專利名稱：：一種鑒別hbv基因突變類型的方法及其專用芯片與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因分析領(lǐng)域中一種鑒別HBV基因突變類型的方法及其專用芯片與試劑盒。
背景技術(shù)：
：慢性乙型肝炎是目前最嚴(yán)重的健康問題之一，全球約20億人曾感染過乙型肝炎病毒(h印atitisBvirus，HBV)，其中3.5億人為慢性HBV感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)。我國屬HBV感染高流行區(qū)，中國現(xiàn)有1.3億乙肝病毒攜帶者，3000多萬乙型肝炎病人。一般人群的HBsAg陽性率為9.09%。HBV是一個高突變的病毒，在它逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程中，因RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，可使病毒在復(fù)制過程中發(fā)生一個或多個核苷酸的突變。HBV突變可以在慢性持續(xù)性感染過程中自然突變，也可以受人體免疫應(yīng)答和疫苗接種，使病毒受免疫壓力而導(dǎo)致突變，也可以因各種抗病毒藥物治療誘導(dǎo)病毒突變。發(fā)生突變的病毒常可改變其生物學(xué)特性，直接導(dǎo)致HBV的免疫逃避、耐藥，從而造成治療的失敗和病情的惡化。因此，準(zhǔn)確檢測HBV突變基因類型將具有重要的生物學(xué)、臨床和社會意義。由于HBV自身復(fù)制能力很強(qiáng)，每24小時可以復(fù)制1024個拷貝，在復(fù)制的逆轉(zhuǎn)錄過程中，逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏嚴(yán)格校正機(jī)制，自發(fā)突變率達(dá)10—5。在HBV感染過程中，會積累大量的HBV突變病毒株，而且與野生病毒株同時存在。在不同病程時期會出現(xiàn)優(yōu)勢種群和劣勢種群的轉(zhuǎn)換。目前，已知的HBV多聚酶(Pol)基因(P基因)與耐藥相關(guān)的突變類型包括如表l所示的一些類型。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>目前國內(nèi)外HBV突變位點(diǎn)檢測主要有以下幾種方法(1)HBVDNA聚合酶基因序列測定根據(jù)HBV基因組保守序列設(shè)計引物擴(kuò)增靶序列，將PCR產(chǎn)物直接測序，直接獲得有關(guān)耐藥突變的序列信息。盡管序列分析是金標(biāo)準(zhǔn)，但此方法只能檢測含量大于10%的突變株，且操作復(fù)雜，成本較高，需要測序儀，多用于科研，不適用于臨床檢測中廣泛應(yīng)用；(2)HBVPCR產(chǎn)物限制性片段長度多態(tài)性分析(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP):原理為將待測的DNA片段用限制性內(nèi)切酶酶切，以識別并切割特異的序列，將酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)DNA片段的大小來判斷目的基因是否會有特異性序列。用PCR-RFLP方法在HBV耐拉米夫定突變株的檢測原理為將HBV聚合酶基因擴(kuò)增，在擴(kuò)增產(chǎn)物中引入特定堿基序列，其與突變株形成內(nèi)切酶位點(diǎn)，而不能和野生株形成內(nèi)切酶位點(diǎn)；突變株擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后則產(chǎn)生短片段,根據(jù)電泳結(jié)果可以判斷是否會有突變序列。但目前方法標(biāo)準(zhǔn)化程度差、混合基因型檢測能力差，檢測基因突變時，對于l個堿基以上的突變，需要多個檢測系統(tǒng)分別檢出；(3)PCR-序列特異性引物(PCR-sequencespecificprimer,PCR-SSP)擴(kuò)增HBVDNA:位點(diǎn)特異性引物僅與特異突變序列結(jié)合，可特異地擴(kuò)增出突變株。但每對引物1次只能檢測l種特異突變,反應(yīng)條件不易控制，存在非特異擴(kuò)增的可能和HBV基因異質(zhì)性較高、個體之間的HBV序列存在差異有可能產(chǎn)生假陰性，在臨床檢測中已很少應(yīng)用。(4)肽核苷酸介導(dǎo)序列特異性PCR:PNA是一種核酸類似物,它的骨架為肽鍵鏈，堿基連在骨架鏈上的氮原子上。寡聚PNA可以與單鏈核酸模板結(jié)合，但不能作為引物引導(dǎo)DNA的合成。寡聚PNA結(jié)合力較普通寡核苷酸強(qiáng),退火溫度(Tra)比普通寡核苷酸高50%，但如果出現(xiàn)錯配，則結(jié)合力迅速下降。在擴(kuò)增時寡聚PNA作為阻軛物放在引物前面，與PCR引物部分重疊，當(dāng)寡聚PNA與野生模板完全配對時，不能發(fā)生聚合反應(yīng)；當(dāng)寡聚PNA與突變模板出現(xiàn)錯配時，結(jié)合力迅速下降，失去阻軛作用，使聚合反應(yīng)得以進(jìn)行。但此時擴(kuò)增產(chǎn)物為突變序列。該方法可用于突變檢測，但不能獲得序列信息；(5)熔解溫度法(meltingtemperature)。當(dāng)溫度慢慢升高時，由于單個堿基的不匹配也會造成結(jié)合能力的降低，因此發(fā)生位點(diǎn)突變的DNA模板會較早發(fā)生與探針的變性分離而導(dǎo)致熒光信號的降低，最終表現(xiàn)為突變株的Tra值低于野生株的Tm值，通過軟件分析可以實現(xiàn)完全的區(qū)分而達(dá)到對突變的檢測。目前有商品試劑供應(yīng)，需要儀器為RocheLightcycler，單一反應(yīng)管，閉管檢測，結(jié)果直觀明確；(6)線性探針分析將不同序列的探針固定在硝化纖維膜上的不同位置,每個位置用來檢測不同的突變序列，然后與HBV聚合酶的基因擴(kuò)增產(chǎn)物雜交?？刂品磻?yīng)條件，使擴(kuò)增出的突變序列與相應(yīng)探針結(jié)合，再根據(jù)結(jié)合的不同位置探測出不同部位的突變?，F(xiàn)在該方法已經(jīng)有商品化試劑供應(yīng)。該方法經(jīng)擴(kuò)增后雜交，具有敏感度好，可檢測突變株大于10%的低滴度樣品。尚有提供信息量大和操作可自動化的優(yōu)點(diǎn)。但試劑昂貴，同時存在少量由于DNA序列多態(tài)性導(dǎo)致的不容易解釋結(jié)果的問題，因此在臨床檢測中應(yīng)用較少；(7)序列特異性探針雜交法(SequenceSpecificOligonucleotideProbe，SS0P)基因芯片技術(shù)利用基因芯片的高通量、平行檢測特性，對引起突變的眾多基因設(shè)計探針，這些探針結(jié)合于同一張芯片上，從血清樣本中提取病毒DNA經(jīng)體外擴(kuò)增后，與芯片探針雜交，根據(jù)雜交信號判斷HBV的突變基因型。該技術(shù)對于單堿基差異很難準(zhǔn)確區(qū)分，特異性較差；同時，該方法很難對突變型/野生型共存?zhèn)€體進(jìn)行準(zhǔn)確的區(qū)分。上述技術(shù)都存在一個共同的不足，即任何單一方法都不能高通量、準(zhǔn)確特異的檢出優(yōu)勢種群/劣勢種群中的HBV基因突變類型。