularBiology(Lesk,A.M.編輯)OxfordUniversity:NY(1988);2.)Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects(Smith,D.W.編輯)Academic:NY(1993);3.)ComputerAnalysisofSequenceData,PartI(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.編輯)Humania:NJ(1994);4.)SequenceAnalysisinMolecularBiology(vonHeinje，G.編輯)Academic(1987);和5.)SequenceAnalysisPrimer(Gribskov,M.和Devereux,J.,編輯)Stockton:NY(1991)。設(shè)計(jì)用于測定同一'性的優(yōu)選方法來獲得檢測序列之間的最佳匹配。用于測定同一性和相似性的方法在可公開獲得的計(jì)算機(jī)程序中編成了代碼。序列比對(duì)和百分比同一性計(jì)算可以用LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算4欠件包(LASERGENEbioinformaticscomputingsuite)(DNASTARInc.,Madison,WI)中的MegAlignTM程序進(jìn)行。序列的多重比對(duì)采用包括幾種改變形式的算法在內(nèi)"Clustal比對(duì)方法"進(jìn)行，包括"ClustalV比對(duì)方法"，該算法相當(dāng)于稱為ClustalV(在Higgins和Sharp,CABIOS,5:151誦153(1989);Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.,8:189-191(1992)中有所描述)并且可以在LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算軟件包(DNASTARInc.)中的MegAlign程序中找到的比對(duì)方法。對(duì)于多重比對(duì)，默認(rèn)值對(duì)應(yīng)于缺口罰分(GAPPENALTY)=10和缺口長度罰分(GAPLENGTHPENALTY)=10。用ClustalV方法進(jìn)行成對(duì)比對(duì)和蛋白質(zhì)序列的百分比同一性計(jì)算的默認(rèn)參數(shù)為KTUPLE-1、缺口罰分=3、窗口(WINDOW)=5和DIAGONALSSAVED=5。對(duì)于核酸，這些參數(shù)為KTUPLE=2、缺口罰分=5、窗口=4和DIAGONALSSAVED=4。在用ClustalV程序進(jìn)行序列比對(duì)后，通過觀察相同程序中的"序列距離"表來獲得"百分比同一性"成為可能。此外，也可以^使用"ClustalW比對(duì)方法，，，該方法相當(dāng)于稱為ClustalW(在Higgins和Sharp,CABIOS,5:151-153(1989);Higgins,D.G.,等人，Comput.Appl.Biosci.,8:189-191(1992)中有所描述)并且可以在LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算軟件包(DNASTARInc.)中的MegAligrTv6.1程序中找到的比對(duì)方法。用于多重比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)對(duì)應(yīng)于缺口罰分=10、缺口長度罰分=0.2、延遲發(fā)散序列(DelayDivergenSeqs)(%)=30、DNA轉(zhuǎn)換權(quán)重(DNATransitionWeight)=0.5、蛋白質(zhì)權(quán)重矩陣(ProteinWeightMatrix)-Gonnet系列和DNA權(quán)重矩陣(DNAWeightMatrix)=IUB。在用ClustalW程序進(jìn)行序列比對(duì)后，通過觀察相同程序中的"序列距離"表來獲得"百分比同一性"成為可能。"BLASTN比對(duì)方法，，是由國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(NCBI)提供的用以采用默認(rèn)參數(shù)比較核香酸序列的算法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將充分理解，許多水平的序列同一性可用于從其它物種鑒定多肽，其中該多肽具有相同或相似的功能或活性。合適的核酸片段(本發(fā)明的分離的多核苷酸)編碼與本文所報(bào)道的氨基酸序列具有至少約70%同一性，優(yōu)選至少約75%同一性，并且更優(yōu)選至少約80%同一性的多肽。優(yōu)選的核酸片段編碼與本文所報(bào)道的氨基酸序列具有至少約85%同一性的氨基酸序列。更優(yōu)選的核酸片段編碼與本文所報(bào)道的氨基酸序列具有至少約90%同一性的氨基酸序列。最優(yōu)選的核酸片段編碼與本文所報(bào)道的氨基酸序列具有至少約95%同一性的氨基酸序列。雖然優(yōu)選的范圍如上所述，但從67%至100%的任何整數(shù)氨基酸同一性都可用于描述本發(fā)明，例如68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。合適的核酸片段不僅具有以上同源性，而且通常還編碼具有至少50個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少150個(gè)氨基酸，還更優(yōu)選至少200個(gè)氨基酸，并且最優(yōu)選至少250個(gè)氨基酸的多肽。術(shù)語"保守結(jié)構(gòu)域"或"基序"指進(jìn)化上相關(guān)的蛋白質(zhì)的比對(duì)序列中在特定位置保守的一組氨基酸。雖然同源蛋白質(zhì)之間在其它位置的氨基酸可以發(fā)生變化，但在特定位置高度保守的氨基酸表示對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或活性來說是必需的氨基酸。因?yàn)樗鼈兛赏ㄟ^它們在蛋白質(zhì)同源物家族比對(duì)序列中的高度保守來鑒定，所以它們可用作識(shí)別標(biāo)記或"簽名"來確定具有新的測定序列的蛋白質(zhì)是否屬于以前鑒定的蛋白質(zhì)家族。術(shù)語"序列分析軟件"指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何計(jì)算機(jī)算法或軟件程序。"序列分析軟件，，可以商業(yè)獲得或者獨(dú)立開發(fā)。一般的序列分析軟件將包括但不限于l.)GCG程序包(WisconsinPackageVersion9.0,GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,WI);2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol"215:403-410(1990));3.)DNASTAR(DNASTARInc.,Madison,WT);4.)Sequencher(GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI);和5.)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson,ComputMethodsGenomeRes.,[Proc.Int.Symp.](1994),MeetingDate1992,111-20。編輯Suhai,Sandor.Plenum:NewYork，NY)。在本申請(qǐng)的上下文中應(yīng)該理解，除非另外說明，否則在使用序列分析軟件進(jìn)行分析時(shí)，分析的結(jié)果將基于所參考的程序的"默認(rèn)值"。如本文所用的，"默認(rèn)值"將指在首次初始化軟件時(shí)軟件最初加載的任何值或參數(shù)集。就本文使用的BLASTP算法而言，默認(rèn)參數(shù)將包括Robinson和Robinson氨基酸頻率(RobinsonA.B.,RobinsonL.R.,Proc.NatlAcad.Sci.,U.S.A.,88:8880-8884(1991))、BLOSUM62打分矩陣和缺口成本(gapcost)△(g)=U+g。術(shù)語"植物部分"包括分化和未分化的組織，包括但不限于下列部分根、莖、苗、葉、花粉、種子、肺瘤組織和多種形式的細(xì)胞和培養(yǎng)物(如單個(gè)細(xì)〗包、原生質(zhì)體、胚和愈傷組織)。纟直物組織可存在于植林或植物器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中。術(shù)語"植物器官"指構(gòu)成植株的形態(tài)和功能迥異的部分的植物組織或組織群。術(shù)語"基因組"指(1)存在于生物的每一個(gè)細(xì)胞或者病毒或細(xì)胞器中的全套遺傳物質(zhì)(基因和非編碼序列)；(2)作為(單倍體)單位從一個(gè)親本遺傳的全套染色體。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的并且已經(jīng)在如下文獻(xiàn)中有所描述Sambrook,J.,Fritsch,E.R和Maniatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1989)(下文稱"Maniatis");Silhavy,T.J.，Bennan,ML.和Enquist,L.W.,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1984);以及Ausubel,F.M.等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWiley畫Interscience出版，Hoboken,NJ(1987)。術(shù)語"重組構(gòu)建體"、"表達(dá)構(gòu)建體"、"嵌合構(gòu)建體"、"構(gòu)建體"和"重組DNA構(gòu)建體"在本文中可互換使用。重組構(gòu)建體包含核酸片段(如在天然條件下不會(huì)一起存在的調(diào)節(jié)序列和編碼序列)的人工組合。例如，嵌合構(gòu)建體可包含源自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，;ij:'、這種二建:可以單:使用S與載體聯(lián):使用。、如果使用載體r則載體的選擇取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的將要用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方34法。例如，可以使用質(zhì)粒載體。技術(shù)人員十分了解必須存在于載體上以成功地轉(zhuǎn)化、選擇和繁殖含本發(fā)明任何分離的核酸片段的宿主細(xì)胞的遺傳元件。技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到，不同的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件將導(dǎo)致不同水平和模式的表達(dá)(Jones等人，EMBOJ.4:2411-2418(1985);DeAlmeida等人，Mol.Gen.Genetics218:78-86(1989)),因此，必須篩選多次事件以獲得顯示期望表達(dá)水平和模式的品系。這種篩選可以通過DNA的DNA印跡分析、mRNA表達(dá)的RNA印跡分析、蛋白質(zhì)表達(dá)的免疫印跡分析或表型分析等完成。如本文所用的，術(shù)語"表達(dá)"指功能性終產(chǎn)物(如mRNA或蛋白質(zhì)[前體或成熟形式])的產(chǎn)生。術(shù)語"導(dǎo)入"指將核酸(如表達(dá)構(gòu)建體)或蛋白質(zhì)提供至細(xì)胞中。導(dǎo)入包括指將核酸整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸可以整合進(jìn)細(xì)胞的基因組內(nèi)，以及包括指將核酸或蛋白質(zhì)暫時(shí)提供給細(xì)胞。導(dǎo)入包括指穩(wěn)定的或瞬時(shí)的轉(zhuǎn)化方法以及有性雜交。因此，將核酸片段(如重組DNA構(gòu)建體/表達(dá)構(gòu)建體)插入細(xì)胞內(nèi)的情況下的"導(dǎo)入"意指"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，并且包括指將核酸片段整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸片段可以整合進(jìn)細(xì)胞的基因組(如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)內(nèi)、轉(zhuǎn)變成自主的復(fù)制子，或瞬時(shí)表達(dá)(如轉(zhuǎn)染的mRNA)。"成熟"蛋白質(zhì)指經(jīng)翻譯后加工的多肽(即，已經(jīng)除去了存在于初級(jí)翻譯產(chǎn)物中的任何前肽或肽原的多肽)。"前體，，蛋白質(zhì)指mRNA的初級(jí)翻譯產(chǎn)物(即前肽和肽原仍然存在)。前肽和肽原可以是但不限于細(xì)胞內(nèi)定位信號(hào)。"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"指將核酸片段轉(zhuǎn)移至宿主生物的基因組(包括核基因組和細(xì)胞器基因組)內(nèi)，導(dǎo)致在遺傳上穩(wěn)定遺傳。相比之下，"瞬時(shí)轉(zhuǎn)化"指將核酸片段轉(zhuǎn)移至宿主生物的核內(nèi)或含有DNA的細(xì)胞器內(nèi)，導(dǎo)致基因表達(dá)而不整合或不穩(wěn)定遺傳。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物稱作"轉(zhuǎn)基因"生物。如本文所用的，"轉(zhuǎn)基因"指其基因組內(nèi)含有異源多核苷酸的植物或細(xì)胞。優(yōu)選地，將異源多核苷酸穩(wěn)定整合進(jìn)基因組內(nèi)以便該多核苷酸連續(xù)傳代。異源多核苷酸可以單獨(dú)地或作為表達(dá)構(gòu)建體的部分整合進(jìn)基因組中。本文所用的轉(zhuǎn)基因包括因異源核酸存在而已經(jīng)改變了基因型的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括初始進(jìn)行此類改變的轉(zhuǎn)基因以及從初始的轉(zhuǎn)基因通過有性雜交或無性繁殖產(chǎn)生的那些轉(zhuǎn)基因。如本文所用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"不包括通過常規(guī)植物育種方法或通過諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組改變。"反義抑制"指能抑制靶蛋白質(zhì)表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生。"共抑制"指能抑制相同或基本相似的外來或內(nèi)源基因表達(dá)的有義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生(美國專利No.5,231,020)。以前已經(jīng)設(shè)計(jì)了植物中的共抑制構(gòu)建體，這通過集中于在有義方向上與內(nèi)源mRNA同源的核酸序列的超表達(dá)來進(jìn)行，其導(dǎo)致與超表達(dá)序列同源的所有RNA減少(Vaucheret等人,PlantJ.16:651-659(1998);Gura,Nature404:804-808(2000))。該現(xiàn)象的整體效率低，并且RNA減少的程度的變化范圍4艮大。更近期的工作已經(jīng)描述了以互補(bǔ)方向整合了全部或部分mRNA編碼序列的"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)的利用，其導(dǎo)致表達(dá)的RNA出現(xiàn)可能的"莖-環(huán)，，結(jié)構(gòu)(PCT公開No.WO99/53050,于1999年10月21日公開；PCT公開No.W002/00904，于2002年1月3日公開)。這增加了回收的轉(zhuǎn)基因植物中的共抑制頻率。另一變化形式描述了利用植物病毒序列來引導(dǎo)近側(cè)mRNA編碼序列的抑制或"沉默"(PCT公開No.WO98/36083，于1998年8月20日公開)。盡管遺傳學(xué)證據(jù)已經(jīng)開始解開這種復(fù)雜的情形(Elmayan等人，PlantCell10:1747-1757(1998)),但這兩種共抑制現(xiàn)象都還沒有從機(jī)理上得到闡明。綜述脂肪酸和三?；视偷奈⑸锷锖铣赏ǔ?，含油微生物的脂質(zhì)蓄積響應(yīng)存在于生長培養(yǎng)基中的總的碳氮比率而觸發(fā)。該過程(導(dǎo)致含油微生物中游離棕櫚酸(16:0)的從頭合成)在PCT公開No.WO2004/101757中有詳細(xì)描述。棕櫚酸是長鏈飽和的和不飽和的脂肪酸衍生物的前體，這些脂肪酸衍生物通過延長酶和去飽和酶的作用形成(圖1)。TAG(脂肪酸的主要貯存單位)通過包括如下反應(yīng)在內(nèi)的一系列反應(yīng)形成1.)一分子的?；o酶A和甘油-3-磷酸通過酰基轉(zhuǎn)移酶酯化而生成溶血磷脂酸；2.)笫二分子的?；o酶A通過?；D(zhuǎn)移酶酯化而生成1,2-二酰基甘油磷酸(通常稱為磷脂酸)；3.)通過磷脂酸磷酸酶除去磷酸而生成1,2-二?；视?DAG);和4.)在?；D(zhuǎn)移酶作用下加入笫三個(gè)脂肪酸以形成TAG。廣譜的脂肪酸可被整合進(jìn)TAG中，包括飽和的和不飽和的脂肪酸以及短鏈和長鏈的脂肪酸。w-脂肪酸的生物合成其中油酸轉(zhuǎn)化成co-3/a)-6脂肪酸的代謝過程包括通過添加碳原子使碳鏈延長和通過加入雙鍵使分子去飽和。這需要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)的一系列特殊去飽和酶和延長酶。然而，如在圖1中看到的和如下所述的，通常存在多個(gè)用于產(chǎn)生特定co-3/co-6脂肪酸的替代途徑。具體地講，所有途徑都需要最初通過A-12去飽和酶將油酸轉(zhuǎn)化成LA(笫一個(gè)co-6脂肪酸)。然后，利用"A-6去飽和酶/A-6延長酶途徑"，如下形成oo-6脂肪酸(1)通過A-6去飽和酶將LA轉(zhuǎn)化成GLA;(2)通過C18/2o延長酶將GLA轉(zhuǎn)化成DGLA;和(3)通過△-5去飽和酶將DGLA轉(zhuǎn)化成ARA。作為另一種選擇，"△-6去飽和酶/厶-6延長酶途徑"可用于如下形成w-3脂肪酸(1)通過A-15去飽和酶將LA轉(zhuǎn)化成ALA(第一個(gè)w-3脂肪酸)；(2)通過△-6去飽和酶將ALA轉(zhuǎn)化成STA;(3)通過ds/2o延長酶將STA轉(zhuǎn)化成ETA;(4)通過A-5去飽和酶將ETA轉(zhuǎn)化成EPA;(5)通過C2。/22延長酶將EPA轉(zhuǎn)化成DPA;和(6)通過A-4去飽和酶將DPA轉(zhuǎn)化成DHA。任選地，co-6脂肪酸可轉(zhuǎn)化成co-3脂肪酸；例如，ETA和EPA通過A-17去飽和酶活性分別從DGLA和ARA生成。用于生物合成co-3/w-6脂肪酸的替代途徑使用了A-9延長酶和A-8去飽和酶。更具體地講，LA和ALA可通過A-9延長酶分別轉(zhuǎn)化成EDA和ETrA;然后，△-8去飽和酶將EDA轉(zhuǎn)化成DGLA和/或?qū)TrA轉(zhuǎn)化成ETA。預(yù)期需要在特定宿主生物中表達(dá)用以產(chǎn)生w-3/co-6脂肪酸的特定功能將取決于宿主細(xì)胞(及其天然的PFUA概況和/或去飽和酶/延長酶概況)、底物的可利用性和所需的終產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定多種編碼co-3/w-6脂肪酸生物合成所需的每種酶的候選基因?？捎玫娜ワ柡兔负脱娱L酶序列可源自任何來源，例如，分離自天然來源(來自細(xì)菌、藻類、真菌、植物、動(dòng)物等)、經(jīng)由半合成途徑產(chǎn)生或從頭合成。盡管導(dǎo)入宿主的去飽和酶和延長酶基因的具體來源不是關(guān)鍵的，但選擇具有去飽和酶或延長酶活性的特定多肽的考慮事項(xiàng)包括1.)多肽的底物特異性；2.)多肽或其組分是否為限速酶；3.)去飽和酶或延長酶是否是合成期望的PUFA所必需的；和/或4.)多肽所需的輔因子。表達(dá)的多肽優(yōu)選具有與它在宿主細(xì)胞中的位置的生化環(huán)境相容的參數(shù)(其它詳細(xì)信息參見PCT公開No.WO2004/101757)。在另外的實(shí)施方案中，考慮每種具體的去飽和酶和/或延長酶的轉(zhuǎn)換效率也將是有用的。更具體地講，由于每種酶極少能以100%的效率將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物，宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的未純化的油的最終脂質(zhì)概況將通常是由期望的co-3/co-6脂肪酸及多種上游PUFA中間產(chǎn)物組成的多種PUFA混合物。因此，當(dāng)最優(yōu)化所需的脂肪酸的生物合成時(shí)，每種酶的轉(zhuǎn)換效率也是一個(gè)要考慮的變量?？紤]到上述各個(gè)考慮事項(xiàng)，具有合適去飽和酶和延長酶活性(如A誦6去飽和酶、Qs/2。延長酶、A-5去飽和酶、A-17去飽和酶、A-15去飽和酶、A-9去飽和酶、A-12去飽和酶、(^14/16延長酶、<316/18延長酶、A-9延長酶、A-8去飽和酶、A-4去飽和酶和C2o/22延長酶)的候選基因可根據(jù)可公開獲得的文獻(xiàn)(如GenBank)、專利文獻(xiàn)和對(duì)具有產(chǎn)生PUFA能力的生物的實(shí)驗(yàn)分析來鑒定。這些基因?qū)⑦m用于導(dǎo)入到特定的宿主生物中，以使生物能合成PUFA或增強(qiáng)生物合成PUFA。新的多甲藻屬物種CCMP626A-5去飽和酶的序列鑒定在本發(fā)明中，已經(jīng)從多曱藻屬物種CCMP626中分離出一種編碼A-5去飽和酶(SEQIDNO:2)(在本文中稱為"RD5")的核苷酸序列(SEQIDNO:l)。RD5的核苷酸堿基和推導(dǎo)的氨基酸序列與公共數(shù)據(jù)庫的比較揭示，用ClustalW比對(duì)方法，最相似的已知序列與本文所報(bào)道的RD5氨基酸序列在463個(gè)氨基酸的長度上具有約67%的同一性。更優(yōu)選的氨基酸片段與本文中的序列具有至少約70%-80%的同一性，其中具有至少約80%-90%同一性的那些序列尤其適合，而具有至少約90%-95%同一性的那些序列是最優(yōu)選的。類似地，優(yōu)選的對(duì)應(yīng)本發(fā)明ORF的編碼RD5的核酸序列是編碼活性蛋白質(zhì)的那些并且其與本文所報(bào)道的RD5的核酸序列具有至少約70%-80%同一性，其中具有至少約80%-90%同一性的那些序列尤其適合，而具有至少約90%-95%同一性的那些序列是最優(yōu)選的。在備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的RD5去飽和酶序列可經(jīng)密碼子最38優(yōu)化以便在特定的宿主生物中表達(dá)。如本領(lǐng)域所熟知的，這可以是進(jìn)一步最優(yōu)化該酶在替代宿主中表達(dá)的有用手段，因?yàn)槭褂盟拗鲀?yōu)選的密碼子能夠大幅增強(qiáng)編碼該多肽的外來基因的表達(dá)。通常，宿主優(yōu)選的密碼子可在所關(guān)注的具體宿主物種中通過檢查蛋白質(zhì)(優(yōu)選那些最大量表達(dá)的蛋白質(zhì))中的密碼子使用以及確定哪些密碼子的使用頻率最高來測定。然后，可利用宿主物種優(yōu)選的密碼子整個(gè)或部分地合成具有例如去飽和酶活性的所關(guān)注的多肽的編碼序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，RD5經(jīng)密碼子最優(yōu)化以便在解脂耶氏酵母中表達(dá)。這可能通過這樣來實(shí)現(xiàn)首先測定解脂耶氏酵母的密碼子使用概況(參見PCT公開No.WO04/101757和美國專利7,125,672)并鑒定那些優(yōu)選的密碼子。然后，為了進(jìn)一步最優(yōu)化在解脂耶氏酵母中的基因表達(dá)，對(duì)'ATG，起始密碼子周圍的共有序列進(jìn)行測定。這種最優(yōu)化導(dǎo)致修飾了1392bp的編碼區(qū)中的247bp(17.7%)以及最優(yōu)化了總共463個(gè)密碼子中的229個(gè)密碼子(49.4%)。經(jīng)密碼子最優(yōu)化的基因("RD5S";SEQIDNO:3)中的所有修飾都不改變所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。如實(shí)施例ll中所描述的，當(dāng)在解脂耶氏酵母中表達(dá)時(shí)，經(jīng)密碼子最優(yōu)化的基因?qū)GLA去飽和形成ARA的效率比野生型基因高8.9%?；谝吧蚏D5序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠利用本文的教導(dǎo)產(chǎn)生適用于在替代宿主(即解脂耶氏酵母以外的宿主)中最優(yōu)化表達(dá)的多種其它經(jīng)密碼子最優(yōu)化的A-5去飽和酶。因此，本發(fā)明涉及任何來源于野生型RD5(即由SEQIDNO:2編碼的)的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的△-5去飽和酶蛋白。