專利名稱：編碼木脂素甲基化酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的酶的基因、利用該甲基化 酶使木脂素組成改變的植物等。更加具體地說，本發(fā)明涉及具有合成甲基化木 脂素活性的酶的基因，優(yōu)選來自芝麻的具有合成甲基化木脂素活性的酶的基因 及其利用。
背景技術(shù)：
胡麻屬芝麻(Sesamum indicum)，是屬于胡麻科(Pedaliaceae)的1年生 草本植物。據(jù)說芝麻的原產(chǎn)地在中非，芝麻是大約有6000年歷史的最古老的栽 培油料作物，并己在世界范圍內(nèi)栽培。自古以來芝麻就是珍貴的食品，被認(rèn)為 是健康食品的代表。特別是芝麻種子、從芝麻種子中得到的油、芝麻種子的提 取物均在被利用(例如參照《芝麻其科學(xué)和功能性》日語原名「37^(D科學(xué) t機(jī)能性」、并木滿夫編丸善planet公司(1998))。芝麻種子內(nèi)含有的成分 中約50%是脂質(zhì)，約20%是蛋白質(zhì)。芝麻中含有的脂質(zhì)的主要成分是以油酸和亞 油酸為主體的甘油三酯，并且芝麻中還含有維生素Bl、 B2、 E等。除上述成分 之外，芝麻中還含有被統(tǒng)稱為木脂素的植物的二次代謝物(例如芝麻素和芝麻 林素等)，這些物質(zhì)具有強(qiáng)抗氧化性(例如參照B iochemical Sy stematics and Ecology 13， 133 — 139 (198 5 ))。關(guān)于木脂素的生物合成，例如在L ignans: biosynthes is and function, Comprehensive natu ral products chemistry, 1: 640 — 713 (1 999 ); PhytochemistryRev. 2257 — 288 (20 0 3 )等中有記載。例如在Phytochemistry Rev. 2257 — 288
(2 0 0 3 )中，表示由松柏醇聚合合成的松脂醇是首次生物合成的木脂素， 并且利用松脂醇，在各植物種內(nèi)經(jīng)過特有的生物合成途徑可合成多種木脂素。有報(bào)告指出有助于該松脂醇合成的dirigent protein存在于連翹等中(例如參 照Science 275， 362 — 366 (1997)等)。并且還報(bào) 導(dǎo)了連翹的松脂醇-落葉松脂素還原酶基因(例如參照J(rèn) . B i o 1 . C h e m.， 271: 29473 (1996 )、日本特表2001-507931號(hào)公報(bào)等)，T h u j ap 1 i c a t a的松脂醇-落葉松脂素還原酶基因(例如參照J(rèn) . B i o 1 . C h e m. ， 2 7 4: 6 1 8 ( 1 9 9 9 )等)，以及閉聯(lián)異落葉松脂素脫 氫酶及其使用方法(例如參照J(rèn) . Biol. C h e m. ， 2 7 6 ( 1 6 ): 1 2614 — 23 (2001)、日本特表2 002 — 512790號(hào)公報(bào)等)。 并且從L arrea tridentata中克隆至U Larreatricin氫氧化酶 基因(例如參照P roc. Nat. Acad. Sci. USA， 100: 1 0 6 4 1 ( 2 0 0 3 )等)。關(guān)于芝麻木脂素的生物合成， 一般認(rèn)為是通過胡椒醇合成酶作用于松脂醇 而合成胡椒醇，接著，通過芝麻素合成酶作用于此胡椒醇而合成芝麻素。但已 證明，從芝麻中克隆到的細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì)CYP81Q1，單獨(dú)由松脂醇經(jīng)過胡 椒醇而合成芝麻素(國際公開公報(bào)WO2005/030944;參照?qǐng)Dl)。近年來，不僅是木脂素，而且木脂素糖苷也正受到關(guān)注。已知上述木脂素 分子中有幾種以糖苷的形式存在于植物中。例如，芝麻種子中存在芝麻素酚糖 苷(sesaminol 2 ， 一 0 — P — D —Glucopyranoside; sesaminol 2 ， 一 0 —P —D — glucopyranosyl (1 — 2) — 0 — D — Glucopymnoside 5 及 sesaminol 2 ， 一 0 — 6 — D —glucopyranosyl (1 — 2) —0 — (—D — glucopyranosyl (1 — 6)) —P—D — Glucopyranoside )); 及松月旨醇糖苷 (Pinoresinol 4 ， 一 O — P — D — glucopyranosyl (1—6) —D — Glucopyranoside; Pinoresinol 4 ， 一 O — P — D —glucopyranosyl ( 1 — 2 ) 一 P — D —Glucopyranoside; Pinoresinol 4 ， 一 O — P — D —glucopyranosyl (l一6) — — (P_D— glucopyranosyl ( 1 — 6 ) ) 3 — D — Glucopymnoside; 及Pinoresinoldi—O — P — D —Glucopyranoside"等。 連翹中存在(+ ) —Pinoresinol— 4 ， 一 O — e — DGlucoside及(一) 一羅
漢松樹脂酚一 4—0 — Glucoside。亞麻中存在Secoisolariciresinol DiGlucoside和Pinoresinol DiGlucoside等(例如參考「生藥學(xué)雜志」日語 原名「生薬學(xué)雑誌」、第32巻、第194頁(1 9 7 8 );T e t r a h e d r on， 14: 649 (2003 ); Phytochemistry， 58: 5 8 7 ( 2 0 0 1 )等)。芝麻中含有的松脂醇糖苷和芝麻素酚糖苷(例如參照K a t s ii z a k i ， H.等、Biosci. Biotech. Biochem. 56， 2087 一 2 0 8 8 ( 1 9 9 2 )等)，因?yàn)樵谒苄詤^(qū)域顯示強(qiáng)抗氧化性，所以期待其 有與脂溶性抗氧化劑(例如生育酚)不同的應(yīng)用。此外，對(duì)于木脂素糖苷主張 其有如下所述作用機(jī)理，即、木脂素糖苷的具有抗氧化性的官能團(tuán)酚羥基被自 身具有的糖保護(hù)，但攝入體內(nèi)后在腸內(nèi)細(xì)菌具有的P —葡萄糖苷酶的作用下發(fā) 生水解，生成作為葡糖苷配基部分的脂溶性木脂素。該葡糖苷配基在腸內(nèi)吸收 通過血液被運(yùn)送到各臟器內(nèi)，防止臟器生物膜等的氧化障礙。依據(jù)這種作用機(jī) 理，期待將木脂素糖苷作為動(dòng)脈硬化預(yù)防食品而應(yīng)用(例如參照T. 0 s a w a:Anticarcinogenesis and radiation protection 2: p. 327， Plenum Press, Ne w Y o )。作為木脂素糖苷以外的木脂素衍生物已知有甲基化木脂素。甲基化木脂素 與木脂素糖苷相同，具有抗氧化性的官能團(tuán)酚羥基受甲基保護(hù)，因此是具有甲 氧基結(jié)構(gòu)的木脂素。報(bào)導(dǎo)了呋喃駢呋喃類的芝麻木脂素中胡椒醇的4位羥基被 甲基化的Kobusine及芝麻素酚的2，位羥基被甲基化的Sesangolin (參照P y tochemistry 47， 583 — 591 (1998);及J. Or g.Chem. 27， 3232 — 3235 (1962))(圖1)。但還不明 確催化這些合成反應(yīng)的酶，并且到目前為止還沒有精制、分離使呋喃駢呋喃類 木脂素甲基化的酶及編碼該酶的基因的報(bào)告。已知具有催化甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)這種特定功能的蛋白質(zhì)，在不同的植物種中其 氨基酸序列類似(例如參照P lant Cell 14，505 — 519 (2 0 0 2 ))。 發(fā)明內(nèi)容通過改變植物的二次代謝物等的生物合成途徑，能夠進(jìn)行有用物質(zhì)的生成 及/或有用植物的育種，將這種技術(shù)稱為代謝工程。如果利用這種技術(shù)，能夠大 量生產(chǎn)任意的化合物及/或抑制不需要的物質(zhì)的生產(chǎn)。因此，鑒于上述這些物質(zhì) 的有用性，使用與木脂素代謝途徑相關(guān)的基因，采用基因工程合成木脂素及其 代謝物在工業(yè)上有用。但是，有關(guān)木脂素、特別是與以芝麻木脂素為代表的呋 喃駢呋喃類木脂素的生物合成相關(guān)的基因的知識(shí)，如上所述還很有限，并且仍 未發(fā)現(xiàn)催化甲基化呋喃駢呋喃類木脂素生成的甲基化酶，更期望得到其基因。本發(fā)明鑒于上述狀況，提供如下所示的具有木脂素甲基轉(zhuǎn)移活性的酶、編 碼該酶的多核苷酸，含有該多核苷酸的載體，細(xì)胞，轉(zhuǎn)化體等。(1) 多核苷酸，其為下述(a) (d)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，(a) 多核苷酸，其含有具有序列號(hào)1或3的堿基序列的多核苷酸；(b) 多核苷酸，其含有編碼具有序列號(hào)2或4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多 核苷酸；(c) 多核苷酸，其為與具有序列號(hào)1或3的堿基序列的部分或全部互補(bǔ)堿 基序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，且編碼具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上 的活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(d) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有在序列號(hào) 2或4的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基 酸序列，且具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性。(2) 如上述(1)所述的多核苷酸，其編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有序列 號(hào)2或4的氨基酸序列，或者具有在該氨基酸序列中添加、缺失1個(gè)或多個(gè)氨 基酸及/或被其他氨基酸替換修飾的氨基酸序列，且具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上 的活性。(3) 如上述(1)所述的多核苷酸，其與具有序列號(hào)1或3的堿基序列的 部分或全部互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，且編碼具有將甲 基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的蛋白質(zhì)。(4) 如上述(1)所述的多核苷酸，其與具有序列號(hào)1或3的堿基序列的 部分或全部互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在5 x S S C、 5 0 。C的條件下進(jìn)行雜交，
且編碼具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的蛋白質(zhì)。(5) 如上述(1)所述的多核苷酸，其含有具有序列號(hào)1或3的堿基序列 的多核苷酸。(6) 如上述(1)所述的多核苷酸，其含有編碼具有序列號(hào)2或4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸。(7) 如上述(1) (6)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其為DNA。(8) 如上述(1) (7)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其編碼對(duì)于呋喃駢呋 喃類木脂素具有轉(zhuǎn)移甲基活性的蛋白質(zhì)。(9) 如上述(8)所述的多核苷酸，其編碼對(duì)于松脂醇及/或胡椒醇具有轉(zhuǎn)移甲基活性的蛋白質(zhì)。(10) 蛋白質(zhì)，其是被上述(1) (9)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。(11) 載體，其含有上述(1) (9)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。(12) 宿主細(xì)胞，其為被上述(11)所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。(13) 該蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)或繁殖權(quán)利要求12所述的 宿主細(xì)胞，從該宿主細(xì)胞中提取具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的蛋白質(zhì)。(14) 植物體(例如，芝麻、連翹或亞麻)或具有與該植物體相同性質(zhì)的 該植物體的后代植物體、或這些植物體的組織，其中導(dǎo)入上述(1) (9)中 任一項(xiàng)所述的多核苷酸。(15) 方法，其使用上述(1) (9)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，將甲基 轉(zhuǎn)移至木脂素上。(16) 該植物體或具有與該植物體相同性質(zhì)的該植物體的后代植物體，其 中，將上述(1) (9)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸導(dǎo)入植物體內(nèi)，通過表達(dá)使 產(chǎn)生的木脂素組成改變。(17) 多核苷酸，其具有上述(1) (9)中所述的多核苷酸的片段或其 互補(bǔ)序列。如果利用本發(fā)明的多肽(木脂素甲基化酶)，產(chǎn)生的效果是例如能夠在生 物(特別是植物)中人為地調(diào)節(jié)木脂素及甲基化木脂素的量。此外，通過使用 這些重組酶使木脂素甲基化，可以改變體外和體內(nèi)的物性(溶解度、動(dòng)物的吸
