p53基因突變的快速檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種p53基因突變的快速檢測(cè)方法，本發(fā)明分別設(shè)計(jì)了p53第6號(hào)外顯子（p53-E6）和第8號(hào)外顯子（p53-E8）的野生型引物和突變型引物，分別擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的野生型目的片段和突變型目的片段，不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片段的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進(jìn)行區(qū)分；與其它方法相比，本發(fā)明方法具有高特異性、高靈敏度與方便快捷的優(yōu)點(diǎn)；而且通量更高，單次成本更低。
【專利說明】P53基因突變的快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是分子生物學(xué)，分子診斷，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。
【背景技術(shù)】:
[0002]P53基因位于人17號(hào)染色體17pl3.1上，全長(zhǎng)約20Kb，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成，其中第I個(gè)外顯子不編碼，外顯子2、4、5、7、8分別編碼5個(gè)進(jìn)化上高度保守的結(jié)構(gòu)域。P53基因編碼一個(gè)393個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，分子量為53KD，這也是其被命名為“P53”的原因。
[0003]野生型P53蛋白(wtP53)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，多個(gè)途徑抑制腫瘤的發(fā)生:
[0004]①「滯細(xì)胞周期P53蛋白通過調(diào)控下游基因P21編碼蛋白，引起細(xì)胞Gl期阻滯；此外，P53蛋白通過細(xì)胞周期蛋白BI (Cyclin BI)、壓力響應(yīng)蛋白(CADD45)和14-3-3 σ三個(gè)下游基因，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。
[0005]②「促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Ρ53蛋白可以上調(diào)B-細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)蛋白(Bcl-2associated X protein, Bax)的表達(dá)并下調(diào)B_細(xì)胞淋巴瘤/白血病_2(Bcl_2)的表達(dá),介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；此外，P53蛋白可以通過腫瘤壞死因子(TNF)受體和死亡相關(guān)因子(factor associated suicide, Fas)蛋白等死亡信號(hào)受體蛋白途徑誘導(dǎo)凋亡。
[0006]③「維持基因組穩(wěn)定P53可參與DNA的修復(fù)過程，其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域本身具有核酸內(nèi)切酶的活性，可切除錯(cuò)配核 苷酸，結(jié)合并調(diào)節(jié)核苷酸內(nèi)切修復(fù)因子著色性干皮病B基因(XPB)和(著色性干皮病D基因)XPD的活性，影響其DNA重組和修復(fù)功能。
[0007]④「抑制腫瘤血管生成P53蛋白能刺激抑制血管生成基因Smad4(drosophilamothers against decapentaplegic protein)等表達(dá)，抑制腫瘤血管形成。P53蛋白通過多途徑來抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，在腫瘤抑制上發(fā)揮及其重要的作用。
[0008]P53突變的類型包括基因片段缺失、插入、點(diǎn)突變引起的錯(cuò)義突變以及雜合性缺失。但是在所有P53突變形式中，占主導(dǎo)地位的還是因點(diǎn)突變引起的錯(cuò)義突變，其比例約占總體的80%。而在這些P53錯(cuò)義突變中，發(fā)生在DNA結(jié)合域(DNA binding doma in, DBD區(qū))的點(diǎn)突變比例高達(dá)97%。這些突變中，以下6個(gè)位點(diǎn)的突變?cè)谀[瘤中高頻率出現(xiàn)。與腫瘤進(jìn)程密切相關(guān)的，被稱為熱點(diǎn)突變，分別是:R175、G245、R248、R249、R273和R282 (圖
O[l]o這些突變型P53蛋白(mutP53)的功能發(fā)生了逆轉(zhuǎn)式的改變。一方面，mutP53喪失了原有的細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡發(fā)生、介導(dǎo)細(xì)胞衰老、維持基因組穩(wěn)定和錯(cuò)配DNA修復(fù)等抑癌功能。同時(shí)，mutP53在腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[2]。另一方面，mutP53獲得了癌基因特性[3]。mutP53通過調(diào)節(jié)其表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factorreceptor, EGFR)、增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)、禽類髓細(xì)胞病毒癌基因(c-myc)等下游靶基因，參與到腫瘤的物質(zhì)代謝、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、血管生成以及耐藥性的增強(qiáng)中。并與P63、p73等發(fā)生可能性結(jié)合，損害p63和p73介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化和凋亡的執(zhí)行，削弱了 P63和p73的抑癌功能。此外，mutP53干擾MRN-ATM通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，衰減轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (transforming growth factor-β ,TGF-β )通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。