這包括但不限于在SEQIDNO:3中示出的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼經(jīng)密碼子最優(yōu)化以用于在解脂耶氏酵母中表達(dá)的合成的A-5去飽和酶蛋白(即RD5S)。同源物的鑒定和分離任何本發(fā)明的去飽和酶序列(即RD5和RD5S)或其部分都可用于利用序列分析軟件來搜索相同或其它細(xì)菌、藻類、真菌或植物物種中的A-5去飽和酶同源物。通常，這種計(jì)算機(jī)軟件通過將同源的程度分配給多種置換、缺失和其它^f奮飾來匹配相似的序列。備選地，任何本發(fā)明的去飽和酶序列或其部分也可以用作雜交試劑用以鑒定A-5同源物。核酸雜交試驗(yàn)的基本組分包括探針、懷疑含有所關(guān)注的基因或基因片段的樣品及特定的雜交方法。本發(fā)明的探針通常是與待檢測核酸序列互補(bǔ)的單鏈核酸序列。探針與待檢測的核酸序列是"可雜交的"。盡管探針的長度可在5個(gè)堿基到成好幾萬個(gè)堿基之間變化，但通常約15個(gè)堿基到約30個(gè)堿基的探針長度是合適的。只需要探針分子的部分與待檢測核酸序列互補(bǔ)。另外，探針和靶序列之間不需要完全互補(bǔ)。雜交確實(shí)可以在并不完全互補(bǔ)的分子之間發(fā)生，結(jié)果是雜交區(qū)內(nèi)的某些堿基級(jí)分沒有與正確的互補(bǔ)堿基配對(duì)。雜交方法是非常確實(shí)的。通常探針和樣品必須在允許核酸雜交的條件下混合。這涉及在正確濃度和溫度條件下在存在無機(jī)或有機(jī)鹽時(shí)使探針和樣品接觸。探針和樣品核酸必須接觸足夠長的時(shí)間，使探針和樣品核酸之間的任何可能的雜交都可發(fā)生?；旌衔镏械奶结樆虬械臐舛葘Q定雜交發(fā)生所需的時(shí)間。探針或靶的濃度越高，所需的雜交孵育時(shí)間就越短。任選地，可以加入離液劑(如氯化胍、碌b氰酸胍、石危氰酸鈉、四氯乙酸鋰、高氯酸鈉、四氯乙酸銣、石典化鉀和三氟乙酸銫)。如果需要，人們可以加入曱酰胺至雜交混合物中，通常為30-50%(v/v)。可以采用多種雜交溶液。通常，這些雜交溶液包含約20%至60%體積，優(yōu)選30%體積的極性有機(jī)溶劑。普通的雜交溶液采用約30-50%v/v曱酰胺、約0.15至1M氯化鈉、約0.05至0.1M緩沖液(如檸檬酸鈉、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范圍約6-9))、約0.05至0.2%去污刺(如十二烷基疏酸鈉)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(PharmaciaInc.)(約300-500千道爾頓(kdal))、聚乙烯吡咯烷酮(約250-500千道爾頓)和血清白蛋白。一般的雜交溶液還將包含約0.1至5mg/mL未經(jīng)標(biāo)記的載體核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鮭精DNA或酵母RNA),以及任選約0.5%至2%重量/體積的甘氨酸。還可以包含其它添加劑，例如包括多種極性水溶性或可膨脹試劑(如聚乙二醇)、陰離子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚曱基丙烯酸酯)和陰離子糖類聚合物(如硫酸葡聚糖)在內(nèi)的體積排阻劑。核酸雜交可適用于多種測定形式。最合適的形式之一是夾心測定形式。夾心測定尤其適用于在非變性條件下雜交。夾心型測定最主要的成分是固體支持體。固體支持體具有吸附或共價(jià)連接至其上的固定核酸探針，該探針未經(jīng)標(biāo)記并且與序列的一部分互補(bǔ)。在另外的實(shí)施方案中，本文描述的任何△-5去飽和酶核酸片段(或其鑒定的任何同源物)都可用于從相同的或其它細(xì)菌、藻類、真菌或植物物種中分離編碼同源蛋白質(zhì)的基因。使用序列依賴性規(guī)程分離同源基因是本領(lǐng)域熟知的。序列依賴性規(guī)程的實(shí)例包括但不限于l.)核酸雜交方法；2.)DNA和RNA擴(kuò)增方法，這可通過核酸擴(kuò)增4支術(shù)的多種用法例證[如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),Mullis等人，美國專利4,683,202;連接酶鏈反應(yīng)(LCR),Tabor,S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,82:1074(1985);或鏈置換擴(kuò)增(SDA)，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.,89:392(1992)];和3.)文庫構(gòu)建和互補(bǔ)篩選方法。例如，編碼與本文描述的A-5去飽和酶相似的蛋白質(zhì)或多肽的基因可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，通過將本發(fā)明的核酸片段的全部或部分用作DNA雜交探針來篩選來自例如任何期望的酵母或真菌(其中那些產(chǎn)生ARA[或其衍生物]的生物將是優(yōu)選的)的文庫而得以直接分離。基于本發(fā)明的核酸序列的特異性寡核苷酸探針可通過本領(lǐng)域已知的方法(Maniatis,同上)設(shè)計(jì)和合成。而且，整個(gè)序列可直接用于通過熟練技術(shù)人員已知的方法(如隨才幾引物DNA標(biāo)記、切口平移或末端標(biāo)記技術(shù))合成DNA探針，或使用可獲得的體外轉(zhuǎn)錄體系合成RNA探針。另外，可設(shè)計(jì)特異性引物并將其用于擴(kuò)增部分(或全長)的本發(fā)明序列。所得的擴(kuò)增產(chǎn)物可在擴(kuò)增反應(yīng)過程中直接標(biāo)記或在擴(kuò)增反應(yīng)后標(biāo)記，并用作探針來在合適的嚴(yán)格條件下分離全長的DNA片段。通常，在PCR類型的擴(kuò)增技術(shù)中，引物具有不同的序列而且彼此之間不互補(bǔ)。取決于所需的檢測條件，應(yīng)該設(shè)計(jì)引物序列以提供既有效又可靠的耙核酸的復(fù)制。PCR引物設(shè)計(jì)方法是本領(lǐng)域常見且熟知的(Thein和Wallace，"TheuseofoligonucleotidesasspecifichybridizationprobesintheDiagnosisofGeneticDisorders",HumanGeneticDiseases:APracticalApproach,K.E.Davis編輯，(1986)pp33-50,IRL:Hemdon,VA;以及Rychlik,W.,MethodsinMolecularBiology,White,B.A.編輯，(1993)Vol.15,pp31-39,PCRProtocols:CurrentMethodsandApplications.Humania:Totowa,NJ)?；騌NA擴(kuò)增編碼同源基因的更長的核酸片段。PCR也可以用克隆的核酸片段的文庫進(jìn)行，其中一個(gè)引物的序列源自本發(fā)明的核酸片段，而另一個(gè)引物的序列利用編碼真核基因的mRNA前體的3'端的多腺苷酸片的存在。備選地，第二個(gè)引物序列可以基于來源于克隆載體的序列。例如，技術(shù)人員可以按照RACE規(guī)程(Frohman等人，Proc.NatlAcad.Sci.，U.S.A.,85:8998(1988)),通過用PCR擴(kuò)增在轉(zhuǎn)錄物內(nèi)單個(gè)位點(diǎn)與3'或5'端之間的區(qū)域的拷貝來產(chǎn)生cDNA。以3'和5'方向取向的引物可用本發(fā)明的序列設(shè)計(jì)。使用可商業(yè)獲得的3'RACE或5'RACE體系(Gibco/BRL,Gaithersburg,MD)，可以分離特異性的3'或5'cDNA片段(Ohara等人，Proc.NatlAcad.Sci.，U.S.A.,86:5673(1989);Loh等人，Science,243:217(1989))。在其它實(shí)施方案中，本文所述的任何A-5去飽和酶核酸片段(或其鑒定的任何同源物)都可用于產(chǎn)生新的和改良的脂肪酸去飽和酶。如本領(lǐng)域所熟知的，體外誘變和選擇、化學(xué)誘變、"基因改組(geneshuffling)"法或其它手段可用于獲得天然存在的去飽和酶基因的突變。備選地，改良的脂肪酸可以通過結(jié)構(gòu)域交換合成，其中將本文所述的任何△-5去飽和酶核酸片段的功能結(jié)構(gòu)域與備選的去飽和酶基因的功能結(jié)構(gòu)域交換，從而產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)。用于產(chǎn)生多種oo-3和/或o)-6脂肪酸的方法期望在合適的啟動(dòng)子控制下編碼本文所描述的A-5去飽和酶(即RD5、RD5S或其它突變酶、經(jīng)密碼子最優(yōu)化的酶或它們的同源物)的嵌合基因的導(dǎo)入將導(dǎo)致ARA和/或EPA分別在轉(zhuǎn)化的宿主生物內(nèi)的產(chǎn)生增加。同樣，本發(fā)明涵蓋了用于直接產(chǎn)生PUFA的方法，其包括將脂肪酸底物(即DGLA或ETA)暴露給本文所描述的去飽和酶(例如RD5和RD5S),以便該底物轉(zhuǎn)化成期望的脂肪酸產(chǎn)物(即分別為ARA或EPA)。更具體地來說，本發(fā)明的目的是提供用于在宿主細(xì)胞(如含油酵母、大豆)中產(chǎn)生ARA的方法，其中宿主細(xì)胞包含(i)編碼A-5去飽和酶多肽的分離的核苷酸分子，基于BLASTP算法或ClustalW比對(duì)方法，該多肽在與具有SEQIDNO:2中示出的氨基酸序列的多肽比較時(shí)具有至少67%的同一性；和(ii)二高-Y-亞油酸的來源；其中將宿主細(xì)胞在使A-5去飽和酶表達(dá)并且將DGLA轉(zhuǎn)化成ARA的條件下培育，而且其中可任選地回收ARA。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，A-5去飽和酶的廣的底物范圍可以另外允許利用該酶將ETA轉(zhuǎn)化成EPA。因此本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生EPA的方法，其中宿主細(xì)胞包含(i)編碼A-5去飽和酶多肽的分離的核苷酸分子，基于BLASTP算法或ClustalW比對(duì)方法，該多肽在與具有SEQIDNO:2中示出的氨基酸序列的多肽比較時(shí)具有至少67%的同一性；和(ii)ETA的來源；其中將宿主細(xì)胞在使a-5去飽和酶表達(dá)并將eta轉(zhuǎn)化成epa的條件下培育，而且其中可任選地回收EPA。作為另一種選擇，本文描述的每種A-5去飽和酶基因及其相應(yīng)的酶產(chǎn)物可間接用于產(chǎn)生co-3脂肪酸(參見美國專利公開No.2005/0136519X發(fā)生了間接產(chǎn)生co-3/oo-6PUFA,其中脂肪酸底物經(jīng)由中間步驟或途徑中間產(chǎn)物間接轉(zhuǎn)化成期望的脂肪酸產(chǎn)物。因此，預(yù)期可以將本文描述的A-5去飽和酶(如RD5、RD5S或其它突變酶、經(jīng)密碼子最優(yōu)化的酶或它們的同源物)與另外的編碼pufa生物合成途徑的酶(如A-6去飽和酶、ds/2o延長酶、A-17去飽和酶、A-15去飽和酶、A-9去飽和酶、A-12去飽和酶、014/16延長酶、(:16/18延長酶、A-9延長酶、A-8去飽和酶、A-4去飽和酶、C2o,22延長酶)的基因結(jié)合表達(dá)以導(dǎo)致更高水平地產(chǎn)生長鏈co-3脂肪酸(如EPA、DPA和DHA)。包含于具體表達(dá)盒中的具體基因?qū)⑷Q于宿主細(xì)胞(和它的PFUA概況和/或去飽和酶/延長酶概況)、底物的可利用性和期望的終產(chǎn)物。在備選的實(shí)施方案中，基于本文描述的完整序列、那些完整序列的互補(bǔ)序列、那些序列的基本部分、源于那些序列的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的去飽和酶以及那些與其基本同源的序列，破壞宿主生物內(nèi)的天然△-5去飽和酶可能是有用的。植物表達(dá)系統(tǒng)、盒和載體以及轉(zhuǎn)化在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重組構(gòu)建體，其包含可操作地連接至至少一種適用于在植物中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的本發(fā)明的任何一種A-5去飽和酶多核苦酸。啟動(dòng)子是引導(dǎo)植物的細(xì)胞機(jī)器從啟動(dòng)子下游(3')的鄰接編碼序列產(chǎn)生RNA的DNA序列。啟動(dòng)子區(qū)影響速率、發(fā)育階段和其中產(chǎn)生基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的細(xì)胞類型。RNA轉(zhuǎn)錄物被加工而產(chǎn)生mRNA,其作為RNA序列翻譯成所編碼多肽的氨基酸序列的模板。5'非翻譯前導(dǎo)序列是位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)上游的可在mRNA的起始和翻譯中起作用的mRNA區(qū)。3'轉(zhuǎn)錄終止/多腺苷酸化信號(hào)是蛋白質(zhì)編碼區(qū)下游的非翻譯區(qū)，其在植物細(xì)胞中起作用以導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄終止以及在RNA的3'端添加多腺香酸核苦酸。選擇用于驅(qū)動(dòng)A-5去飽和酶編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子的來源不重要，只要它具有足夠的轉(zhuǎn)錄活性來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，這通過使期望核酸片段的可翻譯mRNA在期望的宿主組織中在正確的時(shí)間表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。異源性或非異源性(即內(nèi)源性)啟動(dòng)子可用于實(shí)踐本發(fā)明。例如，合適的啟動(dòng)子包括但不限于P-伴大豆球蛋白a，亞基啟動(dòng)子、Kunitz胰蛋白酶抑制劑3啟動(dòng)子、膜聯(lián)蛋白啟動(dòng)子、大豆球蛋白Gyl啟動(dòng)子、P-伴大豆球蛋白P-亞基啟動(dòng)子、P34/GlyBdm30K啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子、LegAl啟動(dòng)子和LegA2啟動(dòng)子。膜聯(lián)蛋白或P34啟動(dòng)子在PCT公開No.WO2004/071178(于2004年8月26日公開)中有描述。膜聯(lián)蛋白啟動(dòng)子的活性水平與許多已知的強(qiáng)啟動(dòng)子的活性水平相當(dāng)，例如(1)CaMV35S啟動(dòng)子(Atanassova等人，PlantMol.Biol.37:275-285(1998);Battraw和Hall,PlantMol.Biol.l5:527隱538(1990);Holtorf等人，PlantMol.Biol.29:637國646(1995);Jefferson等人，EMBOJ.6:3901-3907(1987);Wilmink等人，PlantMol.Biol.28:949-955(1995));(2)鼠耳芥屬"油'—&)油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(Plant等人，PlantMol.Biol.25:193-205(1994);Li,TexasA&MUniversityPh.D.dissertation,pp.107-128(1997));(3)鼠耳芥屬泛蛋白延伸蛋白啟動(dòng)子(Callis等人，JBiol.Chem,265(21):12486陽93(1990";(4)西紅柿泛蛋白基因啟動(dòng)子(Rollfinke等人，Gene.211(2):267-76(1998));(5)大豆熱休克蛋白啟動(dòng)子(Schoffl等人，MolGenGenet.217(2-3):246-53(1989));和(6)玉米H3組蛋白基因啟動(dòng)子(Atanassova等人,PlantMolBiol.37(2):275-85(1989))。膜聯(lián)蛋白啟動(dòng)子的另一個(gè)有用的特征是其在發(fā)育中的種子中的表達(dá)概況。膜聯(lián)蛋白啟動(dòng)子在發(fā)育中的種子的早期階段(授粉后10天之44前)最活躍，而在后期階段很大程度上靜止。膜聯(lián)蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)概況不同于許多種子特異性啟動(dòng)子，例如種子貯藏蛋白啟動(dòng)子，其通常在發(fā)育的后期階段提供最高的活性(Chen等人，Dev.Genetl0:112-122(1989);Ellerstrom等人，PlantMol.Biol.32:1019-1027(1996);Keddie等人，PlantMol.Biol.24:327-340(1994);Plant等人，(同上)；Li,(同上))。盡管膜聯(lián)蛋白啟動(dòng)子具有更常規(guī)的表達(dá)概況但仍與其它已知的種子特異性啟動(dòng)子不同。因此，當(dāng)需要在胚的早期發(fā)育階段超表達(dá)或抑制基因時(shí)，膜聯(lián)蛋白啟動(dòng)子將是非常有吸引力的候選者。例如，超表達(dá)調(diào)節(jié)胚早期發(fā)育的基因或參與種子成熟前代謝的基因可能是所需的。在鑒定出適用于表達(dá)特異性△-5去飽和酶編碼序列的合適啟動(dòng)子之后，隨后用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段將啟動(dòng)子以有義方向可操作地連接。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的并且在如下文獻(xiàn)中得到了更充分的描述Sambrook,J.等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual;第二版；ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,NewYork,1989(下文稱為"Sambrook等人，1989")或Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Seidman,J.G.,Smith,J.A.和Stmhl,K.(編輯),CurrentProtocolsinMolecularBiology;JohnWileyandSons:NewYork,1990(下文稱為"Ausubel等人,1990，，)。一旦已經(jīng)制備了重組構(gòu)建體，就可隨后通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法(例如，轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化和電穿孔)將它導(dǎo)入至所選擇的植物細(xì)胞中。油料種子植物細(xì)胞是優(yōu)選的植物細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在允許長鏈PUFA表達(dá)的合適條件下培養(yǎng)和再生，隨后任選回收和純化表達(dá)的長鏈PUFA。可以將本發(fā)明的重組構(gòu)建體導(dǎo)入一種植物細(xì)胞中；或者，作為另一種選擇，可以將每種構(gòu)建體導(dǎo)入獨(dú)立的植物細(xì)胞中。在植物細(xì)胞中的表達(dá)可以如上所述的瞬時(shí)或穩(wěn)定的方式完成。期望的長鏈PUFA可以在種子中表達(dá)。從這些轉(zhuǎn)化植物獲得的種子或植物部分也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。植物部分包括分化和未分化的組織，包括但不限于下列部分根、莖、苗、葉、花粉、種子、腫瘤組織和多種形式的細(xì)胞和培養(yǎng)物(如單個(gè)細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚和愈傷組織)。植物組織可存在于植林或植物器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中。術(shù)語"植物器官"指構(gòu)成植物的形態(tài)和功能迥異的部分的植物組織或組織群。術(shù)語"基因組"指(1)存在于生物的每個(gè)細(xì)胞、或病毒或細(xì)胞器中的全套遺傳物質(zhì)(基因和非編碼序列)；和/或(2)作為(單倍體)單位從一個(gè)親本遺傳的全套染色體。因此，本發(fā)明也涉及用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，其包括用本發(fā)明的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞并選擇用本發(fā)明的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞。所關(guān)注的還有用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法，其包括用本發(fā)明的△-5去飽和酶多核苷酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生出植抹。已經(jīng)公布了用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物(主要使用根癌土壤桿菌(爿gra6flc&〃wm^/me/acz'e"s))以及獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中涉及的植物有棉花(美國專利No.5,004,863;美國專利No.5,159,135);大豆(美國專利No.5,569,834;美國專利No.5,416,011);蕓苔屬(美國專利No.5,463,174);花生(Cheng等人，PlantCellRep.15:653-657(1996);McKently等人，PlantCellRep.14:699-703(1995));番木瓜(Ling,K.等人,Bio/technology9:752-758(1991));和豌豆(Grant等人，PlantCellRep.15:254-258(1995))。其它常用的植物轉(zhuǎn)化方法的綜述參見Newell,C.A.(Mol.Biotechnol.16:53-65(2000))。這些轉(zhuǎn)化方法中的一種使用了發(fā)才艮土i裏桿菌(爿graZa"en'wwWn'zoge"^)(Tepfler,M.和Casse-Delbart,F.Microbiol.Sci.,4:24-28(1987))。已G.M.等人，Mol.Biotechnol.3:17-23(1995);Christou,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.84:3962國3966(1987))、顯微注射和粒子轟擊(McCabe:D.E.等人,Bio/Technology6:923(1988);Christou等人，PlantPhysiol.87:671-674(1988))，利用直接遞送DNA來轉(zhuǎn)化大豆。存在多種用于從植物組織再生出植物的方法。具體的再生方法將取決于初始的植物組織和待再生的具體植物物種。從單個(gè)植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體或從多種轉(zhuǎn)化的外殖體的植物的再生、發(fā)育和培養(yǎng)是本領(lǐng)域熟知的(Weissbach和Weissbach,MethodsforPlantMolecularBiology,(編輯)，Academic:SanDiego,CA(1988))。這種再生和生長方法通常包括如下步驟選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以及培養(yǎng)那些個(gè)體化的細(xì)胞通過胚發(fā)育的通常階段、通過生根的小植林階段。轉(zhuǎn)基因胚和種子以相似的方式再生。此后，將所得的轉(zhuǎn)基因的生根的苗種植在合適的植物生長培養(yǎng)基例如土壤中。優(yōu)選地，讓再生的植物自花授粉以提供純合的轉(zhuǎn)基因植物。另外，將從再生植物獲得的花粉與農(nóng)藝學(xué)上重要的品系的種子-繁育的植物雜交。相反，將來自這些重要品系的植物的花粉用于給再生的植物授粉。用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法培養(yǎng)含有所需多肽的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物。除了上面討論的方法，從業(yè)人員還熟悉描述下列操作的具體條件和方法的標(biāo)準(zhǔn)資源資料大分子(如DNA分子、質(zhì)粒等)的構(gòu)建、操作和分離；重組DNA片段和重組表達(dá)構(gòu)建體的產(chǎn)生；和克隆的篩選和分離。參見，例如Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor:NY(1989);Maliga等人，MethodsinPlantMolecularBiology,ColdSpringHarbor:NY(1995);Birren等人,GenomeAnalysis:DetectingGenes,第1巻，ColdSpringHarbor:NY(1998);Birren等人，GenomeAnalysis:AnalyzingDNA,第2巻,ColdSpringHarbor:NY(1998);PlantMolecularBiology:ALaboratoryManual(編輯)Clark，Springer:NY(1997)。