專利名稱：：沙冬青cbl1基因啟動(dòng)子的鑒定及其功能研究的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及沙冬青"腳，i/^a/7t/ws歷o/^o"ci/s)CBL1基因啟動(dòng)子AmCBLlP的鑒定，數(shù)據(jù)庫(kù)分析，其缺失片斷植物表達(dá)載體的構(gòu)建及該啟動(dòng)子的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鈣離子作為第二信使，在植物多種非生物脅迫(干旱，低溫，鹽堿)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中有非常重要的作用。從鈣離子到基因表達(dá)，許多信號(hào)因子在這個(gè)工程中起重要作用。Ca"通過(guò)與鈣結(jié)合蛋白的特應(yīng)性結(jié)合把信號(hào)傳遞到下游。鈣結(jié)合蛋白主要有三類CaM，CDPK和CBL。CBL蛋白是最新發(fā)現(xiàn)的鈣結(jié)合蛋白。1999年，kudla等首次在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了三種CBL蛋白，它們和哺乳動(dòng)物中的鈣調(diào)磷酸酶B亞基和神經(jīng)元鈣結(jié)合元件相似。在擬南芥基因組中共發(fā)現(xiàn)10個(gè)CBL家族成員，即AtCBLl-lO,該組蛋白皆包含4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)，本身沒有酶活性，通過(guò)與目的蛋白CIPK(CBL-interactingproteinkinase)特異性結(jié)合而起作用。CBL家族中對(duì)CBL1基因的研究最為詳盡。在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，CBL1可以受多種脅迫如干旱、高鹽等誘導(dǎo)，超量表達(dá)CBL1基因能促進(jìn)一系列逆境誘導(dǎo)基因的表達(dá)，并能提高擬南芥對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性，但卻降低其耐凍性，推測(cè)CBL1可能是干旱響應(yīng)的正調(diào)節(jié)因子和低溫響應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子。2006年，Xu和Li首次在擬南介中發(fā)現(xiàn)CBL1和CBL9通過(guò)與CIPK23相結(jié)從而合激活CIPK23，激活的CIPK23直接磷酸化一種鉀離子通道蛋白AKT1，在植物缺鉀的情況下，提高鉀離子的吸收。由此看來(lái)，CBL1是植物逆境信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的傳遞元件和重要組分，很可能是信號(hào)途徑上游一個(gè)重要交叉節(jié)點(diǎn)。沙冬青"/M/op^"/7t力i/s歷o/^o^c^)是我國(guó)沙漠地區(qū)唯一的生常綠灌木，在長(zhǎng)期的惡劣環(huán)境中形成了極強(qiáng)的抗旱，耐寒性。因此，以沙冬青為材料，分離其CBL1基因的啟動(dòng)子，研究其功能，以期闡明強(qiáng)抗逆性植物沙冬青CBL1基因的上游調(diào)控機(jī)制，為提高植物抗逆性基因工程提供新的思路。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明以強(qiáng)抗逆性植物沙冬青為材料，克隆了受多種脅迫誘導(dǎo)的CBL1基因的上游啟動(dòng)子序列，PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)分析其序列，發(fā)現(xiàn)該序列具有啟動(dòng)子的基本元件TATA-box、CAAT-box,包含多處與干旱，高鹽和激素誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件的同源序列。并構(gòu)建了相應(yīng)得缺失表達(dá)載體。本研究對(duì)揭示沙冬青CBL1基因的上游調(diào)控機(jī)制，提升植物抗逆性，具有重要的科學(xué)意義。本文在已知沙冬青CBL1cDNA序列(GenBank的注冊(cè)號(hào)位AY902246)的基礎(chǔ)上，借鑒5'RACE策略，利用錨定PCR步移的方法克隆了沙冬青CBL1基因1683bp的5'側(cè)翼序列，命名為AmCBLlP。采用5，RACE技術(shù)，得到了AmCBLl基因上游124bp的5，非翻譯區(qū)(UTR)。