收效率等)。此外，通過利用本發(fā)明的多核苷酸，可人工生產(chǎn)目前為止自然界中 未鑒定的甲基化木脂素。此外，利用本發(fā)明的多肽合成的甲基化木脂素，能夠 作為新型生理功能物質(zhì)的初始物質(zhì)或中間體有效利用。通過使用基因重組技術(shù)使本發(fā)明的木脂素甲基化酶在所期望的生物內(nèi)表達(dá)，可由松脂醇人工生產(chǎn)單甲基化松脂醇及/或由胡椒醇人工生產(chǎn)Kobusine。此外，通過使用基因重組技術(shù)使本發(fā)明的木脂素甲基化酶在所期望的生物內(nèi)表達(dá)， 能夠制造人為控制木脂素和甲基化木脂素的量的植物及/或微生物。在生產(chǎn)Kobusine或甲基化松脂醇的植物中，通過抑制本發(fā)明的木脂素甲基 化酶的表達(dá)，能夠使葡糖苷配基游離，使木脂素(特別是胡椒醇及/或松脂醇) 的量增加。如果使用本發(fā)明的木脂素甲基化酶，能夠由松脂醇人工生產(chǎn)新型甲基化木 脂素單甲基化松脂醇。


圖1是芝麻木脂素的結(jié)構(gòu)和代謝途徑圖。圖2-2A是通過RT — PCR的S i 0MT1及S i OMT2在芝麻 (S. indicum cv.真瀨金)不同器官的基因表達(dá)分析的結(jié)果圖。圖2 — 2 B是通 過RT — PCR的S rOMTl在芝麻(S. radiatum)不同器官的基因表達(dá)分析 的結(jié)果圖。圖3—3 A是大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的S i OMTl和松脂醇的酶反應(yīng)液在A280nm 處的色譜圖。圖3—3 B是大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的S i 0MT1和胡椒醇的酶反應(yīng)液 在A280nm處的色譜圖。圖4一3C是大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的S i OMT2和松脂醇的酶反應(yīng)液在A280nm 處的色譜圖。圖4 一3D是大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的S i 0MT2和胡椒醇的酶反應(yīng)液 在A280nm處的色譜圖。圖5 —3E是大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的S r OMTl和松脂醇的酶反應(yīng)液在A280nm 處的色譜圖。圖5—3F是大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的S rOMTl和胡椒醇的酶反應(yīng)液 在A280nm處的色譜圖。圖6—4A是由S i 0MT1生成的甲基化松脂醇的L C—MS的色譜圖。
圖7—4B是由S i 0MT1生成的甲基化胡椒醇(Kobusine)的LC一M S的色譜圖。圖8是使用S i 0MT1基因全長探針的Genomic Southern雜交的結(jié)果。 圖9 —6A是標(biāo)準(zhǔn)品咖啡酸在A280nm處的色譜圖。圖9 一6B是大腸桿菌內(nèi) 表達(dá)的S i OMTl和咖啡酸的酶反應(yīng)液在A280nm處的色譜圖。圖9一6C是大 腸桿菌內(nèi)表達(dá)的S r OMTl和松脂醇的酶反應(yīng)液在A280nm處的色譜圖。圖1 0 —6D是由S i 0MT1生成的甲基化咖啡酸(阿魏酸)的LC一M S的色譜圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了以木脂素特別是以松脂醇及/或胡椒醇為主要基質(zhì)的新型 甲基化酶，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該甲基化酶可使松脂醇甲基化。到目前為止雖然已鑒定出 二甲基化松脂醇桉脂素，但仍未發(fā)現(xiàn)單甲基化松脂醇。本發(fā)明者通過同源性檢索，從包括來自芝麻種子的5000個(gè)克隆體的EST數(shù) 據(jù)庫中查找芝麻甲基化酶樣基因的部分序列，其結(jié)果得到2種甲基化酶樣基因(下述S i 0MT1和S i OMT2)。這些S i 0 M T基因在種子內(nèi)表達(dá)強(qiáng)烈。 采用RACE法取得這些基因的全長堿基序列，使其在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)。使得 到的重組蛋白質(zhì)與芝麻素酚或松脂醇反應(yīng)后，利用HPLC分析、LC一MS 分析、及TOF—MS /MS分析，測(cè)定酶活性。其結(jié)果證明S i OMTl具有 催化使胡椒醇甲基化生成Kobusine的反應(yīng)的活性。并且證明S i 0 M T 1具有 催化使松脂醇甲基化生成單甲基化松脂醇的反應(yīng)的活性。認(rèn)為該甲基化木脂素 是松脂醇的衍生物桉脂素的中間體。通過PCR從非洲芝麻Sesamum radiatum中 克隆S i 0MT1的同源基因S r 0MT1，確認(rèn)S r OMT1具有與S i OM Tl同樣的甲基化活性。"木脂素"是具有C6-C3骨架的2分子phenylpropanoid化合物主要通過這 些8-8'位聚合(8-8，鍵)的化合物。 一般認(rèn)為木脂素對(duì)植物的生物體防御機(jī) 構(gòu)有用(參照P hytochemistryRev.2， 371—390(2 ， 0 0 3 ))。作為代表性的木脂素，可以為芝麻中含有的(+ ) —芝麻素、(+ ) —芝麻素
酚、(+ ) —芝麻林素、(+ ) —松脂醇、(+ ) —胡椒醇及(+) —芝麻素酚；連翹(Forsythia intermedia)中含有的(+ )—松脂醇、 (一) 一牛蒡子苷配基及(一) 一羅漢松樹脂酚；甘肅瑞香(Daphne t a n g u t i c a )中含有的(一) 一松脂醇和(一) 一落葉松脂素；亞麻(L inum usitatissimum)中含有的(+ ) —閉聯(lián)異落葉松脂 素等。這些木脂素有多種分子結(jié)構(gòu)(參照W o od Research 90， 2 7 — 1 1 0( 2 ， 0 0 3 )等)。以(+)—松脂醇為代表的芝麻木脂素類被分 類為在范圍最廣的植物種中已被鑒定的呋喃駢呋喃類木脂素。作為芝麻木脂素 之一的芝麻素，具有多種生理活性作用，對(duì)膽固醇代謝、肝功能及免疫功能的 改善有效(例如參照《芝麻其科學(xué)和功能性》日語原名「^7^0科學(xué)i:効能 性」、并木滿夫編；丸善planet公司(1998))。從芝麻種子或芝麻粕中分離精 制芝麻素的方法已經(jīng)實(shí)用化(例如、日本特開2 0 0 1 — 1 3 9 5 7 9公報(bào)、 日本特開平l 0 — 7 6 7 6號(hào)公報(bào)等)，以芝麻素為主要成分的具有促進(jìn)乙醇分 解作用的肝功能改善/增強(qiáng)劑已有市售(商品名「七廿S乂」(芝麻素)，總經(jīng) 銷三得利株式會(huì)社)。此外，有報(bào)告指出，除芝麻素之外，其它木脂素(例如 芝麻素酚、芝麻林素等)也具有生理活性(例如參照「日本農(nóng)藝化學(xué)會(huì)志」日 語原名「日本農(nóng)蕓化學(xué)會(huì)誌」、76: 805 — 813 (2002 ))。因此，木 脂素或其衍生物作為具有各種生理活性的生理活性物質(zhì)或其中間體有用。以下，對(duì)于本發(fā)明的編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸、被該 多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)、及其利用進(jìn)行詳細(xì)說明。 (1)多核苷酸首先，本發(fā)明提供下述(a) (d)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。(a) 多核苷酸，其含有具有序列號(hào)1或3的堿基序列的多核苷酸；(b) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有序列號(hào)2 或4的氨基酸序列；(c) 多核苷酸，其為與具有序列號(hào)1或3的堿基序列的部分或全部互補(bǔ)堿 基序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，且編碼具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上 的活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(d) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有在序列號(hào) 2或4的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基 酸序列，且具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性。在本發(fā)明書中，用語"多核苷酸"可與"基因"、"核酸"或"核酸分子" 交換使用，是指核苷酸的聚合物。在本說明書中，用語"堿基序列"可與"核酸序列"或"核苷酸序列"交換使用，以脫氧核糖核苷酸(省略為A、 G、 C及T)的序列表示。本發(fā)明的多核苷酸可以RNA (例如mRNA)的形態(tài)、或DNA的形態(tài)(例如cDNA 或基因組DNA)存在，DNA可以是雙鏈或單鏈，單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈(正 義鏈)，或者也可以是非編碼鏈(反義鏈)。在本說明書中，用語"寡核苷酸"是指數(shù)個(gè) 數(shù)十個(gè)核苷酸(例如2 60 個(gè))結(jié)合形成的寡核苷酸，可與"多核苷酸"交換使用。對(duì)于寡核苷酸，短的 稱為二核苷酸(二聚體)、三核苷酸(三聚體)，長的用30mer或100mer這種發(fā) 生聚合的核苷酸的數(shù)量表示。寡核苷酸可以作為更長的多核苷酸的片段而生成， 也可以化學(xué)合成。在本說明書中，用語"部分多核苷酸"是指該多核苷酸的片段，例如是指 至少12nt (核苷酸)，優(yōu)選約15nt，更優(yōu)選至少約20nt，更進(jìn)一步優(yōu)選至少約 30nt，最優(yōu)選至少約40nt長度的片段。"至少12nt長度的片段"，例如是指含 有序列號(hào)1所示的堿基序列中的12以上連續(xù)堿基的片段。參照本說明書可提供 序列號(hào)1所示的堿基序列，所以同領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地制作以序列號(hào)1為 基礎(chǔ)的DNA片段。例如為了制作各種大小的片段可容易地使用限制內(nèi)切酶切割 或超聲波切割?；蛘呖珊铣芍谱鬟@種片段。適當(dāng)?shù)钠?寡核苷酸)，可通過A pplied Biosystems Incorporated(ABI， 850 Lincoln Center Dr. ， Foster City, CA94404) 392型Synthesizer等合成。本發(fā)明的多核苷酸，編碼具有木脂素甲基化活性的多肽。這種多核苷酸， 典型的是含有具有序列號(hào)1或3的堿基序列的多核苷酸的多核苷酸，或含有編 碼具有序列號(hào)2或4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。本發(fā)明的 優(yōu)選多核苷酸是具有序列號(hào)1或3的堿基序列的多核苷酸、或編碼具有序列號(hào)2 或4的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸，只要其編碼的多肽具有木脂素甲基化活性，可以為在 序列號(hào)1或3的堿基序列中缺失、插入、替換及/或添加1個(gè)或多個(gè)(例如l 30個(gè)、1 20個(gè)、1 10個(gè)、1 數(shù)個(gè)(例如6個(gè))1 5個(gè)、1 3個(gè)、1 2個(gè) 等)堿基后的突變體。突變體可在編碼區(qū)或非編碼，或在這兩個(gè)區(qū)突變。編碼 區(qū)的突變，可生成保守性或非保守性氨基酸的缺失、插入、替換或添加。本發(fā)明的多核苷酸，是編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸，包 括與具有序列號(hào)l或3的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜 交的多核苷酸。