油料種子植物的實(shí)例包括但不限于大豆、蕓苔屬物種、向日葵、玉米、棉花、亞麻和紅花。具有至少20個(gè)碳原子以及四個(gè)或更多個(gè)碳-碳雙健的PUFA的實(shí)例包括但不限于co-3脂肪酸如EPA、DPA和DHA以及co-6脂肪酸ARA。從這些植物獲得的種子以及從這些種子獲得的油也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及油料種子植物，其包含(a)第一重組DNA構(gòu)建體，其包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的編碼△-5去飽和酶多肽的分離的多核苷酸；和，(b)至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體，其包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的編碼選自由如下酶組成的組的多肽的分離的多核苷酸A-4去飽和酶、A-5去飽和酶、A-6去飽和酶、A-8去飽和酶、A-9去飽和酶、A-9延長酶、A-12去飽和酶、47△-15去飽和酶、A-17去飽和酶、Cw6延長酶、(:16/18延長酶、018/2。延長酶和C20/22延長酶。另外的去飽和酶在例如美國專利No.6,075,183、5,968,809、6,136,574、5,972,664、6,051,754、6,410,288和PCT公開No.W098/46763、W098/46764、WO00/12720和WOOO/40705中有所討論。所用盒的組合的選擇部分取決于待轉(zhuǎn)化的油料種子植物的PUFA概況和/或去飽和酶/延長酶概況以及將要表達(dá)的長鏈PUFA。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于在植物細(xì)胞中產(chǎn)生長鏈PUFA的方法，其包括(a)用本發(fā)明的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞；以及，(b)選擇產(chǎn)生長鏈PUFA的那些轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于在大豆細(xì)胞中產(chǎn)生至少一種PUFA的方法，其包括(a)用第一重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化大豆細(xì)胞，該重組構(gòu)建體包含(i)可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的編碼△-5去飽和酶多肽的分離的多核苷酸；和,(ii)至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的編碼選自由如下酶組成的組的多肽的分離的多核苷酸A-4去飽和酶、A-5去々包和酶、A-6去々包和酶、A-8去々包和酶、A-9去飽和酶、A-9延長酶、A-12去飽和酶、A-15去飽和酶、△-17去飽和酶、014/16延長酶、d6/!8延長酶、C翻延長酶和C20/22延長酶；(b)從步驟(a)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生大豆植抹；以及，(c)選擇從步驟(b)的植林獲得的、與獲自非轉(zhuǎn)化大豆植林的種子的PUFA水平比較時(shí)具有改變的PUFA水平的那些種子。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體編碼具有A-9延長酶活性的多肽，例如分離自或源于綠光等鞭金藻("oc/zowjga/Z)a"a)的△-9延長酶(GenBank登錄號(hào)AF390174;IgD9e)或者分離自或源于小眼蟲的△-9延長酶。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體編碼具有A-8去飽和酶活性的多肽。例如，PCT〃>開No.WO2005/103253(于2005年4月22日公開)公開了來自鹽生巴夫藻的△-8去飽和酶的氨基酸和核酸序列(也參見美國公開No.2005/0273885)。Sayanova等人，(FEBSLett.580:1946-1952(2006))描述了來自自由生活的土;裏變形蟲卡氏l束變形蟲(JcaW/zamoeMc"We〃"m7)的cDNA的分離和表征，當(dāng)在鼠耳芥屬中表達(dá)時(shí)，該cDNA編碼C20A-8去飽和酶。此外，于2006年4月28日提交的臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)枮?0/795,810的申請(qǐng)人:的受讓人共同未決的申請(qǐng)(代理人檔案號(hào)BB-1566)公開了來自路氏巴夫藻(CCMP459)的A-8去飽和酶的氨基酸和核酸序列。美國臨時(shí)申請(qǐng)No.60/853,563(于2006年10月23日提交；代理人檔案號(hào)BB-1574)公開了來自TW認(rèn)加;top謹(jǐn)，&腦;yCCMP149I、Ew/y6^"e〃(3sp.CCMP389和五w&ep"e〃ac/—gymwa^/caCCMP1594的△-8去飽和酶的氨基酸和核酸序列。微生物表達(dá)系統(tǒng)、盒和載體以及轉(zhuǎn)化本文描述的A-5去飽和酶基因和基因產(chǎn)物(即多曱藻屬物種CCMP626A-5去飽和酶、或其它突變酶、經(jīng)密碼子最優(yōu)化的酶或它們的同源物)也可以在異源微生物宿主細(xì)胞，尤其是含油酵母(如解脂耶氏酵母)的細(xì)胞中產(chǎn)生。含有引導(dǎo)外來蛋白質(zhì)高水平表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的微生物表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些微生物表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體的任一種均可用于構(gòu)建用于產(chǎn)生本發(fā)明序列的任何基因產(chǎn)物的嵌合基因。然后可以將這些嵌合基因通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入進(jìn)合適的微生物中以提供所編碼的酶的高水平表達(dá)?？捎糜谵D(zhuǎn)化合適的微生物宿主細(xì)胞的載體或DNA盒是本領(lǐng)域熟知的。存在于構(gòu)建體中的序列的具體選擇取決于期望的表達(dá)產(chǎn)物(同上)、宿主細(xì)胞的性質(zhì)以及建議的相對(duì)于未轉(zhuǎn)化細(xì)胞分離轉(zhuǎn)化細(xì)胞的手段。然而，通常載體或盒含有引導(dǎo)相關(guān)基因、選擇標(biāo)記和允許自主復(fù)制或染色體整合的序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。合適的載體包含控制轉(zhuǎn)錄起始的基因5'區(qū)(如啟動(dòng)子)和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段3'區(qū)(如終止子)。最優(yōu)選的是，這兩個(gè)控制區(qū)都來源于來自轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞的基因，盡管應(yīng)該了解這種控制區(qū)不必源自選作生產(chǎn)宿主的特定物種的天然基因?？捎糜隍?qū)動(dòng)本發(fā)明A-5去飽和酶ORF在期望微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動(dòng)子有許多并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。實(shí)際上任何能引導(dǎo)這些基因在所選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子都適用于本發(fā)明。在微生物宿主細(xì)胞中的表達(dá)可以瞬時(shí)或穩(wěn)定的方式完成。瞬時(shí)表達(dá)可通過誘導(dǎo)可操作地連接至所關(guān)注的基因的可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的活性完成。穩(wěn)定表達(dá)可通過利用可操作地連接至所關(guān)注的基因的組成型啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)。舉例來說，當(dāng)宿主細(xì)胞為酵母時(shí)，提供在酵母細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯區(qū)，尤其是來自宿主物種的轉(zhuǎn)錄和翻譯區(qū)(例如，對(duì)于在解脂耶氏酵母中使用的優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)，參見PCT公開No.WO2004/101757和WO2006/052870)?？梢允褂迷S多調(diào)節(jié)序列的任意一種，這取決于是期望組成型轉(zhuǎn)錄還是誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄、啟動(dòng)子在表達(dá)所關(guān)注的ORF中的效率、構(gòu)建容易性等。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始密碼子'ATG，周圍的核苷酸序列可影響酵母細(xì)胞中的表達(dá)。如果期望的多肽在酵母中表達(dá)差，則可以將外源基因的核普酸序列進(jìn)行修飾以包含有效的酵母翻譯起始序列來獲得最優(yōu)化的基因表達(dá)。對(duì)于在酵母中表達(dá)，這可以通過將低效率表達(dá)的基因與內(nèi)源性酵母基因(優(yōu)選高度表達(dá)的基因)框內(nèi)融合來對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)誘變而完成。作為另一種選擇，人們可以測定宿主中的共有翻譯起始序列并將該序列工程改造到異源性基因中以最優(yōu)化它們在所關(guān)注的宿主中的表達(dá)。終止區(qū)可源于起始區(qū)從其獲得的基因的3'區(qū)或來自不同的基因。大量的終止區(qū)是已知的并且(在用于與它們源自的屬和物種相同和不同的屬和物種兩者時(shí))在多種宿主中發(fā)揮的功能令人滿意。終止區(qū)的選擇通常更多是為了方便而不是因?yàn)槿魏翁厥獾男再|(zhì)。優(yōu)選地，當(dāng)微生物宿主為酵母細(xì)胞時(shí)，終止區(qū)來源于酵母基因(尤其是糖酵母屬(Sacc/zar畫jA^y)、裂殖糖酵母屬(iSWn'myacc/(aro，(^)、假絲酵母屬、耶氏酵母屬或克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces))。編碼Y-干擾素和a-2干擾素的哺乳動(dòng)物基因的3'區(qū)也已知在酵母中發(fā)揮功能。終止控制區(qū)也可以來源于優(yōu)選宿主的多種天然基因。任選地，終止位點(diǎn)可以是非必需的；然而，如果包括則是最優(yōu)選的。盡管無意于限制，但可用于本公開內(nèi)容的終止區(qū)包括解脂耶氏酵母細(xì)胞外蛋白酶(XPR;GenBank登錄號(hào)M17741)的約lOObp的3'區(qū)；酰基輔酶A氧化酶(Aco3:GenBank登錄號(hào)AJ001301和No.CAA04661;Pox3:GenBank登錄號(hào)XP—503244)終止子；Pex20(GenBank登錄號(hào)AF054613)終止子；Pexl6(GenBank登錄號(hào)U75433)終止子；丄0/(GenBank登錄號(hào)Z50020)終止子；(GenBank登錄號(hào)AJ012632)終止子；和3-氧代?；?輔酶A辟L解酶(OCT;GenBank登錄號(hào)X69988)終止子。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所意識(shí)到的，僅僅將基因插入到克隆載體中不能保證它將被成功地以所需要的水平表達(dá)。響應(yīng)于對(duì)高表達(dá)率的需要，通過操作許多控制轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、氧限制和從微生物宿主細(xì)胞分泌方面的不同遺傳元件，已經(jīng)建立了許多專用的表達(dá)載體。更具體地講，已經(jīng)進(jìn)行操作來控制基因表達(dá)的一些分子特征包括(1)相關(guān)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子序列的性質(zhì)；(2)所克隆基因的拷貝數(shù)目以及該基因是質(zhì)粒攜帶的還是整合到了宿主細(xì)胞的基因組中；(3)所合成的外來蛋白質(zhì)的最終細(xì)胞定位；(4)蛋白質(zhì)在宿主生物內(nèi)的翻譯和正確折疊的效率；(5)所克隆基因的mRNA和蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)的固有穩(wěn)定性；和(6)所克隆基因中的密碼子使用，以使得其頻率與宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子使用頻率接近。這些類型的#~飾的每一種都包含于本發(fā)明中，作為進(jìn)一步最優(yōu)化本文所描述的A-5去飽和酶的表達(dá)的手段。一旦已經(jīng)獲得適于在合適的微生物宿主細(xì)胞(如含油酵母)中表達(dá)的編碼多肽的DNA(如包含啟動(dòng)子、ORF和終止子的嵌合基因)，則將其置于能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒載體中，或?qū)⑵渲苯诱系剿拗骷?xì)胞的基因組中。表達(dá)盒的整合可以在宿主基因組中隨機(jī)地發(fā)生或者可以通過使用這樣的構(gòu)建體來靶向，該構(gòu)建體含有足以靶向宿主基因座中的重組的與宿主基因組同源的區(qū)。如果構(gòu)建體靶向內(nèi)源性基因座，則全部或一些轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)區(qū)可以由內(nèi)源性基因座提供。在本發(fā)明中，在解脂耶氏酵母中表達(dá)基因的優(yōu)選方法是將線性DNA整合到宿主的基因組中；而且，當(dāng)期望基因高水平表達(dá)時(shí)，整合到基因組中的多個(gè)位置可以是尤其有用的[如在t/ra3基因座(GenBank登錄號(hào)AJ306421)、丄ew2基因座(GenBank登錄號(hào)AF260230)、丄"5基因(GenBank登錄號(hào)M34929)、Jco2基因座(GenBank登錄號(hào)AJ001300)、尸ox3基因座(Pox3:GenBank登錄號(hào)XP503244;或Aco3:去飽和酶基因座(PCT公開No.W02004/104167)、L,》/基因座(GenBank登錄號(hào)Z50020)和/或丄02基因座(GenBank登錄號(hào)AJO12632)]。有利的是，t/ra3基因可反復(fù)地與5-氟乳清酸(5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；"5-FOA，，)選擇(下文)聯(lián)合使用，以容易地允許基因修飾以簡易的方式整合到耶氏酵母基因組中。如果兩個(gè)或更多個(gè)基因從獨(dú)立的復(fù)制載體表達(dá)，則希望每個(gè)載體具有不同的選擇手段并且應(yīng)該缺乏與其它構(gòu)建體的同源性以維持穩(wěn)定表達(dá)和防止元件在構(gòu)建體之間重配(reassortment)?？捎脤?shí)馬全方法確定調(diào)節(jié)區(qū)、選擇手段和導(dǎo)入的構(gòu)建體的增殖方法的明智選擇，以便所有導(dǎo)入的基因都以需要的水平表達(dá)從而提供所需產(chǎn)品的合成。包含目的基因的構(gòu)建體可以通過任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入到微生物宿主細(xì)胞中。這些技術(shù)包括轉(zhuǎn)化(如醋酸鋰轉(zhuǎn)化[MethodsinEnzymology,194:186-187(1991)])、原生質(zhì)體融合、基因槍轟擊(bolisticimpact)、電穿孔、顯微注射或任何將所關(guān)注的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中的其它方法。適用于含油酵母(即解脂耶氏酵母)的更具體的教導(dǎo)包括U.S.4,880,741和U.S.5,071,764以及Chen,D.C.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.,48(2):232-235(1997"。為方便起見，已經(jīng)通過任何方法操縱而來攝取DNA序列(如表達(dá)盒)的宿主細(xì)胞在本文中將稱為"轉(zhuǎn)化的"或"重組的"。因此，術(shù)語"轉(zhuǎn)化的"和"重組的"在本文中可互換使用。轉(zhuǎn)化的宿主將具有至少一個(gè)拷貝的表達(dá)構(gòu)建體，而且可以具有兩個(gè)或更多個(gè)拷貝，這取決于該基因是整合到基因組內(nèi)、被擴(kuò)增還是存在于具有多拷貝數(shù)的染色體外元件上。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可通過多種選擇技術(shù)鑒定，如在PCT公開No.WO2004/101757和WO2006/052870中描述的。本文4吏用的優(yōu)選選擇方法是對(duì)卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418的抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、賴氨酸、色氨酸或組氨酸的培養(yǎng)基上生長的能力。在備選的實(shí)施方案中，將5-FOA用于選擇酵母Ura-突變體。該化合物對(duì)具有編碼乳清苦5'-單磷酸脫羧酶(OMP脫羧酶)的功能性URA3基因的酵母細(xì)胞有毒性；因此，基于這種毒性，5-FOA特別可用于選擇和鑒定Ura-突變酵母菌4朱(Bartel,P.L.和Fields，S.,Yeast2-HybridSystem,Oxford52University:NewYork,笫7巻，第109-147頁，1997)。更具體地講，其中i;5-FOA抗i進(jìn)行選^。^后，可以將二蔟多個(gè)嵌合基因和新的Ura3基因整合至耶氏酵母基因組中的不同基因座，由此產(chǎn)生具有Ura+表型的新菌抹。當(dāng)將導(dǎo)入的Ura3基因敲除時(shí)，后面的整合產(chǎn)生了新的Ura3-菌林(仍利用5-FOA選擇鑒定)。因此，Ura3基因(與5-FOA選擇結(jié)合)可在多輪轉(zhuǎn)化中用作選擇標(biāo)記。轉(zhuǎn)化后，適合于本發(fā)明A-5去飽和酶(以及任選在宿主細(xì)胞中共表達(dá)的其它PUFA酶)的底物可以由宿主自然產(chǎn)生或轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生，或者它們可以從外源提供。用于表達(dá)本發(fā)明基因和核酸片段的微生物宿主細(xì)胞可以包括在多種原料(包括簡單或復(fù)雜的碳水化合物、脂肪酸、有機(jī)酸、油和醇類和/或碳?xì)浠衔?上于廣泛的溫度和pH值范圍內(nèi)生長的宿主?；谏暾?qǐng)人:的受讓人的需要，本發(fā)明描述的基因?qū)⒃诤徒湍?并且尤其是解脂耶氏酵母)中表達(dá)；但是預(yù)期，由于轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)生物合成裝置是高度保守的，任何細(xì)菌、酵母、藻類和/或真菌都將是用于表達(dá)本發(fā)明的核酸片段的合適的微生物宿主。然而，優(yōu)選的微生物宿主是含油酵母。這些生物天然能夠合成并積聚油，其中油可構(gòu)成超過約25%的細(xì)胞干重，更優(yōu)選超過約30%的細(xì)胞干重，而最優(yōu)選超過約40%的細(xì)胞干重。通常鑒定為含油酵母的屬包括但不限于耶氏酵母屬、假絲酵母屬、紅酵母屬、紅冬孢屬、隱球酵母屬、絲孢酵母屬和油脂酵母屬。更具體地講，示例性的油合成酵母包括類酵母紅冬孢(^ot/as/o^/^w/on//w'a^)、斯達(dá)氏油脂酵母(丄Z/7om)/cesstorA:e>77)、產(chǎn)油油月旨酵母(丄.///o/erws)、拉可夫氏4叚絲酵母(Cam^foreWbw力)、鐵紅假絲酵母(C./w/c/zem'ma)、熱帶假絲酵母(C.ro/zca/")、產(chǎn)朊假絲酵母(C.w"/k)、茁芽絲孢酵母(7Wc/2as_poraw/w〃<my)、皮狀絲孑包酵母(71c齒we謂)、股粘紅酵母(A/zodotorw/ag/w""z^)、禾木科紅酵母(A.gra脂m、)和解脂耶氏酵母(以前歸類為解脂假絲酵母(Om&^/*o/;^ca))。最優(yōu)選的是含油酵母解脂耶氏酵母；而且，在其它實(shí)施方案中，最優(yōu)選的是命名為ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944、ATCC#76982和/或LGAMS(7)1的解脂耶氏酵母菌林(PapanikolaouS.和AggelisG.,Bioresour.Technol.82(1):43畫9(2002))。在歷史上，多種解脂耶氏酵母菌林已經(jīng)被用于生產(chǎn)和制備如下物質(zhì)異檸檬酸裂解酶、脂肪酶、聚羥基鏈烷酸酯、檸檬酸、赤蘚醇、2-酮戊二酸、Y-癸內(nèi)酯、Y-十二內(nèi)酯和丙酮酸。適用于工程化ARA、EPA和DHA在解脂耶氏酵母中的產(chǎn)生的具體教導(dǎo)分別在美國專利申請(qǐng)No.ll/264784(WO2006/055322)、美國專利申請(qǐng)No.ll/265761(WO2006/052870)和美國專利申請(qǐng)No.11/264737(WO2006/052871)中有提供。其它優(yōu)選的微生物宿主包括含油細(xì)菌、藻類和其它真菌；而且，在該廣的微生物宿主的組中，特別關(guān)注的是合成co-3/w-6脂肪酸的微生物(或那些能被基因工程化而達(dá)到該目的的微生物[如其它酵母例如啤酒斗唐酵母(5Wcc/zoTO附y(tǒng)ce5"ce"v,wae)])。因jt匕，例如，用處于i秀導(dǎo)型或調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子控制下的任何本發(fā)明的△-5去飽和酶基因轉(zhuǎn)化高山被孢霉(在商業(yè)上用于生產(chǎn)ARA)可以產(chǎn)生能合成增加量的DGLA的轉(zhuǎn)化生物。Mackenzie等人(Appl.Environ.Microbiol.,66:4655(2000))描述了轉(zhuǎn)化高山被孢霉的方法。類似地，美國7,001,772公開了轉(zhuǎn)化破嚢壺菌目(Thraustochytriales)微生物的方法?；谏鲜鼋虒?dǎo)，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分別產(chǎn)生ARA或EPA的方法，該方法包括(a)提供含油酵母，其包含(i)第一重組DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的編碼△-5去飽和酶多肽的分離的多核普酸；和，(ii)分別由DGLA或ETA組成的去飽和酶底物的來源；以及，(b)在存在合適的可發(fā)酵碳源的情況下培育步驟(a)的酵母，其中該編碼A-5去飽和酶多肽的基因得以表達(dá)，并將DGLA轉(zhuǎn)化成ARA或?qū)TA轉(zhuǎn)化成EPA;以及，(c)任選地分別回收步驟(b)的ARA或EPA?？赡苄枰┙o底物。當(dāng)然，由于含油酵母中天然產(chǎn)生的PUFA局限于18:2脂肪酸(即LA)和較不常見的18:3脂肪酸(即ALA),在本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將對(duì)含油酵母進(jìn)行基因工程改造以除了本文所述的A-5去飽和酶之外還表達(dá)長鏈PUFA生物合成所必需的多種酶(由此使得能產(chǎn)生如ARA、EPA、DPA和DHA)。具體地講，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含油酵母，其包含(a)第一重組DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的編碼A-5去飽和酶多肽的分離的多核苷酸；和，(b)至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體，其包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的編碼選自由下列酶組成的組的多肽的分離的多核苷酸A-4去飽和酶、A-5去飽和酶、A-6去飽和酶、A-9去飽和酶、A-12去飽和酶、A-15去飽和酶、A-17去飽和酶、A-9延長酶、(:14/16延長酶、(:16/18延長酶、ds/2。延長酶和C20/22延長酶。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體編碼具有A-9延長酶活性的多肽，如分離自或源于綠光等鞭金藻的A-9延長酶(GenBank登錄號(hào)AF390174;IgD9e或IgD9eS)或分離自或源于小眼蟲的△-9延長酶。