將1683bpAmCBL15'側(cè)翼序列與其5'UTR序列進(jìn)行比對(duì)，重疊的部分相似率達(dá)100%。有趣地是，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)，我們?cè)诨蚪M上發(fā)現(xiàn)AmCBLl基因的5'非翻譯區(qū)插入了一個(gè)長(zhǎng)度為690bp的內(nèi)含子。這與在擬南芥中得到的結(jié)果相似。在擬南芥基因組中，AtCBLl基因5'端也存在一個(gè)內(nèi)含子，位于起始子ATG前123bp處，長(zhǎng)度為411bp。5'端內(nèi)含子究竟起什么作用，還需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一歩驗(yàn)證。啟動(dòng)子上通常會(huì)有一些特殊的DNA序列，即順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合，從而抑制或激活基因的轉(zhuǎn)錄。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，AmCBLl基因表達(dá)受水分脅迫(干旱、鹽等)和脫落酸的誘導(dǎo)。受水分脅迫和ABA誘導(dǎo)表達(dá)的基因的啟動(dòng)子序列中，常有一些起關(guān)鍵作用的功能元件，大多數(shù)受干旱誘導(dǎo)的基因上游存在干旱誘導(dǎo)元件DRE(dehydration-responsiveelement),受ABA誘導(dǎo)的基因的啟動(dòng)子中常含有ABRE(ABA-responsitiveelement)元件等。本文利用PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)分析AmCBLl啟動(dòng)子序列，預(yù)測(cè)其順式作用元件(如表1所示)。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)AmCBLl啟動(dòng)子序列上主要存在一些環(huán)境因子應(yīng)答元件和激素應(yīng)答元件。受干旱，ABA誘導(dǎo)的基因的表達(dá)可能受不同元件的調(diào)控，如上所述，很多干旱和ABA誘導(dǎo)的基因的啟動(dòng)子中分別含有DRE和、BRE元件，但有些受干旱和ABA誘導(dǎo)的基因的啟動(dòng)子中并不含有該元件，如rd22基因的表達(dá)雖受ABA的誘導(dǎo)，但其上游啟動(dòng)子序列卻不含有DRE和ABRE元件，該基因的表達(dá)受MYB和MYC識(shí)別的作用元件的調(diào)控。AmCBLl基因的啟動(dòng)子序列中也未發(fā)現(xiàn)DRE和ABRE元件，卻含有眾多MYB和MYC識(shí)別的作用元件的同源序列，因此，AmCBLl基因的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)可能類似于rd22基因。此外，還發(fā)現(xiàn)與病菌，鹽誘導(dǎo)相關(guān)的元件GT1GMSC扁4(GAAAAA),這個(gè)元件存在于大豆CaM4基因啟動(dòng)子中，介導(dǎo)病菌，鹽信號(hào)。SUSIBA2蛋白在大麥中與WB0XHVIS01位點(diǎn)結(jié)合，參與糖信號(hào)傳導(dǎo)。ABRERATCAL是響應(yīng)鈣離子的順式元件，在162個(gè)鈣離子上調(diào)基因上游皆存在ABRERATCAL元件。實(shí)驗(yàn)證明，AmCBLl基因的表達(dá)受氯化鈣的誘導(dǎo)(實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表數(shù)據(jù))，因此ABRERATCAL元件很可能是AmCBLl基因響應(yīng)鈣離子的順式元件。在啟動(dòng)子序列中還發(fā)現(xiàn)一些和激素誘導(dǎo)相關(guān)的同源元件，CPBCSPOR和ARR1因子結(jié)合位點(diǎn)NGATT介導(dǎo)細(xì)胞分裂素CTK信號(hào)。GAREAT和WRKY710S與GA誘導(dǎo)相關(guān)。WBOX在擬南芥NPR1啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)，能被受SA誘導(dǎo)的WRKY蛋白特異性識(shí)別。在啟動(dòng)子中還存在許多于光信號(hào)相關(guān)的同源元件，如I-BOX,GTl,GATABOX等。綜上所述，我們推測(cè)該啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，受鈣離子、多種逆境因素和激素的調(diào)控。