專利名稱：一種誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法，具體地說(shuō)涉及一種調(diào)節(jié)體外培 養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的新方法。
背景技術(shù)：
少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)的髓鞘形成細(xì)胞，它包繞神經(jīng)纖維軸突形成了絕緣 的髓磷脂鞘，因而，脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的形成對(duì)于神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)、 發(fā)育、神經(jīng)信號(hào)的傳遞起至關(guān)緊要的作用。當(dāng)髓鞘損傷，無(wú)論是結(jié)構(gòu)完整的髓
鞘受到破壞一脫髓鞘(demyelination),如外傷、多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis, MS )，還是少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育異常所致的髓鞘形成不良
(dysmyelination)，如先天性小腦癥等，都可引起嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。 作為髓鞘形成細(xì)胞的少突膠質(zhì)細(xì)胞或祖細(xì)胞缺乏是髓鞘再生失敗的原因之一。 因而，少突膠質(zhì)細(xì)胞移植已經(jīng)為中樞神經(jīng)的損傷如多發(fā)性硬化癥和脫髓鞘疾病 的治療提供了新思路。
目前獲得少突膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的方法有1)可以從胚胎 或成年腦組織分離和體外培養(yǎng)獲得，但是很難獲得足夠的供體細(xì)胞，并存在異 體排斥反應(yīng)。'2)也可以從多種類型具有多能性的干細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干 細(xì)胞等，通過(guò)體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化獲得所需細(xì)胞類型，但主要問(wèn)題是胚胎干細(xì)胞 或神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源的少突膠質(zhì)細(xì)胞，不能自體移植，存在異體排斥反應(yīng)；3)自 體MSC來(lái)源的少突膠質(zhì)細(xì)胞，傳統(tǒng)的方法分離MSC細(xì)胞是用磁珠法分離，價(jià)格 昂貴，分離過(guò)程復(fù)雜，易于污染，生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)分化反應(yīng)，具有致瘤性；目前尚沒(méi)有簡(jiǎn)單可靠的方法從人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)選擇性地分化為少突 前體細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞，因此探索一種有效的方法，定向誘導(dǎo)hBMSC向少突 膠質(zhì)細(xì)胞分化，是細(xì)胞移植治療神經(jīng)損傷如多發(fā)性硬化癥和脫髓鞘疾病的前提。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有易于分離、擴(kuò)增、體外操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在細(xì)胞替 代治療方面不失為理想的種子細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料顯示骨髓來(lái)源的干細(xì)胞經(jīng)外 周靜脈輸入或腦室注射移植后，有治療彌漫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的潛能。體外 實(shí)驗(yàn)也證明，骨髓來(lái)源的干細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)能夠表達(dá)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和雪 旺細(xì)胞標(biāo)志物，但較少表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。F3/contactin屬于免疫球蛋 白超家族成員，F(xiàn)3/contactin屬于免疫球蛋白超家族成員，它的膜外區(qū)均有6
個(gè)ig結(jié)構(gòu)域和4個(gè)纖粘連蛋白m重復(fù)片斷，經(jīng)糖基磷脂酰肌醇結(jié)合而錨定在細(xì)
胞膜上。F3在腦內(nèi)廣泛分布，與少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)。本發(fā)明用簡(jiǎn)單 易行的方法獲得hMSC，并用黏附分子F3 / Contactin誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，從而獲得了大量的少突膠質(zhì)細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種獲得大量少突膠質(zhì)細(xì)胞的方法，用于治療髓鞘損 傷或脫髓鞘等疾病。采用以下的技術(shù)方案
1) 利用簡(jiǎn)單易行的方法獲得人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，本發(fā)明通過(guò)平板黏附法能得 到純度較高的CD90(+)的自體人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
2) 發(fā)明了一種人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的方法。人骨髓間充 質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)預(yù)誘導(dǎo)(P —ME和RA)和黏附分子F3 / Contactin誘導(dǎo)后，NG2 (少突膠質(zhì)前體細(xì)胞標(biāo)志物)和04 (少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比達(dá)到 41. 5%。
本發(fā)明的內(nèi)容未公開(kāi)發(fā)表，本領(lǐng)域的技術(shù)人員如不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)根本不 能根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)推斷得到本發(fā)明的誘導(dǎo)分化方法。


圖1 hBMSCs CD90陽(yáng)性細(xì)胞的流式細(xì)胞分析圖 圖2 MFS組04陽(yáng)性細(xì)胞的流式細(xì)胞分析圖 圖3 F3組04陽(yáng)性細(xì)胞的流式細(xì)胞分析圖 圖4 NG2和04陽(yáng)性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果柱狀圖
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)和擴(kuò)增
hBMSCs (》70%)來(lái)源于Cambrex公司，標(biāo)本采集自38歲健'康男性青年捐 獻(xiàn)者。原代hBMSCs接種于含10yo胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，37°C、 5%的C02培養(yǎng)箱 培養(yǎng)。48h后用PBS沖洗兩次，去除未貼壁的細(xì)胞，并更換新培養(yǎng)液。待貼壁細(xì) 胞90%融合，用0.25%胰蛋白酶消化，按l: 3進(jìn)行傳代繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。
用該方法培養(yǎng)得到的hBMSCs的形態(tài)特性細(xì)胞剛培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)皿內(nèi)懸浮大 量圓形細(xì)胞，通過(guò)換液可去除這些未貼壁的血細(xì)胞，貼壁細(xì)胞則為hBMSCs。初 接種的hBMSCs呈圓形，體積較大，胞體透亮，折光性強(qiáng)；接種24 h后細(xì)胞開(kāi) 始貼壁伸展，伸出2 — 3個(gè)較長(zhǎng)的突起，胞體寬闊、形態(tài)多樣，有梭形、紡錘形，多角形，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，有1一3個(gè)核仁；3d后貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，
