專利名稱：多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種的分離純化方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種多環(huán)芳烴厭氧降解 純菌種的分離純化方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(PAH)是一類具有致癌、致畸、致突變作用的有機(jī)物，在環(huán)境中分布廣泛且具 有生物難降解性因而引起人們的廣泛關(guān)注。多環(huán)芳烴的好氧生物降解是最快的，并且已經(jīng)分 離馴化出多株好氧降解菌。然而，地下含水層或污染土壤通常是厭氧狀態(tài)，使污染帶中的好 氧微生物被厭氧微生物所替代，因此，多環(huán)芳烴的厭氧生物降解比好氧生物降解更加可行且 經(jīng)濟(jì)有效。由于多環(huán)芳烴厭氧降解菌種生長(zhǎng)十分緩慢，世代周期較長(zhǎng)，傳統(tǒng)的好氧分離純化 方法不能適用于多環(huán)芳烴厭氧降解菌的分離，很多年來多環(huán)芳烴厭氧降解菌的分離純化一直 未能成功。由于難于分離到多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種，對(duì)多環(huán)芳烴的厭氧降解機(jī)理與過程研 究不夠深入，從而制約了多環(huán)芳烴污染土壤及地下水厭氧生物修復(fù)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用 研究。因此尋找一種能有效分離純化多環(huán)芳烴厭氧菌的方法與技術(shù)非常有必要，對(duì)于治理和 修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤及地下水有重要的意義。
到目甜為止，國(guó)內(nèi)還沒有關(guān)于分離純化多環(huán)芳烴厭氧降解菌種方法與技術(shù)方面的文獻(xiàn)及 專利報(bào)道。同時(shí)，由于多環(huán)芳烴特別是高于四環(huán)的稠環(huán)芳烴更難于被厭氧生物降解且對(duì)微生 物有較高的毒性作用，使得傳統(tǒng)厭氧微生物菌種的分離純化方法無法適用于多環(huán)芳烴的厭氧 降解純菌種的分離純化。同時(shí)，分離純化的環(huán)境條件及過程參數(shù)選定等都與能否分離純化成 功有密切的關(guān)系，這些條件與參數(shù)都需要經(jīng)過一系列的試驗(yàn)研究后才能確定出最佳范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種的分離純化方法與應(yīng)用。其具體步驟如
下
(1) 向體積為150 200mL的厭氧瓶?jī)?nèi)加入99mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、l.OmL微量金屬液、O.lmL 維生素c溶液，為指示培養(yǎng)基的厭氧狀態(tài)加入O.lmL刃天青溶液，用高純氮?dú)馄貧?.5h后加入 50 60 mg Na2S除去殘余的氧，然后用氟化橡膠塞密封瓶口 ，并用螺旋瓶蓋擰緊；其中基礎(chǔ) 培養(yǎng)基的組成為NH4C1: 1.2 g'L"， KH2P04: 1.2 g丄-1， MgCl2: 0.15 g'U1， CaClr2H20: 0.05 g'L—1; 微量金屬液的組成為CoCl2'6H20: 30 mg.i;1. CuCl2: 0.15 mg'i;1, H3B03: 5.7 mg.U1， MnCl2.4H20: 20 mg'L-1， Na2Mo04-2H20: 2.5 mg.L1' NiCl2- 2H20: 1.5 mg丄-1， ZnCl2: 2.1 mg丄-1。
(2) 在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫鋬?nèi)向體積為80 100 mL的厭氧瓶?jī)?nèi)加入50mL按步驟(1)配制的液體培養(yǎng)基、0.25~0.30g電子受體和0.65g瓊脂，用氟化橡膠塞密封瓶口，并用螺旋 瓶蓋擰緊。然后在溫度為12rC的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至55 6(TC時(shí)，在充滿 氮?dú)獾膮捬跏痔紫渲袑⑵涞谷塍w積為160mL的培養(yǎng)皿中，為除去培養(yǎng)基表面多余的水分將該 培養(yǎng)皿在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫渲蟹胖?天。
(3) 在充滿氮?dú)獾膮捬鮢-套箱內(nèi)向步驟(2)中的培養(yǎng)皿中加入0.3mL濃度為2g/L的多 環(huán)芳烴丙酮溶液，來回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使多環(huán)芳烴的丙酮溶液均勻分布，為除去培養(yǎng)基表面 的丙酮將該培養(yǎng)皿在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫渲蟹胖?天。