微生物中co-3和/或co-6脂肪酸生物合成的代謝工程改造操縱生化途徑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的；而且，預(yù)計(jì)很多操縱將可能使含油酵母并且尤其是解脂耶氏酵母中的co-3和/或oo-6脂肪酸的生物合成達(dá)到最大程度。這種操縱可能需要直接在PUFA生物合成途徑中進(jìn)行代謝工程改造或需要額外的協(xié)同操縱多種其它代謝途徑。對(duì)于在PUFA生物途徑內(nèi)的操縱，期望增加LA的產(chǎn)生以使得能增加oo-6和/或co-3脂肪酸的產(chǎn)生。引入和/或擴(kuò)增編碼A-9和/或A-12去飽和酶的基因可能會(huì)實(shí)現(xiàn)該期望。為了最大水平的產(chǎn)生w-6不飽和脂肪酸，本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知，在基本不含有ALA的宿主微生物中所述產(chǎn)生是有利的；因此，優(yōu)選地，通過移除或抑制允許LA轉(zhuǎn)化成ALA的A-15或co-3型去飽和酶活性來選擇或獲得宿主。作為另一種選擇，可能期望最大程度的產(chǎn)生co-3脂肪酸(而最小程度地合成oo-6脂肪酸)。在該實(shí)例中，人們可使用其中允許油酸轉(zhuǎn)化成LA的A-12去飽和酶活性被移除或抑制的宿主微生物；隨后，將合適的表達(dá)盒連同用于轉(zhuǎn)化成ALA的w-3脂肪酸衍生物(如STA、ETrA、ETA、EPA、DPA、DHA)的合適底物(如ALA)—起導(dǎo)入宿主中。在備選的實(shí)施方案中，與co-3和/或co-6脂肪酸生物合成途徑竟?fàn)幠芰炕蛱嫉纳緩交蚋蓴_特定PUFA終產(chǎn)物產(chǎn)生的天然PUFA生物合成途徑中的酶可以通過基因破壞來去除或通過其它手段(如反義mRNA)來下調(diào)。在PUFA生物合成途徑中作為增加ARA、EPA或DHA的手段的操縱(及其相關(guān)技術(shù))的詳細(xì)討論分別在PCT公開No.WO2006/055322、WO2006/052870和WO2006/052871中給出，在TAG生物合成途徑和TAG降解途徑中的所需的操縱(及其相關(guān)技術(shù))也在其中給出。在本發(fā)明的內(nèi)容中，通過上述策略中的任意一種來調(diào)節(jié)脂肪酸生物合成途徑的表達(dá)都可能是有用的。例如，本發(fā)明提供了方法，通過該方法，編碼A-9延長酶/A-8去飽和酶生物合成途徑中的關(guān)鍵酶的基因i皮導(dǎo)入含油酵母中用以產(chǎn)生w-3和/或w-6脂肪酸。利用對(duì)宿主生物進(jìn)行代謝工程改造的多種手段，使該A-5去飽和酶基因在天然不具有co-3和/或oo-6脂肪酸生物合成途徑的含油酵母中表達(dá)并協(xié)調(diào)這些基因的表達(dá)，以最大程度地產(chǎn)生優(yōu)選的PUFA產(chǎn)物將是特別有用的。PUFA產(chǎn)生的微生物發(fā)酵工藝將轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在最優(yōu)化去飽和酶嵌合基因的表達(dá)并且產(chǎn)生最大且最經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的期望PUFA的條件下生長。通常，可以被最優(yōu)化的培養(yǎng)基條件包括碳源的類型和量、氮源的類型和量、碳氮比、不同礦物離子的量、氧水平、生長溫度、pH、生物量生產(chǎn)期的時(shí)長、油積聚期的時(shí)長以及細(xì)胞收獲的時(shí)間和方法。解脂耶氏酵母通常生長在復(fù)合培養(yǎng)基(如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖液體培養(yǎng)基(YPD))或缺乏生長所必需的成分并由此強(qiáng)迫選擇所需表達(dá)盒的確定成分的極限培養(yǎng)基中(如YeastNitrogenBase(DIFCOLaboratories,Detroit,MI))。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的碳源。PCT公開No.WO2004/101757中教導(dǎo)了合適的碳源。盡管預(yù)期本發(fā)明中利用的碳源可以涵蓋許多種含碳源，但優(yōu)選的碳源是糖類、甘油和/或脂肪酸。最優(yōu)選的碳源是葡萄糖和/或含有10-22個(gè)碳的脂肪酸。氮可以由無機(jī)來源(如(NH4)2S04)或有機(jī)來源(如尿素或谷氨酸)提供。除了合適的碳源和氮源，發(fā)酵培養(yǎng)基還必須含有合適的礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖液、維生素和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合含56油宿主生長并促進(jìn)PUFA產(chǎn)生所必需的酶促途徑的其它組分。要特別注意促進(jìn)脂質(zhì)和PUFA合成的幾種金屬離子(如Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2)(Nakahara,T.等人，Ind.Appl.SingleCellOils,D.J.Kyle和R.Colin(編輯).pp61-97(1992))。本發(fā)明中優(yōu)選的生長培養(yǎng)基是普通的商業(yè)制備的培養(yǎng)基，例如YeastNitrogenBase(DIFCOLaboratories,Detroit,MI)。也可以4吏用其它確定成分的生長培養(yǎng)基或合成的生長培養(yǎng)基，且適于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的。適于發(fā)酵的pH范圍通常在約pH4.0至pH8.0之間，其中優(yōu)選pH5.5至pH7.5作為初始生長條件的范圍。發(fā)酵可以在有氧或厭氧條件下進(jìn)行，其中優(yōu)選為微好氧條件。通常，在含油酵母細(xì)胞中積聚高水平的PUFA需要兩個(gè)階段的過程，因?yàn)榇x狀態(tài)必須在生長和脂肪的合成/貯存之間達(dá)到"平衡"。因此，最優(yōu)選的是，兩個(gè)階段的發(fā)酵過程是在含油酵母(如解脂耶氏酵母)中產(chǎn)生PUFA所必需的。這種方法在PCT公開No.WO2004/101757中有所描述，其也描述了多種合適的發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)(即分批式、補(bǔ)料分批式和連續(xù)式)和生長過程中的注意事項(xiàng)。PUFA油的純化和加工PUFA可以以游離脂肪酸或以酯化的形式(例如?；视?、磷脂、硫脂或糖脂)存在于宿主微生物和植物中，而且可以通過本領(lǐng)域熟知的多種手段從宿主細(xì)胞提取。關(guān)于酵母脂質(zhì)的提取技術(shù)、質(zhì)量分析和可4妾受標(biāo)準(zhǔn)的一篇綜述是Z.Jacobs(CriticalReviewsinBiotechnology,12(5/6):463-491(1992))的綜述。有關(guān)下游加工的簡述也可由A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.,45:271-312(1997))提供。通常，用于純化PUFA的手段可以包括用有機(jī)溶劑提取、超聲處理、超臨界流體萃取(如使用二氧化碳)、皂化和物理手段例如擠壓，或它們的組合。另外的詳細(xì)信息可參考PCT公開WO2004/101757的教導(dǎo)。分離種子油的方法是本領(lǐng)域熟知的(Young等人，ProcessingofFatsandOils,TheLipidHandbook,Gunstone等人編輯，第5章第253-257頁；Chapman&Hall:London(1994))。例如，大豆油是利用涉及從含油種子提取并純化食用油產(chǎn)品在內(nèi)的一系列步驟產(chǎn)生的。大豆油和大豆副產(chǎn)品是利用表3中所示出的一般步驟產(chǎn)生的。表3大豆油和副產(chǎn)品產(chǎn)生的一般步驟<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>更具體地講，將大豆種子清洗、調(diào)和、去皮和切成薄片，從而增加油提取的效率。油提取通常通過溶劑(如己烷)萃取來完成，但也可通過物理加壓和/或溶劑萃取的組合來實(shí)現(xiàn)。將所得油稱為粗油。粗油可以通過使磷脂和其它促進(jìn)它們與非水合的甘油三酯級(jí)分(大豆油)分離的極性和中性脂質(zhì)復(fù)合物水合來進(jìn)行脫膠?？梢詫⑺寐蚜字z進(jìn)一步加工以制成在多種食物和工業(yè)產(chǎn)品中用作乳化和隔離(即抗粘)劑的具有重要商業(yè)價(jià)值的卵磷脂產(chǎn)品?？梢赃M(jìn)一步精煉脫膠的油以除去雜質(zhì)(主要為游離脂肪酸、色素和殘留的膠)。精煉可以通過加入與游離脂肪酸反應(yīng)形成皂以及使粗油中的磷脂和蛋白質(zhì)水合的苛性試劑完成。用水沖洗掉在精煉過程中形成的痕量皂。皂料副產(chǎn)品可以直接用于動(dòng)物伺料或經(jīng)酸化以回收游離脂肪酸。可以通過用除去大部分葉綠素和類胡蘿卜素化合物的漂白土吸附去除顏色?？梢詫⒕珶挼挠蜌浠?，從而得到具有多種熔化性和質(zhì)構(gòu)的脂肪。可將冬化(分級(jí)分離)用于除去氬化油中的硬脂酸甘油酯，這通過在小心控制的冷卻條件下的結(jié)晶進(jìn)行。脫臭(主要通過在真空下蒸汽蒸餾進(jìn)行)是最后的步驟并設(shè)計(jì)用以除去賦予油氣味或風(fēng)味的化合物。其它有價(jià)值的副產(chǎn)品如生育酚和固醇也可以在脫臭過程中移出。含有這些副產(chǎn)物的脫臭餾出液可以出售，用于生產(chǎn)天然維生素E和其它高價(jià)值的藥物產(chǎn)品。經(jīng)精煉、漂白、(氫化、分級(jí)分離)和脫臭的油和脂肪可以進(jìn)行包裝并直接出售或者可以進(jìn)一步加工成更特化的產(chǎn)品。大豆種子加工、大豆油生產(chǎn)和副產(chǎn)品利用的更詳細(xì)參考可在Erickson,PracticalHandbookofSoybeanProcessingandUtilization,TheAmericanOilChemists'SocietyandUnitedSoybeanBoard(1995)中找到。大豆油在室溫下呈液態(tài)，因?yàn)榕c諸如椰子、棕櫚、棕櫚仁和可可油之類的油相比，它的飽和脂肪酸含量相對(duì)較低?？梢詫⒔?jīng)精煉和/或純化的含PUFA的植物和微生物油氬化，從而產(chǎn)生具有多種熔化性和質(zhì)構(gòu)的脂肪。許多加工的脂肪(包括涂抹料、糖果用脂肪、硬質(zhì)脂肪、人造黃油和供烤用起酥油等)要求在室溫下有不同的固化程度并且只能通過改變源油的物理性質(zhì)產(chǎn)生。這最普遍通過催化氫化來實(shí)現(xiàn)。氫化是其中在催化劑(例如鎳)的幫助下將氫添加到不飽和脂肪酸雙4建上的化學(xué)反應(yīng)。例如，高油酸大豆油含有不々包和油酸、LA和亞麻酸脂肪酸，而這些脂肪酸的任何一種都可被氫化。氫化具有兩個(gè)主要作用。第一，油的氧化穩(wěn)定性由于不飽和脂肪酸含量減少而增加。第二，油的物理性質(zhì)改變，因?yàn)橹舅嵝揎椩黾恿巳埸c(diǎn)，導(dǎo)致在室溫下為半液體或固體的脂肪。存在許多影響氫化反應(yīng)的變量，這些變量繼而改變終產(chǎn)物的組成。包括壓力、溫度、催化劑類型和濃度、攪拌和反應(yīng)器設(shè)計(jì)在內(nèi)的操作條件是可控制的較重要參數(shù)中的一些。選擇性氫化條件可用于氫化更不飽和的脂肪酸(優(yōu)先于較少不飽和的脂肪酸)。非常輕微地或部分氫化通常用于增加液體油的穩(wěn)定性。進(jìn)一步的氬化使液體油轉(zhuǎn)化成物理形態(tài)為固體的脂肪。氫化的程度取決于為具體終產(chǎn)物設(shè)計(jì)的期望的性能和熔化特性。液體起酥油(用于制備烘烤產(chǎn)品、固體脂肪和用于商業(yè)油炸和烘烤操作的起酥油)和用于人造黃油生產(chǎn)的基本原料是通過氫化獲得的很多可能的油和脂肪產(chǎn)品中的一些。氫化和氫化產(chǎn)品的更詳細(xì)的描述可在如下文獻(xiàn)中找到Patterson,H.B.W.,HydrogenationofFatsandOils:TheoryandPractice.TheAmericanOilChemists'Society(1994)。由于存在由氬化處理產(chǎn)生的反式-脂肪酸異構(gòu)體，氫化油已經(jīng)變得多少有些令人爭議。攝入大量的反式異構(gòu)體已經(jīng)與有害的健康影響相聯(lián)系，包括血漿中低密度和高密度脂蛋白比率增加和冠心病的風(fēng)險(xiǎn)增加。含PUFA油在食品中的用途市場目前支持許多種摻入了to-3和/或oo-6脂肪酸(尤其是ARA、EPA和DHA)的食物和飼料產(chǎn)品。預(yù)期含有PUFA的本發(fā)明的植物/種子油、改變的種子和微生物油將在食物和伺料產(chǎn)品中起作用以賦予當(dāng)前制劑的健康益處。與其它植物油相比，從物理學(xué)觀點(diǎn)看，據(jù)信本發(fā)明的油與食物應(yīng)用中的其它油的作用相似(例如，部分氫化的油例如大豆油可廣泛用作軟涂抹料、人造黃油和烘烤和油炸用起酥油的成分)。本文所述的含有co-3和/或co-6脂肪酸的植物/種子油、改變的種子和微生物油將適用于許多種食物和飼料產(chǎn)品，包括但不限于食物模擬物、肉產(chǎn)品、谷類產(chǎn)品、烘烤食物、小吃和乳制品。此外，本發(fā)明的植物/種子油、改變的種子和微生物油可用于制劑中以在醫(yī)療食物(包括醫(yī)療營養(yǎng)品、膳食補(bǔ)充劑、嬰兒代乳品以及藥物產(chǎn)品)中賦予健康益處。食物加工和食物配制領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解植物和微生物油的量和組成是如何加入至食物或飼料產(chǎn)品中的。該量在本文中將稱為"有效，，量并將取決于食物或飼料產(chǎn)品、期望補(bǔ)充該產(chǎn)品的膳食或醫(yī)療食物或醫(yī)療營養(yǎng)品打算糾正或治療的醫(yī)學(xué)狀況。食物模擬物可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的工藝制備?？商峒暗氖侨饽M物、干酪模擬物、乳模擬物等。用大豆制備的肉模擬物含有大豆蛋白或豆腐以及其它混合在一起用以模擬多種肉類的成分。這些肉替代物作為冷凍、罐裝或干燥食物出售。通常，它們可以與它們所代替的食物相同的方式使用。用大豆制備的肉替代物是蛋白質(zhì)、鐵和B族維生素的極好來源。肉模擬物的實(shí)例包括但不限于火腿模擬物、香腸才莫擬物、熏肉才莫擬物等。食物模擬物可根據(jù)它們的功能和組成性質(zhì)分為仿制品或替代品。例如，仿制千酪只需要與其設(shè)計(jì)代替的千酪相似。然而，產(chǎn)品只有在它與其所替代的干酪在營養(yǎng)上等價(jià)并滿足該干酪最低組成要求時(shí)，通常才可稱為替代干酪。因此，替代干酪通常將具有比仿制干酪更高的蛋白質(zhì)水平并且富含維生素和礦物質(zhì)。乳模擬物或非乳制品食品包括但不限于仿制乳和非乳制品冷凍甜食(如那些用大豆和/或大豆蛋白產(chǎn)品制得的產(chǎn)品)。肉產(chǎn)品涵蓋了很多種產(chǎn)品。在美國，"肉"包括產(chǎn)自牛、豬和羊的"紅肉"。除了紅肉，還有禽類肉，其包括雞肉、火雞肉、鵝肉、珍珠雞肉、鴨肉和魚肉及貝類。存在許多種類的風(fēng)干的肉產(chǎn)品和加工的肉產(chǎn)品新鮮、熏制和油炸的肉產(chǎn)品以及熏制和煮熟的肉產(chǎn)品。香腸和熱狗是加工的肉產(chǎn)品的實(shí)例。因此，如本文使用的術(shù)語"肉產(chǎn)品"包括但不限于加工的肉產(chǎn)品。谷類食品是來源于糧谷加工的食品。糧谷包括來自產(chǎn)生可食用谷粒(種子)的禾本科的任何植物。最普及的谷物是大麥、玉米、稷、燕麥、奎奴亞藜、稻、黑麥、高粱、黑小麥、小麥和野生稻。谷類食品的實(shí)例包括但不限于整個(gè)谷物、粉碎的谷物、粗磨粉、面粉、糠、胚芽、早餐谷類食物、擠出的食物、意大利面食等。烘烤食品包括上述的任何谷類食品并且已經(jīng)經(jīng)過烘烤或與烘烤相當(dāng)?shù)姆绞?即通過接受熱處理來干燥或硬化)加工。烘烤食品的實(shí)例包括但不限于面包、蛋糕、炸面圈、脆條(bars)、意大利面食、面包屑、烘烤小吃、迷你餅干、迷你脆餅千、迷你曲奇餅和迷你椒鹽巻餅。如上面所提及的，本發(fā)明的油可用作配料。小吃食品包括上文或下文中所描述的任何食品。油炸食品包括經(jīng)油炸過的上文或下文中所描迷的任何食品。保健食品是任何能賦予健康益處的食品。許多源于油料種子的食品可以認(rèn)為是保健食物。飲料可以是液體或干粉的形式。例如，可提及非充碳酸氣的飲料如新鮮的、冷凍的、罐裝的或濃縮的果汁；調(diào)味的或普通的乳飲料等。成年人和嬰兒營養(yǎng)代乳品是本領(lǐng)域熟知且可商業(yè)獲得的(例如來自RossProductsDivision,AbbottLaboratories的Similac、Ensure、Jevity和AHmentum⑧)。嬰兒代乳品是喂養(yǎng)嬰兒和幼兒的液體或復(fù)配粉末。"嬰兒代乳品"在本文中定義為可替代人母乳喂養(yǎng)嬰兒的腸內(nèi)營養(yǎng)產(chǎn)品，并且通常由與水溶液中的理想百分比的碳水化合物及蛋白質(zhì)混合的理想百分比的脂肪組成(例如，參見美國專利No.4,670,285)?；谑澜绶秶慕M成研究以及專家組確定的水平，普通人母乳通常含有約0.20%至0.40%的總脂肪酸(承擔(dān)了來自脂肪的約50%的卡路里)；而一般來說DHA和ARA的比率的范圍應(yīng)該是約1:1至1:2(參見，例如EnfamilLIPIL(MeadJohnson&Company)和SimilacAdvance(RossProductsDivision,AbbottLaboratories的配方))。嬰兒代乳品在嬰兒的膳食中具有特殊的作用，因?yàn)樗鼈兂３Ｊ菋雰旱奈ㄒ粻I養(yǎng)來源；而且，雖然母乳喂養(yǎng)仍然是嬰兒的最佳營養(yǎng)品，但嬰兒代乳品是非常接近的不僅使嬰兒存活而且使嬰兒健壯的笫二大營養(yǎng)品。乳制品是來源于乳的產(chǎn)品。乳模擬物或非乳制品產(chǎn)品來源于乳以外的來源，如上面討論的豆奶。這些產(chǎn)品包括但不限于全脂乳、脫脂乳、發(fā)酵乳制品如酸乳酪或酸乳、奶油、黃油、甜煉乳、脫水乳、調(diào)咖啡白油、咖啡乳脂、水淇^^和干酪等。其中可包含本發(fā)明的含PUFA油的另外的食品是例如口香糖、糖果和糖衣、明膠和布丁、硬糖和軟糖、果醬和果凍、白砂糖、糖替代物、甜沙司、澆頭和糖漿以及干摻合型粉末混合物。含PUFA的油在保健食品和藥物中的用途保健食品是賦予健康益處的任何食品，并包括功能性食物、醫(yī)療食物、醫(yī)療營養(yǎng)品和膳食補(bǔ)充劑。此外，本發(fā)明的植物/種子油、改變的種子和微生物油可以用于標(biāo)準(zhǔn)藥物組合物中(如含有長鏈PUFA的油能容易地?fù)饺氲饺魏紊鲜龅氖称分?，由此產(chǎn)生功能性食物或醫(yī)療食劑的膠嚢、粉末、片劑、軟凝膠、軟膠口嚢劑(g:caps)、一液體i縮劑和乳劑。含PUFA的油在動(dòng)物飼料中的用途動(dòng)物飼料在本文一般定義為旨在用作非人動(dòng)物的飼料或混合在飼料中的產(chǎn)品。本發(fā)明的植物/種子油、改變的種子和微生物油可用作多種動(dòng)物祠料中的配料。更具體地講，盡管不限于此，預(yù)期本發(fā)明的油可用于寵物食品、反芻動(dòng)物食品和家禽食品以及水產(chǎn)動(dòng)物食品中。寵物食品是那些旨在飼喂寵物(如狗、貓、鳥、爬行動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物)的產(chǎn)品。這些產(chǎn)品可以包括上面的谷物和保健食品以及肉和肉副產(chǎn)品、大豆蛋白產(chǎn)品、62草和干草產(chǎn)品(如苜蓿、梯牧草、燕麥或雀麥草、蔬菜)。反芻動(dòng)物食品和家禽食品是那些其中產(chǎn)品旨在飼喂動(dòng)物(如火雞、雞、牛、豬)的產(chǎn)品。與上面的寵物食物一樣，這些產(chǎn)品可以包括谷物和保健食品、大豆蛋白產(chǎn)品、肉類和肉類副產(chǎn)品以及如上面所列的草和干草產(chǎn)品。水產(chǎn)動(dòng)物食品(或"水產(chǎn)祠料(aquafeeds)")是旨在用于水產(chǎn)養(yǎng)殖場(即涉及在淡水或海水中繁殖、培養(yǎng)或飼養(yǎng)水生生物和/或動(dòng)物的場所)的那些產(chǎn)品。實(shí)施例本發(fā)明在下列實(shí)施例中進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例盡管說明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但僅是以例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能確定本發(fā)明的基本特征，并在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，能夠?qū)Ρ景l(fā)明做出多種改變和修飾，以使其適用于多種用法和條件。一般方法實(shí)施例中使用的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的并且在如下文獻(xiàn)中有所描述1.)Sambrook,J.，F(xiàn)ritsch,E.F.和Maniatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1989)(Maniatis);2.)T.J.Silhavy、M.L.Bennan和L.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1984);以及3.)Ausubel，F(xiàn).M.等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWiley國Interscience出版，Hoboken,NJ(1987)。適用于微生物培養(yǎng)物的維持和生長的材料和方法是本領(lǐng)域熟知的。適用于下面實(shí)施例的技術(shù)可在ManualofMethodsforGeneralBacteriology(PhillippGerhardt,R.G.E.Murray,RalphN.Costilow,EugeneW.Nester,WillisA.Wood、NoelR.Krieg和G.BriggsPhillips編輯)，AmericanSocietyforMicrobiology:Washington,D.C.(1994));或ThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第2版，SinauerAssociates:Simderland，MA(1989)的描述中找到。除非另外說明，否則用于微生物細(xì)胞的生長和維持的所有試劑、限制性內(nèi)切酶和材料均獲自AldrichChemicals(Milwaukee,WI)、DIFCOLaboratories(Detroit,MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg,MD)或SigmaChemicalCompany(St,Louis,MO)。大腸桿菌(co//)(XL1-Blue)感受態(tài)細(xì)胞購自StratageneCompany(SanDiego,CA)。大腸桿菌菌抹通常于37°C在LuriaBertani(LB)平板上培養(yǎng)。一般的分子克隆根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等人，同上)來完成。DNA序列是在ABI自動(dòng)測序儀上采用染料終止劑技術(shù)(美國專利5,366,860;EP272,007)使用載體和插入片段特異性引物的組合來產(chǎn)生的。序歹寸編輯在Sequencher(GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)中完成。所有的序列代表在兩個(gè)方向均至少覆蓋兩次。除非在本文中另外說明，否則基因序列的比較使用DNASTAR軟件(DNASTARInc.,Madison,WI)完成。縮寫的含義如下"sec"表示秒，"min"表示分鐘，"h，，表示小時(shí)，"d"表示天，'>L，，表示微升，"mL"表示毫升，"L"表示升，'VM"表示微摩爾濃度，"mM"表示毫摩爾濃度，"M"表示摩爾濃度，"mmol"表示毫摩爾，>mole，，表示微摩爾，"g"表示克，'、g"表示微克，"ng"表示納克，"U"表示單位，"bp"表示堿基對(duì)而"kB"表示千堿基對(duì)。解脂耶氏酵母的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)解脂耶氏酵母菌林ATCC#20362購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville,MD)。解脂耶氏酵母菌林通常在28°C下于YPD瓊脂(1%酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂)上培育。除非另外說明，否則解脂耶氏酵母的轉(zhuǎn)化根據(jù)Chen,D.C.等人(Appl.MicrobiolBiotechnol.,48(2):232-235(1997))的方法完成。簡而言之，將耶氏酵母劃線到Y(jié)PD平板上，并在30。C下培育大約18小時(shí)。從平板上刮掉幾大環(huán)量的細(xì)胞并將其重懸浮于含有下面成分的lmL轉(zhuǎn)化緩沖液中2.25mL50%PEG,平均分子量為3350;0.125mL2M醋酸鋰，pH6.0;0.125mL2MDTT;以及50貼已剪切的鮭精DNA。