[0009]P53基因的這些位點(diǎn)的突變與大部分腫瘤的發(fā)生相關(guān)，包括肺癌、卵巢癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、骨肉癌、白血病、乳腺癌和食管癌等，這些位點(diǎn)上的突變是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及可能的腫瘤產(chǎn)生的預(yù)兆，應(yīng)引起高度重視。因此，關(guān)于P53基因的這些位點(diǎn)的突變的檢測(cè)有著非常重要的作用。
[0010]眾所周知，高分辨熔解曲線(high-resolution melt, HRM)分析技術(shù)是近幾年來在國(guó)外興起的一種用于突變掃描和基因分型的最新遺傳學(xué)分析方法。它是一種高效穩(wěn)健的PCR技術(shù)，不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR (Polymerase ChainReaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨熔解，即可完成對(duì)樣品突變、單核苷酸多態(tài)性-SNP、甲基化、配型等的分析。因操作簡(jiǎn)便快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作，HRM技術(shù)受到普遍關(guān)注。而，高分辨率熔解曲線(HRM)是傳統(tǒng)的熔解曲線分析的延伸:它要求特殊的熒光染料、高性能的熒光定量PCR與專門的分析算法；使我們可以不必測(cè)序直接篩查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在遺傳學(xué)變異(SNPs，mutations)。SYBR Green I對(duì)PCR擴(kuò)增有毒性，因此必需使用低濃度的染料，又因?yàn)樗欠秋柡蛻B(tài)結(jié)合，染料在熔解過程中可重新結(jié)合，使其無法適用于HRM。
[0011]與此同時(shí)，羅氏開發(fā)了一種新的適用于HRM的染料ResoLight或LC Green,它有三個(gè)優(yōu)點(diǎn):1、飽和染料毒性低；2、濃度可以使DNA達(dá)到飽和；3、降低了染料位置重組的可能。而，PCR (Polymerase Chain Reaction)產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線HRM的要求:儀器:高分辨率高、均一性的儀器，確保結(jié)果差異僅受DNA模板的影響；試劑:穩(wěn)定可靠的PCR與HRM染料，確保獲取高分辨率熔解曲線；軟件:高分辨率熔解曲線分析專用軟件。羅氏熒光定量PCR系統(tǒng)LghtCycler Nano System具有光源好、溫控好、檢測(cè)好、加熱快的優(yōu)點(diǎn)，完全能滿足檢測(cè)的要求，這臺(tái)儀器也于近期通過了國(guó)家藥監(jiān)局的審批，適用于臨床診斷檢測(cè)。LightCycler Nano System 是` LightCycler 480System 的縮小版,LightCyc ler? 480 在HRM領(lǐng)域發(fā)表的文獻(xiàn)是當(dāng)前發(fā)表文獻(xiàn)最多的實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng):應(yīng)用領(lǐng)域包括人類疾病、植物、微生物、病毒、藥理、毒理、生理、診斷等影響因子10分以上5篇，包括Nature，NatureMethods, Nature Genetics,影響因子5 — 10分10篇，5分以上文章占總數(shù)的18%逐年上升趨勢(shì)明顯，已經(jīng)成為當(dāng)前qPCR擴(kuò)展應(yīng)用的熱點(diǎn)目前常常使用測(cè)序法來檢測(cè)是否存在突變，但是總結(jié)下來，現(xiàn)有的測(cè)序法有三個(gè)缺點(diǎn):
[0012]第一:靈敏度不高，低比例突變(< 20%)無法檢測(cè)；
[0013]第二:耗時(shí)長(zhǎng)，一般需要2-3天；
[0014]第三:成本高。
[0015]鑒于以上的問題，一種靈敏度高、耗時(shí)短、成本低、可操作性能更高的實(shí)p53基因突變的快速檢測(cè)方法的發(fā)明是勢(shì)在必行的。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0016]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題主要是:現(xiàn)有的測(cè)序法有三個(gè)缺點(diǎn):第一:靈敏度不高，低比例突變(< 20%)無法檢測(cè)；
[0017]第二:耗時(shí)長(zhǎng)，一般需要2-3天；[0018]第三:成本高。
[0019]為了解決以上問題，本發(fā)明技術(shù)在突變位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)一對(duì)野生型引物，并在突變位點(diǎn)上設(shè)計(jì)一對(duì)突變引物，兩者分別擴(kuò)增出野生型模板和突變型片段，再用野生型引物以兩個(gè)突變片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到突變型模板，PCR產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型(Tm的不同):PCR產(chǎn)物的Tm取決于GC含量.[0020]高Tm G:C>A:T>G:G>G:T=G:A > T:T=A:A>T:C>A:C>C:C 低 Tm
[0021]純合子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；當(dāng)然，包括野生型純合子或突變純合子。