(4) 在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫鋬?nèi)向體積為20 25mL的厭氧瓶?jī)?nèi)加入10mL按步驟(1)配 制的液體培養(yǎng)基和0，25g瓊脂，用氟化橡膠塞密封瓶口，并用螺旋瓶蓋擰緊。然后在溫度為 121 。C的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至36-38。C 。
(5) 在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫渲邢虿襟E(4)的厭氧瓶中加入l mL通過富集與馴化篩選 得到的多環(huán)芳烴厭氧降解菌群溶液，搖勻后吸取lmL慢慢加入步驟(3)中的培養(yǎng)皿中，來回 傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使接種有混合菌群的培養(yǎng)基溶液均勻分布。密封培養(yǎng)皿并將其放入充滿氮?dú)?的干燥器中培養(yǎng)觀察，1 2月后便可發(fā)現(xiàn)有明顯的菌落出現(xiàn)。
(6) 在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫鋬?nèi)向體積為20 25 mL的厭氧瓶中加入2.5-3.0 mL濃度 為2 g/L的多環(huán)芳烴丙酮溶液，為除去丙酮將厭氧瓶開口放置2天，然后加入10mL按步驟
(1)配制的液體培養(yǎng)基和0.05~0.06g電子受體。
(7) 在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫鋬?nèi)挑取步驟(5)培養(yǎng)皿中的菌落，將其接種至步驟(6) 中的厭氧瓶中，用氟化橡膠塞密封瓶口，并用螺旋瓶蓋擰緊，在溫度為20土2'C、轉(zhuǎn)速為100r/min 的振蕩器中培養(yǎng)20 25天。
(8) 將步驟(2)至步驟(7)作為一個(gè)分離純化周期重復(fù)步驟(2)至步驟(7),但 每次用前一個(gè)分離純化周期中步驟(7)的菌液代替步驟(5)中用到的多環(huán)芳烴厭氧降解菌 群溶液。分離純化四個(gè)周期以上即可得到能夠厭氧降解多環(huán)芳烴的純菌種。
所述電子受體為硝酸鈉或硝酸鉀。
本發(fā)明的有益效果是所述的方法能夠分離純化到對(duì)多環(huán)芳烴厭氧降解性能好的微生物純 菌種。
具體實(shí)施例方式
在充滿氮?dú)獾膮捬跸鋬?nèi)制作以多環(huán)芳烴為唯一碳源和能源、以硝酸鈉或硫酸鈉為電子受 體的厭氧瓊脂固體培養(yǎng)基底層平板，在底層平板上制作含有多環(huán)芳烴厭氧降解混合菌的厭氧 瓊脂固體培養(yǎng)基頂層平板，將制作好的培養(yǎng)基平板密封后放入充滿氮?dú)獾母稍锲髦信囵B(yǎng)1 2 月。在充滿氮?dú)獾膮捬跸鋬?nèi)向加入多環(huán)芳烴、電子受體、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c
溶液及刃天青的厭氧瓶?jī)?nèi)接入培養(yǎng)基平板中的菌落，在溫度為20土2'C、轉(zhuǎn)速為IOO r/min的振 蕩器中培養(yǎng)20 25天。然后進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于4次后即可得到能夠厭氧降解多環(huán) 芳烴的純菌種。所述多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種為假單胞菌尸化WoAnomwspp.，下面是以運(yùn)用分 離純化的菌種進(jìn)行了多環(huán)芳烴的厭氧降解試驗(yàn)進(jìn)一步說明本發(fā)明。 實(shí)施例1
運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種在硝酸鹽還原條件下進(jìn)行了萘的厭氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表 明假單胞菌i^e"Aww"w spp.能夠?qū)吝M(jìn)行有效的厭氧降解，當(dāng)萘的初始濃度為27.4 mg/L時(shí)， 15天后能降解到0.04mg/L以下。
實(shí)施例2
運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種在硝酸鹽還原條件下進(jìn)行了菲的厭氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表 明假單胞菌i^e"flbwomw spp.能夠?qū)Ψ七M(jìn)行有效的厭氧降解，當(dāng)菲的初始濃度為1.08 mg/L時(shí)， 15天后能降解到0.01mg/L以下。
實(shí)施例3