然后，將大約500ng線性化的質(zhì)粒DNA在100^1重懸浮的細(xì)胞中孵育，并將其在39。C下維持1小時(shí)，每間隔15分鐘進(jìn)行渦旋混合。將細(xì)胞鋪平板在選擇培養(yǎng)基平板上并在30°C下維持2至3天。為了選擇轉(zhuǎn)化體，一般使用極限培養(yǎng)基("MM");MM的組成如下不含硫酸銨或氨基酸的0.17%酵母氮基質(zhì)(DIFCOLaboratories,Detroit,MI)、2%葡萄糖、0.1%脯氨酸,pH6.1。視需要加入尿嘧啶補(bǔ)充劑至終濃度0.01%(由此產(chǎn)生用20g/L瓊脂制備的"MMU"選擇培養(yǎng)基)。備選地，將轉(zhuǎn)化體在5-氟乳清酸("FOA，，；也稱為5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物)選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇，該培養(yǎng)基包含不含硫酸銨或氨基酸的0.17%酵母氮基質(zhì)(DIFCOLaboratories),2%葡萄糖、0.1%月甫氨酸、75mg/L尿嘧啶、75mg/L尿普、卯0mg/LFOA(ZymoResearchCorp.,Orange，CA)和20g/L瓊脂。解脂耶氏酵母的脂肪酸分析為了進(jìn)行脂肪酸分析，將細(xì)胞通過離心收集并如Bligh,E.G.&Dyer,W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.,37:911-917(1959))中所描述的提取脂質(zhì)。脂肪酸甲酯通過將脂質(zhì)提取物與甲醇鈉進(jìn)行酯交換作用而制備(Roughan，G.和NishidaI.,ArchBiochemBiophys.,276(1):38-46(1990))并隨后將其用配有30-mx0.25mm(i.d.)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard6890氣相色語儀(GC)分析。烘箱溫度以3.5。C/min從170°C(保持25min)升到185°C。為了進(jìn)行直接的堿催化酯交換反應(yīng)，收獲耶氏酵母培養(yǎng)物(3mL)，在蒸餾水中洗滌一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10分鐘。將甲醇鈉(100(Li1,1%)加入至樣品中，然后將樣品渦旋并搖動(dòng)20分鐘。加入3滴1MNaCl和400W己烷后，將樣品渦旋并離心。移出上層并如上描述的用GC進(jìn)行分析。實(shí)施例1多甲藻屬物種CCMP626的脂質(zhì)概況和RNA分離多甲藻屬物種CCMP626(紅藻)購自Provasoli-Guillard國立海生浮游才直物培養(yǎng)中心(TheProvasoli-GuillardNationalCenterforCultureofMarinePhytoplankton)(BoothbayHarbor,Maine)。將約200mg細(xì)胞在真空下千燥5分鐘，重懸浮于100|iL氫氧化三曱基锍(TMSH)中并在室溫下?lián)u晃孵育15分鐘。隨后，力。入0.5mL己烷并將小瓶在室溫下?lián)u晃孵育15分鐘。^f吏用配有Omegawax320熔融石英毛細(xì)管柱(產(chǎn)品編號(hào)#24152,SupelcoInc.,Bellefonte,PA)的Hewlett-Packard6890氣相色譜儀對(duì)脂肪酸曱酯(從己烷層取5pL注射上樣)進(jìn)行分離和定量。用程序控制烘箱溫度在220。C下保持2.7分鐘，以20。C/mm上升到240。C并隨后另外保持2.3分鐘。載氣由Whatman氫發(fā)生器提供。將保留時(shí)間與那些市售的甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(目錄號(hào)弁U-99-A,Nu-ChekPrepInc.,Elysian,MN)的保留時(shí)間比較，且所得色譜圖在圖2中示出。GC概況表明多曱藻屬物種CCMP626細(xì)胞既產(chǎn)生大量的ARA又產(chǎn)生大量的EPA,因此說明存在高效的A-5去飽和酶。因?yàn)橹粰z測到痕量的GLA,故而推斷多曱藻屬物種CCMP626利用△-9延長酶/A-8去飽和酶途徑產(chǎn)生PUFA。從CCMP626細(xì)胞提取總RNA。具體地講，通過離心從1L培養(yǎng)物收集細(xì)胞，用液N2快速冷凍并保存在-80。C下。將細(xì)胞沉淀重懸浮于lmLTrizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)中并與0.6mL的玻璃珠(0.5mm)混合，然后將混合物用BiospecMiniBeadbeater(Bartlesville,OK)在最高設(shè)定值下勻漿3分鐘。然后根據(jù)Invitrogen的Trizol使用方法分離總RNA。以該方式，從lL培養(yǎng)物獲得了總RNA(34pg)。將總RNA樣品用于制備cDNA。實(shí)施例2多甲藻屬物種CCMP626的cDNA合成用如下方法直接從多曱藻屬物種CCMP626總RNA合成cDNA。具體地講，將總RNA用來自Invitrogen3'-RACE試劑盒(Carlsbad,CA)中的銜接頭引物AP(SEQIDNO:27)在存在BD-ClontechCreatorSmartcDNA文庫試劑盒(Mississauga,ON,加拿大))中的SmartIV寡核苷酸(SEQIDNO:28)時(shí)引發(fā)。利用3'-RACE試劑盒中的SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶根據(jù)CreatorSmartcDNA文庫試劑盒的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將第一鏈cDNA合成混合物用作用于PCR擴(kuò)增的才莫板，將AP引物(SEQIDNO:27)用作3'引物而CDSIII5'引物(SEQIDNO:29)用作5'引物(與BD-ClontechCreatorSmartcDNA文庫試劑盒一起提供)。利用ClontechAdvantagecDNA聚合酶混合物在如下條件下進(jìn)行擴(kuò)增94°C30秒，然后是20個(gè)循環(huán)的94°C10秒和68°C6分鐘。在68°C下進(jìn)行7分鐘最后的延伸反應(yīng)。實(shí)施例3多曱藻屬物種CCMP626A-5去飽和酶基因的一部分編碼區(qū)的分離本實(shí)施例描述了通過利用源于其它已知的A-5和A-8去飽和酶序列的保守區(qū)的引物，鑒定編碼A-5去飽和酶(本文稱為"RD5"[即，紅藻D5]并對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1和2)的一部分多甲藻屬物種CCMP626基因。在評(píng)價(jià)哪種去飽和酶可以使得能設(shè)計(jì)適合于分離多甲藻屬物種CCMP626A-5去飽和酶的簡并引物時(shí)，做了多種考慮。具體地講，申請(qǐng)人知道只有A-5、A-6和A-8去飽和酶序列在它們的N末端包含保守的'HPGG，基序(其中'HPGG，結(jié)構(gòu)域是熟知的細(xì)胞色素B5結(jié)構(gòu)域的部分)；比4支而言，A-9去飽和酶在它們的C-末端具有細(xì)胞色素B5結(jié)構(gòu)域的'HPGG，基序，而A-17和A-12去飽和酶二者均缺乏細(xì)胞色素B5結(jié)構(gòu)域?；趫D2中描述的GC結(jié)果，推斷A-9延長酶/A-8去飽和酶途徑在多曱藻屬物種CCMP626中起作用；因此，在共有N末端保守的'HPGG'基序的去飽和酶中，預(yù)期只有A-5和A-8去飽和酶存在于該生物中。最后，盡管只有少數(shù)A-8去飽和酶序列是已知的，但許多A-5去飽和酶是可公開獲得的。本申請(qǐng)人選擇了那些與"傳統(tǒng)的，，A-5去飽和酶基因具有較低同源性但彼此之間也共有高度同源性的A-5去飽和酶序列。基于上述內(nèi)容，采用DNASTAR軟件的MegAligiT程序中的ClustalW方法(')"曼的，津f確的，Gonnet選項(xiàng)；Thompson等人，NucleicAcidsRes.,22:4673-4680(1994))對(duì)下面表3中示出的四種A-5去飽和酶和兩種A-8去飽和酶進(jìn)行了比對(duì)。表3進(jìn)行比對(duì)來鑒定氨基酸保守區(qū)的△-5和△-8去飽和酶<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>200780017808.9圖3示出了一部分所得的比對(duì)結(jié)果，該部分含有幾段在6種不同生物之間保守的氨基酸序列?；谠摫葘?duì)，設(shè)計(jì)了兩組簡并寡核苷酸來擴(kuò)增來自多曱藻屬物種CCMP626的A-5去飽和酶基因的一部分編碼區(qū)，其對(duì)應(yīng)于圖3中標(biāo)記為"保守區(qū)r，和"保守區(qū)2"的區(qū)域。具體地講，設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)保守區(qū)1的保守氨基酸序列GHH(I/V)YTN(SEQIDNO:19)，同時(shí)設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)保守區(qū)2的保守氨基酸序列NFQ(V/A)(S/N)HV(SEQIDNO:20)。為了減少寡核苷酸的簡并性，設(shè)計(jì)了4組編碼保守區(qū)1的寡核苷酸(即5-lA、5-lB、5-lC和5-lD);并設(shè)計(jì)了4組編碼保守區(qū)2的反義鏈的寡核苷酸(即5-4AR、5-4BR、5-4CR和5-4DR)。表4用于擴(kuò)增來自多甲藻屬物種CCMP626的A-5去飽和酶基因的簡并寡核苷酸寡<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>[注意用于SEQIDNO:30至NO:37的核酸簡并代碼如下R=A/G;Y=C/T;B=G/T/C;而H=A/C/T。]基于圖3中A-5序列的全長序列，推斷上述擴(kuò)增的多曱藻屬物種CCMP626△-5基因片段的長度將為約630bp(其N末端缺少約210個(gè)氨基酸，而其C-末端缺少70個(gè)氨基酸)?？偣策M(jìn)行了16次不同的PCR擴(kuò)增，因?yàn)闄z測了所有的引物組合(即引物5-lA分別與5-4AR、5-4BR、5-4CR和5-4DR中的每一個(gè)單獨(dú)聯(lián)用；類似地，引物5-1B分別與5-4AR、5-4BR、5-4CR和5-4DR中的每一個(gè)聯(lián)用；等)。PCR擴(kuò)增在包含如下成分的50^1總體積中進(jìn)行PCR緩沖液(含有10mMKC1、10mM(NH4)2S04、20mMTris國HCl(pH8.75)、2mMMgS04、0.1%TritonX誦100)、100pg/mLBSA(終濃度)、200|tiM的每種脫氧核糖核苷酸三磷酸、lOpmol的每種引物、lOng多甲藻屬物種CCMP626的cDNA以及l(fā)^il的TaqDNA聚合酶(EpicentreTechnologies,Madison,WI)。熱循環(huán)儀的條件設(shè)定為95°C1分鐘，56°C30秒和72。C1分鐘，35個(gè)循環(huán)，隨后在72。C進(jìn)行10分鐘的最后延伸。使用QiagenPCR純化試劑盒(Valencia,CA)純化PCR產(chǎn)物。在1%(w/v)瓊脂糖中進(jìn)行凝膠電泳后，將接近預(yù)期大小的一個(gè)片段進(jìn)一步純化并隨后克隆到pGEM-T-easy載體(Promega,Madison,WI)中。將連接的DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B的細(xì)月包，并且在含有氨節(jié)青霉素(100|ag/mL)的LB(1%細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5%細(xì)菌用酵母提取物和1%NaCl)瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。對(duì)得自一組12個(gè)轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA進(jìn)行的分析證實(shí)存在預(yù)期大小的插入片段(質(zhì)粒稱為"pT-12-Dl"、"pT-12-D2"、"pT誦12-D3"等直至"pT-12誦D12")。序列分析顯示pT-12-D5含有563bp的片段(SEQIDNO:4),其編碼187個(gè)氨基酸(SEQIDNO:5)(包括對(duì)應(yīng)于保守區(qū)1和2的氨基酸)。多甲藻屬物種CCMP626序列的特性通過進(jìn)行BLAST(基本的局部比對(duì)搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool);Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.,215:403-410(1993))搜索來尋找與BLAST"nr"數(shù)據(jù)庫(包含所有非豐余GenBankCDS的翻譯序列，來源于三維結(jié)構(gòu)BrookhavenProteinDataBank、SWISS-PROT蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫、EMBL和DDBJ數(shù)據(jù)庫的序列)中含有的序列的相似性來確定。采用由國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法，分析該序列與包含在"nr"數(shù)據(jù)庫中的所有可公開獲得的DNA序列的相似性。采用由NCBI提供的BLASTX算法(Gish,W.和States,D.J.,NatureGenetics,3:266畫272(1993)),比較SEQIDNO:4與包含在"nr"數(shù)據(jù)庫中的所有可公開獲得的蛋白質(zhì)序列的相似性。根據(jù)百分比同一性、百分比相似性和期望值，報(bào)告了BLASTX比較的結(jié)果，該結(jié)果總結(jié)了與SEQIDNO:4具有最大相似性的序列。"百分比同一性，，定義為兩種蛋白質(zhì)之間相同的氨基酸的百分比。"百分比相似性"定義為兩種蛋白質(zhì)之間相同的或保守的氨基酸的百分比。"期望值"用給定分值估計(jì)限定匹配數(shù)的匹配的統(tǒng)計(jì)顯著性，該匹配數(shù)是在完全偶然地搜索數(shù)據(jù)庫中這種大小片段時(shí)所預(yù)期的。因此，SEQIDNO:4的翻譯的氨酸酸序列(即SEQIDNO:5)與假微型海鏈藻的A-8鞘脂去飽和酶的氨酸酸序列(GenBank登錄號(hào)AAX14502;SEQIDNO:21)具有64%的同一性和78%的相似性，期望值為2E-64;此外，SEQIDNO:4的部分片段與三角褐指藻的△-5脂肪酸去飽和酶(GenBank登錄號(hào)AAL92562;SEQIDNO:14)具有65%的同一性和78%的相似性，期望值為7E-62。實(shí)施例4多甲藻屬物種CCMP626A-5去飽和酶基因的5'編碼區(qū)的分離為了分離在實(shí)施例3中鑒定的推定的△-5去飽和酶的N末端部分，使用了基于來自兩個(gè)不同公司(即Invitrogen和BD-Clontech)的RACE方法的改良的5'RACE4支術(shù)。簡而言之，將多曱藻屬物種CCMP626的雙鏈cDNA(實(shí)施例2)在5'RACE實(shí)驗(yàn)中用作沖莫板，該實(shí)驗(yàn)包含兩輪獨(dú)立的PCR擴(kuò)增。在第一輪PCR擴(kuò)增中，寡核苦酸引物由基因特異性的寡核苷酸(即ODMW520;SEQIDNO:38)和來自BD國ClontechCreatorSmartcDNA文庫試劑盒的通用寡核苷酸CDSIII5'引物(SEQIDNO:29)組成。PCR擴(kuò)增在包含如下成分的50^1總體積中進(jìn)行25^1的LATaqpre-mix(TaKaRaBioInc.,Otsu,Shiga,520-2193,日本)、10pmole的每種引物和lpl的r"《DNA聚合酶(EpicentreTechnologies,Madison,WI)。熱循環(huán)儀的條件設(shè)定為95°C1分鐘，56°C30秒和72°C1分鐘，35個(gè)循環(huán)，隨后在72。C進(jìn)行IO分鐘的最后延伸。第二輪PCR擴(kuò)增使用1^的來自第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物作為模板。引物由基因特異性的寡核苷酸(即ODMW521;SEQIDNO:39)和BD-Clontech，sCreatorSmartcDNA文庫試劑盒提供的通用寡核苦酸DNRCDS5'(SEQIDNO:40)組成。擴(kuò)增如上所述的進(jìn)4亍。將第二輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物在1%(重量/體積)瓊脂糖上進(jìn)行電泳。然后從膠上純化400bp和800bp之間的產(chǎn)物并將其克隆到pGEM-T-easy載體(Promega,Madison,WI)中。將連接的DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B,并在含有氨節(jié)青霉素(100pg/mL)的LB瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。對(duì)來自包含推定的A-5去飽和酶基因的5'區(qū)的一個(gè)轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析證實(shí)，存在預(yù)期的稱作pT-RD5-5'C2的質(zhì)粒。序列分析表明pT-RD5-5'C2含有693bp的片段(SEQIDNO:6)，該片段與563bp的pT-12-D5片段(實(shí)施例3;SEQIDNO:4)的5'端具有182bp的重疊，并且另外提供511bp的5'上游序列(SEQIDNO:7)(圖4)。pT-RD5誦5'C2的序列也校正了對(duì)應(yīng)于保守區(qū)1的序列，該對(duì)應(yīng)于保守區(qū)1的序列是通過將簡并寡核苷酸用于初始PCR擴(kuò)增pT-12-D5中的563bp片段(實(shí)施例3)而獲得的。然而，在延長的693bp的SEQIDNO:6片段中沒有翻譯起始密碼子。第二輪改良的5'RACE如上描述的進(jìn)行，不同的是將寡核苷酸ODMW541(SEQIDNO:41)和ODMW542(SEQIDNO:42)用作基因特異性引物。然后從凝膠上純化200bp和400bp之間的產(chǎn)物并克隆到pGEM-T-easy載體(Promega,Madison,WI)中。將連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B,并且在含有氨千青霉素(100pg/mL)的LB瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。對(duì)來自包含推定的A-5去飽和酶基因的5'區(qū)的一個(gè)轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析證實(shí)，存在預(yù)期的稱作pT-RD5-5'2nd的質(zhì)粒。序列分析表明pT-RD5-5，2nd含有358bp的片段(SEQIDNO:8),該片段與上述pT-RD5-5'C2中的DNA片段的5'端具有197bp的重疊，并另外提供161bp的5'上游序列(SEQIDNO:9)。一百一"h六(116)bp的5'延長片^殳編碼推定的A-5去飽和酶基因的N末端部分，包括翻譯起始密碼子，因此提供了該基因完整的5'序列。實(shí)施例5多甲藻屬物種CCMP626A-5去飽和酶基因的3'編碼區(qū)的分離為了分離實(shí)施例3中鑒定的推定的A-5去飽和酶的C-末端部分，利用了3'RACE技術(shù)。方法在上面的實(shí)施例4中描述；然而，在第一輪和第二輪的PCR擴(kuò)增兩者中使用的引物在下面的表5中示出。用于3'RACE的寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增基因特異性的寡核普酸通用的寡核苷酸第一輪ODMW523(SEQIDNO:43)AUAP(SEQIDNO:44)第二輪ODMW524(SEQIDNO:45)AUAP(SEQIDNO:44)*引物AUAP在Invitrogen公司的3'-RACE試劑盒(Carlsbad,CA)中提供。在分離和純化產(chǎn)物(即200-500bp)之后，如實(shí)施例4中那樣將片段克隆到pGEM-T-easy載體(Promega)中并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH103中。對(duì)來自包含A-5去飽和酶基因的3'區(qū)的一個(gè)轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析證實(shí)，存在預(yù)期的稱作pT-RD5-3'的質(zhì)粒。序列分析表明pT-RD5-3'含有299bp的片段(SEQIDNO:IO),該片段與563bp的pT-12-D5片段(實(shí)施例3;SEQIDNO:4)的3'端的52bp重疊，并提供247bp的另外的3'下游序列(SEQIDNO:ll)。包含于pT-RD5-3'中的247bp的延長片段的起始202bp編碼推定的A-5去飽和酶基因的C末端編碼區(qū)(包含翻譯終止密碼子)。pT-RD5-3'的序列也校正了對(duì)應(yīng)于保守區(qū)2的序列，該對(duì)應(yīng)于保守區(qū)2的序列是通過將簡并寡核苷酸用于初始PCR擴(kuò)增pT-12-D5中的563bp片段(實(shí)施例3)而獲得的。在兩輪5'RACE和一輪3'RACE之后，確定了整個(gè)推斷的多曱藻屬物種CCMP626△-5去飽和酶(RD5)編碼區(qū)的DNA序列。如在圖4中示出的，基于SEQIDNO:4、6、8和10的比對(duì)，RD5CDS的長度為1392bp(SEQIDNO:l),并編碼具有463個(gè)氨基酸的多肽(SEQIDNO:2)。用全長RD5基因作為查詢序列的BLASTP序列分析算法的結(jié)果表明它與三角褐指藻的A-5脂肪酸去飽和酶(GenBank登錄號(hào)AAL92562;SEQIDNO:14)具有67%的同一性和81%的相似性，期望值為0.0。此外，全長RD5基因與假微型海鏈藻的A-8鞘脂去飽和酶(GenBank登錄號(hào)AAX14502;SEQIDNO:21)具有64%的同一性和76%的相似性，期望值為2E-178。實(shí)施例6包含RD5的構(gòu)建體r>DMW368的產(chǎn)生本實(shí)施例描述了包含F(xiàn)BAIN::RD5::Pex20嵌合基因的pDMW368(圖5C)的產(chǎn)生。該構(gòu)建體經(jīng)設(shè)計(jì)用于將嵌合基因整合進(jìn)解脂耶氏酵母的基因組中并然后研究多曱藻屬物種CCMP626A-5去飽和酶在解脂耶氏酵母中的功能?；赗D5(SEQIDNO:l)的全長cDNA,將寡核苦酸YL807和YL810(分別為SEQIDNO:46和SEQIDNO:47)用作引物以擴(kuò)增RD5的第一部分(圖5A)。引物YL807含有一個(gè)iVcoI位點(diǎn)，而引物YL810含有一個(gè)SamHl位點(diǎn)。然后，將引物YL808和YL809(分別為SEQIDNO:48和SEQIDNO:49)用作引物來擴(kuò)增RD5的第二部分。引物YL809含有一個(gè)SamHl位點(diǎn)，而引物YL808含有一個(gè)Wort位點(diǎn)。利用引物對(duì)YL807/YL810或YL808/YL809,將多甲藻屬物種CCMP626cDNA(實(shí)施例2)作為才莫板，在含有如下成分的50(^1總體積中進(jìn)行各PCR反應(yīng)PCR緩沖液(含有10mMKCl、10mM(NH4)2S04、20mMTris-HCl(pH8.75)、2mMMgS04、0.1%TritonX掘)、100pg/mLBSA(終濃度)、200pM的每種脫氧核糖核苷酸三磷酸、lOpmole的每種引物以及l(fā)pl的尸/wDNA聚合酶(Stratagene,SanDiego，CA)。熱循環(huán)儀的條件設(shè)定為95°Cl分鐘，56°C30秒和72°Cl分鐘，35個(gè)循環(huán)；隨后在72C進(jìn)行IO分鐘的最后延伸。使用QiagenPCR純化試劑盒純化各PCR產(chǎn)物。用Wcol和SawHl消化來自用引物YL807/YL810擴(kuò)增的反應(yīng)的PCR產(chǎn)物，而用6amHl和Mrt消化來自用引物YL808/YL809擴(kuò)增的反應(yīng)的PCR產(chǎn)物。將經(jīng)A^coIASamHl-和SamHl/A^I消化的DNA片段在1%(w/v)瓊脂糖上凝膠電泳后純化，然后與AAcoI/A^I-消化的pZUF17(圖5B;SEQIDNO:22;包含源自異絲水霉的合成的△-17去飽和酶基因["D17st，，](美國專利公開No.2003/0196217A1),該基因經(jīng)密碼子最優(yōu)化以用于在解脂耶氏酵母表達(dá)(PCT公開No.WO2004/101757))定向連接。該連接的產(chǎn)物為pDMW368(圖5C;SEQIDNO:23,因此其包含下列組分表6質(zhì)粒。DMW368的組分<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>術(shù)語"FBAIN啟動(dòng)子"或"FBAIN啟動(dòng)子區(qū)"指在/Z)"/基因編碼的解脂耶氏酵母果糖二磷酸醛縮酶(E.C.4丄2.13)的'ATG，翻譯起始密碼子之前而且是表達(dá)所必需的5'上游非翻譯區(qū)，加上具有基因的內(nèi)含子的一部分5'編碼區(qū)。