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種鑒別HBV基因突變類型的方法及其專用芯片與試劑合JULo本發(fā)明所提供的鑒別HBV基因突變類型的方法，是以待檢測乙型肝炎病毒的基因組為模板，用如下引物組和沒有3'-5'端外切酶活性(exonucleaseactivity)的DNA聚合酶進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，然后將得到的PCR產(chǎn)物與基因芯片進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果確定HBV基因突變類型；所述引物組包括一種共用引物和一種或一種以上的特異引物；所述共用引物與所述特異引物組成的每對引物能擴(kuò)增包括乙型肝炎病毒基因組的一個突變位點(diǎn)的突變型或野生型堿基在內(nèi)的核苷酸片段；所述特異引物的5'端是條碼序列，所述條碼序列的長度是5-25nt，所述條碼序列與乙型肝炎病毒基因連續(xù)匹配或相同的堿基數(shù)小于5個；所述特異引物的3'端有5-25nt與乙型肝炎病毒的包括一個突變位點(diǎn)的野生型或突變型堿基在內(nèi)的相應(yīng)片段完全匹配；當(dāng)所述引物組包括一種以上的所述特異引物時，一種所述特異引物的5'端是一種條碼序列，各種條碼序列之間Tm值之差小于等于5。C，相互之間以及與所有的引物之間沒有交叉雜交，并且無發(fā)夾結(jié)構(gòu)，與含有所述HBV目的基因的物種的基因組連續(xù)匹配或相同的堿基數(shù)小于10個；所述基因芯片包括若干種探針，所述探針與所述條碼序列一一對應(yīng)，每種探針只含有一種所述條碼序列。上述方法中，所述多重PCR擴(kuò)增的模板具體可為從全血、血清、組織、病毒培養(yǎng)物提取的病毒核酸或質(zhì)粒。該方法中，因為每種PC財廣增產(chǎn)物只包括一個突變位點(diǎn)的野生型或突變型，并且被一種條碼序列標(biāo)記，當(dāng)其與所述芯片雜交后，根據(jù)雜交結(jié)果，即可得知待測樣品的突變類型，進(jìn)而確定HBV的耐藥情況。所述特異引物可與乙型肝炎病毒的包括一個突變位點(diǎn)的野生型或突變型堿基在內(nèi)的相應(yīng)片段完全匹配。為提高檢測的特異性，所述特異引物中可以引入人工錯配堿基。所述人工錯配堿基是天然的A、T、C、G四種堿基或其類似物，該類似物包括尿嘧啶(U)，肽核酸(PNA)，鎖定核酸(LNA)等。所述多重PCR擴(kuò)增可在一管中進(jìn)行，或分為多管進(jìn)行多管多重PCR反應(yīng)。所述條碼序列可為單鏈寡核苷酸序列或肽核酸序列。所述條碼序列帶有熒光分子或可通過化學(xué)發(fā)光或固體微粒進(jìn)行標(biāo)記檢測的分子。所述HBV基因突變類型可為rtL80V、rtL801、rtll69T、rtV173G、rtV173L、rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtT184G、rtS2021、rtM2041、rtM204V、rtM204S、rtN236T和rtM2501中的至少一種。所述HBV基因突變類型具體可為rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtM2041、rtM204V、r憶204S和rtN236T中的至少一種。檢測上述HBV基因突變類型的引物組具體如下所述共用引物的核苷酸序列是序列表中的序列2;所述特異引物為下述11種單鏈核苷酸片段中的一種或任意多種，所述11種單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的序列2至序列12。本發(fā)明提供了1條PCR上游共用引物以及11組PCR下游特異引物(方框內(nèi)為HBV檢測位點(diǎn)的特異引物，下劃線為條碼序列，粗斜體字為人工引入的錯配堿基)共用引物GCACGCTATCACGTTCTTCGCTGTACCAAACCTTCGGAC(序列1)用于擴(kuò)增HBVP基因的rtL180M突變位點(diǎn)的兩個基因特異性引物180L-WT:TCGAGTACAGGACCCACATCAGCACTAGTAAACTGAGCC6G(序歹ij2)180M-MU:GTTGGCTAGGAACTGCAAGCACGGGCACTAGTAAACTGA6CCAT(序列3);用于擴(kuò)增HBVP基因的rtA181T突變位點(diǎn)的兩個基因特異性引物;181A-WT:TCGGCACGCGCGAGATCACCATCACAAATGGCACTAGAAAACTG7GC(序列4)181T-MU:GCATAGACGTGGCTCAACTGT豐ATGGCACTAGTAAACTG7GT|(序歹ij5)用于擴(kuò)增HBVP基因的rtA181V突變位點(diǎn)的兩個基因特異性引物；181A—WT:TCGGCACGCGCGAGATCACCAT豐CAAATGGCACTAGAAAACTG7GCl(序歹U4)181V—MU:AGCTAGACCACTCAGCAGACTG^AACAAATGGCACTAGTAAACTa訶(序歹ij6)用于擴(kuò)增HBVP基因的rtM2041突變位點(diǎn)的兩個基因特異性引物；204M—WT:TTTTCCCGTCCGTCATCGCTCAA(jCCCCCAATACCACATCA圳(序歹lj7)2041-MU:GTTAGGGTCGCGCCAAACTCTC取CCCAATACCACATCATaAl(序列8)用于擴(kuò)增HBVP基因的rtM204V突變位點(diǎn)的兩個基因特異性引物；204M—WT:TTTTCCCGTCCGTCATCGCTCAA(^CCCCCAATACCACATCA紅I(序歹ij7)204V—MU:AGTCGAAGTGTGCGTCAGACTClCCCCCAATACCACATCAT圳(序列9)用于擴(kuò)增HBVP基因的rtM204S突變位點(diǎn)的兩個基因特異性引物;204M—WT:TTTTCCCGTCCGTCATCGCTCAA(jCCCCCAATACCACATCAyCCl(序歹U7)204S-MU:CAAGGCACGTCCCAGACGCATCAA|CCCCCAATACCACATCAT7AC|(序列10)用于擴(kuò)增HBVP基因的rtN236T突變位點(diǎn)的兩個基因特異性引啦236N—WT:GAGTGAAGCCAATCGAGTGAGCC^ACGTTTGGTTTTATTAGGGTl(序列11)236T-MU:CTGTTAAACGTCAGAGCGCAGC|CAACGTTTGGTTTTATTAGGGG|(序列12)所述條碼序列為下述11種單鏈核苷酸片段中的一種或任意多種所述11種單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的序列2的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列3的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列4的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列5的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列6的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列7的自5'末端的第1至24位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列8的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列9的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列10的自5'末端的第1至24位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列11的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列12的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸；所述基因芯片包括下述11種探針中的一種或任意多種所述11種探針中的每種探針分別含有一種所述條碼序列。