可采用Sambrook等、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed. ， Cold Sprin g Harbor Laboratory (1989)中記載的方法的公知 方法進(jìn)行雜交。通常情況下，溫度越高鹽濃度越低，嚴(yán)格度就越高(雜交越難)， 能夠得到同源性更高的多核苷酸。適當(dāng)?shù)碾s交溫度，因堿基序列、該堿基序列 的長度的不同而不同，例如將由編碼6個(gè)氨基酸的18個(gè)堿基組成的DNA片段作 為探針使用時(shí)，優(yōu)選5(TC以下的溫度。在本說明書中，用語"嚴(yán)格的雜交條件"是指，在雜交溶液(含有5 0 % 甲酰胺、5 X S S C (15 0 mM N a C 1 、 15 mM枸櫞酸三鈉)、5 0m M磷酸鈉(p H 7 . 6 )、 5 XDenhardt液、1 0 %硫酸葡聚糖、及2 0 u g / m 1變性剪切鮭精子DN A)中，4 2'C孵育一夜后，約6 5'C時(shí)在0. IX S S C中洗凈過濾器。與多核苷酸的"一部分"雜交的多核苷酸，是指與參照 多核苷酸的至少約15個(gè)核苷酸(nt)，更優(yōu)選至少約20nt，更進(jìn)一步優(yōu)選至少 約30nt，最優(yōu)選至少約30 70nt進(jìn)行雜交的多核苷酸(DNA或RNA的任一種)。本發(fā)明提供具有與序列號(hào)1或3的堿基序列至少8 0 %同一，更優(yōu)選至少 85%、 90%、 92%、 95%、 96%、 97%、 9 8%或9 9%同一的堿基序列的多核苷酸。對(duì)于任意特定的核酸分子，其是否與例如序列號(hào)1或3所示的堿基序列至 少80%、 85%、 90%、 92%、 95%、 96%、 97%、 98%、或 9 9 %同一，使用公知的計(jì)算機(jī)程序(例如B estfit program (WisconsinSequenceAnalysis Packa ge， Version8 forUnix (注冊(cè)商標(biāo))，Genetic sComputerGroup, University Resear chPark, 575ScienceDrive, Madison, W I5 3 7 1 1 ))可以決定。B e s t f i t是利用S m i t h和W a t e rma n的局部同源性算法(Algorithm),發(fā)現(xiàn)2個(gè)序列間的最良好的同源區(qū) 段(segment )(Advances inApplied Mathema tics2: 482 489 (1981 ))。使用B e s t f i t或任意的 其他序列排列程序，決定特定的序列與本發(fā)明的參照序列例如是否95%同一時(shí)， 用參照堿基序列的全長計(jì)算同一性百分率，并且設(shè)定參數(shù)允許參照序列的核苷 酸總數(shù)的5%以下的同源性的空位。在特定實(shí)施方式中，參照(QUERY)序列(本發(fā)明的序列)和對(duì)象序 列之間的同一性(也稱為全體序列排列)，使用以B r u t 1 a g等的算法(C omp. App. Biosci. 6: 237 245 (1990))為基礎(chǔ)的 FASTDB計(jì)算機(jī)程序決定。為了計(jì)算同一性百分率，DNA序列的FAS T D B排列中優(yōu)選使用的參數(shù)為Matrix=Unitary、k—tu ple = 4、 Mismatch Penal ty = l、 Joining P enalty二30、 Randomization Group Leng th = 0、 Cutoff Score = l、Gap Penal ty = 5、 Gap Size Penalty = 0. 05、 Window Size = 5 0 O或?qū)ο髩A基序列的長度(更短一方)。此外，本發(fā)明包括上述多核苷酸的片段或具有其互補(bǔ)序列的寡核苷酸。即 使在本發(fā)明的寡核苷酸不編碼木脂素甲基化多肽時(shí)，同領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易理 解在制作本發(fā)明的多肽時(shí)，可將本發(fā)明的多核苷酸作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 的引物使用。不編碼木脂素甲基化多肽的本發(fā)明的寡核苷酸的其他用途，可以 為下述用途(1) c DNA文庫中的木脂素甲基化酶基因或其對(duì)立基因或剪切 突變體的分離；(2)為了提供木脂素甲基化酶基因的正確的染色體位置，與分 裂中期染色體Spread的原位雜交(例如"F I S H ") ( V e r m a等，H u m an Chromosomes: A Manual of Basic T echniques，PergamonPress,New York(l 9 8 8 )中記載)；及(3)用于檢測(cè)特定組織的木脂素甲基化酶mRNA表達(dá) 的Northern—blot分析。本發(fā)明的多核苷酸或寡核苷酸，可作為利用反義RNA作用原理的基因表達(dá) 操作用的工具使用。利用反義RNA技術(shù)，可觀察到來自內(nèi)源性基因的基因產(chǎn)物 的減少。通過導(dǎo)入本發(fā)明的寡核苷酸，可使具有木脂素甲基化活性的多肽的含 量降低，其結(jié)果能夠控制(增加或減少)植物中的甲基化木脂素含量或含量比。 本發(fā)明的多核苷酸或寡核苷酸，可以包括非翻譯區(qū)(UTR)的序列、載體序列(包 括表達(dá)載體序列)等序列。取得本發(fā)明的多核苷酸或寡核苷酸的方法，可以為將含有本發(fā)明的多核苷 酸或寡核苷酸的DNA片段進(jìn)行分離的各種公知的方法。例如制備與本發(fā)明的多 核苷酸的堿基序列的一部分進(jìn)行特異雜交的探針，篩選基因組DNA文庫或c DNA文庫，能夠取得本發(fā)明的多核苷酸或寡核苷酸。作為這種探針，只要是 與本發(fā)明的多核苷酸的堿基序列或其互補(bǔ)序列中的至少一部分進(jìn)行特異雜交的 多核苷酸(寡核苷酸)即可。這種通過雜交選擇的多核苷酸，可以為天然的多核苷酸(例如來自胡麻科 植物、地衣類植物等植物的多核苷酸)，也可以為來自植物以外的多核苷酸。取得本發(fā)明的多核苷酸的其他方法，可以為使用PCR的方法。該P(yáng)CR擴(kuò)增 方法的特征在于，包括例如利用本發(fā)明的多核苷酸的cDNA的5'側(cè)及/或3'側(cè) 的序列(或其互補(bǔ)序列)制備引物的步驟、使用這些引物將基因組DNA (或cDNA) 等作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。使用本發(fā)明的方法，能夠大量取得含有本發(fā) 明的多核苷酸的DNA片段。作為取得本發(fā)明的多核苷酸的供給源，沒有特別限定，優(yōu)選含有胡椒醇或 松脂醇的生物材料。在本說明書中，用語"生物材料"是指生物學(xué)樣品(從生 物體中得到的組織樣品或細(xì)胞樣品)。在下述實(shí)施例中雖然使用芝麻，但并不限 于此。使用本發(fā)明的多核苷酸，能夠在轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞中合成具有木脂素甲基化活 性的多肽。使用本發(fā)明的多核苷酸，通過檢測(cè)雜交的多核苷酸，能夠容易地檢 測(cè)出表達(dá)具有木脂素甲基化活性的多肽的生物。本發(fā)明的寡核苷酸，通過作為檢測(cè)編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多
核苷酸的雜交探針或用于擴(kuò)增該多核苷酸的引物利用，能夠容易地檢測(cè)出表達(dá) 具有木脂素甲基化活性的多肽的生物或組織。并且，將上述寡核苷酸作為反義 寡核苷酸使用，能夠抑制上述生物體或組織或細(xì)胞的具有木脂素甲基化活性的 多肽的表達(dá)。(2)多肽本發(fā)明還提供被上述本發(fā)明的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)(多肽)，這種多肽， 典型的是具有序列號(hào)2或4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在本說明書中，用語"多肽"可與"肽"或"蛋白質(zhì)"交換使用。此外， 多肽的"片段"是指該多肽的部分片段。且本發(fā)明的多肽可從天然供給源中分 離，也可化學(xué)合成。本發(fā)明的多肽，包括天然精制產(chǎn)物、化學(xué)合成產(chǎn)物、以及從原核生物宿主 或真核生物宿主(例如包括細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、高等植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞及 哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中通過重組技術(shù)產(chǎn)生的產(chǎn)物。依靠重組產(chǎn)生步驟中使用的宿主， 可使本發(fā)明的多肽糖基化或非糖基化。并且，本發(fā)明的多肽在多種情況下，作 為宿主介導(dǎo)過程的結(jié)果，可含有起始的突變蛋氨酸殘基。本發(fā)明還提供具有木脂素甲基化活性的多肽。在本說明書中，"木脂素甲基 化活性"是指使木脂素甲基化的活性，S卩、將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性。也 就是說，本說明書中的"甲基化酶"和"甲基轉(zhuǎn)移酶"可交換使用。通過使作為甲基供給體的SAM和作為基質(zhì)的木脂素與木脂素甲基化酶反應(yīng)，將其反應(yīng)生 成物進(jìn)行HPLC或LC-MS分析，能夠測(cè)定或確認(rèn)"木脂素甲基化活性"。 一般的 甲基化酶活性測(cè)定法如公知文獻(xiàn)所記載(公知文獻(xiàn)Toquin， V. ， et al. (2003) Plant Mol. Biol. 52， 495-509. ， Gang, D. R. ， et al. (2002) Plant Cell 14， 505-519.)。此外，本發(fā)明的多肽是具有序列號(hào)2或4的氨基酸序列的多肽的突變體， 且包括具有木脂素甲基化活性的多肽。這種突變體包括具有在序列號(hào)2或4的氨基酸序列中，缺失、替換、插入 及/或添加l個(gè)或多個(gè)(例如1 30、 1 20、 1 10、 1 數(shù)個(gè)(6個(gè))、1 3個(gè)、 1 2個(gè)等)氨基酸(氨基酸殘基)后的氨基酸序列，且具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂
素上的活性的蛋白質(zhì)。"缺失、替換、插入及/或添加"包括逆轉(zhuǎn)、重復(fù)及類型 替換(例如將親水性殘基替換為其他殘基，但通常不能將強(qiáng)親水性殘基替換為 強(qiáng)疏水性殘基)。特別是，多肽中的"中性"氨基酸的替換， 一般來說幾乎不影 響該多肽的活性?？扇菀椎馗淖兌嚯牡陌被嵝蛄兄械臄?shù)個(gè)氨基酸，而不顯著影響該多肽的 結(jié)構(gòu)或功能，這在該領(lǐng)域是公知的。并且還知道不僅是人為地改變，天然蛋 白質(zhì)中也存在不會(huì)使該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能顯著改變的突變體。同領(lǐng)域技術(shù)人員，使用公知技術(shù)，能夠容易地使多肽的氨基酸序列中1或 多個(gè)氨基酸突變。例如，根據(jù)公知的定點(diǎn)誘變法，能夠使編碼多肽的多核苷酸 的任意堿基突變。此外，設(shè)計(jì)與編碼多肽的多核苷酸的任意位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物， 能夠制作缺失突變體或附加突變體。進(jìn)而，使用本發(fā)明書中記載的方法，可容 易地決定制作的突變體是否具有所期望的活性。優(yōu)選的突變體具有保守性或非保守性氨基酸替換、缺失或添加。優(yōu)選沉默 替換、添加及缺失，特別優(yōu)選保守性替換。這些不會(huì)改變本發(fā)明的多肽的活性。通常認(rèn)為的代表性保守性替換是，脂肪族氨基酸A 1 a 、 V a 1 、 L e u 、 及I 1 e中的1個(gè)氨基酸替換為其他的氨基酸；羥基殘基S e r和Th r的交 換，酸性殘基A s p和G 1 u的交換、酰胺殘基A s n和G 1 n之間的替換、 堿性殘基Ly s和A r g的交換、以及芳香族殘基Phe、 Ty r之間的替換。如上詳述，有關(guān)哪個(gè)氨基酸的突變可能是表達(dá)沉默型(即是否對(duì)功能有顯 著有害效果)的進(jìn)一步指導(dǎo)說明，在B o w i e ， J . U.等"D e c i p hering the Message in Protein Sequ ences: Tolerance to Amino Acid Sub stitutions"， Science 247:1306 — 1310 (1 9 9 0)中有記載。如上所述，這種突變多肽并不限于利用公知的突變多肽的制作方法，具有 人為地導(dǎo)入的突變的多肽，也可以為分離精制天然存在的多肽得到的突變多肽。本發(fā)明的多肽，可以為氨基酸形成肽鍵的多肽，但并不限于此，也可以為 含有多肽以外的結(jié)構(gòu)的復(fù)合多肽。在本說明書中使用時(shí)，"多肽以外的結(jié)構(gòu)"可 以為糖鏈、類異戊二烯(is叩renoid)基等，但未特定。