在載體pBI121中，GUS基因是由花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的，本文將該啟動(dòng)子替換為AmCBLl的啟動(dòng)子片段，以檢測(cè)其功能。用DNAMAN對(duì)啟動(dòng)子序列酶切位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中存在BamHI和Xbal位點(diǎn)，所以3'端只能利用Smal位點(diǎn)。因?yàn)樵贜PTII基因上也存在SphI和PstI酶切位點(diǎn)，所以只有HindlII是35S啟動(dòng)子5'端可用酶切位點(diǎn)。因此，本文利用HindIII和Smal位點(diǎn)來(lái)切除35S啟動(dòng)子，替換成AmCBLl啟動(dòng)子片段。利用PCR技術(shù)進(jìn)行缺失，擴(kuò)增了4個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子缺失片斷，嵌入PBI121載體，代替35S啟動(dòng)子，與GUS報(bào)告基因融合，成功構(gòu)建植物表達(dá)載體分別命名為(S1-GUS，S2-GUSS3-GUS,B1S3-GUS)。此外，為了檢測(cè)5'編碼區(qū)的內(nèi)含子是否發(fā)揮增強(qiáng)子作用，將內(nèi)含子分別以正反向插入到B1S3—GUS載體之前，成功構(gòu)建載體，分別命名為Qin-GUS和Rqin-GUS。根據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方案，該植物表達(dá)載體可以通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化植物，也可通過(guò)基因槍方法轉(zhuǎn)化植物?？墒褂冒ū景l(fā)明的AmCBLlP啟動(dòng)子融合抗逆性基因構(gòu)建植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物宿主(既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物)，培育抗寒、抗旱、耐鹽的植物品種。下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩說(shuō)明。表格l.PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè)AmCBLl啟動(dòng)子序列中的順式元件元件元件的核心序列元件個(gè)數(shù)相關(guān)功能ABRERATCALMACGYGBM=C/A;Y=T/C;B=T/C/G1響應(yīng)鈣離子的順式元件CGCGBOXATVCGCGBV=A/C/G;B=G/T/C2參與多種信號(hào)傳導(dǎo)CTRMCAMV35STCTCTCTCT4增強(qiáng)子CPBCSPORTATTAG1響應(yīng)細(xì)胞分裂素CTK信號(hào)ARR1因子結(jié)合位點(diǎn)NGATT21響應(yīng)細(xì)胞分裂素CTK信號(hào)GATABOXGATA8響應(yīng)光信號(hào)GT1CONSENSUSGRWAAW18響應(yīng)光信號(hào)IBOXCOREGATAA3響應(yīng)光信號(hào)INRNTPSADBYTCANTYY7響應(yīng)光信號(hào)GT1GMSCAM4GAAAAA9與病程和鹽誘導(dǎo)相關(guān)MYBCNGTTR/WAACCA/YAACKG13響應(yīng)干旱，ABA信號(hào)5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>圖1是AmCBLl基因全長(zhǎng)啟動(dòng)子擴(kuò)增結(jié)果M:為marker,從上之下大小為2000，1000，750，500，250，100。1為AmCBLl全長(zhǎng)啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2是5'RACE擴(kuò)增結(jié)果M:為marker,從上之下大小為2000，1000，750，500，250，100。l為全5，RACE擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物圖3是植物表達(dá)載體S1-GUS構(gòu)建流程示意圖(S2-GUS，S3-GUS，B1S3-GUS，B2S3構(gòu)建過(guò)程與此同)圖4是植物表達(dá)載體Qin-GUS構(gòu)建流程示意圖(Rqin-GUS構(gòu)建過(guò)程與此同)具體實(shí)施例方式實(shí)施例l、沙冬青CBL1啟動(dòng)子的克隆沙冬青總DNA的提取采用CTAB法，其步驟如下(1)在2mL的離心管中加入800yL的2XCTAB提取緩沖液[2g/100mlCTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTrisCl(pH8.0)]，8uL巰基乙醇(1%，v/v)，65'C預(yù)熱。