本發(fā)明所提供的鑒別HBV基因突變類型的基因芯片，它包括下述11種探針中的一種或任意多種，所述11種探針中的每種探針分別含有下述11種條碼序列中的任意一種；所述條碼序列為下述11種單鏈核苷酸片段中的一種或任意多種所述11種單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的序列2的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列3的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列4的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列5的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列6的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列7的自5'末端的第1至24位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列8的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列9的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列10的自5'末端的第1至24位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列11的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列12的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸。本發(fā)明所提供的鑒別HBV基因突變類型的試劑盒，包括一種共用引物和一種或一種以上的特異引物；所述共用引物與所述特異引物組成的每對引物能擴(kuò)增包括乙型肝炎病毒基因組的一個突變位點(diǎn)的突變型或野生型堿基在內(nèi)的核苷酸片段；所述特異引物的5'端是條碼序列，所述條碼序列的長度是5-25nt，所述條碼序列與乙型肝炎病毒基因組同源性較低(連續(xù)匹配或相同的堿基數(shù)小于10個)；所述特異引物的3'端有5-25nt與乙型肝炎病毒的包括一個突變位點(diǎn)的野生型或突變型堿基在內(nèi)的相應(yīng)片段完全匹配；當(dāng)所述引物組包括一種以上的所述特異引物時，一種所述特異引物的5'端是一種條碼序列，各種條碼序列之間Tm值之差小于等于5r(有相似的Tra值)，相互之間以及與所有的引物之間沒有交叉雜交，并且無發(fā)夾結(jié)構(gòu)，與含有所述HBV目的基因的物種的基因組連續(xù)匹配或相同的堿基數(shù)小于10個；所述特異引物與乙型肝炎病毒的包括一個突變位點(diǎn)的野生型或突變型堿基在內(nèi)的相應(yīng)片段完全匹配。所述條碼序列為單鏈寡核苷酸序列或肽核酸序列。所述特異引物引入人工錯配堿基；所述人工錯配堿基是天然的A、T、C、G四種堿基或其類似物，所述類似物包括尿嘧啶(U)，肽核酸(PNA)，鎖定核酸(LNA)等。所述條碼序列帶有熒光分子或可通過化學(xué)發(fā)光或固體微粒進(jìn)行標(biāo)記檢測的分子。所述突變位點(diǎn)為rtL證、rtL801、rtll69T、rtV173G、rtV173L、rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtT184G、rtS2021、rtM2041、rtM204V、rtM204S、rtN236T和rtM2501中的至少一個。所述突變位點(diǎn)為rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtM2041、rtM204V、rtM204S和rtN236T中的至少一個。所述共用引物的核苷酸序列是序列表中的序列1;所述特異引物為下述11種單鏈核苷酸片段中的一種或任意多種，所述11種單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的序列2至序列12。所述試劑盒還包括權(quán)利要求12所述的基因芯片。所述試劑盒還包括沒有3'-5'端外切酶活性的DNA聚合酶。本發(fā)明中的多重PCR不同于一般意義上的簡單多重PCR。首先，特異性引物的3'末端堿基有兩種形式，一種是末端堿基和待檢測的基因位點(diǎn)野生型(SNP或突變)匹配，一種是末端堿基和待檢測的基因位點(diǎn)突變型(SNP或突變)匹配，二者相互對照，這增加了反應(yīng)的特異性和準(zhǔn)確性；其次，在特異引物的末端連接條碼序列用于對待檢測的基因位點(diǎn)進(jìn)行編碼；另外，為了增強(qiáng)反應(yīng)的特異性可以在引物序列中引入人工突變點(diǎn)。本發(fā)明中的通用芯片也不同于一般意義上的固定有序列特異性探針的基因芯片，在普通芯片上固定的探針是針對基因的特定位點(diǎn)進(jìn)行檢測的基因片段，檢測不同的目標(biāo)基因需要設(shè)計不同的探針，制備不同的芯片。而本發(fā)明中基因芯片是一種用來對預(yù)先篩選出的一套序列特異性基因片段(條碼序列)進(jìn)行識別的基因芯片，芯片上固定的探針不是針對特定的基因序列，而是針對特定的條碼序列。條碼序列可以用來對不同的基因位點(diǎn)、對不同基因的不同位點(diǎn)、對不同物種的不同基因位點(diǎn)進(jìn)行編碼(相當(dāng)于一個條碼)，對于不同的檢測目的可以用相同的一套條碼序列，這樣對于不同檢測目的，只要在芯片上固定一套可以識別這套條碼序列的基因片段就可完成檢測任務(wù)。本發(fā)明的方法快速、簡便、更具可操作性、易于實現(xiàn)自動化操作?？捎糜谂骎基因突變檢測、基因多態(tài)性分析等方面，適用于臨床HBV耐藥和基因型檢測、耐藥以及肝癌機(jī)理研究和流行病學(xué)調(diào)査等領(lǐng)域，有利于指導(dǎo)臨床診斷、個體化醫(yī)療、耐藥監(jiān)測和預(yù)后分析等。圖l為基因芯片點(diǎn)陣排布示意圖圖2為用圖1所示的基因芯片對克隆質(zhì)粒進(jìn)行實際檢測的結(jié)果圖3為用圖1所示的基因芯片對乙型肝炎病人的臨床樣品1#進(jìn)行實際檢測的結(jié)果圖4為用圖1所示的基因芯片對乙型肝炎病人的臨床樣品2#進(jìn)行實際檢測的結(jié)果圖5為用圖1所示的基因芯片對乙型肝炎病人的臨床樣品3#進(jìn)行實際檢測的結(jié)果具體實施例方式下述實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1、用本發(fā)明的基因芯片和方法檢測已知HBV突變的克隆質(zhì)粒樣品1.突變克隆質(zhì)粒制備1)朋VP基因的野生型質(zhì)粒pGEM-T-HBVPWT的制備以HBV基因組DNA為模板，用上游引物(序列:CAAGGTATGTTGCCCGTTTG)禾口下游引物(序列GGAGTTCCGCAGTATGGATCGG)PCR擴(kuò)增核苷酸序列是GenbankAccessionNumberAB205123的自5'末端第1448位至2191位脫氧核糖核苷酸，將該P(yáng)CR產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體連接，得到含有核苷酸序列是GenbankAccessionNumberAB205123的自5'末端第1448位至2191位脫氧核糖核苷酸的包括HBVP編碼基因在內(nèi)的片段的重組質(zhì)粒pGEM-T-HBVPWT，該質(zhì)粒為包括HBVP基因的野生型質(zhì)粒。