運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種在硝酸鹽還原條件下進(jìn)行了芴的厭氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表 明假單胞菌尸化w^mo"w spp.能夠?qū)踢M(jìn)行有效的厭氧降解，當(dāng)芴的初始濃度為0.13 mg/L時(shí)， 10天后能降解到0.01mg/L以下。
實(shí)施例4
運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種在硝酸鹽還原條件下進(jìn)行了芘的厭氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表 明假單胞菌i^Womomw spp.能夠?qū)胚M(jìn)行有效的厭氧降解，當(dāng)芘的初始濃度為0.12 mg/L時(shí)， 10天后能降解到0.01mg/L以下。
權(quán)利要求
1.一種多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種的分離純化方法，其特征在于，該方法的具體步驟如下(1)向體積為150～200mL的厭氧瓶?jī)?nèi)加入99mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1.0mL微量金屬液、0.1mL維生素c溶液、0.1mL刃天青溶液，用高純氮?dú)馄貧?.5h后加入50～60mg Na2S除去殘余的氧，然后用氟化橡膠塞密封瓶口，并用螺旋瓶蓋擰緊；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為NH4Cl1.2g·L-1，KH2PO41.2g·L-1，MgCl20.15g·L-1，CaCl2·2H2O0.05g·L-1；微量金屬液的組成為CoCl2·6H2O30mg·L-1，CuCl20.15mg·L-1，H3BO35.7mg·L-1，MnCl2·4H2O20mg·L-1，Na2MoO4·2H2O2.5mg·L-1，NiCl2·2H2O1.5mg·L-1，ZnCl22.1mg·L-1。(2)在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫鋬?nèi)向體積為80～100mL的厭氧瓶?jī)?nèi)加入50mL按步驟(1)配制的液體培養(yǎng)基、0.25～0.30g電子受體和0.65g瓊脂，用氟化橡膠塞密封瓶口，并用螺旋瓶蓋擰緊。然后在溫度為121℃的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至60℃左右時(shí)，在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫渲袑⑵涞谷塍w積為160mL的培養(yǎng)皿中，將該培養(yǎng)皿在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫渲蟹胖?天。(3)在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫鋬?nèi)向步驟(2)中的培養(yǎng)皿中加入0.3mL濃度為2g/L的多環(huán)芳烴丙酮溶液，來回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使多環(huán)芳烴的丙酮溶液均勻分布，將該培養(yǎng)皿在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫渲蟹胖?天。(4)在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫鋬?nèi)向體積為20～25mL的厭氧瓶?jī)?nèi)加入10mL按步驟(1)配制的液體培養(yǎng)基和0.25g瓊脂，用氟化橡膠塞密封瓶口，并用螺旋瓶蓋擰緊。然后在溫度為121℃的高壓鍋中滅菌20分鐘，在室溫下冷卻至36～38℃。(5)在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫渲邢虿襟E(4)的厭氧瓶中加入1mL通過富集與馴化篩選得到的多環(huán)芳烴厭氧降解菌群溶液，搖勻后吸取1mL慢慢加入步驟(3)中的培養(yǎng)皿中，來回傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使接種有混合菌群的培養(yǎng)基溶液均勻分布。密封培養(yǎng)皿并將其放入充滿氮?dú)獾母稍锲髦信囵B(yǎng)觀察，1～2月后便可發(fā)現(xiàn)有明顯的菌落出現(xiàn)。(6)在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫鋬?nèi)向體積為20～25mL的厭氧瓶中加入2.5～3.0mL濃度為2g/L的多環(huán)芳烴丙酮溶液，，將厭氧瓶開口放置2天后，加入10mL按步驟(1)配制的液體培養(yǎng)基和0.05～0.06g電子受體。(7)在充滿氮?dú)獾膮捬跏痔紫鋬?nèi)挑取步驟(5)培養(yǎng)皿中的菌落，將其接種至步驟(6)中的厭氧瓶中，用氟化橡膠塞密封瓶口，并用螺旋瓶蓋擰緊，在溫度為20±2℃、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)20～25天。(8)將步驟(2)至步驟(7)作為一個(gè)分離純化周期；重復(fù)步驟(2)至步驟(7)，但每次用前一個(gè)分離純化周期中步驟(7)的菌液代替步驟(5)中用到的多環(huán)芳烴厭氧降解菌群溶液。分離純化四個(gè)周期以上即可得到能夠厭氧降解多環(huán)芳烴的純菌種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種的分離純化方法，其特征在于，所述電 子受體為硝酸鈉、硝酸鉀。