(2)取約O.15g子葉，在液氮中研磨成凍粉。(3)將凍粉轉(zhuǎn)入離心管中，65"C保溫約30min，其間輕柔搖動(dòng)兩次。(4)取出離心管，冷至室溫。加入等體積氯仿/異戊醇，輕柔混勻10min。(5)10000r/min離心10min。(6)轉(zhuǎn)移上清，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置10min。(7)將DNA絮狀沉淀用槍頭挑出，或10000rpm/min離心10min，棄上清，70%乙醇洗滌沉淀3次，37'C烤至微干。(8)將沉淀溶于25uLTE緩沖液中，加入0.75yL(終濃度50ug/mL)RNase，37。C保溫1h。啟動(dòng)子的克隆利用錨定PCR(anchoredPCR):—種新的染色體步行方法(陳柏軍等，2004)。以沙冬青DNA為模板，經(jīng)過(guò)三次染色體歩移，獲得了1683bp的啟動(dòng)子序列。根據(jù)步移所得序列設(shè)計(jì)上游引物SI:AAATGGATTTAATTGGTATAAATTATTAGTGT,以AmCBLl己知序列區(qū)的GSP2:GTCTGTGATGCAAGAATTACTG作為下游引物，沙冬青DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(25yL)為lOXbuffer2.5uL,dNTP(2.5mmol/L)2uL，引物(20umol/L)各0.5uL，Extaq聚合酶(2.5U/uL)0.12ul，總DNA(1ug/uL)1yL，d扁18.38uL。反應(yīng)程序?yàn)?4'C預(yù)變性5min，94。C變性1min，退火溫度分別為57°C，時(shí)間均為lmin，72。C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)后，72匸延伸10min。啟動(dòng)子全長(zhǎng)擴(kuò)增結(jié)果如圖l所示，然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收。PCR產(chǎn)物的回收采用天為時(shí)代公司的離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(1)用干凈的刀片將DNA條帶從瓊脂糖凝膠上切下，并放入2mL離心管中。(2)加入3倍體積的溶膠液PN，5(TC水浴中放置10min，不斷溫和翻轉(zhuǎn)離心管，確保膠塊充分溶解。(3)將上一步所得溶液冷卻至室溫后加入一個(gè)吸附柱中，12000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液。(4)加入700uL漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉廢液。(5)加入500uL漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉廢液。(6)將離心吸附柱放回收集管中，12000rpm離心2min，盡量除去漂洗液。并在37。C溫箱中烘干10min。(7)將吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中間位置加入40uL7(TC預(yù)熱的洗脫緩沖液，室溫放置3min，12000rpm離心1min。(8)再將離心得到的溶液重新加回離心柱中，12000rpm離心1min。產(chǎn)物備用PCR產(chǎn)物與T載體的連接連接載體采用Takara公司的pMD18-T，連接反應(yīng)的體系為T載體1uL、目的DNA片段4iiL、連接液5yL。16。C反應(yīng)過(guò)夜。質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌(1)大腸桿菌ToplO感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于天根公司，將感受態(tài)細(xì)胞置于1.5mL預(yù)冷的無(wú)菌離心管中，加入全部連接產(chǎn)物，輕輕搖勻，立即置冰上30niin。(2)將離心管置42。C恒溫水浴中熱激90s，立即放回冰上放置3min。(3)加入500nL無(wú)附加抗生素的LB培養(yǎng)基，混勻，37。C預(yù)表達(dá)45min。