本發(fā)明的多肽，也可以包括附加多肽。作為附加多肽，例如可以為Hi S、My c、 F 1 a g等表位標(biāo)記的多肽。本發(fā)明的多肽，可以為將編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使 該多肽在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的狀態(tài)，也可以從細(xì)胞、組織等中分離精制。本發(fā)明的多肽，可以如下所述重組生成，也可以化學(xué)合成(例如參照Ho lighten, R.A.， Proc. Natl. Acad. Sci.USA 8 2: 5131—5135 (1985 );美國專利第4 ， 6 3 1， 2 11號(hào)等)。本發(fā)明的多肽，能夠催化木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)的甲基化反應(yīng)。(3)本發(fā)明的多肽或多核苷酸的利用 本發(fā)明還提供通過使用本發(fā)明的多肽或多核苷酸，控制(增加或減少)生 物(優(yōu)選植物)中的木脂素及甲基化木脂素的量的方法以及該經(jīng)控制后的生物 (優(yōu)選植物)。 (A)載體本發(fā)明提供用于生成具有木脂素甲基化活性的多肽時(shí)使用的載體。本發(fā)明 的載體可以為體外翻譯時(shí)使用的載體，也可以為重組表達(dá)時(shí)使用的載體。本發(fā)明的載體，只要含有上述本發(fā)明的多核苷酸，沒有特別限定。例如可 以為插入編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的cDNA的重組表達(dá)載體 等。重組表達(dá)載體的制作方法可以為使用質(zhì)粒、噬菌體、或黏粒等的方法，沒 有特別限定。載體的具體種類沒有特別限定，可適當(dāng)選擇在宿主細(xì)胞中可表達(dá)的載體。 即根據(jù)宿主細(xì)胞的種類，為了使本發(fā)明的多核苷酸準(zhǔn)確地表達(dá)而選擇適當(dāng)?shù)?啟動(dòng)子序列，可以將使其和本發(fā)明的多核苷酸整合到各種質(zhì)粒等中得到的載體 作為表達(dá)載體使用。本發(fā)明的表達(dá)載體，依賴于應(yīng)導(dǎo)入的宿主的種類，含有表達(dá)控制區(qū)(例如 啟動(dòng)子、終止子及/或復(fù)制起點(diǎn)等)。細(xì)菌用表達(dá)載體的啟動(dòng)子，可使用通常用 的啟動(dòng)子(例如t r c啟動(dòng)子、t a c啟動(dòng)子、1 a c啟動(dòng)子等)，酵母用啟動(dòng) 子，例如可以為甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子、PHO 5啟動(dòng)子等，絲狀菌用啟 動(dòng)子，例如可以為淀粉酶(Amylase)、 t r p C等。此外，動(dòng)物細(xì)胞宿主用啟
動(dòng)子，可以為病毒性啟動(dòng)子(例如SV4 0初期啟動(dòng)子、SV4 O后期啟動(dòng)子等)。植物體轉(zhuǎn)化使用的重組表達(dá)載體，只要是在該植物體內(nèi)可使本發(fā)明的多核 苷酸表達(dá)的載體，沒有特別限定。作為這種載體，例如可以為具有在植物細(xì)胞內(nèi)使多核苷酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)表達(dá)的啟動(dòng)子(例如花椰菜花葉病毒的3 5 S啟動(dòng)子) 的載體，或者為具有通過外部剌激被誘導(dǎo)活化的啟動(dòng)子的載體。可根據(jù)使用限制酶及/或連接酶等的通常方法進(jìn)行表達(dá)載體的制備。利用表 達(dá)載體的宿主的轉(zhuǎn)化也可根據(jù)通常的方法進(jìn)行。將使用上述表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主進(jìn)行培養(yǎng)、栽培或飼養(yǎng)后，根據(jù)通常 用的方法(例如過濾、離心分離、細(xì)胞破碎、凝膠過濾色譜法、離子交換色譜 法等)，可從培養(yǎng)物等中回收、精制目標(biāo)蛋白質(zhì)。表達(dá)載體，優(yōu)選至少含有1個(gè)選擇性標(biāo)記。作為這種標(biāo)記，在真核生物細(xì) 胞培養(yǎng)中可以為二氫葉酸還原酶基因或新霉素抗性基因，以及在E. co1 i 及其他細(xì)菌培養(yǎng)中可以為四環(huán)素抗性基因或氨芐青霉素抗性基因。使用上述選擇性標(biāo)記物，能夠確認(rèn)本發(fā)明的多核苷酸是否導(dǎo)入宿主細(xì)胞， 并且確認(rèn)在宿主細(xì)胞中是否準(zhǔn)確表達(dá)。或者，將本發(fā)明的多肽作為融合多肽(例 如與GFP的融合多肽)表達(dá)，可將GFP熒光作標(biāo)記物使用。 (B)轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞本發(fā)明提供導(dǎo)入有編碼具有上述木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn) 化體或細(xì)胞。在本說明書中，用語"轉(zhuǎn)化體"不僅包括組織或器官，還包括生 物個(gè)體。轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞的制作方法(生產(chǎn)方法)沒有特別限定，例如可以為將上述 重組載體導(dǎo)入宿主內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法。這里使用的宿主細(xì)胞，沒有特別限定， 可優(yōu)選使用以往公知的各種細(xì)胞。具體來說，例如可以為大腸桿菌(E s c h erichia coli)等細(xì)菌、酵母(出芽酵母S accharomy ces cerevisiae、分裂酵母Schi zosaccharom ycespombe)、線蟲(Caenorhabditis elega n s )、非洲爪蛙(Xenopus laevis)的卵母細(xì)胞等。上述宿主 細(xì)胞的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基及條件在該領(lǐng)域是公知的。此外，對(duì)作為轉(zhuǎn)化的對(duì)象的生 物沒有特別限定，可以為上述宿主細(xì)胞中例示的各種微生物、植物或動(dòng)物。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞的特征在于，這些轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞使天然具有的木脂 素及/或甲基化木脂素的組成發(fā)生改變。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞，優(yōu)選植物或其 后代、或來自這些植物或其后代的組織，特別優(yōu)選芝麻、連翹或亞麻。這種轉(zhuǎn) 化體或細(xì)胞，通過使用本發(fā)明的控制甲基化木脂素含量的方法，能夠使產(chǎn)生木 脂素的生物中的甲基化木脂素的含量增加或減少。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，可以為植物轉(zhuǎn)化體。本實(shí)施方式的植物轉(zhuǎn)化體可通過下 述方式取得，S卩將含有本發(fā)明的多核苷酸的重組載體導(dǎo)入被該多核苷酸編碼 的多肽可表達(dá)的植物中。使用重組表達(dá)載體時(shí)，植物體轉(zhuǎn)化時(shí)使用的重組表達(dá)載體，只要是在該植 物體內(nèi)可使本發(fā)明的多核苷酸進(jìn)行表達(dá)的載體，沒有特別限定。作為這種載體， 例如可以為具有在植物細(xì)胞內(nèi)可使多核苷酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)表達(dá)的啟動(dòng)子(例如、花 椰菜花葉病毒的3 5 S啟動(dòng)子)的載體，或具有通過外部刺激被誘導(dǎo)活化的啟動(dòng)子的載體。本發(fā)明中作為轉(zhuǎn)化的對(duì)象的植物，是指植物體整體、植物器官(例如葉、 花瓣、莖、根、種子等)、植物組織(例如表皮、韌皮部、柔軟組織、木質(zhì)部、 維管束、柵狀組織、海綿狀組織等)或植物培養(yǎng)細(xì)胞、或各種形態(tài)的植物細(xì)胞 (例如懸浮培養(yǎng)細(xì)胞)、原生質(zhì)體、葉子切片、愈傷組織等任何物質(zhì)。轉(zhuǎn)化使用 的植物，沒有特別限定，可以為屬于單子葉植物綱或雙子葉植物綱植物中的任 何植物。向植物內(nèi)導(dǎo)入基因時(shí)，使用同本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的轉(zhuǎn)化方法(例如農(nóng)桿 菌法、基因槍法、PEG法、電穿孔法等)。例如以農(nóng)桿菌為介質(zhì)的方法和直接向 植物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入的方法是公知的。使用農(nóng)桿菌法時(shí)，將構(gòu)建的植物用表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)霓r(nóng)桿菌(例如A grobacterium tumefacie n s )內(nèi)，根據(jù)葉盤法(內(nèi)宮博文著、「植物基因操作手冊(cè)」日語原名「植物遺伝子操作7二二7》」(1990) 27 31頁、講談社科學(xué)技術(shù)、東京)等，使該株感染無菌培養(yǎng)葉片，可得到轉(zhuǎn)化體。此外，可使用Na g e l等的方法(M icribiol. Lett.、 67、 325 (1990 ))。該方法首先例如將表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌內(nèi)，接著利用P lantMolecular Bio logyManual (S. B. Gelvin等、Academic P ress Publishers)中所述的方法將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì) 胞或植物組織內(nèi)。這里，"植物組織"包括培養(yǎng)植物細(xì)胞得到的愈傷組織。使用 農(nóng)桿菌法進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，可使用雙元載體(binary vector) ( p B I 1 2 l或p P Z P 2 0 2等)。此外，作為將基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞或植物組織內(nèi)的方法，已知有電穿孔 法、基因槍法。使用基因槍時(shí)，可直接使用植物體、植物器官、植物組織本身， 也可制備成切片后使用，還可以制備原生質(zhì)體使用?？蓪⑸鲜鲋苽涞脑嚵嫌没?因?qū)胙b置(例如PDS — 1 0 0 0 (B I 0 —RAD公司)等)處理。處理 條件因植物或試料的不同而不同，但通常在壓力約4 5 0 2 0 0 0 p s i 、 距離約4 1 2 cm的條件下進(jìn)行。已導(dǎo)入基因的細(xì)胞或植物組織，首先用潮霉素抗性等抗藥性選擇，接著利 用通常方法使植物體再生。從轉(zhuǎn)化細(xì)胞到植物體的再生，可根據(jù)植物細(xì)胞的種 類采用同領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。將植物培養(yǎng)細(xì)胞作為宿主使用時(shí)，轉(zhuǎn)化是利用基因槍法、電穿孔法等將重 組載體導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化的結(jié)果得到的愈傷組織、芽、毛狀根等，可直接 在細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)或器官培養(yǎng)中使用，并且使用以往公知的植物組織培養(yǎng) 法，通過投入適當(dāng)濃度的植物激素(生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、 乙烯、油菜素甾醇等)等，能夠使其再生為植物體?？赏ㄟ^PCR法、Southern雜交法、Northern雜交法等來確認(rèn)基因是否導(dǎo)入 植物內(nèi)。例如從轉(zhuǎn)化植物中制備DNA，設(shè)計(jì)DNA特異性引物進(jìn)行PCR。一旦取得本發(fā)明的多核苷酸整合到基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)化植物體，通過該植物體 的有性生殖或無性生殖可得到其后代。此外，從該植物體或其后代、或從該植 物體或其后代的克隆體中，例如得到種子、果實(shí)、切穗、塊莖、塊根、植株、 愈傷組織、原生質(zhì)體等，以這些為基礎(chǔ)能夠量產(chǎn)該植物體。