實(shí)施例7產(chǎn)生解脂耶氏酵母菌抹M4以產(chǎn)生占總脂質(zhì)約8%的DGLA本實(shí)施例描述了來源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株M4的構(gòu)建，該菌抹M4能產(chǎn)生相對(duì)總脂質(zhì)而言8%的DGLA。通過引入pKUNF12T6E構(gòu)建體(圖6A;SEQIDNO:24),該菌抹經(jīng)工程改造而表達(dá)A-6去飽和酶/A-6延長酶途徑。產(chǎn)生該構(gòu)建體用以將四個(gè)嵌合基因(包含A-12去飽和酶、A-6去飽和酶和兩種ds/2o延長酶)整合至野生型耶氏酵母菌抹ATCC#20362的Vra3基因座，由此使得能產(chǎn)生DGLA。因而，pKUNF12T6E含有下列組分表7質(zhì)粒pKUNF12T6E(SEOIDNO:24)的描述SEQIDNO:24中的RE位點(diǎn)和核苷酸片段和嵌合基因組分的描述(9420-8629)784bp的耶氏酵母[7ra3基因的5'部分(GenBank登錄號(hào)AJ306421)(12128-1)516bp的耶氏酵母/7ra3基因的3'部分(GenBank登錄號(hào)AJ306421)(6380-8629)FBAIN::EL1S::Pex20,包含F(xiàn)BAIN:解脂耶氏酵母FBAIN啟動(dòng)子(PCT公開No.WO2005/049805;美國專利7,202,356，在圖中標(biāo)為"Fbal+內(nèi)含子")EL1S:來源于高山被孢霉(GenBank登錄號(hào)AX464731)的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的延長酶l基因(PCT公開No.WO2004/101753)Pex2O:來自耶氏酵母尸e義20基因(GenBank登錄號(hào)AF054613)的Pex20終止子序列5g/II/S而I(4221-6380)TEF::A-6S:丄ipl，包含TEF:解脂耶氏酵母TEF啟動(dòng)子(GenBank登錄號(hào)AF054508)A-6S:來源于高山被孢霉(GenBank登錄號(hào)AF465281)的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的△-6去飽和酶基因(PCT公開WO2004/101753)Lipl:來自耶氏酵母Z^/基因(GenBank登錄號(hào)Z50020)的Lipl終止子序列尸艦I/C7al(4207-1459)FBA::F.A-12::Lip2,包含F(xiàn)BA:解脂耶氏酵母FBA啟動(dòng)子(PCT公開No.WO2005/049805;美國專利7,202,356;在圖中標(biāo)為"FBA1")<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>將質(zhì)粒pKUNF12T6E用AycI/印/zI消化，然后根據(jù)"一般方法"用于轉(zhuǎn)化野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪平板在FOA選擇培養(yǎng)基平板上并在30°C下維持2至3天。挑取FOA抗性菌落并劃線到MM和MMU選擇平板上。將在MMU平板上生長但不在MM平板上生長的菌落選作/7m-菌抹。然后將t/ra-菌抹的單菌落接種到液體MMU中，在30。C下以250rpm/min搖動(dòng)2天。離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過酯交換作用制備脂肪酸曱酯，并隨后用Hewlett-Packard6890GC分析。GC分析顯示，DGLA出現(xiàn)在含有pKUNF12T6E的四個(gè)嵌合基因的轉(zhuǎn)化體中，但沒有出現(xiàn)在野生型耶氏酵母對(duì)照抹中。所選的32個(gè)f/ra—菌抹中大部分產(chǎn)生占總脂質(zhì)約6%的DGLA。有兩個(gè)菌株(即菌抹M4和13-8)產(chǎn)生了占總脂質(zhì)約8。/。的DGLA。實(shí)施例8解脂耶氏酵母M4菌抹中RD5基因的功能分析如"一般方法"中所描述的，將質(zhì)粒pDMW368(實(shí)施例6;包含F(xiàn)BAIN::RD5::Pex20嵌合基因)轉(zhuǎn)化進(jìn)M4菌抹(實(shí)施例7)中。在MM平板上選擇轉(zhuǎn)化體。在30。C下生長2天后，挑取在MM平板上生長的3個(gè)轉(zhuǎn)化體并重新劃線到新鮮的MM平板上。一旦有生長，就將這些菌抹在30。C下單獨(dú)接種到3mL的液體MM中，并以250rpm/min搖動(dòng)2天。離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過酯交換作用制備脂肪酸曱酯，并隨后用Hewlett-Packard6890GC分析。GC分析顯示，所有這3個(gè)轉(zhuǎn)化體中所產(chǎn)生的總脂質(zhì)都含有約4.2%的DGLA和2.2%的ARA,其中在這三個(gè)菌抹中DGLA轉(zhuǎn)化成ARA的轉(zhuǎn)換效率經(jīng)測定為約35%(平均值)。轉(zhuǎn)換效率根據(jù)下面的公式測量([產(chǎn)物]/[底物+產(chǎn)物])x100,其中'產(chǎn)物，包括中間產(chǎn)物和該途徑中源自其的所有產(chǎn)物。因此，該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本文中描述為SEQIDNO:1和2的克隆的多曱藻屬物種CCMP626A-5去飽和酶有效地將DGLA去飽和而形成ARA。實(shí)施例9用于在解脂耶氏酵母中表達(dá)的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的A-5去飽和酶基因("RD5S")的合成將多曱藻屬物種CCMP626的A-5去飽和酶基因(SEQIDNO:l和2;RD5)的密碼子使用以與PCT公開No.WO2004/101753和美國專利7,125,672中描述相似的方式最優(yōu)化，以便在解脂耶氏酵母表達(dá)。具體地講，基于A-5去飽和酶基因RD5的編碼序列(SEQIDNO:2)，根據(jù)耶氏酵母密碼子使用模式(PCT公開No.WO2004/101753)、'ATG，翻譯起始密碼子周圍的共有序列以及RNA穩(wěn)定性的一般規(guī)則(Guhaniyogi,G.和J.Brewer,Gene,265(1-2):11-23(2001)),設(shè)計(jì)經(jīng)密碼子最優(yōu)化的A-5去飽和酶基因(稱作"RD5S",SEQIDNO:3)。除了修飾翻譯起始位點(diǎn)，還對(duì)1392bp編碼區(qū)中的247bp進(jìn)行了修飾(17.7%,圖7A和7B)并最優(yōu)化了229個(gè)密碼子(49.4%)。GC含量從野生型基因(即RD5)中的49.3%增加到合成基因(即RD5S)中的54.2%。分別將iVcoI位點(diǎn)和M)rt位點(diǎn)整合到RD5S(SEQIDNO:3)的翻譯起始密碼子的周圍和終止密碼子之后。在經(jīng)密碼子最優(yōu)化的基因中所有修飾均不改變所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。^殳計(jì)的RD5S基因由GenScriptCorporation(Piscataway,NJ)合成，然后將其克隆到pUC57(GenBank登錄號(hào)Y14837)中而產(chǎn)生pRD5S(SEQIDNO:50;圖6B)(RD5S在圖中標(biāo)記為"RD5S(626)")。實(shí)施例10包含RD5S的pZURD5S構(gòu)建體的產(chǎn)生本實(shí)施例描述了包含F(xiàn)BAIN::RD5S::Pex20嵌合基因的質(zhì)粒pZURD5S的構(gòu)建。通過將pZUF17(圖5B;SEQIDNO:22)的腸I脂I片段用來自pRD5S(SEQIDNO:50;圖6B)的WcoI/A^1RD5S片段替換來構(gòu)建質(zhì)粒pZURD5S(SEQIDNO:51;圖6C)。該連接的產(chǎn)物為pZURD5S(圖6C;SEQIDNO:51),其由此含有下列組分表8質(zhì)粒pZURD5S的組分SEQIDNO:51中的RE位點(diǎn)和核苷酸片段和嵌合基因組分的描述I飾WI(7458-1713)FBAIN::RD5S::Pex20，包含F(xiàn)BAIN:解脂耶氏酵母FBAIN啟動(dòng)子(PCT公開WO2005/049805;美國專利7,202,356)RD5S:來源于多甲藻屬物種CCMP626(圖中標(biāo)為"RD5S(626)")的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的A-5去飽和酶(SEQIDNO:3，本文中描述為RD5S)Pex20:耶氏酵母Pex20基因的Pex20終止子序列(GenBank登錄號(hào)AF054613)<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>)實(shí)施例11經(jīng)密碼子最優(yōu)化的A-5去飽和酶("RD5S")在解脂耶氏酵母M4菌抹中的表達(dá)如"一般方法"中所描述的，將質(zhì)粒pZURD5S(實(shí)施例10;包含F(xiàn)BAIN::RD5S::Pex20嵌合基因)用于轉(zhuǎn)化到M4菌抹(實(shí)施例7)中。挑取在MM平板上生長的八(8)個(gè)轉(zhuǎn)化體并重新劃線到新鮮的MM平板上。一旦有生長，即將這些菌株單獨(dú)接種到3mL液體MM中，在3(TC下以250rpm/min搖動(dòng)2天。離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過酯交換作用制備脂肪酸曱酯，并隨后用Hewlett-Packard6890GC分析。GC結(jié)果顯示，在所有8個(gè)轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生的總脂質(zhì)中含有約5.4%的DGLA和3.3%的ARA。在這8個(gè)菌抹中RD5S將DGLA轉(zhuǎn)化成ARA的轉(zhuǎn)化效率的平均率為約38%。轉(zhuǎn)換效率根據(jù)下面的公式測量([產(chǎn)物]/[底物+產(chǎn)物])xioo,其中"產(chǎn)物"包括中間產(chǎn)物和該途徑中源于其的所有產(chǎn)物。因此，該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，源于多曱藻屬物種CCMP626的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的A-5去飽和酶基因(RD5S,在SEQIDN0:3中示出)將DGLA轉(zhuǎn)化成ARA的效率比野生型RD5(實(shí)施例8)高約8.9%。實(shí)施例12路氏巴夫藻(CCMP459)A-8去飽和酶的分離本實(shí)施例描述了對(duì)實(shí)施例3和圖3中所使用的路氏巴夫藻(CCMP459)A-8去飽和酶的分離(在提交于2007年4月20日的美國專利申請(qǐng)No.11/737,772中也有所描述)。這需要合成路氏巴夫藻(CCMP459)的cDNA;構(gòu)建文庫并測序；鑒定△-8去飽和酶同源物；以及從基因組DNA克隆全長的A-8去飽和酶。路氏巴夫藻(CCMP459)cDNA合成、文庫構(gòu)建和測序如PCT公開No.WO2004/071467(于2004年8月26日公開)所述合成路氏巴夫藻(CCMP459)cDNA文庫。簡而言之，Pav459的冷凍沉淀獲自Provasoli-Guillard國立海生浮游植物培養(yǎng)中心(Provasoli-GuillardNationalCenterforCultureofMarinePhytoplankton)(CCMP,WestBoothbayHarbor,ME)。將這些沉淀在液氮中碾碎并根據(jù)生廠商的使用說明用QiagenRNeasyMaxi試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)從Pav459中提取總RNA。使用寡脫氧胸苷(oligodT)纖維素樹脂從該總RNA中分離mRNA,然后利用pSportl載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)用該mRNA構(gòu)建cDNA文庫。將由此產(chǎn)生的cDNA定向克隆到(5'Sa/I/3'iVwI)pSportl載體中。Pav459文庫每毫升含有大約6.1xloS個(gè)克隆，每個(gè)克隆含有平均大小約為1200bp的插入片段。將該路氏巴夫藻文庫命名為epslc。為了測序，首先從生長/冷凍在384孔冷凍培養(yǎng)基平板中的保藏甘油培養(yǎng)物回收克隆，然后用自動(dòng)QPix菌落挑取儀(Genetix)接種到含有LB+100mg/mL氨節(jié)青霉素的96孔深孔板中。在37。C下生長20小時(shí)后，離心沉淀細(xì)胞然后將其保存于-20。C。然后在Eppendorf5Primerobot上用改良的％孔型堿裂解小量制備方法(EppendorfPerfectPrep)分離質(zhì)粒。簡而言之，將過濾器和多頭抽真空裝置用于促進(jìn)在醋酸鹽沉淀后移除細(xì)胞碎片。質(zhì)粒DNA隨后直接從濾液中結(jié)合到第二個(gè)濾板上，將其進(jìn)行洗滌、干燥并洗脫。使用載體-引發(fā)的T7引物(SEQIDNO:52)和ABIBigDye第3版Prism測序試劑盒在384孔板中對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行末端測序。對(duì)于測序反應(yīng)，使用100-200ng的模板和6.4pmoL的引物，然后重復(fù)下面的反應(yīng)條件25次96°C10秒、50°C5秒和60°C4分鐘。在基于乙醇的純化后，將循環(huán)測序反應(yīng)的產(chǎn)物在Perkin-ElmerABI3700自動(dòng)測序儀上分離并檢測。從路氏巴夫藻cDNA文庫epslc鑒定△-8去飽和酶的同源物通過進(jìn)行BLAST搜索尋找與BLAST"nr"數(shù)據(jù)庫中所包含的序列的相似性(如實(shí)施例3中所描述)，鑒定編碼路氏巴夫藻A-8去飽和酶同源物的cDNA克隆(據(jù)此稱為A-8去^L和酶)。由BLAST計(jì)算的、率)在本文中報(bào)道為"pLog"值，該值代表了所報(bào)道的P-值的負(fù)對(duì)數(shù)。因此，pLog值越大，cDNA序列和BLAST"命中"代表同源蛋白質(zhì)的可能性越大。用來自克隆epslc.pk002.f22的核苷酸序列進(jìn)行的BLASTX搜索揭示，該cDNA編碼的蛋白質(zhì)與葡枝根霉的A-6去飽和酶(SEQIDNO:53)(NCBI登錄號(hào)AAX22052(GI60499699),基因座AAX22052,CDSAY795076;Lu等人，未公布)的相似性。來自克隆epslc.pk002.f22的一部分cDNA插入片段的序列在SEQIDNO:54(cDNA插入片段的5'端)中示出。隨后，獲得了完整的插入片段序列(epslc.pk002.f22:fis)，并在SEQIDNO:55中示出。關(guān)于推斷的氨基酸序列的序列(從SEQIDNO:55的核苷酸1至位于SEQIDNO:55的核苷酸864處的第一個(gè)終止密碼子)在SEQIDNO:56中示出。完整插入片段的測序用改良的轉(zhuǎn)座方法進(jìn)行。將鑒定的用于完整插入片段測序的克隆作為單菌落從保藏的甘油母液回收，然后通過堿裂解分離質(zhì)粒DNA。用TemplateGenerationSystem(TGSII)轉(zhuǎn)座試劑盒(FinnzymesOy,Espoo,芬蘭)根據(jù)廠商的方法使質(zhì)粒模板發(fā)生轉(zhuǎn)座。將轉(zhuǎn)座的DNA經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)EH10B電感受態(tài)細(xì)胞(EdgeBioSystems,Gaithersburg,MD)中。從每個(gè)轉(zhuǎn)座反應(yīng)中隨機(jī)選擇多個(gè)轉(zhuǎn)化體，制備質(zhì)粒DNA,并利用獨(dú)特的引物SeqE(SEQIDNO:57)和SeqW(SEQIDNO:58)如上從轉(zhuǎn)座事件位點(diǎn)向外對(duì)才莫板測序(ABIBigDyev3.1)。收集序列數(shù)據(jù)(ABIPrismCollections軟件),然后用Phrap序列裝配程序(P.Green，UniversityofWashington,Seattle)進(jìn)行裝配。用Consed序列編輯器(D.Gordon,UniversityofWashington,Seattle)觀察裝配序列進(jìn)行最終的編輯。通過BLASTP評(píng)估在SEQIDNO:56中示出的氨基酸序列，得到相對(duì)于來自高山被孢霉的A-6去飽和酶(NCBI登錄號(hào)BAC82361(GI34221934)，基因座BAC82361,CDSAB070557;Sakuradani和Shimizu,Biosd.Biotechnol.Biochem.,67:704-711(2003))的pLog值為19.52(E值為3e-20)?；趤碜耘c高山被孢霉和其它脂肪酸去飽和酶BLASP比較的結(jié)果，路氏巴夫藻A-8去飽和酶不是全長的，且缺少5'端序列。從路氏巴夫藻基因組DNA克隆全長的A-8去飽和酶使用QiagenDNeasyPlantMaxiPrep試劑盒根據(jù)廠商的方法從路氏巴夫藻(CCMP459)中分離基因組DNA。每lgm的冷凍細(xì)胞沉淀使用1個(gè)maxi柱，從4gm的路氏巴夫藻培養(yǎng)物中總共分離122(ig的基因組DNA?；蚪MDNA的終濃度為22.8ngL。使用UniversalGenome"Walker試劑盒(BDBiosciencesClonetech,PaloAlto,CA)才艮據(jù)廠商的方法(Prot弁PT3042-l，版本為PRO3300)合成GenomeWalker文庫。簡而言之，按照所述方法設(shè)立四個(gè)限制酶切消化反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)使用300ng的基因組DNA。在苯酚純化后，將沉淀溶解在4^L的水中，然后按照所述方法連接銜接頭。對(duì)于起始PCR,根據(jù)廠商的方法(Prot#PT3090-1,版本為PR1X433)使用Advantage-GCGenomicPCR試劑盒(BDBiosciencesClonetech)。對(duì)于每個(gè)限制酶切消化，將l^L的文庫與22.8pL的PCR級(jí)水、lOpL的5xGC基因組PCR反應(yīng)緩沖液、2.2pL的25mMMg(CH3C02)2、10pL的GC-Melt(5M)、1|liL的50xdNTP混合物(每種10mM)、l^L的Advantage-GCGenomicPol.Mix(50x)、l^L的通用GenomeWalker引物API(10|aM,SEQIDNO:59)和l^L的GSPPvDES(10pM,SEQIDNO:60)合并在一起。在95。C下變性后，重復(fù)下面的反應(yīng)條件35次94°C30秒，68°C6分鐘。在這些反應(yīng)條件之后，在68。C進(jìn)行6分鐘的另外的延伸，隨后冷卻到15。C直至移出。通過瓊脂糖凝膠電泳分析每個(gè)文庫的起始PCR反應(yīng)，然后觀察分子量大約為6kB、3.5kB、2.5kB和1.2kB的DNA條帶。將每個(gè)文庫的DNA條帶用ZymocleaiT凝膠DNA回收試劑盒(ZymoResearch,Orange,CA)根據(jù)廠商的方法純化。將得到的DNA按照廠商的方法克隆到pGEM-TEasy載體(Promega)中，然后如上所述用T7(SEQIDNO:52)和M13-28Rev(SEQIDNO:61)引物對(duì)插入片段進(jìn)行測序。(;s^qk/nO:62):得另外的序列t通過基因步移獲得的完整5'端序列在SEQIDNO:63中示出。利用Sequencher(版本4.2,GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)4吏用大擊夾口裝酉己算》去(LargeGapassemblyalgorithm)對(duì)該基因組序列(SEQIDNO:63)的重疊區(qū)的序列和完整測序的ESTepslc.pk002.f22:fis(SEQIDNO:55)進(jìn)行比對(duì)。有趣的是，該比較顯示，與該基因組序列(SEQIDNO:63)相比，初始測序的EST(SEQIDNO:55)缺少459bp。在EST中缺少的這個(gè)序列似乎是缺失而非內(nèi)含子，因?yàn)樵谠摶?'端的基因組DNA中沒有鑒定出明確的內(nèi)含子剪接位點(diǎn)。將5'端的基因組序列(SEQIDNO:63)與3'端的EST序列(SEQIDNO:55)結(jié)合從而產(chǎn)生SEQIDNO:64。使用EditSeq6.1序列分析軟件(DNASTARInc.,Madison,WI),鑒定出ORF(SEQIDNO:17)。由SEQIDNO:17編碼的氨基酸序列在SEQIDNO:18中示出。將SEQIDNO:18中示出的氨基酸序列用BLASTP評(píng)估，得到相對(duì)于來自葡枝根霉的A-6去飽和酶(SEQIDNO:65)(NCBIAccessionNo.ABB96724(GI83027409)，基因座ABB96724,CDSDQ291156;Zhang等人，未公布)的pLog值為35.10(E值為8e-36)。而且，利用JotunHein方法，路氏巴夫藻A-8去飽和酶與在PCT公開No.WO2005/103253(于2005年4月22日公開)中公開的鹽生巴夫藻A-8去飽和酶序列(SEQIDNO:66)具有78.0%的同一性。用JotunHein方法(Hein,J.J.，Meth.Enz.,183:626-645(1990))進(jìn)行的序列百分比同一性計(jì)算是使用LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算軟件包(DNASTARInc.,Madison，WI)中的MegAlignv6.1程序以用于成對(duì)比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)(KTUPLE=2)來進(jìn)行。利用ClustalV方法，路氏巴夫藻A-8去飽82和酶與鹽生巴夫藻△-8去飽和酶序列具有76.4%的同一性。用ClustalV方法(Higgins,D.G和Sharp,P.M.,Comput.Appl.Biosci.,5:151-153(1989);Higgins等人,Comput.Appl.Biosci.，8:189-191(1992))進(jìn)行的序列百分比同一性計(jì)算是使用LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算軟件包(DNASTARInc.)中的MegAlignv6.1程序以用于成對(duì)比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)(KTUPLE4、缺口罰分=3、窗口=5、DIAGONALSSAVED=5和缺口長度罰分=10)來進(jìn)行。BLAST分值和概率表明SEQIDNO:17的片段編碼整個(gè)路氏巴夫藻△-8去飽和酶。圖8A和8B示出了SEQIDNO:18(路氏巴夫藻A-8去飽和酶的氨基酸序列)、SEQIDNO:66(鹽生巴夫藻A-8去飽和酶序列的氨基酸序列，同上)、SEQIDNO:16(于2006年2月2日公開的PCT公開No.WO2006/012325中公開為SEQIDNO:2的小眼蟲△-8去飽和酶序列的氨基酸序列)、SEQIDNO:65(葡枝根霉△-6脂肪酸去飽和酶(NCBI登錄號(hào)ABB96724，同上)的氨基酸序列)和SEQIDNO:53(葡枝根霉△-6脂肪酸去飽和酶(NCBI登錄號(hào)AAX22052,同上)的氨基酸序列)的ClustalV比對(duì)(用默認(rèn)的參數(shù))。ClustalV比對(duì)的結(jié)果顯示SEQIDNO:18與SEQIDNO:66、SEQIDNO:16、SEQIDNO:65和SEQIDNO:53分別具有76.4%、22.6%、22.2%和22.2%的同一性。實(shí)施例13大豆體細(xì)胞胚培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)條件將大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物(cv.Jack)在26。C下在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以150rpm維持在35mL液體培養(yǎng)基SB196(見下文)中，使用光強(qiáng)度為60-85pE/m2/s、白天/黑夜光周期為16:8小時(shí)的冷白熒光。通過將大約35mg組織接種到35mL新鮮的SB196液體中，培養(yǎng)物每7天進(jìn)行繼代培養(yǎng)至兩周(優(yōu)選的繼代培養(yǎng)間隔為每7天)。對(duì)于所有的轉(zhuǎn)化，使用DuPontBiolisticPDS1000/HE儀器(heliumretrofit)以基因槍轟擊(Klein等人，Nature,327:70(1987))將大豆表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物中。大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物的開始(Initiation):大豆培養(yǎng)物每個(gè)月開始兩次，每次開始間隔5-7天。在種植后45-55天，從可得到的大豆植林采摘含有不成熟種子的豆莢，去除它們的外殼然后置于滅菌的magenta盒中。通過將大豆種子在含一滴象牙皂的5Q/oClorox溶液(即，95mL的高壓滅菌蒸餾水加5mLClorox和一滴皂，充分混合)中搖晃15分鐘來使它們滅菌。