2)HBVP基因的突變型質(zhì)粒pGEM-T-HBVPMU180M、pGEM-T-HBVPMU181T、pGEM-T-HBVPMU181V、pGEM-T-HBVPMU2041、pGEM-T-HBVPMU204V、pGEM-T-HBVPMU204S和pGEM-T-HBVPMU236T的制備方法如下其中，所用的引物序列具體如下用于制備HBVP基因突變克隆的通用上游引物CAAGGTATGTTGCCCGTTTG(突變引物1);用于制備HBVP基因突變克隆的通用下游引物GGAGTTCCGCAGTATGGATCGG(突變引物2);用于制備HBVP基因的rtL180M突變克隆的引物突變上游引物CGTTTCTCATGGCTCAGTTTAC(突變引物3)，突變下游引物GTAAACTGAGCCATGAGAAACGG(突變引物4);用于制備HBVP基因的rtA181T突變克隆的引物突變上游引物GTTTCTCCTGACTCAGTTTACTAG(突變引物5)，突變下游引物CTAGTAAACTGAGTCAGGAGAAACG(突變引物6);用于制備HBVP基因的rtA181V突變克隆的引物突變上游引物GTTTCTCCTGGTTCAGTTTACTAG(突變引物7)，突變下游引物CTAGTAAACTGAACCAGGAGAAACG(突變引物8);用于制備HBVP基因的rtM204I突變克隆的引物突變上游引物CTTTCAGTTATATTGATGATGTGG(突變引物9)，突變下游引物ACCACATCATCAATATAACTGAAAG(突變引物10);用于制備HBVP基因的rtM204V突變克隆的引物突變上游引物CTTTCAGTTATGTGGATGATGTG(突變引物11),突變下游引物CACATCATCCACATAACTGAAAG(突變引物12);用于制備HBVP基因的rtM204S突變克隆的引物突變上游引物CTTTCAGTTATAGTGATGATGTGG(突變引物13)，突變下游引物ACCACATCATCACTATAACTGAAAG(突變引物14);用于制備HBVP基因的rtN236T突變克隆的引物突變上游引物GGTATACATTTGACCCCTAATAAAAC(突變引物15)，突變下游引物GTTTTATTAGGGGTCAAATGTATACC(突變引物16)。第一輪PCR擴(kuò)增所有反應(yīng)均以野生型質(zhì)粒pGEM-T-HBVPWT作為模板；分別以突變引物1和突變引物3以及突變引物2和突變引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為產(chǎn)物1和產(chǎn)物2;分別以突變引物1和突變引物5以及突變引物2和突變引物6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為產(chǎn)物3和產(chǎn)物4;分別以突變引物1和突變引物7以及突變引物2和突變引物8進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為產(chǎn)物5和產(chǎn)物6;分別以突變引物1和突變引物9以及突變引物2和突變引物IO進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為產(chǎn)物7和產(chǎn)物8;分別以突變引物l和突變引物11以及突變引物2和突變引物12進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為產(chǎn)物9和產(chǎn)物10;分別以突變引物1和突變引物13以及突變引物2和突變引物14進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為產(chǎn)物11和產(chǎn)物12;分別以突變引物1和突變引物15以及突變引物2和突變引物16進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為產(chǎn)物13和產(chǎn)物14;第二輪PCR擴(kuò)增所有反應(yīng)引物均為突變引物1和突變引物2;共擴(kuò)增7管，模板分別為產(chǎn)物1和產(chǎn)物2的混合物(管1)，產(chǎn)物3和產(chǎn)物4的混合物(管2)，產(chǎn)物5和產(chǎn)物6的混合物(管3)，產(chǎn)物7和產(chǎn)物8的混合物(管4)，產(chǎn)物9和產(chǎn)物10的混合物(管5)，產(chǎn)物11和產(chǎn)物12的混合物(管6)，產(chǎn)物13和產(chǎn)物14的混合物(管7)將上述PCR產(chǎn)物(管l)與pGEM-TEasy載體連接，得到質(zhì)粒pGEM-T-HBVPMU180M，該質(zhì)粒為包括HBVP基因的180M突變型質(zhì)粒；將上述PCR產(chǎn)物(管2)與pGEM-TEasy載體連接，得到質(zhì)粒pGEM-T-HBVPMU181T，該質(zhì)粒為包括HBVP基因的180T突變型質(zhì)粒；將上述PCR產(chǎn)物(管3)與pGEM-TEasy載體連接，得到質(zhì)粒pGEM-T-HBVPMU181V，該質(zhì)粒為包括HBVP基因的180V突變型質(zhì)粒；將上述PCR產(chǎn)物(管4)與pGEM-TEasy載體連接，得到質(zhì)粒pGEM-T-HBVPMU204I，該質(zhì)粒為包括HBVP基因的2041突變型質(zhì)粒；將上述PCR產(chǎn)物(管5)與pGEM-TEasy載體連接，得到質(zhì)粒pGEM-T-HBVPMU204V，該質(zhì)粒為包括HBVP基因的204V突變型質(zhì)粒；將上述PCR產(chǎn)物(管6)與pGEM-TEasy載體連接，制備質(zhì)粒pGEM-T-HBVPMU204S，該質(zhì)粒為包括HBVP基因的204S突變型質(zhì)粒；將上述PCR產(chǎn)物(管7)與pGEM-TEasy載體連接，得到質(zhì)粒pGEM-T-HBVPMU236T，該質(zhì)粒為包括HBVP基因的236T突變型質(zhì)粒。2.制備多重PCR引物及基因芯片的探針5(1)引物引物如表2所示，引物名稱中后綴為WT的引物代表擴(kuò)增野生型基因特異性引物，引物名稱中后綴為MU的引物代表擴(kuò)增突變型基因特異性引物，每個突變位點(diǎn)的兩種基因特異性引物分別與共用引物(UF)配對。多重PCR引物序列見序列l(wèi)序列12,弓l物由上海Invitrogen公司(InvitrogenCo.,Shanghai,China)合成與純化。為提高檢測特異性，部分等位基因特異性引物中引入人工錯配堿基。(2)探針芯片是由與多重PCR產(chǎn)物雜交的ll種條碼序列探針、QC(點(diǎn)樣的陽性質(zhì)控)、BC(點(diǎn)樣的陰性質(zhì)控)、NC(雜交的陰性質(zhì)控)和PC(雜交的陽性質(zhì)控)組成的陣列。