重組質(zhì)粒的抗生素及a-互補(bǔ)篩選(1)制備LB附加抗生素(50mg/LAmp)的固體平板。(2)取150liL菌液與4uLIPTG及40uLX-gal(20mg/mL)混勻。(3)用無(wú)菌吸頭將混合液移至LB平板，用涂布器將菌液涂滿整個(gè)平板表面。(4)將平板倒置，于37"培養(yǎng)16h。質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒的提取采用賽百盛公司的UltraPureTM質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒進(jìn)行。(1)取含中間載體質(zhì)粒的菌液各4mL，含pCAMBIA1305.2質(zhì)粒的菌液8mL，13000rpm離心30s收集菌體。(2)倒掉上清，將菌體完全懸浮于100uL懸浮液中。(3)加入150uL裂解液，輕柔顛倒混勻，溶液逐漸變得粘稠、清亮。裂解時(shí)間不得超過(guò)5min，否則會(huì)造成DNA污染。(4)加入150uL中和液，輕柔顛倒混勻。此時(shí)可見到白色絮狀的染色體DNA及細(xì)菌碎片。13000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5mL離心管中，加入400uL純化樹脂(使用前充分混勻)，顛倒混勻3min。(5)將純化樹脂及上清液的混合物吸入離心純化柱中，13000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液。(6)將純化柱重新套入廢液收集管中，加入600uL80%乙醇，13000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液。(7)重復(fù)第7步2次，盡可能除去雜質(zhì)。(8)取出純化柱，將其套入干凈的1.5mL離心管中，開蓋放置3min，將殘留的乙醇揮發(fā)干。加入35uLTE緩沖液于純化樹脂上。室溫放置5min，13000rpm離心1min。再將洗脫下來(lái)的DNA溶液放回純化樹脂上，再次離心，以獲得更高產(chǎn)量的質(zhì)粒DNA。DNA序列測(cè)定由奧科生物技術(shù)有限公司完成。實(shí)施例2、5，RACE沙冬青RNA的提取使用前，所有的水，試劑和玻璃器皿均用0.1%DEPC(焦炭磷酸二乙酯)處理。CTABRNA提取緩沖液的配制25鵬ol/LEDTA,100腿ol/LTrisCl(pH8.0)，CYTAB2%，NaCl2%,2°/0巰基乙醇(現(xiàn)加)。LiCllOmM，70%乙醇(DEPC水配制)。DEPC處理水。沙冬青RNA的提取流程(1)取0.2g干旱處理的沙冬青子葉放入-2(TC預(yù)冷的研缽中，于液氮中研磨成凍粉，加入事先預(yù)熱(65°C)的RNA提取緩沖液800ul。漩渦震蕩30s。65'C溫浴2-5min,其間震蕩1-2次。(2)將離心管從水浴中取出，冷卻至室溫，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，震蕩10min。4°C,12000rpm離心10min。(3)轉(zhuǎn)移上清，氯仿/異戊醇重復(fù)抽提一次。(4)轉(zhuǎn)移上清，加入1/5體積10mM的LiCl，-2(TC放置1h。(5)4'C，12000rpm離心20min。(6)棄上清，吸干凈底部殘留的液體。(7)400uLDEPC處理的水溶解沉淀，再加入1/5體積10mM的LiCl，-2(TC放置1h。(8)4°C，12000rpm離心15min，棄上清，70%乙醇漂洗沉淀2-3次，4°C，12000rpm離心IOmin，除去乙醇，于室溫通風(fēng)櫥中自然風(fēng)干，約15min。(9)將溶液轉(zhuǎn)至1.5mL的離心管中，加入2體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，-2(TC放置3h。(10)4°C，12000rpm離心20min。(11)20uLDEPC處理的水溶解沉淀。(12)1%瓊脂糖凝膠，120V電壓檢測(cè)。-7(TC貯藏備用5，RACE方法參見5'RACESystemforR鄰idAmplificationofc隱Ends,Version2.0(Invitrogen)的說(shuō)明書，設(shè)計(jì)的三個(gè)特異性引物為GSP0:GTGCTTCAACCTCGCTGACAG，GSP2:GTCTGTGATGCAAGAATTACTG，和GSP3:GTCTCCTAACCTTAGAGTTGAAGCAC。5'RACE擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，回收該片段，連接，轉(zhuǎn)化，PCR菌落檢測(cè)后，陽(yáng)性克隆由奧科公司測(cè)序。