因此，本發(fā)明包括 可表達(dá)地導(dǎo)入本發(fā)明的多核苷酸的植物體，或具有與該植物體相同性質(zhì)的該植 物體的后代，或來自上述植物體或其后代的組織。對(duì)各種植物的轉(zhuǎn)化方法已有報(bào)導(dǎo)，作為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體植物，例如可以為 芝麻、稻子、煙草、大麥、小麥、油菜籽、馬鈴薯、番茄、白楊、香蕉、有加 利樹、甘薯、大豆、紫花苜蓿、羽扇豆、玉米、菜花、薔薇、菊花、康乃馨、 金魚草、仙客來、蘭花、洋桔梗、洋水仙、大丁草、唐菖蒲、霞草、長壽花、百合、天竺葵屬植物、天竺葵、矮牽牛、藍(lán)翅草、郁金香、連翹、擬南芥、亞 麻及百脈根等，但不限于這些。在優(yōu)選實(shí)施方式中，可使用芝麻制作本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。芝麻的轉(zhuǎn)化體的制作方法，例如可以為T.Asamizu: Transformation o f sesame plants using MAT vector s ystem: introduction of fatty acid d esaturase genes. Sesame Newsletter 16: 22 25 (2002)中記載的公知方法。使用如此得到的轉(zhuǎn)化芝麻，因?yàn)樵谠撝ヂ閮?nèi)生產(chǎn)甲基化木脂素，所以能夠 用低成本且環(huán)境低負(fù)荷的生產(chǎn)工序生產(chǎn)甲基化木脂素(胡椒醇及/或松脂醇)。在其它優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可優(yōu)選使用煙草。煙草和矮牽牛 都是容易轉(zhuǎn)化的代表性植物，由單個(gè)除去細(xì)胞壁的細(xì)胞(原生質(zhì)體)可再生單 個(gè)植物個(gè)體。這種再生的單個(gè)植物個(gè)體與來自多細(xì)胞的單個(gè)個(gè)體不同，不會(huì)形 成嵌合體狀，能夠高效制作轉(zhuǎn)化體。煙草轉(zhuǎn)化的優(yōu)選方法可為葉盤法。這種方法操作容易，可從1枚葉切片上 得到數(shù)個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化的方法例如在"新生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)3核酸的分 離、分析和基因試驗(yàn)法化學(xué)同人"日語原名「新生物化學(xué)実験O手引會(huì)3 核 酸O分離'分析t遺伝子実験法化學(xué)同人」(1 9 9 6年)中有記載。使用上述得到的轉(zhuǎn)化煙草，能夠用低成本且環(huán)境低負(fù)荷的生產(chǎn)工序生產(chǎn)木 脂素甲基化酶。在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可優(yōu)選使用稻子。使用轉(zhuǎn)化稻子， 能夠用低成本且環(huán)境低負(fù)荷的生產(chǎn)工序在該稻子內(nèi)生產(chǎn)木脂素甲基化酶。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，只要是含有木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)的生物， 不論是什么生物種類，只要導(dǎo)入上述多核苷酸就可生產(chǎn)該甲基化木脂素。使用導(dǎo)入含有編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體，能 夠催化植物等生物中內(nèi)在的木脂素進(jìn)行甲基化的反應(yīng)，所以可用低成本且環(huán)境 低負(fù)荷的生產(chǎn)工序大量制備甲基化木脂素。并且，本發(fā)明通過大量制備甲基化 木脂素，能夠提供廉價(jià)的食品或工業(yè)制品。
使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，能夠在低成本且環(huán)境低負(fù)荷的條件下提供催化木脂 素甲基化反應(yīng)的多肽。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及的細(xì)胞可以為各種細(xì)菌宿主。本實(shí)施方式涉 及的細(xì)胞，可通過下述方式取得，g卩將含有本發(fā)明涉及的多核苷酸的重組載 體導(dǎo)入被該多核苷酸編碼的多肽可表達(dá)的細(xì)胞中。同領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)本說明書中的記載容易理解如果導(dǎo)入含有編碼具 有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的重組表達(dá)載體，就能夠?qū)募?xì)菌到高 等植物的廣泛范圍的生物賦予木脂素甲基化能力。本發(fā)明的細(xì)胞，只要是含有木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)的生物，不 論是什么生物種類，只要導(dǎo)入上述多核苷酸就可生產(chǎn)該甲基化木脂素。使用導(dǎo)入含有編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的重組表達(dá)載體的細(xì)胞，能夠 催化該細(xì)胞內(nèi)的木脂素甲基化反應(yīng)，所以可用低成本且環(huán)境低負(fù)荷的生產(chǎn)工序 大量制備甲基化木脂素。并且本發(fā)明通過大量制備甲基化木脂素，能夠提供廉 價(jià)的食品或工業(yè)制品。使用本發(fā)明的細(xì)胞，能夠在低成本且環(huán)境低負(fù)荷的條件下提供催化木脂素 甲基化反應(yīng)的多肽。(C)多肽的生產(chǎn)方法 本發(fā)明提供生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法。使用本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)方法，能 夠在低成本且環(huán)境低負(fù)荷的條件下提供催化木脂素甲基化反應(yīng)的多肽。此外， 使用本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)方法，可容易生產(chǎn)催化木脂素甲基化反應(yīng)的多肽。本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)方法，可使用含有編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的載體。本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)方法，優(yōu)選將上述載體用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系。 使用無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系時(shí)，可使用各種市售的試劑盒。優(yōu)選本實(shí)施方式的 多肽的生產(chǎn)方法包括孵育上述載體和無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成液的工序。本實(shí)施方式的多肽的生產(chǎn)方法，也可使用重組表達(dá)體系。使用重組表達(dá)體 系時(shí)，可采用下述方法等，即將本發(fā)明的多核苷酸整合到重組表達(dá)載體內(nèi)后， 利用公知的方法可表達(dá)地導(dǎo)入宿主內(nèi)，然后精制在宿主內(nèi)翻譯得到的上述多肽 的方法。重組表達(dá)載體，可以是質(zhì)粒也可以不是質(zhì)粒，只要能夠?qū)⒛繕?biāo)多核苷
酸導(dǎo)入宿主內(nèi)即可。優(yōu)選本實(shí)施方式的多肽的生產(chǎn)方法包括將上述載體導(dǎo)入宿 主內(nèi)的工序。宿主可使用原核生物或真核生物，作為原核生物宿主，例如可使用屬于Es c h e r i c h i a屬的細(xì)菌(例如大腸桿菌(E scherichia c o 1 i )等)、例如屬于B a c i 1 1 u s屬的細(xì)菌(例如、Bacillus s ii b t i 1 i s )等。作為真核生物宿主，可使用低等真核生物(例如酵母 或絲狀菌等真核生物微生物)。作為酵母，可以為S accharomyces 屬微生物(例如Saccharomycescerevisiae等)，作 為絲狀菌，可以為A s p e r g i 1 1 u s屬微生物(例如A s p e r g i 1 lusoryzae、 Aspergillus niger等)、Peni c i1 i um屬微生物。此外，動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞可作為宿主使用。作為 動(dòng)物細(xì)胞，可以為小鼠、大鼠、猴子、人體等的細(xì)胞。并且，昆蟲細(xì)胞(例如 蠶細(xì)胞、或蠶的成蟲)也可作為宿主使用。上述宿主細(xì)胞沒有特別限定，可優(yōu)選使用以往公知的各種細(xì)胞。具體來說， 例如可以為大腸桿菌(E scherichia coli)等細(xì)菌、酵母(出 芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母S c hizosaccharomyces pombe)、線蟲(Caeno rh abditis elegans)、非洲爪蛙(Xenopus laevi s )的卵母細(xì)胞等，沒有特別限定。對(duì)上述宿主細(xì)胞而言合適的培養(yǎng)基以及條 件，為同領(lǐng)域內(nèi)所公知。這樣在宿主內(nèi)導(dǎo)入外源多核苷酸時(shí)，關(guān)于表達(dá)載體，優(yōu)選以外源多核苷酸 表達(dá)的方式整合在宿主內(nèi)發(fā)揮功能的啟動(dòng)子。精制重組產(chǎn)生的多肽的方法，因 使用的宿主、多肽的性質(zhì)的不同而不同，可利用標(biāo)簽(tag)等比較容易地精制目 標(biāo)多肽。本實(shí)施方式涉及的多肽的生產(chǎn)方法，優(yōu)選還包括從含有本發(fā)明的多肽的細(xì) 胞或組織的提取液中精制該多肽的工序。精制多肽的工序，優(yōu)選利用公知的方 法(例如破壞細(xì)胞或組織后進(jìn)行離心分離，回收可溶性組分的方法)，從細(xì)胞、 組織中制備細(xì)胞提取液后，通過公知的方法(例如硫酸銨沉淀或乙醇沉淀、酸 提取、陰離子或陽離子交換色譜法、磷酸纖維素層析法、疏水相互作用色譜法、
親和色譜法、羥基磷灰石色譜法、及凝集素層析法)從該細(xì)胞提取液中精制的 工序，但并不限于此。最優(yōu)選使用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行精制。本發(fā)明的多肽，可以從天然表達(dá)本發(fā)明的多肽的細(xì)胞或組織中精制該多肽， 也可以通過化學(xué)合成制備。制作突變多肽的方法，沒有特別限定，例如可以通過使用下述方法，制作突變多肽。即位點(diǎn)專一誘變法(例如參照H ashimoto—Gotoh， Gene 152， 271—275 (1995 ))，利用PCR法在堿基序列中 導(dǎo)入點(diǎn)突變制作突變多肽的方法，或通過插入轉(zhuǎn)座子制作突變株的方法等公知 的制作突變多肽的方法。制作突變多肽時(shí)也可利用市售的試劑盒。因此，本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)方法，只要至少根據(jù)具有木脂素甲基化活性的 多肽的氨基酸序列、或編碼具有木脂素甲基化活性的多肽的多核苷酸的堿基序 列，使用公知的常用技術(shù)即可。 (D)甲基化木脂素生產(chǎn)方法到目前為止，木脂素及甲基化木脂素的生產(chǎn)是通過提取芝麻進(jìn)行的，因此 存在無法大量生產(chǎn)等問題，但是，根據(jù)本發(fā)明能夠低成本大量生產(chǎn)木脂素及甲 基化木脂素。本發(fā)明提供用表達(dá)本發(fā)明的多肽的生物體或細(xì)胞來生產(chǎn)甲基化木脂素的方 法。上述生物體可以是天然的未改變的生物體，也可以是使用重組表達(dá)體系的 轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的甲基化木脂素生產(chǎn)方法，能夠高效生產(chǎn)木脂素(特別是松脂 醇或胡椒醇)。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的甲基化木脂素生產(chǎn)方法的特征在于，使用用編 碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的生物體或其組織，生產(chǎn)甲基化木脂素。優(yōu)選 上述生物體是上述轉(zhuǎn)化體植物或細(xì)菌，特別優(yōu)選大腸桿菌、芝麻、連翹或亞麻。本發(fā)明的甲基化木脂素生產(chǎn)方法，包括將編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸導(dǎo) 入上述生物體內(nèi)的工序。將多核苷酸導(dǎo)入上述生物體內(nèi)的工序，使用上述各種 基因?qū)敕椒纯?。本?shí)施方式在該方面，上述生物體在轉(zhuǎn)化前產(chǎn)生的甲基化 木脂素和轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的甲基化木脂素的組成不同。具體來說，從上述生物體中 得到的木脂素和甲基化木脂素的含有率增加。本實(shí)施方式該方面涉及的甲基化 木脂素生產(chǎn)方法，優(yōu)選還包括從上述生物體中提取甲基化木脂素的工序。