其中，探針序列具體如下(下劃線為條碼序列)用于檢測HBVP基因的rtL180M突變位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的探針；180L:NH2-polyT15-gUggctaggaactgcaagcac(條碼序列是序列2的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸)180M:NH2-polyT15-tcgagtacaggacccacatcag(條碼序列是序列3的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸)用于檢測HBVP基因的rtA181T突變位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的探針；181A:NH2-polyT15-tcggcacgcgcgagatcaccatc(條碼序列是序列4的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸)181T:NH2-polyT15-gcatagacgtggctcaactgtc(條碼序列是序列5的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸)用于檢測HBVP基因的rtA181V突變位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的探針；181A:NH2-polyT15-tcggcacgcgcgagatcaccatc(條碼序列是序列4的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸)181V:NH2-polyT15-agctagaccactcagcagactg(條碼序列是序列6的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸)用于檢測HBVP基因的rtM2041突變位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的探針；204M:NH2-polyT15-ttttcccgtccgtcatcgctcaag(條碼序列是序列7的自5'末端的第1至24位脫氧核糖核苷酸)2041:NH2-polyT15-gttagggtcgcgccaaactctcc(條碼序列是序列8的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸)用于檢測HBVP基因的rtM204V突變位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的探針；204M:NH2-polyT15-ttttcccgtccgtcatcgctcaag(條碼序列是序列7的自5'末端的第1至24位脫氧核糖核苷酸)204V:NH2-polyT15-agtcgaagtgtgcgtcagactc(條碼序列是序列9的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸)用于檢測HBVP基因的rtM204S突變位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的探針；204M:NH2-polyT15-Uttcccgtccgtcatcgctcaag(條碼序列是序列7的自5'末端的第1至24位脫氧核糖核苷酸)204S:NH2-polyT15-caaggcacgtcccagacgcatcaa(條碼序列是序列10的自5'末端的第1至24位脫氧核糖核苷酸)用于檢測HBVP基因的rtN236T突變位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的探針；236N:NH2-polyT15-gagtgaagccaatcgagtgagc(條碼序列是序列11的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸)236T:NH2-polyT15-ctgttaaacgtcagagcgcagc(條碼序列是序列12的自5,末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸)。探針由上海Invitrogen公司(InvitrogenCo.，Shanghai,China)合成與純化。芯片上的條碼序列探針序列結(jié)構(gòu)通式為NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-條碼序列。即探針的5'端氨基修飾，氨基旁邊連接poly-T15，然后是分別是條碼序列。將探針固定到醛基化修飾的玻片上。所有的條碼序列探針用50%DMS0溶解，終濃度為15幽，每個點(diǎn)重復(fù)四次點(diǎn)制到玻片上。QC是一端帶有Hex標(biāo)記，另一端氨基修飾的寡核苷酸探針，用于觀察芯片點(diǎn)樣和固定的效率，其序列為NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAGAGTGCTTGGTGCCATAAC-HEX;BC為50%的DMS0，用于質(zhì)控點(diǎn)樣過程中有無樣品殘留污染；NC是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，與雜交液中的所有待檢測序列不會雜交，用于觀察有無非特異雜交，其序列為NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGCAACCACCACCGGAGG;PC是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，可以與雜交液中添加的熒光標(biāo)記的互補(bǔ)序列(c-PC)雜交，用于雜交過程的質(zhì)控，其序列為NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGGTATCGCGACCGCATCCCAATCT。表2.檢測的突變位點(diǎn)、引物及探針突變形式引物名稱引物序列在序列表中的編號探針名稱rtL180M180L-WT2180L180M-MU3180MrtA181T181A-WT4181A181T-MU5181TrtA181V181A-WT4181A181V-MU6181VrtM204I204M-WT7204M204I-MU82041rtM204V204M-WT7204M204V-MU9204VrtM204S204M-WT7204M204S-MU10204SrtN236T236N-WT11236N236T-MU12236T共用引物(UF)13.多重PCR分別以pGEM-T-HBVPWT，pGEM-T-HBVPMU180M，pGEM-T-HBVPMU181T，pGEM-T-HBVPMU204V和pGEM-T-朋VPMU236T5種質(zhì)粒等摩爾混合作為模板，進(jìn)行多重PCR。多重PCR在2管中進(jìn)行，2管除了特異引物不同，其余成分完全相同。管l特異引物180L-WT，181A-WT，204M-WT，236N-WT;管2特異引物180M-MU，204I-MU，204V-MU，204S-MU,181T-MU，181V-MU，236T-MU。擴(kuò)增體系如下，包括0.2mMdNTPs，1XQiagenPCRbuffer,添加MgCl2至2mM，pH8.7，1單位HotStarTaqDNAPolymerase(Qiagen,Hilden,Germany),和O.lng質(zhì)粒DNA，共用引物，各檢測位點(diǎn)的特異引物。25W擴(kuò)增體系中，各引物的濃度如下180L-WT0.02幽，181A-WT0.02(JM，204M-WT0.03,，236N-WT0.03PM，180M-MU0.03湖，2041-MU0.03MM，204V-MU0.02幽，204S-MU0.02,，181T-MU0.03^M，181V-MU0.02MM，236T-MU0.02mM，共用引物O.8幽。擴(kuò)增參數(shù)為先95°C15分鐘；然后9化30秒，0.5。C/秒降至69°C，56°C30秒，0.2XV秒升至70。C，70。C45秒，IO個循環(huán)；再90。C30秒，0.5。C/秒降至60。C，56。C30秒，0.2。