呈克隆性生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)大多數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形；5d后細(xì)胞迅速增殖，并相互融 合^片，排列緊密有一定的方向性，呈成纖維細(xì)胞樣分布。
實(shí)施例2用流式細(xì)胞儀分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特性
當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用0。25%含EDTA 的胰酶將塑料皿中貼壁的hMSC消化為單細(xì)胞，用PBS洗三次，記數(shù)并調(diào)節(jié)到適 當(dāng)?shù)臐舛?1X106/ml)，酒精固定，用PBS洗三次；用TritonX-100和雙氧水 處理；加入正常羊血清室溫封閉30分鐘；分別加入CD34， CD45， 或CD90抗 體室溫2小時(shí)后；加入FITC熒光抗體共同孵育，然后用FACS分析CD90的陽(yáng)性 細(xì)胞數(shù)。
結(jié)果顯示貼壁的細(xì)胞接近90%融合時(shí)進(jìn)行流式細(xì)胞分析。結(jié)果顯示CD90 (+)細(xì)胞達(dá)到83.8%到97.7% ，平均為94.78+4.52% (附圖1)，還約有4.7% 的細(xì)胞表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34,另外有5. 8%的細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞表面標(biāo)志 CD45。充分說(shuō)明所培養(yǎng)的細(xì)胞確為hBMSCs，并且經(jīng)過(guò)貼壁分離法能得到純度較 高的CD90(+) hBMSCs。
實(shí)施例3人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化及表型鑒定
參考Dezawa等(Dezawa M， Takahashi I， Esaki M, et al. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromalcells.)化學(xué)誘導(dǎo)hBMSCs的方法接近融合的細(xì)胞 用ImM e —巰基乙醇(e —ME) DMEM預(yù)誘導(dǎo)24h;再用含35ng/ml視黃酸(RA) 的10%胎牛血清DMEM誘導(dǎo)液誘導(dǎo)3d;隨后將細(xì)胞分為MFS組(陽(yáng)性對(duì)照組)和 F3組繼續(xù)培養(yǎng)3d， MFS組細(xì)胞培養(yǎng)于含有1(^胎牛血清、5mM forskolin、 lOng/ml 堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、 5ng/ml血小板生長(zhǎng)因子(PDGF)、 200 ng/mL heregulin (HRG) DMEM培養(yǎng)基；F3組細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、20nM F3 的DMEM培養(yǎng)基。
用流式細(xì)胞儀分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為少突膠質(zhì)細(xì)胞的特性。用0.25 X含EDTA的胰酶將塑料皿中貼壁的hMSC消化為單細(xì)胞，用PBS洗三次，記數(shù)并 調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)臐舛?1X106/ml)，酒精固定，用PBS洗三次；用TritonX-100 和雙氧水處理；加入正常羊血清室溫封閉30分鐘；分別加入多克隆兔NG2抗體 (1: 200， Chemicon， Temecula, CA)和單克隆鼠0.4抗體(1: 200， Chemicon， Temecula， CA)室溫2小時(shí)后；加入分別PE結(jié)合的抗兔的IgG和FITC結(jié)合的抗 鼠的二抗共同孵育，PBS洗滌2次，每次]000rpm離心5min，棄上清。然后用 流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)少突膠質(zhì)或前體細(xì)胞。
流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)P—ME和RA逐級(jí)誘導(dǎo)后，再用分別用MFS (陽(yáng)性 對(duì)照組)和F3組繼續(xù)培養(yǎng)3d后，發(fā)現(xiàn)F3組和MFS組04陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多(F3 組3L 55土5. 8%，MFS組32. 61土6. 8%;圖2和3)，而NG2陽(yáng)性細(xì)胞(F3組9: 9化3,, 3%， MFS組7. 75土4. 3%;圖4) ， F3組與MFS組相比04和NG2表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (p〉0.05;圖4)。經(jīng)F3和MFS處理后，細(xì)胞胞體平鋪展開(kāi)形成扁平形，伸出1 一2短小突起，并且表達(dá)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物MBP。以上結(jié)果表明與MFS作用相似，F(xiàn)3可以誘導(dǎo)產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞得陽(yáng)性率達(dá)41. 5%。
權(quán)利要求
1. 一種誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的方法，其特征在于利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的特點(diǎn)，采用分階段誘導(dǎo)的方法獲得少突膠質(zhì)細(xì)胞。
2. 按照權(quán)利要求1的誘導(dǎo)方案，采用一種神經(jīng)黏附分 子誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為04和NG2陽(yáng)性的少 突膠質(zhì)細(xì)胞。
3. 按照權(quán)利要求2的誘導(dǎo)方案，其特征在于獲得的少 突膠質(zhì)細(xì)胞用于治療髓鞘損傷或脫髓鞘等疾病，避 免了異體細(xì)胞移植引起的免疫排斥反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的方法。本發(fā)明的目的是提供一種獲得大量少突膠質(zhì)細(xì)胞以用于治療髓鞘損傷或脫髓鞘等疾病。本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)易的平板黏附法獲取大量的自體人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用黏附分子F3/Contactin誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。通過(guò)本發(fā)明的方法，采用一種簡(jiǎn)便易行的手段，體外調(diào)節(jié)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的方法，實(shí)現(xiàn)獲取自體少突膠質(zhì)細(xì)胞、大量制備、價(jià)格低廉。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)應(yīng)用自體人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的少突膠質(zhì)細(xì)胞治療脫髓鞘病，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101451123SQ20071019584
公開(kāi)日2009年6月10日 申請(qǐng)日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者朱玲玲, 肖志誠(chéng), 明 范, 彤 趙, 莉 陸 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所