[0022]雜合子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線.[0023]S卩，為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種p53基因突變的快速檢測(cè)方法，其特征在于，其包括如下實(shí)現(xiàn)步驟:
[0024]在P53基因突變位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)一對(duì)野生型引物，并在突變位點(diǎn)上設(shè)計(jì)一對(duì)突變引物；
[0025]分別擴(kuò)增出野生型模板和突變型片段，再用野生型引物以兩個(gè)突變片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到突變型模板，，擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的突變型模板；
[0026]不同比例混合野生型模板和突變型模板，用HRM方法進(jìn)行區(qū)分。
[0027]所述PCR產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR產(chǎn)物的Tm取決于GC含量.[0028]所述高Tm G:C>A:T>G:G>G:T=G:A > T:T=A:A>T:C>A:C>C:C 低 Tm。
[0029]所述純合子包括野生型純合子或突變純合子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；雜合子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線.[0030]所述不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片 段的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進(jìn)行區(qū)分。
[0031]分別設(shè)計(jì)了 p53第6號(hào)外顯子(p53_E6)和第8號(hào)外顯子(p53_E8)的野生型引物和突變型引物。
[0032]所述的一種p53基因突變的快速檢測(cè)方法，其特征在于，其包括如下步驟:樣本處理:取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存；DNA提取:取200 μ L抗凝血用QIAmp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取DNA，采用電泳凝膠成像對(duì)DNA純度和濃度作檢測(cè)；
[0033]qPCR-HRM檢測(cè)，包括:對(duì)照孔的設(shè)立和檢測(cè)重復(fù)孔；10 μ L反應(yīng)體系構(gòu)成；在八連管中依照次序加入各試劑，混合均勻；所有樣本混合完后，將八連管置于羅氏熒光定量PCR系統(tǒng)-LightCycler Nano儀器中進(jìn)行程序性檢測(cè)；結(jié)果分析及判定:在高分辨率熔解曲線分析方法中，以陽性對(duì)照孔為分界線，樣本孔與基線差異大于陽性對(duì)照孔的判定為突變型，差異小于陽性對(duì)照孔的判定為野生型。
[0034]所述qPCR-HRM檢測(cè)的程序包括:95°C變性10分鐘；95°C變性10秒鐘；退火采用探底式，設(shè)置探底退火溫度為55-65°C，每個(gè)循環(huán)降低1°C，時(shí)間為10秒鐘；72°C延伸30秒鐘；重復(fù)第2步到第四步45個(gè)循環(huán)；95°C變性60秒鐘；40°C變性60秒鐘；設(shè)置高分辨率熔解溫度從60°C到95°C，緩變率是0.050C /s)。
[0035]所述p53-E6突變型模板的獲取包括:[0036]利用帶有突變位點(diǎn)的突變引物獲得突變位點(diǎn)前后兩段突變片段；
[0037]將這兩段突變片段連接起來，構(gòu)成p53-E6突變型模板。
[0038]所述野生型模板的獲取包括:以已知未突變基因組為模板，P53-E6 F+p53_E6R為引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得條帶單一的特異性野生型模板；將目的片段稀釋至I萬-10萬倍，終濃度約為IOng/μ L，作為檢測(cè)野生型陰性對(duì)照模板用。
[0039]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明分別設(shè)計(jì)了 ρ53第6號(hào)外顯子(Ρ53-Ε6)和第8號(hào)外顯子(Ρ53-Ε8)的野生型引物和突變型引物，分別擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的野生型目的片段和突變型目的片段，不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片段的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進(jìn)行區(qū)分，采用了高分辨率熔解曲線法(HRM法)；與其它方法相比，本發(fā)明的HRM法能檢出0.1 %的突變、檢測(cè)時(shí)間只需要I小時(shí)、每樣品試劑耗材成本〈Υ7.00，即，本發(fā)明方法具有高特異性、高靈敏度與方便快捷的優(yōu)點(diǎn)；而且通量更高，單次成本更低。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0040]圖1為本發(fā)明Ρ53蛋白功能域及熱點(diǎn)突變位點(diǎn)示意圖；
[0041]圖2為用野生型引物檢測(cè)ρ53第6號(hào)外顯子(ρ53-Ε6)1/10、1/100、1/1000突變型和野生型模板的HRM圖；
[0042]圖3為用野生型引物檢測(cè)ρ53第6號(hào)外顯子(ρ53_Ε8)1/10、1/100、1/1000突變型和野生型模板的HRM圖；
【具體實(shí)施方式】:
[0043]本發(fā)明應(yīng)用于生.物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是分子生物學(xué)，分子診斷，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。