C/秒升至7(TC,70。C45秒，22個循環(huán)；最后6(TCIO分鐘;4"C保存。4.基因芯片雜交2管PCR產(chǎn)物混合，取IOW混合物加到20W雜交緩沖液中(6XSSC,5XDenhardt'sreagent,25%甲酰胺，0.1%SDS，5nMc-PC(與芯片PC互補(bǔ)的序列，5'端TAMRA標(biāo)記)。98t:變性5分鐘，冰浴，雜交混合物加入到兩個相鄰的點(diǎn)陣中作為重復(fù)實驗。然后將芯片放置5(TC水浴中雜交1小時。取出玻片分別在兩種洗液中42。C各洗2min，洗液I:0.3XSSC/0.1%SDS，洗液II:0.06XSSC。最后，玻片稍離心甩干。5.數(shù)據(jù)分析使用晶芯'MLuxscan-10K/B(博奧生物有限公司)掃描玻片，掃描圖如圖3所示。圖2顯示的是用圖1所示的基因芯片對pGEM-T-HBVPWT，pGEM-T-HBVPMU180M，pGEM-T-HBVPMU181T，pGEM-T-HBVPMU204V禾口pGEM-T-HBVPMU236T混合PCR產(chǎn)物進(jìn)行實際檢測的結(jié)果。每種探針2X2連續(xù)重復(fù)點(diǎn)樣四次。雜交結(jié)果顯示野生型檢測探針(180L、181A、204M、236N)全部出現(xiàn)雜交信號(工作正常)；雜交圖中相應(yīng)的突變檢測探針(180M、181T、204V、和236T)均雜交出了相應(yīng)的正確檢測信號。而181T、204V和204S突變檢測探針均沒有出現(xiàn)雜交信號。由圖2結(jié)果可知，所有位點(diǎn)檢測結(jié)果都正確無誤，特異性很好。實施例2、用本發(fā)明的基因芯片和方法檢測已知HBV突變的臨床樣品1.臨床樣品核酸制備已知HBV基因突變的離體病例樣品(HBV陽性血清)由人民醫(yī)院肝病研究所提供。樣品ltt為HBVP基因的野生型(WT)、HBVP基因的突變型180M和HBVP基因的突變型2041的混合型；樣品2tt為HBVP基因的野生型(WT)、HBVP基因的突變型180M和HBVP基因的突變型204S的混合型；樣品3#為HBVP基因的野生型(WT)、HBVP基因的突變型181V和HBVP基因的突變型236T的混合型。使用QIAampDNABloodMiniKit(Qiagen，Hilden，Germany)提取HBV陽性血清中的基因組DNA。2.制備多重PCR引物及基因芯片的探針(1)引物引物如表1所示，引物名稱中后綴為WT的引物代表擴(kuò)增野生型基因特異性引物，弓I物名稱中后綴為MU的引物代表擴(kuò)增突變型基因特異性引物，每個突變位點(diǎn)的兩種基因特異性引物分別與共用引物(UF)配對。多重PCR引物序列見序列l(wèi)序列13，弓l物由上海Invitrogen公司(InvitrogenCo.，Shanghai,China)合成與純化。為提高檢測特異性，部分等位基因特異性引物中引入人工錯配堿基。(2)探針芯片與實施例1中的如圖l所示的芯片相同。該芯片是由與多重PCR產(chǎn)物雜交的ll種條碼序列探針(如圖l所示，探針序列同實施例1)、QC(點(diǎn)樣的陽性質(zhì)控)、BC(點(diǎn)樣的陰性質(zhì)控)、NC(雜交的陰性質(zhì)控)和PC(雜交的陽性質(zhì)控)組成的陣列。芯片上的條碼序列探針序列結(jié)構(gòu)通式為NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-條碼序列。即探針的5'端氨基修飾，氨基旁邊連接poly-T15，然后是分別是條碼序列。將探針固定到醛基化修飾的玻片上。所有的條碼序列探針用50%DMS0溶解，終濃度為15,，每個點(diǎn)重復(fù)四次點(diǎn)制到玻片上。QC是一端帶有Hex標(biāo)記，另一端氨基修飾的寡核苷酸探針，用于觀察芯片點(diǎn)樣和固定的效率，其序列為NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAGAGTGCTTGGTGCCATAAC-HEX;BC為50X的DMS0，用于質(zhì)控點(diǎn)樣過程中有無樣品殘留污染；NC是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，與雜交液中的所有待檢測序列不會雜交，用于觀察有無非特異雜交，其序列為NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGCAACCACCACCGGAGG;PC是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，可以與雜交液中添加的熒光標(biāo)記的互補(bǔ)序列(c-PC)雜交，用于雜交過程的質(zhì)控，其序列為NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGGTATCGCGACCGCATCCCAATCT。3.多重PCR分別以從樣品ltt、樣品2tt、樣品3tt中提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行多重PCR。多重PCR在2管中進(jìn)行，2管除了特異引物不同，其余成分完全相同。管l特異引物180L-WT，181A-WT，204M-WT，236N-WT;管2特異引物180M-MU，2041-MU，204V-MU，204S-MU，181T-MU，181V-MU，236T-MU。擴(kuò)增體系如下，包括0.2mMdNTPs，1XQiagenPCRbuffer,添加MgCl2至2mM,pH8.7,1單位HotStarTaqDNAPolymerase(Qiagen，Hilden，Ger薩y)，禾口0.lng質(zhì)粒DNA，共用引物，各檢測位點(diǎn)的特異引物。25W擴(kuò)增體系中，各引物的濃度如下180l-wt0.02mm，181a-wt0.02幽，204m-wt0.03幽，236n-wt0.03mM，180M-MU0.03MM,2041-MU0.03MM，204V-MU0.02幽，204S-MU0.02幽，181T-MU0.03^，181V-MU0.02141，236T-MU0.02,，共用引物O.8,。擴(kuò)增參數(shù)為先95。C15分鐘；然后94°c30秒，0.5'c/秒降至69°c，56°c30秒，0.2。c/秒升至70°c,70°c45秒，io個循環(huán)；再90。c30秒，0.5。c/秒降至60。c，56。c30秒，0.2。c/秒升至70°c,70°c45秒，22個循環(huán)；最后60。cio分鐘；4t:保存。4.基因芯片雜交2管PCR產(chǎn)物混合，取10Pl混合物加到20W雜交緩沖液中(6XSSC，5XDenhardt'sreagent,25%甲酰胺，0.1%SDS，5nMc-PC(與芯片PC互補(bǔ)的序列，5'端T細(xì)RA標(biāo)記)。98。C變性5分鐘，冰浴，雜交混合物加入到兩個相鄰的點(diǎn)陣中作為重復(fù)實驗。然后將芯片放置5(TC水浴中雜交1小時。取出玻片分別在兩種洗液中42。C各洗2min，洗液I:0.3XSSC/0.1%SDS，洗液II:0.06XSSC。最后，玻片稍離心甩干。5.數(shù)據(jù)分析使用晶芯"Luxscan-10K/B(博奧生物有限公司)掃描玻片，掃描圖如圖3-5所示。圖3-圖5顯示的是用圖l所示的基因芯片對臨床乙肝患者血清樣品進(jìn)行實際檢測的結(jié)果。每種探針2X2連續(xù)重復(fù)點(diǎn)樣四次。樣品1#的檢測結(jié)果如圖3所示，樣品2#的檢測結(jié)果如圖4所示，樣品3ft的檢測結(jié)果如圖5所示。