專利名稱：棘皮動(dòng)物活體取樣提取dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棘皮動(dòng)物提取DNA的方法，尤其是一種棘皮動(dòng)物活體取樣 提取DNA的方法。
背景技術(shù)：
目前，動(dòng)物的DNA提取技術(shù)已在遺傳育種、實(shí)驗(yàn)研究以及生產(chǎn)檢測(cè)中普 遍應(yīng)用，基本方法是從動(dòng)物體(活體、死體)上取下部分組織樣品，將樣品在 裂解液中充分剪碎或勻漿，并使樣品組織充分消化，然后再經(jīng)過(guò)萃取、離心取 上清液、乙醇沉淀、離心分離、檢測(cè)等步驟，而其中的活體取樣更利于遺傳育 種、養(yǎng)殖狀況監(jiān)測(cè)、基因篩選、家系鑒別等研究。海洋動(dòng)物中有部分可以實(shí)現(xiàn) 活體取樣，例如魚類，可以抽血、剪鰭條等，但是，對(duì)于棘皮動(dòng)物(海膽、海 參)卻很難實(shí)現(xiàn)。由于海膽表面有殼和棘覆蓋、海參表面主要是膠原蛋白和多 糖，都很難獲取到含有基因組DNA的細(xì)胞，因而傳統(tǒng)的棘皮動(dòng)物DNA提取方 法需要將試驗(yàn)動(dòng)物殺死，而后選用齒間肌(海膽)、縱肌(海參)等組織取樣， 即在死體上取樣。這種取樣方法所獲得的遺傳信息在育種上沒有實(shí)際意義，對(duì) 棘皮動(dòng)物遺傳育種工作的開展極為不利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述問題，提供一種可以合理利用棘 皮動(dòng)物資源，進(jìn)行輔助育種、養(yǎng)殖狀況監(jiān)測(cè)、基因篩選、家系鑒別等研究工作 的棘皮動(dòng)物活體取樣提取DNA的方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是 一種棘皮動(dòng)物活體取樣提取DNA的方法，其步 驟如下
a. 取棘皮動(dòng)物活體組織至少0.01g，放入離心管中；
b. 在盛有棘皮動(dòng)物樣品組織的離心管中，加入200 pl裂解液，然后將組 織在裂解液中充分剪碎，5(TC消化45 55min，期間每隔10min振蕩搖勻一次， 所述裂解液的組分及終濃度為0.2g/l蛋白酶K， 0.5%SDS， 10Ommol/1EDTA， 0.05g/lRNA酶；
c. 在離心管中加入200TES稀釋溶液稀釋；d. 加入200 ^的Tris-飽和平衡酚和200 pi氯仿-異戊醇混合液，萃取15~30
min;
e. 7500r/min離心10min，用粗口槍頭移液器抽取上清，將上清液置入另 一離心管中；
f. 重復(fù)d、 e步驟；
g. 將萃取之后的上清夜在10000r/min離心10min，使用粗口槍頭移液器 吸取溶液，放入另一離心管中；
h. 在離心管中，加入兩倍于離心管中體積的100%的-20"€乙醇，之后放入 -2(TC中靜置至少4h;
i. 12500 r/min離心15 min，除去溶液，將離心管倒置在濾紙上，吸干剩液； j.向離心管中加入70%乙醇800 pl，洗滌一次，12500 r/min離心5 min，
倒掉溶液，室溫晾干至少30min;
k.加入0.1XTE100nl，輕輕振蕩，然后4"C溶解至少4 h;
1.用1%的瓊脂糖凝膠電泳，取2 ^ DNA模板混合2 pl上樣緩沖液在瓊脂 糖膠上點(diǎn)樣進(jìn)行檢測(cè)，電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像顯示DNA的濃度與質(zhì)量。
所述a步驟是將活海膽或活海參放在盛有海水的容器中，海水的深度剛沒 過(guò)海膽或海參，用剪刀剪取海膽管足或海參的觸手、管足，放在濾紙上吸千水 分。
為防止感染，最好在所述海水中以0.001 g/1的劑量加入青霉素。
所述a步驟是將促使活海參排出內(nèi)臟；將海參吐出的腸剖開用雙蒸水沖洗
干凈，然后將洗凈的海參腸放在濾紙上吸干水分。
所述的促使活海參排出內(nèi)臟是向海參體內(nèi)注射淡水或注射0.35 mo1/1的
KC1 2~4ml。
所述f步驟后觀察中間層和下層，如有中間層或下層顏色深，加入400^iL 氯仿-異戊醇再萃取一次。