實(shí)施例3、植物表達(dá)載體的構(gòu)建1)啟動(dòng)子缺失片段表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建所用的引物設(shè)計(jì)如下，加下劃線的部分為HindIII酶切位點(diǎn)序列，之前的兩個(gè)堿基CT作為為保護(hù)堿基。正向引物HS1:CTAAGCTTAAATGGATTTAATTGGTATAAATTASI:AAATGGATTTAATTGGTATAAATTATTAGTGTHS2:CTAGCTTGGAGAATGCTAATTAGTATCCTTTGAS2:GGAGAATGCTAATTAGTATCCTTTGAACATHS3:CTAAGCTTCTTTACTTTCAGTTCAGGAACTTTCS3:CTTTACTTTCAGTTCAGGAACTTTCTG反向引物RS:ATGGAGGAAATCCAGGCAAAGBinl:CCAGTTGAAAAAGTAAAGAACTTTGTCCIns:CTAAGCTTTACTTTTTCAACTGGGTGAGTCTTInr:CTAAGCTTTGCTCAGGCTTCACCACTTC啟動(dòng)子Sl表達(dá)載體的構(gòu)建流程如圖3所示，其他片段表達(dá)載體的構(gòu)建與之相同。在AmCBLl啟動(dòng)子上游，距ATG1657bp，1412bp，1046bp處，分別設(shè)計(jì)加HindIII接頭的上游引物HSl，和HS2，HS3，這三個(gè)正向引物均以距起始子ATG2bp處的RS為反向引物，保存AmCBLl啟動(dòng)子片段全長(zhǎng)的菌液為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(25yL)為上、下游引物(10umol/L)各O.5uL、10Xbuffer2.5pL、dNTP(2.5咖ol/U2uL、Extaq聚合酶(2.5U/pU0.12"L、模板菌液luL、ddH2018.38uL。反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性5min，94。C變性50s，均為57。C退火50s，72。C延伸1min30s，30個(gè)循環(huán)后，72。C延伸10min。以HS3為正向引物，內(nèi)含子之前的Binl為反向引物進(jìn)行PCR，條件同上，72。C延伸30s。將回收的PCR產(chǎn)物再次與克隆載體pMD18-T連接，構(gòu)建中間載體。將中間載體質(zhì)粒和pBI121分別用Smal和HindlII進(jìn)行酶切，因?yàn)镾mal酶切溫度為3(TC，HindlII酶切溫度為37'C，所以分開進(jìn)行酶切，酶切體系如下-9Smal■1uL10XTBuffer2yL0.1%BSA2uL質(zhì)粒DNA10uL滅菌水5uL3(TC酶切2h時(shí)后，再加入luLHindIII37"酶切2h。后用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，回收目的片段并進(jìn)行連接。連接。反應(yīng)采用Takara公司pMD18-T載體試劑盒中的連接液(LigationMix)進(jìn)行。反應(yīng)體系如下，16。C反應(yīng)4h。載體DNA片段2uL插入DNA片段3wL連接液5uL2)檢測(cè)內(nèi)含子功能表達(dá)載體的構(gòu)建為了檢測(cè)內(nèi)含子是否起增強(qiáng)子的作用，構(gòu)建了載體Qin-GUS和Rqin-GUS。Qin-GUS的構(gòu)建流程如圖4所示，Rqin-GUS的構(gòu)建過(guò)程與其相同。以Ins和Inr為特異性引物，保存AmCBLl啟動(dòng)子全長(zhǎng)片段的菌液為模板，反應(yīng)體系和程序同實(shí)施案例3中的1)，擴(kuò)增出加HindIII接頭的內(nèi)含子序列，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化，檢測(cè)得到pMD18-T-intron載體。將pMD18-T-intron載體和pBI121用Hindin在37"C酶切2h，酶切體系如下HindIIIlul10XTBuffer2ul質(zhì)粒DNAlOul滅菌水7ul瓊脂糖凝膠電泳，回收pMD18-T-intron載體酶切的小片段和S3-GUS酶切的開環(huán)大片段，將目的片斷連接。3)表達(dá)載體的鑒定將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落搖菌后進(jìn)行PCR檢測(cè)，分別用引物S1/RS，S2/RS，S3/RS，S3/Binl，反應(yīng)體系(25")為上、下游引物(10ymol/L)各O.5UL、10Xbuffer2.5uL、dNTP(2.5腿ol/L)2uL、Extaq聚合酶(2.5U/yL)0.12uL、模板菌液luL、ddH2018.38pL。