3. —種權(quán)利要求l所述多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種的應(yīng)用，運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種 在硝酸鹽還原條件下進(jìn)行了萘的厭氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表明假單胞菌尸化t^owo"^ spp.能夠?qū)?進(jìn)行有效的厭氧降解，當(dāng)萘的初始濃度為27.4mg/L時(shí)，15天后能降解到0.04mg/L以下。
4. 一種權(quán)利要求l所述多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種的應(yīng)用，運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種 在硝酸鹽還原條件下進(jìn)行了菲的厭氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表明假單胞菌尸sewto/nomw spp.能夠?qū)Ψ?進(jìn)行有效的厭氧降解，當(dāng)菲的初始濃度為1.08mg/L時(shí)，15天后能降解到0.01mg/L以下。
5. —種權(quán)利要求l所述多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種的應(yīng)用，運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種 在硝酸鹽還原條件下進(jìn)行了芴的厭氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表明假單胞菌i^eWo/wwcw spp.能夠?qū)?進(jìn)行有效的厭氧降解，當(dāng)芴的初始濃度為0.13mg/L吋，10天后能降解到0.01mg/L以下。
6. —種權(quán)利要求l所述多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種的應(yīng)用，運(yùn)用本發(fā)明方法分離純化的菌種 在硝酸鹽還原條件下進(jìn)行了芘的厭氧降解試驗(yàn)，結(jié)果表明假單胞菌尸化"必附o"fls spp.能夠?qū)?進(jìn)行有效的厭氧降解，當(dāng)芘的初始濃度為0.12mg/L時(shí)，10天后能降解到0.01mg/L以下。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于受污染土壤與水的生物降解處理技術(shù)領(lǐng)域的一種多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種的分離純化方法與應(yīng)用。在充滿氮?dú)獾膮捬跸鋬?nèi)制作以多環(huán)芳烴為唯一碳源和能源、以硝酸鈉或硝酸鉀為電子受體的厭氧瓊脂固體培養(yǎng)基底層平板，在底層平板上制作含有多環(huán)芳烴厭氧降解混合菌的厭氧瓊脂固體培養(yǎng)基頂層平板，將制作好的培養(yǎng)基平板密封后放入充滿氮?dú)獾母稍锲髦信囵B(yǎng)1～2月。在充滿氮?dú)獾膮捬跸鋬?nèi)向加入多環(huán)芳烴、電子受體、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液、維生素c溶液及刃天青的厭氧瓶?jī)?nèi)接入培養(yǎng)基平板中的菌落，在溫度為20±2℃、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)20～25天。然后進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)接，在循環(huán)次數(shù)大于4次后即可得到能夠厭氧降解多環(huán)芳烴的純菌種。本方法能夠分離純化得到對(duì)多環(huán)芳烴厭氧降解性能好的微生物純菌種。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101195811SQ200710195110
公開日2008年6月11日 申請(qǐng)日期2007年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日
發(fā)明者丁愛中, 豆俊峰 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)