本發(fā)明可無(wú)需將棘皮動(dòng)物殺死，而是在活體上取樣，繼而提取DNA，使分 子生物學(xué)技術(shù)能真正成為遺傳育種的輔助工具。利用本發(fā)明，可以合理利用棘 皮動(dòng)物資源，進(jìn)行輔助育種、養(yǎng)殖狀況監(jiān)測(cè)、基因篩選、家系鑒別等工作。另 外，對(duì)于棘皮動(dòng)物中很多瀕危種的保護(hù)和研究，意義也十分重大。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 : a. 將活海膽放在盛有少量海水的容器中，海水的深度以剛沒過(guò)海膽為宜， 這樣，可讓海膽管足在水中呈放射狀向外伸出，方便取樣；用剪刀剪取少量海 膽管足(根據(jù)實(shí)際情況大約能夠獲得約l 3mm長(zhǎng)的管足不等)，放在濾紙上吸 干水分；稱量所取海膽管足質(zhì)量，取樣量最少不得少于0.01g，放入1.5 ml離 心管中；
b. 在盛有海膽管足的離心管中，加入200 pl裂解液，然后將管足在裂解 液中充分剪碎或勻漿，5(TC消化45 55min，期間每隔10 min振蕩搖勻一次， 以保證樣品組織充分消化;所述裂解液的組分及終濃度為0.2g/l蛋白酶K， 0.5% SDS， 100 mmol/1 EDTA， 0.05g/lRNA酶；因?yàn)榛铙w棘皮動(dòng)物的DNA中RNA 的含量較多，裂解液中加入RNA酶可降解掉多余的RNA;
c. 由于活體海膽管足消化后的溶液過(guò)于粘稠，在萃取時(shí)無(wú)法順利進(jìn)行水相 轉(zhuǎn)移，因此必須在萃取之前在離心管中加入200 ^tl TES稀釋溶液稀釋；
d. 加入200 ^的Tris-飽和平衡酚和200 pl氯仿-異戊醇混合液(24: 1 )， 萃取15 30min;
e. 7500 r/min離心10 min，用粗口槍頭移液器抽取上清，將上清液置入另 一離心管中；粗口槍頭移液器是將20(Hil移液器的槍頭前端切掉至少lcm，避 免使用普通細(xì)口槍頭所存在的不易抽提且會(huì)使DNA鏈發(fā)生斷裂的現(xiàn)象；
f. 重復(fù)d、 e步驟；
g. 將d、 e步驟萃取之后的上清夜合并，在10000 r/min離心10 min,將海 膽管足中含有的骨片沉淀于離心管底部，使用粗口槍頭移液器慢慢從上至下小 心吸取溶液，放入新的離心管中，即棄去骨片，防止骨片影響所提取DNA的 質(zhì)量；
h. 在離心管中，加入兩倍于離心管中體積的100。/。的-2(TC預(yù)先冷卻乙醇， 之后放入-2(TC冰箱中靜置至少4 h;
i. 12500 r/min離心15 min，除去溶液，基因組DNA會(huì)留在離心管中，將 離心管倒置在濾紙上，吸干剩液；
j.向離心管中加入70%乙醇800 pl，洗滌一次，12500 r/min離心5 min， 倒掉溶液，室溫晾干至少30min;
k.加入0.1XTE100nl，輕輕振蕩，然后放入4-C冰箱中溶解至少4 h;
1.用1%的瓊脂糖凝膠電泳，取2 DNA模板混合2 ^上樣緩沖液在瓊脂 糖膠上點(diǎn)樣進(jìn)行檢測(cè)。分光光度計(jì)測(cè)量DNA的濃度(260 nm)， 260/280 nm
的光密度比值在1.8以上，則可以滿足正常實(shí)驗(yàn)要求。
電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像顯示本發(fā)明實(shí)施例DNA的濃度與質(zhì)量，與棘皮動(dòng)物 傳統(tǒng)的(死體)取樣組織提取的DNA—致。
實(shí)施例2:
a.將活海參放在盛有少量海水的容器中，海水的深度以剛沒過(guò)海參為宜， 用剪刀剪取海參的觸手1~3條(根據(jù)海參的大小)或管足少許，放在濾紙上吸 干水分備用；稱量所取海參管足或觸手質(zhì)量，取樣量最少不得少于0.01g，放入 1.5ml離心管中；為防止海參因觸手或管足受傷而感染，以0.001 g/L的劑量在 海水中加入青霉素消炎；
按實(shí)施例1的b~l步驟提取DNA。
電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像顯示本發(fā)明實(shí)施例DNA的濃度與質(zhì)量，與棘皮動(dòng)物 傳統(tǒng)的(死體)取樣組織提取的DNA—致。 實(shí)施例3:
a.向海參體內(nèi)注射淡水而刺激海參，在注射的同時(shí)海參就會(huì)發(fā)生排臟現(xiàn) 象，也可注射0.35 mol/L的KC1 2~4 mL， 1~2 min后排出內(nèi)臟；將海參吐出的 腸剖開用雙蒸水沖洗干凈，然后將洗凈的海參腸放在濾紙上吸干水分；稱量所 取海參腸質(zhì)量，取樣量最少不得少于0.01g，放入1.5ml離心管中；
按b f步驟操作；
f步驟后觀察中間層和下層，如有中間層或下層顏色深(不澄清)，加入400 kil氯仿-異戊醇(24: 1)再萃取一次。 再按g l步驟操作，提取DNA。