本發(fā)明的甲基化木脂素生產(chǎn)方法，包括將本發(fā)明的寡核苷酸作為反義寡核 苷酸導(dǎo)入天然表達(dá)本發(fā)明的多肽的生物體內(nèi)的工序。將寡核苷酸導(dǎo)入上述生物 體內(nèi)的工序，使用上述反義RNA技術(shù)即可。本實(shí)施方式涉及的甲基化木脂素生 產(chǎn)方法，優(yōu)選還包括下述工序，即使用上述抗體或寡核苷酸來鑒定天然表達(dá) 本發(fā)明的多肽的生物體的工序。本實(shí)施方式該方面涉及的甲基化木脂素生產(chǎn)方 法，優(yōu)選還包括從上述生物體中提取甲基化木脂素的工序。在本實(shí)施方式中，上述生物體在導(dǎo)入上述寡核苷酸之前產(chǎn)生的甲基化木脂 素和導(dǎo)入后產(chǎn)生的甲基化木脂素的組成不同。具體來說，從上述生物體得到的 木脂素及甲基化木脂素的含有率降低。 (E)食品和工業(yè)制 品 本發(fā)明提供使用根據(jù)上述甲基化木脂素生產(chǎn)方法得到的甲基化木脂素制造 的食品及工業(yè)制品。本項(xiàng)中記載的食品，可以是上述轉(zhuǎn)化植物體的種子、果實(shí)、 切穗、塊莖及/或塊根，也可以是使用從上述轉(zhuǎn)化植物體中提取的甲基化木脂素 制造的食品(例如芝麻、連翹或亞麻、或其加工食品)。本發(fā)明涉及的食品或工 業(yè)制品，可含有期望量的木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)。例如，可以將從上述甲基化木脂素含量增加的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物中提取的 甲基化木脂素提取液，作為甲基化木脂素含量高的食品提供。此外，不僅限于 提取的甲基化木脂素，還可以將上述轉(zhuǎn)化植物體的種子、果實(shí)、切穗、塊莖及/ 或塊根等作為含有大量甲基化木脂素的食品提供。使甲基化木脂素的組成改變 的對(duì)象沒有特別限定，除植物之外，還可以將動(dòng)物、細(xì)菌或酵母等所有生物作為對(duì)象。此外，根據(jù)木脂素及甲基木脂素的獨(dú)特的物性，本發(fā)明的多肽或多核苷酸， 可作為工業(yè)制品(例如薄膜、生物降解性塑料、功能性纖維、潤滑油、或洗劑 類工業(yè)制品)的原料使用。在本說明書中，雖然記載了芝麻的木脂素甲基化多肽的一個(gè)例子，但本發(fā) 明并不限定于來自芝麻的多肽或多核苷酸，本發(fā)明涉及具有木脂素甲基化活性 的全部多肽及其應(yīng)用，這一點(diǎn)為同領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉。木脂素甲基化酶可以 來自植物、動(dòng)物或微生物中的任何生物，只要具有木脂素甲基化酶活性就能夠 控制木脂素的量。并且，本發(fā)明還涉及通過導(dǎo)入編碼木脂素甲基化酶的多核苷
酸而制作的木脂素的量得到調(diào)節(jié)的植物、其后代或它們的組織，其形態(tài)可以為 切花。使用本發(fā)明的木脂素甲基化多肽，能夠促進(jìn)或抑制甲基化木脂素的生成。 此外，使用通常方法，將上述多核苷酸導(dǎo)入植物內(nèi)，使該多核苷酸結(jié)構(gòu)或組織 特異性表達(dá)，使目標(biāo)多肽的表達(dá)增加，以及通過使用反義法、共抑制法及RNAi 法等，能夠抑制目標(biāo)多肽的表達(dá)，易為同領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。實(shí)施例本發(fā)明根據(jù)以下的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明，但并不限于此。實(shí)施例中使用的分子生物學(xué)的方法，只要沒有另外詳述，均根據(jù)國際公開WO2004/018682號(hào)公報(bào)(PCT/JP03/10500)或M olecular Cloning (Sambrook等、Cold Sp ringHarbourLaboratoryPress, 1989)中記載的方法。實(shí)施例l:芝麻種子的EST分析按照制造商推薦的方法，使用Rapid Excision試劑盒(Stratagene公司)， 將公知文獻(xiàn)(國際公開公報(bào)W02005/030944)中記載的來自芝麻的c DNA噬 菌體文庫剪切連接到pBK-CMV噬菌粒(Stratagene社)上，使感染大腸桿菌。從 含有來自該芝麻種子的E S T的大腸桿菌菌落中隨機(jī)選擇5000克隆體，使用M 13RV引物(序列號(hào)5)和M4 (-20)引物(序列號(hào)6)，在下述條件下進(jìn)行菌 落P C R 。在含有l(wèi)XEx — Taqb u f f e r ( T a k a R a )、 0 . 2 mM d N T P s 、引物各0. 2pmol/ul、 Ex — Taq polymera se 1. 2 5 U的混合液中懸浮大腸桿菌菌落，9 4'C反應(yīng)5分鐘后，使9 4'C1分鐘，5 5'C1分鐘，7 2。C2分鐘的反應(yīng)進(jìn)行3 0個(gè)循環(huán)，P C R擴(kuò)增 后，7 2"C保持7分鐘。序列號(hào)5: M13RV:5， -caggaaacagcattgac 序列號(hào)6: M4-20:5， -gtaaaacgacggccagt
將這些PCR產(chǎn)物供給瓊脂糖凝膠電泳，通過溴化乙錠染色，確認(rèn)PBK —CMV中含有的E S T被特異性擴(kuò)增。將這5000種PCR產(chǎn)物4 y 1禾CI 10皿it 的Exonucleasel (USB公司)禾口 2unit的Shrimp Alkaline phosphatase (U SB公司)混合，37。C保持30分鐘，8(TC保持20分鐘結(jié)束酶反應(yīng)。使用該酶反應(yīng)液l" 1，在下述條件下進(jìn)行直接測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序反應(yīng)液含有酶反應(yīng)液1u 1、5xBigDyeSequencingBuf fer ver. 3. 1 ( A p p 1 ied Biosystems)3yl、 BigDyeSequencing R R ver. 3. l(Applied Biosystems) 2yl、1.6p mol/ li 1 M13RV引物lu 1 、滅菌水13y 1 。測(cè)序反應(yīng)是在96。C反應(yīng)1分鐘后， 使96。C10秒、5(TC5秒、60。C4分鐘的反應(yīng)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。測(cè)序反應(yīng)液利用D y e E x 9 6 (QIAGEN公司)，根據(jù)制造商推薦的方法生成，使用S e q u e n cermodel 3100 (AppliedBiosystems公司)決定堿基序列。得到的5000種堿基序列用B last x進(jìn)行同源檢索，從其中鑒定出與甲 基化酶基因具有同源性的2種芝麻甲基化酶(Sesamum indicum 0—methyltransferase;以下略為SiOMT)的部分序列。Blast x分析的條件 如下所述，程序Blastx ver. 2.2.9，數(shù)據(jù)庫n r ，遺傳 密碼standard ( 1 )，過濾器LOW complexity 、E xpect: 10， Word size: 3， Matrix: BLOSUM6 2， GapCosts: Existence11， Extension 1。實(shí)施例2:芝麻甲基化酶基因的表達(dá)分析為了分析通過ES T分析得到的二種S i 0MT1和S i OMT2基因表達(dá) 模式，對(duì)于公知文獻(xiàn)(國際公開公報(bào)W02005/030944)記載的芝麻的不同器官 的cDNA，在以下條件下進(jìn)行RT —P C R。PCR反應(yīng)液含有cDNAlul、lXEx—Taq buffer (TakaRa)、 0. 2 mMdNTPs、引物各0. 2 p m o 1 / u 1 、 Ex — Taqpolymerase 1. 25U。
94 °C反應(yīng)5分鐘后，
使9 4 °C 1分鐘、5 5 °C 1分鐘、7 2 °C 2分鐘的反應(yīng)進(jìn)行3 2個(gè)循環(huán)，P C R 擴(kuò)增后，7 2。C保持5分鐘。作為S i 0MT1及S i OMT2特異性引物，使 用S i OMT1-FW (序列號(hào)7 )禾卩S i OMT1-R V (序列號(hào)8 )以及S i OMT2-FW (序列號(hào)9)和S i OMT2-R V (序列號(hào)10)。為了比較S i 0 MT基因的表達(dá)量和內(nèi)源性基因的表達(dá)量，同時(shí)進(jìn)行作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的基因的P C R反應(yīng)。具體來說，使用S i 1 8 S r RN A — F引物(序列號(hào)11)和S i 1 8 S r RN A —R引物(序列號(hào)12)，進(jìn)行芝麻的1 8 Sr i b o s o m a 1RN A基因(登錄號(hào)AF169853)的PC R反應(yīng)。序列號(hào)7: Si0MTl-FW:5 (-ttgccccatgtcattcaagat 序列號(hào)8: Si0MTl-RV:5 ^-aaaattcagacttataacgataccaaa 序歹U號(hào)9: SiOMT2-FW:5 '-ttagaaaaactcaattcgtctaat 序列號(hào)10: Si0MT2-RV:5 '-cctacatccacgacggaatccaaa 序歹U號(hào)lh Sil8SrRNA-FW:5' -tatgcttgtctcaaagattaa 序列號(hào)12: Sil8SrRNA - RV:5' -aacatctaagggcatcacaga將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，進(jìn)行溴化乙錠染色的結(jié)果，確認(rèn)兩S i OMT基因 (S i 0MT1和S i OMT2)均在種子內(nèi)強(qiáng)烈表達(dá)(圖2—2A)。即可確認(rèn) 兩S i OMT基因表達(dá)區(qū)域和甲基化木脂素的蓄積區(qū)域一致。實(shí)施例3:芝麻甲基化酶基因的克隆因?yàn)閮蒃ST克隆未含推定ORF的5，區(qū)域，所以使用5， Rapid Amplification of cDNA End(以下稱5 ' R A C E)法，擴(kuò)增各S i OMT基因的5'區(qū)域。具體來說，根據(jù)制造商推薦的方 法使用G ene Racer kit(Invitroge n公司)，用以下 引物(序列號(hào)13 16)，擴(kuò)增各5，區(qū)域。序列號(hào)13: GR-Si0MTl-RV:5， -ccggcccactgttcgggtcctaacgggaaa 序歹ij號(hào)14: Si0MTl-NEST-RV:5' -gcaaatccacttcataaaaat 序列號(hào)15: GR-Si0MT2-RV:5， -cctcgggttccgctctttctgctcccagaa 序列號(hào)16: SiOMT2-NEST-RV:5， -atcaatttgggaaattacaaa對(duì)于S i 0MT2,因?yàn)镋 S T克隆未含推定O RF的3'末端，所以使用 序列號(hào)17和18的引物進(jìn)行3' RACE。序歹!j號(hào)1 7 : GR-SiOMT2-FW:5， -gaagatcgccccatgagcatgaaacccttt 序列號(hào)1 8 : S濯T2-NEST-FW:5， -aacgtcgttctgggagcagaaaga由RAC E法得到的擴(kuò)增片段的堿基序列通過引物步移法決定，得到包括 S i 0MT1和S i OMT2基因的全長開放閱讀框的堿基序列信息(序列號(hào)1 和序列號(hào)19)。.S i 0MT1和S i OMT 2相互在氨基酸序列中顯示29%的序列同一性， 對(duì)于序列同一性，采用默認(rèn)值(default)設(shè)定，使用C 1 u s t a 1W a 1 i g n m e n t程序(MacVector ver.7.2.2(Sy manteccorporat ion))。通過B last x分析得到的S i OMT基因的全長c DNA序列(h t tp: / /www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)，檢 索具有同源性的己知蛋白質(zhì)。Blast x分析的條件如下所述。程序Blastxver. 2.2.9，數(shù)據(jù)庫n r ，遺傳密碼 standard (1),過濾器LOWcomplexity, Expe ct: 10， Word size: 3， Matrix: BLOSUM62, Gap Costs: Existence 11， Extension 1。Blast x分析結(jié)果顯示，S i OMT 1與Catharanthsus roseus Caffeic acid-0-methyltransferase (COMT) (AAK20170)有74%序列同一 性，S i OMT2與Rosa hybrida(AAM23004)的0rcinol-0—methyltransferase (OOMT)有5 7%的序列同一性。由此可見，兩S i OMT與已知甲基化酶 之間的序列同一性都不算高。因此，不能推定得到的兩S i OMT基因的功能。