雜交結(jié)果顯示野生型檢測探針(180L、181A、204M、236N)全部出現(xiàn)雜交信號(工作正常)；雜交圖中相應(yīng)的突變檢測探針(180M、181V、2041、204S和236T)均雜交出了相應(yīng)的正確檢測信號。而181T和204V突變檢測探針均沒有出現(xiàn)雜交信號。由圖3-圖5結(jié)果可知，所有位點(diǎn)檢測結(jié)果都正確無誤，特異性很好。序列表<160〉12〈210〉1<211〉39<212>薩<213〉人工序列<220><223〉<400〉1gcacgctatcacgttcttcgctgtaccaaaccttcggac39<210〉2<211〉41<212>腿<213〉人工序列〈220〉<223〉〈■〉2tcgagtacaggacccacatcagcactagtaaactgagccgg41<210>3<211〉44<212〉腿<213〉人工序列〈220〉<223〉<400>3gttggctaggaactgcaagcacgggcactagtaaactgacccat44<210〉4〈211〉47〈212>腿<213〉人工序列<220〉<223〉〈400>4tcggcacgcgcgagatcaccatcacaaatggcactagaaaactgtgc47〈210〉5<211>43〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉<400〉5gcatagacgtggctcaactgtcaatggcactagtaaactgtgt43<210>6〈211>47<212〉腿〈213〉人工序列〈220〉<223〉<400〉6agctagaccactcagcagactggaacaaatggcactagtaaactcaa47<210〉7〈211〉44<212>腿<213〉人工序列〈220〉<223><400>7ttttcccgtccgtcatcgctcaagcccccaataccacatcaacc44<210>8<211>44<212〉腿<213〉人工序列<220〉<223〉<400〉8gttagggtcgcgccaaactctcccccccaataccacatcatgaa44<210>9<211>43〈212>DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉<400〉9agtcgaagtgtgcgtcagactccccccaataccacatcatgaa43<210〉10〈211〉45〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<223〉<400〉10caaggcacgtcccagacgcatcaacccccaataccacatcattac45<210〉11<211〉44<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223><400>11gagtgaagccaatcgagtgagccaacgtttggttttattagggt44〈210〉12<211〉44<212〉腿<213〉人工序列<220〉〈223〉<400〉12ctgttaaacgtcagagcgcagccaacgtttggttttattagggg4權(quán)利要求1、一種鑒別HBV基因突變類型的方法，是以待檢測乙型肝炎病毒的基因組為模板，用如下引物組和沒有3′-5′端外切酶活性的DNA聚合酶進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，然后將得到的PCR產(chǎn)物與基因芯片進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果確定HBV基因突變類型；所述引物組包括一種共用引物和一種或一種以上的特異引物；所述共用引物與所述特異引物組成的每對引物能擴(kuò)增包括乙型肝炎病毒基因組的一個突變位點(diǎn)的突變型或野生型堿基在內(nèi)的核苷酸片段；所述特異引物的5′端是條碼序列，所述條碼序列的長度是5-25nt，所述條碼序列與乙型肝炎病毒基因連續(xù)匹配或相同的堿基數(shù)小于5個；所述特異引物的3′端有5-25nt與乙型肝炎病毒的包括一個突變位點(diǎn)的野生型或突變型堿基在內(nèi)的相應(yīng)片段完全匹配；當(dāng)所述引物組包括一種以上的所述特異引物時，一種所述特異引物的5′端是一種條碼序列，各種條碼序列之間Tm值之差小于等于5℃，相互之間以及與所有的引物之間沒有交叉雜交，并且無發(fā)夾結(jié)構(gòu)，與含有所述HBV目的基因的物種的基因組連續(xù)匹配或相同的堿基數(shù)小于10個；所述基因芯片包括若干種探針，所述探針與所述條碼序列一一對應(yīng)，每種探針只含有一種所述條碼序列。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述特異引物與乙型肝炎病毒的包括一個突變位點(diǎn)的野生型或突變型堿基在內(nèi)的相應(yīng)片段完全匹配。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述多重PCR擴(kuò)增在一管中進(jìn)行，或分為多管進(jìn)行多管多重PCR反應(yīng)。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述條碼序列為單鏈寡核苷酸序列或肽核酸序列。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述特異引物引入人工錯配堿基;所述人工錯配堿基是天然的A、T、C、G四種堿基或其類似物；所述類似物包括尿嘧啶，肽核酸和鎖定核酸。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述條碼序列帶有熒光分子或可通過化學(xué)發(fā)光或固體微粒進(jìn)行標(biāo)記檢測的分子。7、根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述HBV基因突變類型為rtL80V、rtL801、rtll69T、rtV173G、rtV173L、rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtT184G、rtS2021、rtM2041、rtM204V、rtM204S、rtN236T和rtM2501中的至少一種。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述HBV基因突變類型為rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtM2041、r億04V、rtM204S和rtN236T中的至少一種。9、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述共用引物的核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi);所述特異引物為下述11種單鏈核苷酸片段中的一種或任意多種，所述11種單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的序列2至序列12。