電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像顯示本發(fā)明實(shí)施例DNA的濃度與質(zhì)量，與棘皮動(dòng)物 傳統(tǒng)的(死體)取樣組織提取的DNA—致。
權(quán)利要求
1.一種棘皮動(dòng)物活體取樣提取DNA的方法，其步驟如下a.取棘皮動(dòng)物活體組織至少0.01g，放入離心管中；b.在盛有棘皮動(dòng)物樣品組織的離心管中，加入200μl裂解液，然后將組織在裂解液中充分剪碎，50℃消化45～55min，期間每隔10min振蕩搖勻一次，所述裂解液的組分及終濃度為0.2g/l蛋白酶K，0.5％SDS，100mmol/l EDTA，0.05g/lRNA酶；c.在離心管中加入200μl TES稀釋溶液稀釋；d.加入200μl的Tris-飽和平衡酚和200μl氯仿-異戊醇混合液，萃取15～30min；e.7500r/min離心10min，用粗口槍頭移液器抽取上清，將上清液置入另一離心管中；f.重復(fù)d、e步驟；g.將萃取之后的上清夜在10000r/min離心10min，使用粗口槍頭移液器吸取溶液，放入另一離心管中；h.在離心管中，加入兩倍于離心管中體積的100％的-20℃乙醇，之后放入-20℃中靜置至少4h；i.12500r/min離心15min，除去溶液，將離心管倒置在濾紙上，吸干剩液；j.向離心管中加入70％乙醇800μl，洗滌一次，12500r/min離心5min，倒掉溶液，室溫晾干至少30min；k.加入0.1×TE 100μl，輕輕振蕩，然后4℃溶解至少4h；l.用1％的瓊脂糖凝膠電泳，取2μl DNA模板混合2μl上樣緩沖液在瓊脂糖膠上點(diǎn)樣進(jìn)行檢測(cè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的棘皮動(dòng)物活體取樣提取DNA的方法，其特征在于: 所述a步驟是將活海膽或活海參放在盛有海水的容器中，海水的深度剛沒過(guò)海 膽或海參，用剪刀剪取海膽管足或海參的觸手、管足，放在濾紙上吸干水分。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的棘皮動(dòng)物活體取樣提取DNA的方法，其特征在于: 在所述海水中以0.001 g/1的劑量加入青霉素。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的棘皮動(dòng)物活體取樣提取DNA的方法，其特征在于: 所述a步驟是促使活海參排出內(nèi)臟；將海參吐出的腸剖開用雙蒸水沖洗干凈， 然后將洗凈的海參腸放在濾紙上吸干水分。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的棘皮動(dòng)物活體取樣提取DNA的方法，其特征在于 所述的促使活海參排出內(nèi)臟是向海參體內(nèi)注射淡水或注射0.35 mol/l的KCl 2~4 ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的棘皮動(dòng)物活體取樣提取DNA 的方法，其特征在于所述f步驟后觀察中間層和下層，如有中間層或下層顏 色深，加入400pl氯仿-異戊醇再萃取一次。
全文摘要
本發(fā)明公開一種棘皮動(dòng)物活體取樣提取DNA的方法，是取活體海膽的管足或取活體海參的管足、觸手或腸，用加有DNA酶的裂解液裂解消化，經(jīng)過(guò)萃取、離心取上清液、離心除渣(骨片)、乙醇沉淀、離心分離、檢測(cè)等步驟，使所提取的DNA的濃度與質(zhì)量，與棘皮動(dòng)物傳統(tǒng)的(死體)取樣組織提取的DNA一致。無(wú)需將棘皮動(dòng)物殺死，而是在活體上取樣，繼而提取DNA，使分子生物學(xué)技術(shù)能真正成為遺傳育種的輔助工具。利用本發(fā)明，可以合理利用棘皮動(dòng)物資源，進(jìn)行輔助育種、養(yǎng)殖狀況監(jiān)測(cè)、基因篩選、家系鑒別等工作。另外，對(duì)于棘皮動(dòng)物中很多瀕危種的保護(hù)和研究，意義也十分重大。
文檔編號(hào)C12P19/34GK101168760SQ200710157999
公開日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2007年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月8日
發(fā)明者君 丁, 于佳平, 馮志綱, 常亞青, 燚 田 申請(qǐng)人:大連水產(chǎn)學(xué)院