即得到的兩S i OMT基因就是到目前為止仍未分離的木脂素甲基化酶的可 能性非常高。實(shí)施例4:大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建對(duì)于S i OMT 1 ，使用序列號(hào)20和21的引物對(duì)，將在c DNA的起始 蛋氨酸密碼子(ATG)的上游具有B g 1 I I位點(diǎn)、在終止密碼子的下游具 有S a i I位點(diǎn)的片段，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。另一方面，對(duì)于S i OMT2，使用序列號(hào)22和23的引物對(duì)，將在c D N A的起始蛋氨酸密碼子(ATG)的上游具有B amH I位點(diǎn)、在終止密碼子 的下游具有X h o I位點(diǎn)的片段進(jìn)行P C R擴(kuò)增。P C R使用的引物如下所示。序歹!j號(hào)20: Bgl2-SiOMTl-FW:5， -aaaacatgtatggcggatcagtccgaggaagaaga ggcttt序歹ll號(hào)2h SalI-SiOMTl-RV: 5， -attgtcgacttatgaaattccatgatccaaatatt 序歹ll號(hào)22: BamHI-SiOMT2-FW: 5， -aaaggatccatggcgatggttaaccaaaagcaaaatctt 序歹ll號(hào)23- Xho1-SiOMT2-RV: 5， -aaactcgagttaaggatatatctcgatgatagatctcaaP C R反應(yīng)液(2 5 n 1 )含有作為模板的芝麻種子c DNA、各引物 0.2pmol/iil、lXKODplusbuffer (TOYO BO)、 0. 2mMdNTPs、 1 mM MgS04、 1UKOD pl us polymerase 。94 。C反應(yīng)5分鐘后，使9 4 °C 1分鐘、5 5 t:i分鐘、7 2'C2分鐘的反應(yīng)進(jìn)行3 0個(gè)循環(huán)，PCR擴(kuò)增后，7 2'C保持 3分鐘。將得到的各P C R產(chǎn)物，根據(jù)制造商推薦的方法，插入P C R4 B 1 unt—TOPOvector (Invi trogen)的多克隆位點(diǎn)， 得到S iOMTl/pCR4 Blunt—TOPO (稱為p S P B2678)、 SiOMT2/pCR4 Blunt—TOPO (稱為p S P B2679)。分析p S P B2678和p S P B2679中含有的S i OMT堿基序列，確認(rèn)是 否進(jìn)行了正確的PCR。將這些質(zhì)粒在附加在PCR引物上的限制酶位點(diǎn)消化， 得到全長S i OMT，將含有該S i OMT的約l . lk b的DNA片段插入大 腸桿菌表達(dá)載體p Q E30載體(QIAGEN)的BamHI / Sa 1 I位點(diǎn)， 得到S iOMTl/pQE30 (稱為p S P B2690)、 SiOMT2/pQE30 (稱為p S P B2686)。實(shí)施例5:重組蛋白質(zhì)的制備使用上述制作的大腸桿菌表達(dá)載體P S P B2690和p S P B2686，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌菌株J Ml 0 9 (TOYOBO)，在含有最終濃度為2 0 y g / m 1的 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于3 7t:前培養(yǎng)一夜。將一部分前培養(yǎng)液添加到含 有氨芐青霉素5 0 tx g / m 1 、酸水解酪素0 . 5 ^的M 9培養(yǎng)基(1 0 m 1 ) 中，振蕩培養(yǎng)直到As。。二0. 6 1. 0。接著，在培養(yǎng)液中加入最終濃度為 0. 5mM的IPTG (I sopropyl—3 — D— thi oga 1 ac topyranos ide)，進(jìn)一步在3 0 "C振蕩培養(yǎng)一夜后，3 0 0 0 r p m、 4 'C離心分離1 0分鐘，集菌。將菌體懸浮在1 0 m 1的緩沖液(3 0 m MTris—HC1 (pH7. 5 )、 2mM MgC12、0.5mM EDT A、 50nMAPSMF)中，然后進(jìn)行超聲波處理，破碎大腸桿菌，接著1 5 ， 0 0 0 rpm、 4'C離心分離1 0分鐘，將得到的上清液作為粗酶液用于以下活性實(shí)施例6:芝麻木脂素甲基化酶的生成物的分析將酶反應(yīng)的底物使用的芝麻木脂素溶解于少量的DMSO中，然后再溶解于70% 乙醇中，制備底物溶液(1m g /m 1 )。芝麻木脂素例如可根據(jù)公知的方法 (日本農(nóng)藝化學(xué)會(huì)志6 7: 1 6 9 3 ( 1 9 9 3 ))(日語原名日本農(nóng)蕓化學(xué) 會(huì)誌)，從芝麻中提取和精制得到。將底物溶液l 0 U 1 、在大腸桿菌中表達(dá)的 S i O M T的上述粗酶液2 0 0 y 1及1 0 mM S—Adenosyl -L-Mathianine (SAM) 1 0 y 1在反應(yīng)試管中混合，然后使其在3 0 。C反應(yīng) 2小時(shí)。在反應(yīng)試管內(nèi)添加含有0 . 1 %三氟乙酸(T F A)的1 0 0 %乙腈(2 5 0 ii 1 )，結(jié)束酶反應(yīng)。用旋渦混合器(Vortex Mixer)劇烈攪拌反應(yīng)試管， 然后1 5 ， Q Q 0 r p m、 4 。C離心分離5分鐘，將得到的上清液用過濾器(孔 1 1 ex — LH、 Mi 1 1 i po re)洗凈， 然后使用高效液相色譜法(以下稱為HPLC)分析該上清液。木脂素及其甲 基化木脂素的分析條件如下所示。使用C 一 3 0柱(野村化學(xué)C 3 0—UG—5、 4. 6 mmX 1 5 0 mm)， 進(jìn)行液相色譜法(L c 一 2 0 1 0 c (島津制作所))。流動(dòng)相中，A液使用0 . 1 %T F A， B液使用含有O . 1 %TF A的9 0 %乙腈。使用A液8 0 %: B 液2 0%的混合液平衡柱子(2 O分鐘)后，使用直線濃度梯度(A液8 0%: B液2 0 % —A液l 0 %: B液9 0 %)，洗脫20分鐘(流速0 . 6 m 1 /分)， 進(jìn)一步使用A液1 0%: B液9 0%洗脫7分鐘。測(cè)定2 8 0nm處的吸收，檢 測(cè)樣品中含有的化合物。對(duì)于化合物的各吸收峰，使用SPD—1 OAV (島 津制作所)測(cè)定其在l 9 0 nm 4 0 0 nm處的光譜，分析具有木脂素的2 個(gè)特征最大吸收峰(2 3 0 n m和2 8 0 n m)的物質(zhì)。在該條件下，在約11. 8 分鐘檢測(cè)出松脂醇標(biāo)準(zhǔn)品，在約15.5分鐘檢測(cè)出胡椒醇標(biāo)準(zhǔn)品，在約16.8分 鐘檢測(cè)出芝麻素酚標(biāo)準(zhǔn)品。在S i 0MT1重組蛋白質(zhì)和松脂醇的反應(yīng)液中，新得到具有木脂素光譜的 保留時(shí)間為14.0分鐘的吸收峰A (圖3 — 3 A)。此外，在S i 0MT1重組蛋白質(zhì)和胡椒醇的反應(yīng)液中，新得到具有木脂素光譜的保留時(shí)間約為17.7分鐘的 吸收峰B (圖3 — 3 B)。在S i OMT2重組蛋白質(zhì)和松脂醇或胡椒醇的反應(yīng)液中，沒有發(fā)現(xiàn)新的生 成物(圖4 一3 C 3 D )。并且發(fā)現(xiàn)，SiOMTl和SiOMT2對(duì)芝麻素酚沒有木脂素甲基化活性。接著，利用LC一MS分析，決定由S i OMT1生成的新型木脂素的分子 量(液相色譜法(LC): Waters 2795 (Waters公司)，質(zhì)量分析 器QUATRO micro (Micr o公司))。用5 0 X丙酮5m 1洗凈 填充有1 m 1 DIAI0N H P — 2 0樹脂(三菱化學(xué))的色譜柱，然后用1 0 m 1 水平衡。將含有由S i OMTl生成的甲基化木脂素的酶反應(yīng)液裝入色譜柱，用 5 m 1水洗凈雜質(zhì)，然后使用8 0 Q/^丙酮2 m 1進(jìn)行洗脫。使用蒸發(fā)儀將洗脫 液千燥固化后，再溶解于含l %甲酸的9 0 %乙腈(1 0 0 ii 1 )中，作為L C一MS分析樣品。LC條件如下所示。 使用Develosil C30—UG—3柱(野村化學(xué)3 . 0X15 0mm)，對(duì)于流動(dòng)相，A液使用水，B液使用l 0 0%乙腈，C液使用1 %甲 酸，D液使用l 0 OmM乙酸銨水溶液。使用l O分鐘的直線濃度梯度(A液 6 0%: B液3 0X: C液5X: D液5X—A液10X: B液8 0X: C液 5%: D液5 %)洗脫，然后使用A液1 0 %: B液8 0X: C液5X: D液 5%，洗脫5分鐘(流速通常O. 2ml /分)。作為銨加合離子檢測(cè)信號(hào)。在這種條件下，約8.3分鐘檢測(cè)出吸收峰A，約11.3分鐘檢測(cè)出吸收峰B (圖3 5)。使用離子模型(ion mode) ES+、Cone voltage 15V 、 Collision2 eV的M S條件，在100 800(m/z， 3 0分)的范圍進(jìn)行MS掃描，在210 400nm(30分)的范圍測(cè)定 P D A。上述條件下的LC—MS分析結(jié)果是，吸收峰A的銨加合離子分子量373 (m/ z)，吸收峰B的銨加合離子分子量371 (m/ z)。(圖6—4A、圖7 — 4B)。因此，鑒定這些吸收峰分別是松脂醇(銨加合離子分子量3 5 9 )的單 甲基化物，及胡椒醇(銨加合離子分子量3 7 4 )的單甲基化物。以上結(jié)果證明，S i OMTl是對(duì)芝麻木脂素松脂醇及胡椒醇具有單甲基化 活性的酶。實(shí)施例7:芝麻木脂素甲基化酶同源基因的分離為了證明在芝麻種間是否功能性及結(jié)構(gòu)性地保存有具有木脂素甲基化活性 的酶基因，嘗試從與栽培芝麻品種S e s amumi n d i c um在細(xì)胞遺 傳學(xué)上不同的非洲芝麻(Sesamumradiatum)中，分離S i OMT1的Counterpart gene ( S r OMTl)。S. r a d i a t u m是非洲現(xiàn)存的芝麻植物，根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)分析，確 定染色體數(shù)為2 n = 6 4 ，是與栽培芝麻品種S. indicum(2n = 2 6)在遺傳學(xué)上不同的系統(tǒng)(參考文獻(xiàn)、并木滿夫、小林貞作"芝麻的科學(xué)" 朝倉書店)(日語原名「-、o科學(xué)」)。但是，已知S. r a d i a t um種 子中也蓄積有多種木脂素(參考文獻(xiàn)、Bedigian，D.等、Bioc hemical Systematics and Ecology 1 3: 133 — 139 (1985 ))。因此，期望S . r a d i a t u m的基因 組中含有與S. indicum的Si0MT1相對(duì)應(yīng)的基因。使用S . r a d i a t u m種子的c D N A ，使用Bgl2- S i 0 M T 1-FW (序列號(hào)20及)Sall-S i 0MT1—RV (序列號(hào)21)的引物對(duì)，通過P C R嘗 試S r OMTl的擴(kuò)增。P C R反應(yīng)液含有S . r a d i a t u m種子的c D N A 1 y 1 、 IX Ex — Taq buffer (TakaRa)、0.2mM dNTPs、引 物各0.2pmol/pl、Ex — Taq polymerase 1.2 5 U 。 9 4 。C反應(yīng)5分鐘后，使9 4 °C 1分鐘、5 5 °C1分鐘、7 2 °C 2分鐘的 反應(yīng)進(jìn)行3 0個(gè)循環(huán)，P C R擴(kuò)增后，7 2 'C保持5分鐘。根據(jù)制造商推薦的 方法，將得到的約1 . 1k b的P C R產(chǎn)物插入pCR2—TOPO vect or(Invitroge n公司)的多克隆位點(diǎn)內(nèi)，得到S r S i OMTl / pCR2 —TOPO (pSPB2910)。根據(jù)引物步移法，決定P S PB2910中含有的S r OMTl的堿基序列(及 氨基酸序列)(序列號(hào)3和4)。 S rOMTl與S i OMTl在氨基酸序列中有 89%的序列同一性。對(duì)于序列同一性，設(shè)定默認(rèn)值(default),使用C 1 u s tal Walignment程序(Mac Vector ve r. 7. 2. 2(Symanteccorporation))。這禾中高序歹廿 同一性強(qiáng)有力地支持SrOMTl是SiOMTl的Counterpart gene。采用與實(shí)施例2同樣的方法進(jìn)行RT — PCR，確認(rèn)S rOMTl的種子特 異性基因表達(dá)(圖2 — 2 B)。與實(shí)施例4相同，構(gòu)建S r OMTl的大腸桿菌表達(dá)載體S r O M T 1/p Q E3 0 (pSPB2911)，與實(shí)施例5同樣制備重組蛋白質(zhì)，與實(shí)施例6同樣對(duì) 其活性及生成物進(jìn)行分析。S rOMTl與S i OMTl相同，對(duì)松脂醇和胡椒醇顯示甲基化活性(圖 5)。此外，S i OMTl對(duì)芝麻素酚不顯示甲基化活性。上述結(jié)果表明，S r OMTl是S i O M T 1的Counterpart gene，本酶基因保留在芝麻種間。實(shí)施例8: S i O M T 1的基因組Southern分析