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述條碼序列為下述ll種單鏈核苷酸片段中的一種或任意多種所述11種單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的序列2的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列3的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列4的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列5的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列6的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列7的自5'末端的第1至24位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列8的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列9的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列10的自5'末端的第1至24位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列11的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列12的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸；所述基因芯片包括下述11種探針中的一種或任意多種所述11種探針中的每種探針分別含有一種所述條碼序列。11、一種基因芯片，它包括下述ll種探針中的一種或任意多種，所述ll種探針中的每種探針分別含有下述11種條碼序列中的任意一種；所述條碼序列為下述11種單鏈核苷酸片段中的一種或任意多種所述11種單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的序列2的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列3的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列4的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列5的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列6的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列7的自5'末端的第1至24位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列8的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列9的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列10的自5'末端的第1至24位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列11的自5'末端的第1至23位脫氧核糖核苷酸、序列表中的序列12的自5'末端的第1至22位脫氧核糖核苷酸.12、一種試劑盒，包括一種共用引物和一種或一種以上的特異引物；所述共用引物與所述特異引物組成的每對引物能擴(kuò)增包括乙型肝炎病毒基因組的一個突變位點(diǎn)的突變型或野生型堿基在內(nèi)的核苷酸片段；所述特異引物的5'端是條碼序列，所述條碼序列的長度是5-25nt，所述條碼序列與乙型肝炎病毒基因連續(xù)匹配或相同的堿基數(shù)小于5個；所述特異引物的3'端有5-25nt與乙型肝炎病毒的包括一個突變位點(diǎn)的野生型或突變型堿基在內(nèi)的相應(yīng)片段完全匹配；當(dāng)所述引物組包括一種以上的所述特異引物時，一種所述特異引物的5'端是一種條碼序列，各種條碼序列之間Tm值之差小于等于5i:，相互之間以及與所有的引物之間沒有交叉雜交，并且無發(fā)夾結(jié)構(gòu)，與含有所述HBV目的基因的物種的基因組連續(xù)匹配或相同的堿基數(shù)小于10個。13、根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于所述特異引物與乙型肝炎病毒的包括一個突變位點(diǎn)的野生型或突變型堿基在內(nèi)的相應(yīng)片段完全匹配。14、根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其特征在于所述條碼序列為單鏈寡核苷酸序列或肽核酸序列。15、根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其特征在于所述特異引物引入人工錯配堿基；所述人工錯配堿基是天然的A、T、C、G四種堿基或其類似物；所述類似物包括尿嘧啶，肽核酸和鎖定核酸。16、根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其特征在于所述條碼序列帶有熒光分子或可通過化學(xué)發(fā)光或固體微粒進(jìn)行標(biāo)記檢測的分子。17、根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其特征在于所述突變位點(diǎn)為rtL80V、rtL801、rtll69T、rtV173G、rtV173L、rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtT184G、rtS2021、rtM2041、rtM204V、rtM204S、rtN236T和rtM2501中的至少一個。18、根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其特征在于所述突變位點(diǎn)為rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtM2041、rtM204V、rtM204S和rtN236T中的至少一個。19、根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其特征在于所述共用引物的核苷酸序列是序列表中的序列1;所述特異引物為下述11種單鏈核苷酸片段中的一種或任意多種，所述11種單鏈核苷酸片段的核苷酸序列分別是序列表中的序列2至序列12。20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括權(quán)利要求ll所述的基因芯片。21、根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括沒有3'-5'端外切酶活性的DNA聚合酶。全文摘要本發(fā)明公開了鑒別HBV基因突變類型的方法及其專用芯片與試劑盒。該鑒別HBV基因突變類型的方法，是以待檢測乙型肝炎病毒的基因組為模板，用如下引物組和沒有3′-5′端外切酶活性的DNA聚合酶進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，然后將得到的PCR產(chǎn)物與基因芯片進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果確定HBV基因突變類型；所述引物組包括一種共用引物和一種或一種以上的特異引物；所述特異引物的5′端是條碼序列，所述條碼序列的長度是5-25nt，所述條碼序列與乙型肝炎病毒基因組較低的同源性；所述特異引物的3′端有5-25nt與乙型肝炎病毒的包括一個突變位點(diǎn)的野生型或突變型堿基在內(nèi)的相應(yīng)片段完全匹配；所述基因芯片包括若干種探針，所述探針與所述條碼序列一一對應(yīng)，每種探針只含有一種所述條碼序列。文檔編號C12Q1/68GK101182585SQ200710179329公開日2008年5月21日申請日期2007年12月12日優(yōu)先權(quán)日2007年12月12日發(fā)明者王國青,京程,趙傳贊,永郭,高華方申請人:博奧生物有限公司;清華大學(xué)