[0044]如圖1-3所不,本發(fā)明分別設(shè)計(jì)了 ρ53第6號(hào)外顯子(ρ53_Ε6)和第8號(hào)外顯子(Ρ53-Ε8)的野生型引物和突變型引物，分別擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的野生型目的片段和突變型目的片段，不同比例混合這兩種片段，使突變型目的片段的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進(jìn)行區(qū)分。下面以ρ53-Ε6為例，說明具體的操作。
[0045]1、樣本處理:取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存。
[0046]2、DNA 提取:取 200 μ L 抗凝血用 QI Amp DNA Blood Mini Kit 試劑盒提取 DNA。采用電泳凝膠成像對(duì)DNA純度和濃度作檢測(cè)。
[0047]3、qPCR-HRM 檢測(cè)的體系:
[0048]I)對(duì)照的設(shè)立和檢測(cè)重復(fù)孔
[0049]每個(gè)樣本的檢測(cè)必須同時(shí)設(shè)有對(duì)照實(shí)驗(yàn)，包括野生型陰性對(duì)照和m/w (突變/野生=1%)陽性對(duì)照。對(duì)照和樣本均采用復(fù)孔。
[0050]2) 10 μ L反應(yīng)體系構(gòu)成(引物序列見附表)
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種p53基因突變的快速檢測(cè)方法，其特征在于，其包括如下實(shí)現(xiàn)步驟: 在P53基因突變位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)一對(duì)野生型引物，并在突變位點(diǎn)上設(shè)計(jì)一對(duì)突變引物； 分別擴(kuò)增出野生型模板和突變型片段，再用野生型引物對(duì)兩種突變型片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的突變型模板； 不同比例混合野生型模板和突變型模板，用HRM方法進(jìn)行區(qū)分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述PCR產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR產(chǎn)物的Tm取決于GC含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述純合子包括野生型純合子或突變純合子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線，得到相似峰形的熔解曲線；雜合子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線，得到不同峰形的熔解曲線。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述不同比例混合這兩種模板，使突變型模板的含量為1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法進(jìn)行區(qū)分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:分別設(shè)計(jì)了p53第6號(hào)外顯子(p53-E6)和第8號(hào)外顯子(p53-E8)的野生型引物和突變型引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種P53基因突變的快速檢測(cè)方法，其特征在于，其包括如下步驟: 樣本處理:取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存； DNA提取:取200 μ L抗凝血用試劑盒提取DNA，采用電泳凝膠成像對(duì)DNA純度和濃度作檢測(cè)；` qPCR-HRM檢測(cè)，包括:對(duì)照孔的設(shè)立和檢測(cè)重復(fù)孔；10μ L反應(yīng)體系構(gòu)成；在八連管中依照次序加入各試劑，混合均勻；所有樣本混合完后，將八連管置于羅氏熒光定量PCR系統(tǒng)儀器中進(jìn)行程序性檢測(cè)； 結(jié)果分析及判定:在高分辨率熔解曲線分析方法中，以陽性對(duì)照孔為分界線，樣本孔與基線差異大于陽性對(duì)照孔的判定為突變型，差異小于陽性對(duì)照孔的判定為野生型。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述qPCR-HRM檢測(cè)的程序包括:95°C變性10分鐘；95°C變性10秒鐘；退火采用探底式，設(shè)置探底退火溫度為55-65°C，每個(gè)循環(huán)降低1°C，時(shí)間為10秒鐘；72°C延伸30秒鐘；重復(fù)第2步到第四步45個(gè)循環(huán);95°C變性60秒鐘；40°Co 變性60秒鐘；設(shè)置高分辨率熔解溫度從60°C到95°C，緩變率是0.050C /s)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述P53-E6突變型模板的獲取包括:利用帶有突變位點(diǎn)的突變引物獲得突變位點(diǎn)前后兩段突變片段；將這兩段突變片段連接起來，構(gòu)成P53-E6突變型模板。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或6任一所述的方法，其特征在于:所述野生型模板的獲取包括:以已知未突變基因組為模板，P53-E6 F+p53-E6 R為引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得條帶單一的特異性野生型模板；將野生型模板稀釋至I萬-10萬倍，終濃度約為IOng/ μ L，作為檢測(cè)野生型陰性對(duì)照模板用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103436593SQ201210335283
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月11日
【發(fā)明者】王明, 彭南求 申請(qǐng)人:上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司