為了搞清楚芝麻基因組內(nèi)的S i 0MT1基因的拷貝數(shù)，實(shí)施基因組Southern分析。根據(jù)制造商推薦的方法，使用Nucleon Phytop ure forPlantExtractionKit (Amersham公 司)，從S. i n d i c um (真瀨金品種)的葉子中提取出基因組DNA。將 提取的基因組DN A 20txg用EcoRI、Hindl11， XhoI或X b a I消化后，通過使用瓊脂糖凝膠的電泳進(jìn)行分離。使用0 . 2 5 M H C 1使該瓊脂糖凝膠水解1 5分鐘后，使用1 . 5 M N a C 1 / 0 . 5 M N a O H溶液使其變性(3 0分鐘)，通過添加含1. 5M NaCl的Tris —H C 1 ( p H 7 . 5 )在變性溶液中進(jìn)行中和(2 0分鐘)。接著，將瓊脂糖 凝膠內(nèi)的基因組DNA在2 0 X S S C溶液中轉(zhuǎn)印到膜上(H y b r i b o n d — N、 Amersham公司)。通過U V照射使轉(zhuǎn)印到膜上的基因組D N A與膜結(jié)合， 使用含有7XSDS、 5 0%甲酰胺、5XSSC、 2 %封閉試劑、0. 1% 十二烷基肌氨鈉、5 0 mM磷酸鈉緩沖液(p H 7 . 0 )的雜交緩沖液(高S DS緩沖液羅氏公司)，在4 2'C下進(jìn)行1小時(shí)預(yù)雜交。將p S P B 2678作為模板，分別使用序列號(hào)20(Bgl2-SiOMTl — FW)及序列號(hào)21 (Sail —SiOMTl—RV)的引物對(duì)，通過P C R制 作DIG標(biāo)記的雜交探針。PCR反應(yīng)液含有p SPB2678質(zhì)粒l n g、 IX P C R緩沖液(TaKaRa生物公司)、2 . 5 mM DIG—dNTP mixt ure(PCR DIG labeling Mix、羅氏公司)、各引物對(duì) 0. 2pmo1、 1UrTaq polymerase (TaKaRa生物公司)。 P C R反應(yīng)是9 5 °C 3 0秒、5 3 °C 3 0秒、7 2 °C 2分鐘的反應(yīng)進(jìn)行3 0個(gè) 循環(huán)。將用S ephadex G—50柱一F i n e (Boehringer公司)精 制的PCR產(chǎn)物作為雜交探針使用。使該探針進(jìn)行熱變性后，在預(yù)雜交液中添 加1 5 u 1 ， 4 2 。C孵育一夜。雜交之后，通過高嚴(yán)格度的條件(使用含有0 . 2 X S S C和O . 1%S D S的溶液，6 5 °C 3 0分鐘進(jìn)行2次)洗凈膜。根據(jù)制造商的說明書，使用 D I G標(biāo)記&檢測(cè)試劑盒(羅氏公司)，檢測(cè)雜交信號(hào)。Southern分析的結(jié)果顯示，因?yàn)樵谌魏蜗拗泼赶慕M分中都檢測(cè)出2條 以上的條帶，所以與S i OMT1同源性極高的基因至少有l(wèi)個(gè)以上在芝麻基因
組內(nèi)被編碼(圖8)。進(jìn)一步說，期望在芝麻基因組中存在多個(gè)與S i 0MT1 功能性重復(fù)或類似的酶基因。實(shí)施例9:芝麻木脂素甲基化酶的COMT活性測(cè)定如實(shí)施例3所示，通過數(shù)據(jù)庫檢索，顯示S i 0MT1和S r 0MT1在已 知的蛋白質(zhì)中與C OMT具有最高序列同一性。這表明芝麻甲基化酶也具有C OMT活性。討論在實(shí)施例5和實(shí)施例7中表達(dá)的S i 0MT1和S rOMTl對(duì)咖啡酸 的甲基化活性。將0.4mg/m 1咖啡酸l 0 n 1 、大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的S i OM T的粗酶液2 0 0 u 1及1 0 mMSAM1 0 u 1在反應(yīng)試管內(nèi)混合后， 3 0 "C反應(yīng)1小時(shí)，然后采用與實(shí)施例6同樣的方法供給H P L C分析。其結(jié)果，S i OMTl和S r OMTl均在與咖啡酸的反應(yīng)液中，生成與標(biāo) 準(zhǔn)品阿魏酸的保留時(shí)間一致的吸收峰C (保留時(shí)間約7. 3分鐘(圖9 一6A 6 C ))。在本H P L C分析條件下，咖啡酸在保留時(shí)間約為3. 9分鐘時(shí)被洗脫。在與實(shí)施例6同樣的條件下，進(jìn)行LC一MS分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸收峰C為 銨加合離子分子量195 (m / z)(圖l 0—6D)。因此，確認(rèn)吸收峰C是咖啡 酸單(銨加合離子分子量181 (m/z))甲基化生成的阿魏酸。因此證明兩種木 脂素甲基化酶均具有C 0 M T活性。如上所述，本發(fā)明的多肽和多核苷酸對(duì)甲基化木脂素的生產(chǎn)有用。此外， 可表達(dá)地導(dǎo)入了本發(fā)明的多核苷酸的轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞，在食品領(lǐng)域、各種工業(yè)領(lǐng) 域中，對(duì)生產(chǎn)甲基化木脂素或使用甲基化木脂素的制品極為有用。上述轉(zhuǎn)化體 是植物體的情況下，能夠?qū)⒅参矬w自身作為食品使用，所以在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域等非常 有用。通過將本發(fā)明的多肽和多核苷酸與本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的其他酶(合成胡椒醇和 芝麻素的酶S i P 1 8 9)組合，不僅是芝麻，而且可確立特定的木脂素分子 種的生產(chǎn)體系，其結(jié)果能夠擴(kuò)大特定木脂素及甲基化木脂素的生產(chǎn)量。因此， 本發(fā)明可在農(nóng)業(yè)、食品產(chǎn)業(yè)、醫(yī)藥品產(chǎn)業(yè)及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)廣泛利用。
權(quán)利要求
1. 多核苷酸，其為下述(a)～(d)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，(a)多核苷酸，其含有具有序列號(hào)1或3的堿基序列的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有編碼具有序列號(hào)2或4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(c)多核苷酸，其為與具有序列號(hào)1或3的堿基序列的部分或全部的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，且編碼具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(d)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有在序列號(hào)2或4的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，且具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性。
2. 如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有序列號(hào) 2或4的氨基酸序列，或者具有在該氨基酸序列中添加、缺失1個(gè)或多個(gè)氨基酸 及/或被其他氨基酸替換修飾的氨基酸序列，且具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活 性。
3. 如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其與具有序列號(hào)1或3的堿基序列的部 分或全部的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交，且編碼具有將甲 基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的蛋白質(zhì)。
4. 如權(quán)利要求l所述的多核苷酸，其與具有序列號(hào)1或3的堿基序列的部 分或全部的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在5 x S S C、 5 0 "C的條件下進(jìn)行雜交， 且編碼具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的蛋白質(zhì)。
5. 如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其含有具有序列號(hào)1或3的堿基序列的 多核苷酸。
6. 如權(quán)利要求l所述的多核苷酸，其含有編碼具有序列號(hào)2或4的氨基酸 序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
7. 如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其為DNA。
8. 如權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其編碼對(duì)于呋喃駢呋喃類 木脂素具有轉(zhuǎn)移甲基活性的蛋白質(zhì)。
9. 如權(quán)利要求8所述的多核苷酸，其編碼對(duì)于松脂醇及/或胡椒醇具有轉(zhuǎn) 移甲基活性的蛋白質(zhì)。
10. 蛋白質(zhì)，其為被所述權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。
11. 載體，其含有所述權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
12. 宿主細(xì)胞，其為被權(quán)利要求ll所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
13. 該蛋白質(zhì)的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)或繁殖權(quán)利要求12所述的宿 主細(xì)胞，從該宿主細(xì)胞中提取具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的蛋白質(zhì)。
14. 植物體或具有與該植物體相同性質(zhì)的該植物體的后代植物體、或這些 植物體的組織，其中導(dǎo)入權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
15. 方法，其為使用權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，將甲基轉(zhuǎn)移 至木脂素上的方法。
16. 該植物體或具有與該植物體相同性質(zhì)的該植物體的后代植物體，其中， 將權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的多核苷酸導(dǎo)入植物體內(nèi)，通過表達(dá)使產(chǎn)生的木 脂素組成改變。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有將甲基轉(zhuǎn)移至木脂素上的活性的酶的基因、利用該甲基化酶使木脂素組成改變的植物等。更加具體地說，本發(fā)明涉及具有合成甲基化木脂素活性的酶的基因，優(yōu)選來自芝麻的具有合成甲基化木脂素活性的酶的基因及其利用。
文檔編號(hào)C12N15/54GK101213303SQ20078000006
公開日2008年7月2日 申請(qǐng)日期2007年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月29日
發(fā)明者小埜榮一郎 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社