反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性5min，94。C變性50s，均為57。C退火50s，72。C延伸lmin30s，30個(gè)循環(huán)后，72。C延伸10min。選三個(gè)擴(kuò)增出特異性條帶的樣品，進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序由奧科公司完成。Qin-GUS，Rqin-GUS只用測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)內(nèi)含子插入的正反方向。測(cè)序所用引物為根據(jù)pBI121載體序列設(shè)計(jì)的特異性引物PBIS:GCACGACAGGTTTCCCGACT，PBIR:GCACGATACGCTGGCCTGC，測(cè)序由奧科公司完成。沙冬青CBL1啟動(dòng)子核苷酸酸序列表<110〉夏新莉、尹偉倫、于艷華<120〉沙冬青CBL1啟動(dòng)子的鑒定及其功能研究<141〉2007-5-28<160〉1<210>1〈211〉1683<212〉脆〈213〉沙冬青"卿。//pt3"t力i/s/ff。恥。iicus)<220〉〈221〉啟動(dòng)子<222〉(1)…(1683)<223><220〉<221〉內(nèi)含子<222>(931)...(1620)<223〉<400〉1ttatttatttt犯33t3ttta_ttttaaa^tggatttaattggtataaatt60aaaatttttt3tactgtcaatcaatcataaattatcacatgtttgattct120tatgctaacttcacccaaatcatgaatatatattatatttatatttgaca180acattgtacattcaaatttactcattttcaacttcattgt240aaaacttcattgttattgagctataactaaaggagaatgctaattagtatcctttgaaca300ttggttaagaaaa犯ttttgtattg犯agat3tatattta_atattttaaa360cttaattttttagggaaacantctuttattgatttatt420cttaatgagatcagttacta犯ttagamet480aacgatat3ttttttattattgaatgaattttagaggt犯ctactctctt犯t卿tggg540tctcaagaatctgtttaacggagtggggacccgttttctacggccacctt600aacacaattcgccgttaacgtactttcagttcaggaactt660tctgacaacaacagcgtgagtctaatctctctctctttcaccctgatgtactatgtgtgt720atgtatatatg卿gggatggttcta犯ta犯t犯a^ctcatacctcagt780tctactctctcagctcaacccactttcccttttctcgagtactccgcgttttctttgttt840ttctctctcctctutttctctcatttctt3ta^gcccaactcactcaaatgccatttttc900taggacaaagttctttactttttcaactgggtgagtctttttccatcatcaccgttcttt960tttcgtttgatttacatcttatgttgaggttcttttccgtggggtttatgggaggagggg1020gtgggtttcaUttUtctgattaattatgtgatgtttat1080gtattttttttgttacaccgatcttcttgacgtcttttgatttctagatgatgtttataa1140agttatgaatttgcgcttcttttgataggatccatggatttcatcttggtattggttggt1200ctttaatttttgtaagattattattattattattatttcatcttggtaatggggt犯卿1260aattttagtcaagatcaaatttttatttattaatcactceiatttgtttattatttgtttt1320cttgaattattatgtaagttgtgtctttttgtgtccctaagctcatggtcatagecatet1380tttcat犯tggttctgagtcttgg犯cactacatactacei1440gttattcttttttaagattcttctgctttatcttttattttttttaattcaatgtttagc1500acagctaacatgtacca犯acttcac肌ggttgatttgtttatttattattttgcgttgt1560tggtgtttcaatttgggattaaaattgcaaggtt卿atgattttggtgatatattttag1620tgaagtggtgaagcctgagcactgctccggtaccttgetgctttgcctggatttcctcca1680tsa<210>2<211〉12411<212〉cDNA的5'證<213〉沙冬青"Mff,'pf朋t力u51yz(7"ga/j'cu51)〈400〉2tatagcccaactcactcaaatgccatttttctaggacaaagttctttactttttcaactg60gtgaagtggtgaagcctgagcactgctccggtaccttgctgctttgcctggatttcctcc120ataa權(quán)利要求1.從沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)中鑒定的CBL1基因的啟動(dòng)子序列，它具有與序列表SEQIDNo1所示的核苷酸序列。2.沙冬青CBLl基因cDNA序列中124bp的5，非翻譯區(qū)(UTR)，它具有如序列表SEQIDNo:2所示核苷酸序列。3.將權(quán)力要求1所述的序列與權(quán)力要求2所述序列相比對(duì)，發(fā)現(xiàn)的沙冬青基因組上CBL1基因5'非翻譯區(qū)插入了一個(gè)690bp的內(nèi)含子序列，內(nèi)含子是如序列表SEQIDNo:l特征所標(biāo)注的(931)...(1620)之間的序列。4.權(quán)力要求l所述的序列，其特征是根據(jù)預(yù)測(cè)它是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，受多種環(huán)境因子和激素的誘導(dǎo)。5.權(quán)力要求1所述的序列，其特征是含有多處與干旱，高鹽和激素誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件的同源序列，如MYB和MYC識(shí)別的作用元件，此元件和水分脅迫和ABA誘導(dǎo)相關(guān)；與病菌，鹽誘導(dǎo)相關(guān)的元件GT1GMSCAM4;響應(yīng)鈣離子的順式元件ABRERATCAL;參與糖信號(hào)傳導(dǎo)的WB0XHVIS01:赤霉素，水楊酸，細(xì)胞分裂素有到元件。6.根據(jù)權(quán)力要求1所述的啟動(dòng)子片段全部或部分序列構(gòu)建的植物表達(dá)載體。7.為了檢測(cè)權(quán)力要求3所述內(nèi)含子是否發(fā)揮增強(qiáng)子作用，構(gòu)建的植物表達(dá)載體。8.權(quán)力要求6和7所述的植物表達(dá)載體在改良植物抗旱，抗寒，耐鹽性中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)CBL1基因1683bp啟動(dòng)子序列，命名為AmCBL1P，公開了AmCBL1cDNA124bp的5’非翻譯區(qū)(UTR)。將1683bpAmCBL1啟動(dòng)子序列與其cDNA的5’UTR序列進(jìn)行比對(duì)，在基因組上發(fā)現(xiàn)AmCBL1基因的5’非翻譯區(qū)插入了一個(gè)長(zhǎng)度為690bp的內(nèi)含子。PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)AmCBL1P進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該序列含有多處與干旱，高鹽和激素誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件的同源序列。因此，推測(cè)AmCBL1P是一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，受多種逆境因子和激素的誘導(dǎo)。為了鑒定AmCBL1P的功能區(qū)域，構(gòu)建了啟動(dòng)子片段全部或部分序列植物表達(dá)載體。為了檢測(cè)5’非翻譯區(qū)的內(nèi)含子是否發(fā)揮增強(qiáng)子作用，改變內(nèi)含子的位置和方向，構(gòu)建了植物表達(dá)載體。本研究對(duì)闡明沙明清CBL1基因的上游調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，對(duì)提高植物抗逆性具有重要的科學(xué)意義。文檔編號(hào)C12N15/29GK101457227SQ200710195058公開日2009年6月17日申請(qǐng)日期2007年12月11日優(yōu)先權(quán)日2007年12月11日發(fā)明者于艷華,夏新莉,尹偉倫申請(qǐng)人:夏新莉;尹偉倫;于艷華