用兩個(gè)l升瓶子中的無菌蒸餾水沖洗種子，然后將那些小于4mm的種子置于單獨(dú)的顯微鏡載玻片上。切除種子的小的一端，從種皮中擠出子葉。將子葉轉(zhuǎn)移至含有SB1培養(yǎng)基的平板(每個(gè)平板25-30個(gè)子葉)。將平板用纖維帶包裹并保存8周。之后，切除次生胚并將其置于SB196液體培養(yǎng)基中7天。用于轟擊的DNA的制備將含有所關(guān)注的△-5去飽和酶基因和選擇標(biāo)記基因的完整質(zhì)?；駾NA質(zhì)粒片段用于轟擊。通過對(duì)消化的質(zhì)粒進(jìn)行凝膠分離獲得來自包含本發(fā)明的A-5去飽和酶的大豆表達(dá)質(zhì)粒的片段。將所得的DNA片段通過在1%SeaPlaqueGTG瓊脂糖(BioWhitakerMolecularApplications)上進(jìn)行凝膠電泳而分離，并從瓊脂糖凝膠上切取含有基因盒的DNA片段。使用GELase消化酶根據(jù)廠商的方法從瓊脂糖中純化DNA。將含有3mg金顆粒的無菌蒸餾水的50pL等分試樣加入到5pL的ljugLDNA溶液(完整的質(zhì)?；蛉缟纤鲋苽涞腄NA片段)、50|iiL的2.5MCaCl2和20pL的0.1M亞精胺中。將混合物在渦旋振蕩器上以3檔振蕩3分鐘并在臺(tái)式微量離心機(jī)上離心10秒鐘。用400nL的100%乙醇洗滌后，通過超聲處理將沉淀懸浮于40pL的100%乙醇中。將DNA懸浮液(5|nL)分配到BiolisticPDS1000/HE儀圓盤的每個(gè)飛行圓盤中。每次轟擊(即每個(gè)圓盤)的每個(gè)5pL等分試樣含有大約0.375mg金顆粒。組織制備和用DNA轟擊將大約150-200mg的7天大的胚懸浮培養(yǎng)物置于無菌的60x15mm空培養(yǎng)皿中，并用塑料網(wǎng)覆蓋該培養(yǎng)皿。對(duì)每個(gè)平板的組織轟擊1或2槍，膜破裂壓力設(shè)定為U00PSI，并將小室抽真空到27-28英寸汞柱。將組織放置在距阻滯/阻止篩大約3.5英寸的地方。轉(zhuǎn)化的胚的選擇用潮霉素作為選擇標(biāo)記來選擇轉(zhuǎn)化的胚。具體地講，在轟擊后，將組織置于新鮮的SB196培養(yǎng)基中并如上所述地進(jìn)行培養(yǎng)。轟擊后6天，用含有30mg/L潮霉素的新鮮SB196交換該SB196。每周更新選擇培養(yǎng)基。選擇后4至6周，觀察到綠色的轉(zhuǎn)化組織從未轉(zhuǎn)化的、壞死的胚發(fā)生叢中長出。將分離的綠色組織移出并接種到多孔板以產(chǎn)生新的、無性繁殖的、轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。胚的成熟將胚在光強(qiáng)度為90-120pE/m2s、光周期為16:8小時(shí)的冷白熒光(PhillipscoolwhiteEconowattF40/CW/RS/EW)和Agro(PhillipsF40Agro)的燈泡(40瓦特)下，于26。C下的SB196中培養(yǎng)4-6周。之后，將胚叢移至SB166固體瓊脂培養(yǎng)基上1-2周。然后將所述叢在SB103培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3周。在此期間，將單獨(dú)的胚從所述叢中移出并根據(jù)如上文所述的它們的脂肪酸組成的改變進(jìn)行篩選。培養(yǎng)基配方SB196-FNLite液體增殖培養(yǎng)基(每升)MSFeEDTA100x^f諸液1lOmLMS;危酸鹽100x4諸液2lOmLFNLite囟化物100x儲(chǔ)液3lOmLFNLiteP，B,Mo100x儲(chǔ)液4lOmLB5維生素(lmL/L)l.OmL2,4-D(10mg/L終濃度)l.OmLKN032.83gm(NH4)2S040.463gm天冬酰胺l.Ogm蔗糖(1%)lOgmpH5.8貯存號(hào)1FNLite儲(chǔ)液訓(xùn)OmL500mLMSFeEDTA訓(xùn)x儲(chǔ)液Na2EDTA*3.724gFeS04-7H202.784g先加入，在深色瓶中攪拌溶解1.862g1.392g2MS;克酸鹽100x儲(chǔ)液MgS04-7H2037.0g18.5gMnS04-H201.69g0.845gZnS04-7H200.86g0.43gCuS04-5H200.0025g0扁25g3FNLite卣化物-100x儲(chǔ)液CaCl2-2H2030.0g15.0gKI0.083g0.0715gCoCl2-6H200,0025g0扁25g4FNLiteP,B，Mo100x儲(chǔ)液KH2P0418.5g9.25gH3B030.62g0.31gNa2Mo04-2H200.025g0.0125gSB1固體培養(yǎng)基(每升)1個(gè)包裝的MS鹽(Gibco/BRL-產(chǎn)品編號(hào)為11117-066)lmLB5維生素1000x儲(chǔ)液31.5g蔗糖2mL2,4-D(終濃度為20mg/L)pH5.78gTC瓊脂SB166固體培養(yǎng)基(每升)1個(gè)包裝的MS鹽(Gibco/BRL-產(chǎn)品編號(hào)為11117-066)lmLB5維生素1000x儲(chǔ)液60g麥芽糖750mgMgCl2六水合物5g活性炭pH5.72g脫乙酰吉蘭糖膠(gelrite)86SB103固體培養(yǎng)基(每升)1個(gè)包裝的MS鹽(Gibco/BRL-產(chǎn)品編號(hào)為11117-066)lmLB5維生素1000x儲(chǔ)液60g麥芽糖750mgMgCl2六水合物pH5.72g脫乙酰吉蘭糖膠SB71-4固體培養(yǎng)基(每升)一并瓦含蔗糖的Gamborg'sB5鹽(Gibco/BRL-產(chǎn)品編號(hào)為21153-036)pH5.75gTC瓊脂2,4-D儲(chǔ)液從Phytotech獲得預(yù)制品，產(chǎn)品編號(hào)為D295-濃度為lmg/mLB5維生素儲(chǔ)液(每100mL)將等分試樣在-2(TC下保存10g肌醇100mg煙酸100mg鹽酸吡"多醇lg硫胺素如果溶液不能足夠快地溶解，則用攪拌加熱板輕微加熱。實(shí)施例14大豆體細(xì)胞胚中A-5去飽和酶(SEQIDNO:l和2)的功能分析成熟的大豆體細(xì)胞胚是合子胚的良好模型。當(dāng)在液體培養(yǎng)中呈球形胚狀態(tài)時(shí)，大豆體細(xì)胞胚含有非常少量的成熟大豆合子胚典型的三酰基甘油(TAG)或貯藏蛋白。在該發(fā)育階段，總的三?；视团c總87的極性脂質(zhì)(磷脂和糖脂)的比率是約1:4，這是該發(fā)育階段(體細(xì)胞胚培養(yǎng)物從該階段起始)的大豆合子胚典型的比率。同樣在球形期，顯著的種子蛋白，P-伴大豆球蛋白o(hù)c，-亞基、kunitz胰蛋白酶抑制劑3和種子凝集素的mRNA基本上不存在。在轉(zhuǎn)移至不含激素的培養(yǎng)基中以允許分化至成熟的體細(xì)胞胚狀態(tài)后，TAG成為最豐富的脂類。同樣，P-伴大豆球蛋白a，-亞基、kunitz胰蛋白酶抑制劑3和種子凝集素的mRNA也成為總mRNA群中非常豐富的信使。基于此，該大豆體細(xì)胞胚體系與體內(nèi)成熟的大豆合子胚表現(xiàn)非常相似，因此是用于分析改變脂肪酸生物合成途徑中的基因表達(dá)的表型影響的良好且快速的模型體系(參看PCT公開No.WO2002/00904,實(shí)施例3)。最重要的是，該模型體系也可預(yù)測起源于轉(zhuǎn)基因胚的植抹的種子的脂肪酸組成。將含有本發(fā)明的△-5去飽和酶的轉(zhuǎn)基因大豆體細(xì)胞胚以如下方式進(jìn)行分析。通過酯交換作用從單個(gè)成熟的大豆體細(xì)胞胚制備脂肪酸曱酯。將個(gè)別胚置于含有50(iL氫氧化三曱基锍(TMSH)和0.5mL己烷的小瓶中并在室溫下?lián)u晃孵育30分鐘。用配有Omegawax320熔融石英毛細(xì)管柱(Catalog#24152,SupelcoInc.)的Hewlett-Packard6890氣相色語儀分離和定量脂肪酸曱酯(從己烷層取5pL注射上樣)。用程序控制烘箱溫度保持在220。C2.6分鐘，以2(TC/min上升到24CTC,然后另外保持2.4分鐘。載氣由Whatman氫發(fā)生器提供。將保留時(shí)間與那些市售的甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(Nu-ChekPrepInc.)的保留時(shí)間比4交。通常，使用上述方法，通過GC每個(gè)事件分析5-10個(gè)胚。實(shí)施例15在大豆體細(xì)胞胚中共表達(dá)其它啟動(dòng)子/基因/終止子盒的組合除了本文所描述的基因、啟動(dòng)子、終止子和基因盒，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，其它啟動(dòng)子/基因/終止子盒的組合能夠以類似于但不限于本文所描述的方式合成。例如，PCT公開No.WO2004/071467和No.WO2004/071178描述了用于在大豆中胚特異表達(dá)的多種啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子序列的分離。此外，PCT公開No.WO2004/071467、No.WO2005/047479和No.WO2006/012325還描述了通過以獨(dú)特組合將單獨(dú)的啟動(dòng)子、基因和轉(zhuǎn)錄終止子連接在一起來合成多種啟動(dòng)子/基因/終止子盒組合。通常，將旁側(cè)為合適的啟動(dòng)子(例如，那些列于但不限于表9中的啟動(dòng)子)和轉(zhuǎn)錄終止子(例如，那些列于但不限于表10中的終止200780017808.9子)的Wort位點(diǎn)用于克隆所需的基因。通過采用經(jīng)設(shè)計(jì)用于將M^I位點(diǎn)引入基因的5'端和3'端的寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可將M)/I位點(diǎn)添加至所關(guān)注的基因，例如那些列于但不限于表11中的基因。然后用消化所得的PCR產(chǎn)物并將其克隆到合適的啟動(dòng)子/Mrt/終止子盒中。此外，PCT公開No.W02004/071467、No.WO2005/047479和No.WO2006/012325還描述了將單獨(dú)的基因盒以獨(dú)特組合，以及合適的選擇標(biāo)記盒連接在一起，以獲得所需的表型表達(dá)。盡管這主要是使用不同的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)來進(jìn)行，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，很多技術(shù)都可用于實(shí)現(xiàn)所需的啟動(dòng)子/基因/轉(zhuǎn)錄終止子組合。這樣一來，任何組合的胚特異性啟動(dòng)子/基因/轉(zhuǎn)錄終止子盒都可實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也能理解，這些盒可位于單獨(dú)的DNA片段上或位于多個(gè)片段上，其中多個(gè)DNA片段的共轉(zhuǎn)化導(dǎo)致基因的共表達(dá)。表9種子特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)子生物啟動(dòng)子的參考文獻(xiàn)P-伴大豆球蛋白a'-亞基大豆Beachy等人，EMBOJ.,4:3047-3053(1985)kunitz胰蛋白酶抑制劑大豆Jofuku等人，PlantCell,1:1079-1093(1989)膜聯(lián)蛋白大豆PCT公開No.WO2004/071467大豆球蛋白Gyl大豆PCT公開No.WO2004/071467白蛋白2S大豆美國專利6,177,613豆3求蛋白Al豌豆Rerie等人,Mol.Gen.Genet"225:148-157(1991)P-伴大豆球蛋白&-亞基大豆PCT公開No.WO2004/071467BD30(也稱為P34)1大豆PCT公開No.WO2004/071467豆5求蛋白A2豌豆Rerie等人，Mol.Gen.Genet.,225:148-157(1991)89表10<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>1agg尸egafw附△-9延長酶綠光等鞭金藻PCT公開No.WO2002/077213△-9延長酶小目艮蟲美國專利申請(qǐng)No.11/601563A-8去々包和酶小目艮蟲PCT公開No.WO2000/34439;美國專利6,825,017;PCT公開No.WO2004/057001;PCT公開No.WO2006/012325△-8去飽和酶卡氏棘變形蟲Saya,a等人，F(xiàn)EBSLett.,580:1946-1952(2006)△-8去飽和酶鹽生巴夫藻PCT公開No.WO2005/103253△-8去飽和酶路氏巴夫藻美國專利申i青No.11/737,772實(shí)施例16綠黃隆選擇(ALS)和植物再生綠黃隆(ALS)選擇轟擊后，將植物組織分配到2個(gè)裝有新鮮SB196培養(yǎng)基的瓶中并如實(shí)施例13中所述的進(jìn)行培養(yǎng)。轟擊后6至7天，用含有l(wèi)OOng/mL綠黃隆選擇劑的新鮮SB196交換所述SB196。每周更新選擇培養(yǎng)基。選擇后4至6周，觀察到綠色的轉(zhuǎn)化的組織從未轉(zhuǎn)化的、壞死的胚發(fā)生叢中長出。將分離的綠色組織移出并接種到含有SB196的多孔板中以產(chǎn)生新的、無性繁殖的、轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。大豆體細(xì)胞胚再生為植抹為了從胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物獲得完整植抹，必須進(jìn)行組織再生。如實(shí)施例13中所述使胚成熟。在SB103培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3周后，將單獨(dú)的胚從所述叢中移出并如實(shí)施例14所迷針對(duì)它們脂肪酸組成的改變進(jìn)行篩選。應(yīng)該注意的是，由所關(guān)注基因的表達(dá)導(dǎo)致的任何可檢測表型都可在該階段進(jìn)行篩選。這將包括但不限于脂肪酸概況、蛋白質(zhì)概況和蛋白質(zhì)含量、碳水化合物含量、生長率、生存力或正常發(fā)育成大豆植物的能力的改變。通過將成熟的單獨(dú)的胚置于空的小培養(yǎng)亞(35x10mm)中干燥大約4至7天。用纖維帶密封平板(產(chǎn)生小的潮濕小室)。將干燥的胚種植到SB71-4培養(yǎng)基中，并在上述的相同培養(yǎng)條件下讓它們在那里發(fā)芽。從萌發(fā)培養(yǎng)基中移出發(fā)芽的小植抹并用水充分沖洗，然后種植到覆蓋有透明塑料圓頂?shù)?4孔托盤(24-cellpacktray)中的Redi-Earth中。兩周后，移除該圓頂并使植物在接下來一周受冷而變得耐寒。如果小植林看起來耐寒，則將它們移植到Redi-Earth的10"罐中，每個(gè)罐至多3林小植抹。10至16周后，收獲成熟的種子，將其切碎并如在實(shí)施例14中所述分析脂肪酸。培養(yǎng)基配方可在實(shí)施例13中找到，綠黃隆儲(chǔ)液為在0.01N氫氧化銨中含有l(wèi)mg/mL綠黃隆。實(shí)施例17比較高山被孢霉A-5去飽和酶(MaD5)與多甲藻屬物種CCMP626△-5去飽和酶(RD5)在解脂耶氏酵母中的底物特異性本實(shí)施例描述了美國專利6,075,183和PCT公開No.WO2004/071467和No.WO2005/047479中描述的高山被孢霉△-5去飽和酶(MaD5;SEQIDNO:67和68)與RD5(SEQIDNO:2)在解脂耶氏酵母中的底物特異性的比較。這項(xiàng)工作包括如下步驟(1)構(gòu)建包含MaD5的耶氏酵母表達(dá)載體pY98;(2)將pY98和pDMW368轉(zhuǎn)化至耶氏酵母菌抹Y2224中；和3.)在提供脂肪酸底物后比較包含pY98或包含pDMW368的轉(zhuǎn)化生物內(nèi)的脂質(zhì)概況。包含MaD5的耶氏酵母表達(dá)載體pY98的構(gòu)建質(zhì)粒pY5-22(SEQIDNO:69)是既能在大腸桿菌中復(fù)制又能在解脂耶氏酵母中復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，其含有如下元件耶氏酵母自主復(fù)制序列(ARS18;GenBank登錄號(hào)M91600);ColEl質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn);用于在大腸桿菌中選擇的氨千青霉素抗性基因(AmpR);用于在耶氏酵母中選擇的耶氏酵母URA3基因(GenBank登錄號(hào)No.AJ306421);和嵌合的TEF::M:oI/A^I::XPR盒，其中"XPR"是耶氏酵母Xpr基因(GenBank登錄號(hào)M17741)的3'區(qū)的約100bp。盡管質(zhì)粒pY5-22的構(gòu)建在本文中沒有詳細(xì)描述，但它來源于pY5(以前在PCT公開No.WO2004/101757中描述過)。通過用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，用解脂耶氏酵母GPD啟動(dòng)子(SEQIDNO:71)置換TEF啟動(dòng)子而從pY5-22(SEQIDNO:69)產(chǎn)生質(zhì)粒pY5-22GPD(SEQIDNO:70)。耶氏酵母"GPD啟動(dòng)子"指位于由解脂耶氏酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPD)基因編碼的蛋白質(zhì)的翻譯起始密碼子'ATG，之前的5'上游非翻譯區(qū)并且是表達(dá)所必需的(PCT公開No.WO2005/003310)。更具體地講，解脂耶氏酵母GPD啟動(dòng)子是使用寡核苷酸GPDsense(SEQIDNO:73)和GPDantisense(SEQIDNO:74)從質(zhì)粒pYZDE2-S(SEQIDNO:72;其以前在美國專利申請(qǐng)No.11/737,772(藉此將其內(nèi)容以引用方式并入本文)中描述過)擴(kuò)增而來。用消化所得的DNA片段并克隆進(jìn)pY5-22(SEQIDNO:69)的Sa/Wort片段中，因而用GPD啟動(dòng)子和獨(dú)特的M)fl位點(diǎn)替換了TEF啟動(dòng)子和7VcoI/A^I位點(diǎn)，并由此產(chǎn)生pY5-22GPD(SEQIDNO:70)。通過用AWI消化而從pKR136(SEQIDNO:75;以前在PCT公開No.WO2004/071467(藉此將其內(nèi)容以引用方式并入本文)中描述過)釋放高山被孢霉A-5去飽和酶基因(SEQIDNO:67)，并將其克隆到pY5-22GPD的位點(diǎn)中以產(chǎn)生pY98(SEQIDNO:76;圖9)。pY98(包含MaD5)和pDMW368(包含RD5)轉(zhuǎn)化到耶氏酵母菌抹Y2224中以及脂質(zhì)概況的比較酵母抹Y2224用如下方式分離將來自YPD瓊脂平板(1%酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%葡萄糖和2%瓊脂)的解脂耶氏酵母ATCC#20362細(xì)胞劃線到含有250mg/L5-FOA(ZymoResearch)的MM平板(尿嘧啶和尿苷各75mg/L、6.7g/L含有硫酸銨但不含氨基酸的YNB以及20g/L葡萄糖)上。在28。C下孵育平板，將所得菌落中的4個(gè)單獨(dú)接種(patched)到含有200mg/mL5-FOA的MM平板和不含尿嘧咬和尿苷的MM平板上以確認(rèn)尿嘧。定〖》a3營養(yǎng)缺陷。如"一般方法"中所述，用pY98(SEQIDNO:76,圖9)和pDMW368(SEQIDNO:23;圖5C;實(shí)施例6)轉(zhuǎn)化Y2224抹。將含有pY98(SEQIDNO:76)或pDMW368(SEQIDNO:23)的轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母的單個(gè)菌落于30"下在不含尿嘧啶但補(bǔ)充有0.2%表面活性劑的3mLMM中培育1天。此后，將0.1mL轉(zhuǎn)移到3mL補(bǔ)充有EDA、ETrA、DGLA、ETA或不補(bǔ)充脂肪酸的相同培養(yǎng)基中。將這些培養(yǎng)基在3(TC下以250rpm孵育16小時(shí)，然后通過離心獲得沉淀。將細(xì)胞用水洗滌一次、通過離心沉淀并風(fēng)干。用500pL的1%曱醇鈉使沉淀在50°C下進(jìn)行酯交換反應(yīng)30分鐘(Roughan,G.和Nishida，I.,Arch.93Biochem.Biophys.,276(1):38-46(1990)),隨后加入500|aL的lMNaCl和lOOpL的庚烷。充分混合和離心后，用GC分析脂肪酸曱酯(FAME)。使用配有Omegawax320熔融石英毛細(xì)管柱(CatalogNo.24152,SupelcoInc.)的Hewlett-Packard6890氣相色譜儀分離和定量FAME(從己烷層取5pL樣品注射上樣)。用程序控制烘箱溫度在220。C保持2.6分鐘，以20°C/min上升到240。C并隨后另外保持2.4分鐘。載氣由Whatman氫發(fā)生器提供。將保留時(shí)間與那些市售的甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(Nu-ChekPrep,Inc.)的保留時(shí)間比較。表達(dá)pY98(SEQIDNO:76)或pDMW368(SEQIDNO:23)的解脂耶氏酵母的脂肪酸概況和所提供的多種底物在圖IOA中示出。在圖IOA中，陰影區(qū)表示提供的底物和產(chǎn)生的產(chǎn)物；脂肪酸鑒定為16:0(棕櫚酸)、16:1、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、GLA、ALA、STA、EDA、SCI(sciadonicacid或順式-5,ll,14-二十碳三烯酸;20:3oo-6)、DGLA、ARA、ETrA、JUP(juniperonicacid或順式誦5，11,14,17-二十碳三烯酸；20:4co-3)、ETA和EPA。脂肪酸組成表示為總脂肪酸的重量百分比(重量％)。RD5和MaD5對(duì)每種底物的A-5去飽和百分比("A-5去飽和％")在圖10B中示出，且取決于提供哪種底物，該去飽和百分比以產(chǎn)物(SCI、JUP、ARA或EPA)的重量°/。除以底物和產(chǎn)物(分別為EDA和SCI、ETrA和JUP、DGLA和ARA或ETA和EPA)的重量％之和然后乘以100表示為％來計(jì)算。MaD5和RD5的活性用圖10B中的△-5去飽和百分比的比率("R/Ma的去飽和比率，，)來比較，且以RD5對(duì)具體底物的A-5去飽和百分比除以MaD5對(duì)相同底物的A-5去飽和百分比來計(jì)算。RD5和MaD5對(duì)正確的w-6脂肪酸底物(即DGLA)相對(duì)于對(duì)副產(chǎn)物脂肪酸(即.SCI)或?qū)φ_的co-3脂肪酸底物(即ETA)相對(duì)于對(duì)副產(chǎn)物脂肪酸(即JUP)的底物特異性也在圖10B中示出。具體地講，對(duì)co-6底物的底物特異性("產(chǎn)物/副產(chǎn)物比，，)以對(duì)DGLA的A-5去飽和百分比(^-5去飽和％)除以對(duì)EDA的A-5去飽和百分比(△-5去飽和％)來計(jì)算并在與DGLA的結(jié)果的相同行中示出。對(duì)co-3底物的底物特異性("產(chǎn)物/副產(chǎn)物比")以對(duì)ETA的A-5去飽和百分比(A-5去飽和Q/Q)除以對(duì)ETrA的A-5去飽和百分比(么-5去飽和％)來計(jì)算并在與ETA的結(jié)果的相同行中示出。此外，對(duì)co-6底物的底物特異性的比("R/Ma的產(chǎn)物/副產(chǎn)物比")以RD5對(duì)co-6底物(即DGLA/EDA)的底物特異性除以MaD5對(duì)co-6底物的特異性來測定。對(duì)co-3底物的底物特異性的比("R/Ma的產(chǎn)物/副產(chǎn)物比，，)以RD5對(duì)o)-3底物(即ETA/ETrA)的底物特異性除以MaD5對(duì)co-3底物的特異性來計(jì)算。RD5和MaD5對(duì)w-6或co-3底物的偏好用圖10B中的A-5去飽和百分比的比率("n-6/n-3的比率，，)來比較，且以RD5和MaD5對(duì)特定co-6底物(DGLA或EDA)的A-5去飽和百分比除以對(duì)相應(yīng)oo-3底物(分別為ETA或ETrA)的△-5去飽和百分比來計(jì)算。從圖10B中的結(jié)果看出，顯然，當(dāng)DGLA、EDA、ETrA和ETA用作為底物時(shí)，RD5在耶氏酵母中的活性是MaD5活性的大約3.0至9.7倍。RD5相較于MaD5(RD5/MaD5)對(duì)正確的co-6底物(即DGLA對(duì)EDA)的底物特異性為大約0.4，而對(duì)co-3底物(即ETA對(duì)ETrA)的底物特異性為大約0.6。RD5還對(duì)w-6底物(即EDA和DGLA)相較于co-3底物(即ETrA和ETA)有1.4倍的偏好性。實(shí)施例18用于共表達(dá)高山被孢霉A-5去飽和酶(MaD5)與來源于小眼蟲的A-9延長酶(EgD9e)和來源于小眼蟲的A-8去飽和酶(EgD8)的大豆表達(dá)載體pKR916的構(gòu)建本實(shí)施例描述了用于共表達(dá)MaD5(SEQIDNO:67，實(shí)施例17)與EgD9e(SEQIDNO:77;在美國申請(qǐng)No.11/601,563(提交于2006年11月16日；代理人檔案號(hào)BB-1562)中有所描述)和EgD8(SEQIDNO:78;在PCT公開No.WO2006/012325中描述為Eg5)的大豆載體的構(gòu)建。小目艮蟲A-9延長酶(EgD9e):將含有小眼蟲A-9延長酶(EgD9e;SEQIDNO:77)的來源于眼蟲cDNA文庫(eeglc)被稱為eeglc.pk001.n5f的克隆用作模板，根據(jù)廠商的方法用寡核苷酸引物oEugELl-l(SEQIDNO:79)和oEugELl-2(SEQIDNO:80)以及VentRDNA聚合酶(產(chǎn)品目錄號(hào)M0254S,NewEnglandBiolabsInc.，Beverly,MA)擴(kuò)增EgD9e。用ZeroBluntPCR克隆試劑盒(InvitrogenCorporation)根據(jù)廠商的方法，將得到的DNA片段克隆到pCR-Blunt⑧克隆載體中，以產(chǎn)生pKR906(SEQIDNO:81)。起始質(zhì)粒pKR72(ATCC登錄號(hào)PTA-6019;SEQIDNO:82,7085bp序列)是以前在PCT公開No.WO02/008269(藉此將其內(nèi)容以引用的方式并入本文)中描述的pKS123的衍生物，其含有旁側(cè)為T7啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPT)(即T7prom/HPT/T7term盒)(Gritz,L.和Davies,J.,Gene,25:179-188(1983))和用于在細(xì)菌(如大腸桿菌)選擇和復(fù)制的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)。此外，pKR72也含有旁側(cè)為35S啟動(dòng)子(Odell等人，Nature,313:810-812(1985))和NOS3'轉(zhuǎn)錄終止子(Depicker等人，J.Mol.Appl.Genet,1:561-570(1982))的用于在植物如大豆中選擇的HPT(即35S/HPT/NOS3'盒)。pKR72還含有旁側(cè)為P-伴大豆球蛋白cx，亞基的啟動(dòng)子(Beachy等人，EMBOJ.,4:3047-3053(1985))和菜豆蛋白基因的3'轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(Doyle等人，J.Biol.Chem.,261:9228-9238(1986))的AAort限制性位點(diǎn)，因而允許克隆到M^I位點(diǎn)的基因在大豆種子中以很強(qiáng)的組織特異性表達(dá)。將來自以前在PCT公開No.WO02/00905(藉此將其內(nèi)容以引用的方式并入本文)中描迷的質(zhì)粒pKS102(SEQIDNO:83)的、含有T7prom/hpt/T7term盒和細(xì)菌oh的^化I片l爻與質(zhì)粒pKR72(SEQIDNO:82)的、含有Pcon/M)rt/Phas盒的y4scl片段組合以產(chǎn)生以前在PCT公開No.WO04/071467(藉此將其內(nèi)容以引用方式并入本文)中描述的pKR197(SEQIDNO:84)。通過用Wort消化以從pKR906(SEQIDNO:81)釋放小眼蟲的△-9延長酶基因，并將其克隆進(jìn)pKR197(SEQIDNO:84)的7VwI位點(diǎn)中以產(chǎn)生中間克隆載體pKR911(SEQIDNO:85)。小眼蟲A-8去飽和酶(EgD8):以前在PCT公開No.WO2006/012325(藉此將其內(nèi)容以引用方式并入本文)中描迷的質(zhì)粒pKR680(SEQIDNO:86)含有旁側(cè)為Kunitz大豆胰蛋白酶抑制劑(KTi)啟動(dòng)子(Jofuku等人，PlantCell,1:1079-1093(1989))和KTi3，終止區(qū)(其分離方法在美國專利6,372,965中描述)的小目艮蟲A-8去飽和酶(EgD8;SEQIDNO:78;在WO2006/012325中描述為Eg5)以及其后的以前在PCT公開No.WO2004/071467中描述的大豆白蛋白轉(zhuǎn)錄終止子(即Kti/A^ort/Kti3，Salb3，盒)。96用5wWI消化質(zhì)粒pKR680(SEQIDNO:86),并將含有EgD8的片段克隆進(jìn)pKR911(SEQIDNO:85)的5wWI位點(diǎn)中以產(chǎn)生pKR913(SEQIDNO:87)。高山被孢霉A-5去飽和酶(MaD5):以前在PCT公開No.WO2006/012325(藉此將其內(nèi)容以引用方式并入本文)中描述的pKR767(SEQIDNO:88)質(zhì)粒含有旁側(cè)為大豆球蛋白Gyl基因啟動(dòng)子和豌豆豆球蛋白A23'轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的高山被孢霉△-5去飽和酶(MaD5;SEQIDNO:67)(即Gyl/MaD5/legA2盒；其構(gòu)建在WO2006/012325中有所描述)。通過用幼/1消化而從pKR767(SEQIDNO:88)釋放Gyl/Mad5/legA2盒，并將所得的片段克隆至pKR913(SEQIDNO:87)的S6/I位點(diǎn)中以產(chǎn)生pKR916(SEQIDNO:89)。pKR916的示意圖在圖11A中示出。以該方式，小眼蟲A-9延長酶(在圖11A中標(biāo)記為"eugell，，)就與小眼蟲A-8去飽和酶(在圖11A中標(biāo)記為"eugd8-sq5")和高山一皮孢霉A-5去飽和酶(在圖11A中標(biāo)記為"高山^皮孢霉A-5去飽和酶")在強(qiáng)的種子特異性啟動(dòng)子后面共同表達(dá)。實(shí)施例19用于共表達(dá)多曱藻屬物種CCMP626A-5去飽和酶(RD5)與來源于小眼蟲的△-9延長酶(EgD9e)和來源于小眼蟲的△-8去々包和酶(EgD8)的大豆表達(dá)載體pKR1038的構(gòu)建本實(shí)施例描述了用于共表達(dá)RD5(SEQIDNO:l，實(shí)施例5)與EgD9e(SEQIDNO:77,實(shí)施例18)和EgD8(SEQIDNO:78,實(shí)施例18)的大豆載體的構(gòu)建。除了將含有MaD5的片段替換為含有異絲水霉A-5去飽和酶(SdD5;SEQIDNO:91,其在PCT公開No.WO2004/071467中有所描述)的WI片段外，起始質(zhì)粒pKR974(SEQIDNO:90)與pKR767(SEQIDNO:88,實(shí)施例18)相同。此外，通過用A^el消化、填補(bǔ)A^el位點(diǎn)和重新連接(即CAATTG被轉(zhuǎn)變成CAATTAATTG)去除了pKR767(SEQIDNO:88)的legA2終止子中的A^I位點(diǎn)，因此，相較于pKR767(SEQIDNO:88)的766bp,pKR974(SEQIDNO:90)的legA2終止子為770bp。為了將RD5克隆進(jìn)大豆表達(dá)載體中，需要在基因的5'端引入A^1限制位點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到有許多種方式可將限制位點(diǎn)引入到基因中，例如但不限制于PCR或通過亞克隆至含有合適位點(diǎn)的載體中。在這種情況下，為了將A^I位點(diǎn)引入RD5(SEQIDNO:l)的5'端，用A^el消化pDMW368(SEQIDNO:23)，然后用部分消化。將含有全長RD5(SEQIDNO:l)的WcoI/A^d片段克隆進(jìn)在iVcoI位點(diǎn)(即GCGGCCGCAAACCATGG)正上游具有位點(diǎn)的中間克隆載體的iVcoI/A^el位點(diǎn)中。用iVort消化所得的質(zhì)粒，然后將含有RD5(SEQIDNO:l)的片段克隆至pKR974(SEQIDNO:90)的Mrt位點(diǎn)中以產(chǎn)生pKR1033(SEQIDNO:92)。通過用幼/1消化而從pKR1033(SEQIDNO:92)釋放Gyl/EgD5/legA2盒，并將所得的片段克隆進(jìn)pKR913(SEQIDNO:87)的幼/1位點(diǎn)以產(chǎn)生pKR1038(SEQIDNO:93)。pKR1038(SEQIDNO:93)的示意圖在圖11B中示出。以該方式，小眼蟲A-9延長酶(在圖11B中標(biāo)記為"eugell")就能夠與小眼蟲A-8去飽和酶(在圖11B中標(biāo)記為"eugd8-sq5，，)和多曱藻屬物種CCMP626A-5去飽和酶(在圖IIB中標(biāo)記為"CCMP626d5DS")在強(qiáng)的種子特異性啟動(dòng)子后面共同表達(dá)。實(shí)施例20小目艮蟲A-9延長酶、小眼蟲A-8去飽和酶和異絲水霉A-17去飽和酶或者與高山被孢霉A-5去飽和酶(pKR916和pKR328)或者與多曱藻屬物種CCMP626A-5去飽和酶(pKR1038和pKR328)在大豆體細(xì)胞胚中的共表達(dá)本實(shí)施例描述了pKR916(SEQIDNO:89，實(shí)施例18;含有EgD9e、EgD8和MaD5)與含有異絲水霉△-17去飽和酶(SdD17)和用于潮霉素選擇的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的pKR328(SEQIDNO:94,圖11C,以前在PCT公開No.W004/071467中有所描迷)，在大豆體細(xì)胞胚中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)。本實(shí)施例進(jìn)一步描述了pKR1038(SEQIDNO:93,實(shí)施例19;含有EgD9e、EgD8和RD5)與pKR328(SEQIDNO:94,圖11C)在大豆體細(xì)胞胚中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)。如實(shí)施例13中所述，用含有pKR916的表達(dá)盒(SEQIDNO:89)的Acl片段和完整的質(zhì)粒pKR328(SEQIDNO:94)或者含有pK1038的表達(dá)盒(SEQIDNO:93)的爿"I片段和完整的質(zhì)粒pKR328(SEQIDNO:94)轉(zhuǎn)化豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物(cv.Jack)。用改良的方法在大豆組織分化和成熟液體培養(yǎng)基(SHaM液體培養(yǎng)基；Schmidt等人，CellBiologyandMorphogenesis,24:393(2005))中使胚成熟。簡而言之，在如實(shí)施例13所述在SB196中選擇4周后，將胚叢移至250mL錐形瓶中的35mLSB228(SHaM液體培養(yǎng)基)中。使用光強(qiáng)度為60-85|tiE/m2/s、白天/黑夜光周期為16:8小時(shí)的冷白熒光于26°C在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以130rpm使組織維持在SHaM液體培養(yǎng)基中兩周直至胚成熟。在SHaM液體培養(yǎng)基中生長2周的胚在大小和脂肪酸含量方面與在實(shí)施例13中所描述的在SB166/SB103上培養(yǎng)5-8周的胚等價(jià)。培養(yǎng)基配方SB228-大豆組織分化和成熟(SHaM)(每升)DDIH20600mLSHaM用FN-LiteMacro鹽10xlOOmLMSMicro鹽1000xlmLMSFeEDTA100x10mLCaC1100x6.82mLB5維生素1000xlmLL-曱石危氨酸0.149g蔗糖30g山梨糖醇30g調(diào)節(jié)體積至900mLpH5.8高壓滅菌加入到冷卻的培養(yǎng)基(《30°C):*谷氨酰胺(終濃度30mM)4%llOmL*注意加入谷氨酰胺后最終體積將為1010mL。由于谷氨酰胺降解相對(duì)較快，在使用培養(yǎng)基前立即加入可能是優(yōu)選的。加入谷氨酰胺后有效期為兩周；不含谷氨酰胺的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可保存更長時(shí)間。SHAM10x用FN-liteMacro-儲(chǔ)液弁l(每升)(NH4)2S04(硫酸銨)4.63gKN03(硝酸鉀)28.3gMgSO4*7H20(七水硫酸鎂)3.7gKH2P04(磷酸二氫鉀)1.85g々六疋谷高壓滅菌MSMicro1000x-儲(chǔ)液#2(每1升)H3B03(硼酸)6.2gMnS04*H20(—水為H酸錳)16.9gZnSO4*7H20(七水硫酸鋅)8.6gNa2MoO4*2H20(二水鉬酸鈉)0.25gCuSO4*5H20(五水石危酸銅)0.025gCoCl2*6H20(六水氯化鈷)0.025gKI(碘化鉀)0.8300g定容高壓滅菌FeEDTA100x-儲(chǔ)液#3(每升)Na2EDTA*(EDTA鈉)FeSO4*7H20(七水石危酸4失)*在加入鐵之前EDTA必須完全溶解。定容溶液是光敏的。瓶子應(yīng)該用箔包裹以避光。高壓滅菌3.73g2.78gCalOOx-儲(chǔ)液#4(每升)CaCl2*2H20(二水氯化鈣)44g定容高壓滅菌100B5維生素lOOOx-儲(chǔ)液#5(每升)鹽酸;危胺素?zé)熕猁}酸吡。多醇肌醇定容冷凍保存10glglg訓(xùn)g4%谷氨酰胺-儲(chǔ)液#6(每升)加熱至3(TC的DDI水900mLL-谷氨酰胺40g邊攪拌邊逐漸加入，并輕微加熱。不要超過35'C定容過濾滅菌冷凍保存**注意在31°C溫浴中熱融化儲(chǔ)液以便完全溶解晶體。在ShaM液體培養(yǎng)基中成熟后，從叢中移出個(gè)別胚，干燥并如上文所述針對(duì)脂肪酸組成的改變進(jìn)行篩選。收獲用pKR916(SEQIDNO:89)和pKR328(SEQIDNO:94)或pKR1038(SEQIDNO:93)和pKR328(SEQIDNO:94)轉(zhuǎn)化的一亞組大豆胚(即，每個(gè)事件6個(gè)胚)并挑取放入玻璃GC小瓶中，然后通過酯交換作用制備脂肪酸曱酯。為了進(jìn)行酯交換，將50pL的氫氧化三曱基锍(TMSH)和0.5mL的己烷加入到玻璃小瓶中的胚中，然后在室溫下?lián)u晃孵育30分鐘。使用配有Omegawax320熔融石英毛細(xì)管柱(產(chǎn)品號(hào)24152,SupelcoInc.)的Hewlett-Packard6890氣相色譜儀分離和定量脂肪酸曱酯(從己烷層取5pL注射上樣)。用程序控制烘箱溫度在220。C保持2.6分鐘，以20°C/min上升到240。C并隨后另外保持2.4分鐘。載氣由Whatman氫發(fā)生器提供。將保留時(shí)間與那些市售的曱酯標(biāo)準(zhǔn)品(Nu-ChekPrep,Inc.)的保留時(shí)間比較。以這種方式，分析了60個(gè)用pKR916(SEQIDNO:89)和pKR328(SEQIDNO:94)轉(zhuǎn)化的事件以及31個(gè)用pKR1038(SEQIDNO:93)和pKR328(SEQIDNO:94)轉(zhuǎn)化的事件。每種轉(zhuǎn)化(pKR916和pKR328、pKR1038和pKR328)的具有最高△-5去飽和酶活性的10次事件的平均脂肪酸譜概況別在圖12A和圖12B中示出。在圖12A和12B中，脂肪酸被鑒定為16:0(棕櫚酸)、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、SCI、DGLA、ARA、ERA、JUP、ETA和EPA。列為"其它"的脂肪酸包括18:2(5,9)、GLA、STA、20:0、20:1(11)、20:2(7,11)或20:2(8,11)和DPA。這些"其它"脂肪酸中的每一種在總脂肪酸中的相對(duì)豐度都小于3.0%。個(gè)別胚的脂肪酸組成表示為總脂肪酸的重量百分比(重量％),而平均脂肪酸組成則為每一事件中6個(gè)胚的平均值。A-5去飽和酶對(duì)"正確"底物(即DGLA和ETA)的活性表示為根據(jù)下面公式計(jì)算的A-5去飽和百分比("正確。/。A-5去飽和，，)([產(chǎn)物]/[底物+產(chǎn)物)x100。更具體地講，對(duì)"正確"底物的百分比A-5去飽和可測定為([ARA+EPA]/[DGLA+ETA+ARA+EPA])x100。△-5去飽和酶對(duì)"錯(cuò)誤"底物(即EDA和ERA)的活性也表示為△-5去飽和百分比("錯(cuò)誤。/。A-5去飽和")，如下計(jì)算([SCI+JUP]/[EDA+ERA+SCI+JUP])"00。比較了MaD5和RD5對(duì)"正確"底物(即DGLA和ETA)相對(duì)于"錯(cuò)誤"底物(即EDA和ERA)的底物特異性，并將該比較在圖13中示出。在圖13中，MaD5(來自圖12A的數(shù)據(jù))和RD5(來自圖12B的數(shù)據(jù))對(duì)"正確"底物的A-5去飽和酶的活性("正確％^-5去飽和")繪制在x-軸，而對(duì)"錯(cuò)誤"底物的A-5去飽和酶活性("錯(cuò)誤。/oA-5去飽和")繪制在y-軸。權(quán)利要求1.一種分離的多核苷酸，包含(a)編碼具有Δ-5去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中在與SEQIDNO2中示出的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，基于ClustalW比對(duì)方法，所述多肽具有至少80％的氨基酸同一性；(b)編碼具有Δ-5去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中在與SEQIDNO1或SEQIDNO3中示出的核苷酸序列進(jìn)行比較時(shí)，基于BLASTN比對(duì)方法，所述核苷酸序列具有至少80％的序列同一性；(c)編碼具有Δ-5去飽和酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO1或SEQIDNO3中示出的核苷酸序列雜交；或(d)(a)、(b)或(c)的所述核苷酸序列的互補(bǔ)序列，其中所述互補(bǔ)序列和所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成且100％互補(bǔ)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苦酸，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:3。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含(a)SEQIDNO:2;或(b)與(a)中所述氨基酸序列具有至少一個(gè)保守氨基酸置換的不同的氨基酸序列。4.一種重組DNA構(gòu)建體，包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的多核普酸。5.—種細(xì)胞，其基因組中包含根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組DNA構(gòu)建體。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自由植物和酵母組成的組。7.—種轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞并選擇用根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化了的那些細(xì)胞。8.—種產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的多核苦酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并從所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生出植物。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述植物為大豆植物。10.—種轉(zhuǎn)基因種子，其基因組中包含根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組構(gòu)建體。11.一種轉(zhuǎn)基因種子，所述轉(zhuǎn)基因種子從用根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法制備的植物獲得。12.—種在植物細(xì)胞中產(chǎn)生長鏈多不飽和脂肪酸的方法，包括(a)用根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞；(b)選擇那些產(chǎn)生長鏈多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。13.油或副產(chǎn)品，所述油或副產(chǎn)品從根據(jù)權(quán)利要求10所述的種子獲得。14.油或副產(chǎn)品，所述油或副產(chǎn)品從根據(jù)權(quán)利要求11所述的種子獲得。15.—種在油料種子植物細(xì)胞中產(chǎn)生至少一種多不飽和脂肪酸的方法，包括(a)用第一重組DNA構(gòu)建體和至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化油料種子植物細(xì)胞，所述第一重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的、編碼至少一種A-5去飽和酶多肽的分離的多核苷酸；所述另外的重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的、編碼選自由以下酶組成的組的多肽的分離的多核香酸A-4去飽和酶、A-5去飽和酶、A-6去飽和酶、A-8去々包和酶、A-12去飽和酶、A-15去飽和酶、A-17去飽和酶、A-9去飽和酶、A-9延長酶、。14/16延長酶、(:16/18延長酶、ds/2。延長酶和C2。/22延長酶；(b)從步驟(a)的所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生油料種子植物；以及(c)選擇從步驟(b)的所述植物獲得的那些種子，與從非轉(zhuǎn)化油料種子植物獲得的種子的多不飽和脂肪酸水平相比，所述種子具有改變的多不飽和脂肪酸水平。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述油料種子植物選自由大豆、蕓苔屬物種、向日葵、玉米、棉花、亞麻和紅花組成的組。17.—種油料種子植物，其基因組中包含根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組構(gòu)建體。18.—種油料種子植物，包含(a)第一重組DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的、編碼至少一種A-5去飽和酶多肽的分離的多核苷酸；和(b)至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列的、編碼選自由下列酶組成的組的多肽的分離的多核苷酸A-4去飽和酶、A-5去飽和酶、A-6去飽和酶、△-8去飽和酶、A-12去飽和酶、A-15去飽和酶、A-17去飽和酶、A-9去飽和酶、A-9延長酶、(:14/16延長酶、(:16/18延長酶、ds/2o延長酶和C20/22延長酶。19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的油料種子植物，其中所述油料種子植物選自由大豆、蕓莒屬物種、向日葵、玉米、棉花、亞麻和紅花組成的組。20.—種轉(zhuǎn)基因種子，所述轉(zhuǎn)基因種子從根據(jù)權(quán)利要求15所述的油料種子植物獲得。21.—種轉(zhuǎn)基因種子，所述轉(zhuǎn)基因種子從根據(jù)權(quán)利要求16所述的油料種子植物獲得。22.油或副產(chǎn)品，所述油或副產(chǎn)品從根據(jù)權(quán)利要求20所述的種子獲得。23.油或副產(chǎn)品，所述油或副產(chǎn)品從根據(jù)權(quán)利要求21所述的種子獲得。24.油，所述油用根據(jù)權(quán)利要求12或15所述的方法獲得。25.食物或飼料，所述食物或飼料摻入了根據(jù)權(quán)利要求22所述的油。26.食物或飼料，所述食物或飼料摻入了根據(jù)權(quán)利要求23所述的油。27.食物或飼料，所述食物或飼料摻入了根據(jù)權(quán)利要求24所述的油。28.食物或飼料，所述食物或飼料包含根據(jù)權(quán)利要求20所述的種子。29.食物或飼料，所述食物或飼料包含根據(jù)權(quán)利要求21所迷的種子。30.食物或飼料，所述食物或飼料包含對(duì)根據(jù)權(quán)利要求20所述的種子進(jìn)行加工獲得的成分。31.食物或飼料，所述食物或伺料包含對(duì)根據(jù)權(quán)利要求21所述的種子進(jìn)行加工獲得的成分。32.根據(jù)權(quán)利要求22所述的油或副產(chǎn)品，其中所述副產(chǎn)品為卵磷脂。33.根據(jù)權(quán)利要求23所述的油或副產(chǎn)品，其中所述副產(chǎn)品為卵磷脂。34.后代植抹，所述后代植抹從根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法制備的植物獲得。35.后代植株，所述后代植株從根據(jù)權(quán)利要求20或30所述的油料種子植物獲得。36.—種分離的核酸分子，該核酸分子編碼SEQIDNO:3中示出的A-5去飽和酶，其中至少一個(gè)密碼子經(jīng)密碼子最優(yōu)化以用于在耶氏酵母屬物種中表達(dá)。全文摘要本發(fā)明公開了編碼Δ-5去飽和酶的分離的核酸片段、包含這種片段的重組構(gòu)建體以及利用該Δ-5去飽和酶在植物和含油酵母中制備長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)的方法。文檔編號(hào)C12N15/53GK101448946SQ200780017808公開日2009年6月3日申請(qǐng)日期2007年5月17日優(yōu)先權(quán)日2006年5月17日發(fā)明者H·G·達(dá)穆德,Q·Q·朱申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司