專利名稱：一種基于腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物8的人源抗體樣分子TEM8-Fc及其在腫瘤治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物8(TEM8)的人源抗體樣分子TEM8-Fc及 其在腫瘤治療中的應(yīng)用，屬于生物制藥領(lǐng)域。
技術(shù)背景血管生成和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是所有晚期惡性實(shí)體瘤發(fā)生和發(fā)展的必然發(fā)生的過程。 與血管生成和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子自然成為研制腫瘤治療藥物的理想耙標(biāo)，研制 拮抗或阻斷血管生成和腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移通路的藥物，應(yīng)具有廣譜抗腫瘤的活性。血管生長(zhǎng)調(diào)節(jié)失控是腫瘤惡性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的主要促進(jìn)因素。因此，抑制腫瘤血管 生長(zhǎng)，即"餓死腫瘤"的抗腫瘤策略己經(jīng)引起了腫瘤研究者和臨床醫(yī)生的極大興趣和 廣泛關(guān)注。從理論上講，這種抗腫瘤策略具有以下多方面優(yōu)勢(shì)①大部分實(shí)體瘤的惡 性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移均需要充足的血液供應(yīng)，因此抑制血管生長(zhǎng)具有廣譜抗腫瘤特性；②與 常規(guī)的抗腫瘤方法不同，抑制腫瘤血管生長(zhǎng)針對(duì)的是基因型相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)皮細(xì)胞，因此在一定程度上避免了腫瘤耐藥性的產(chǎn)生；③靜脈輸注的抗腫瘤血管生長(zhǎng)藥物能迅速到達(dá)并作用于腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞，這樣就避免了常規(guī)抗腫瘤藥物所面臨的藥代動(dòng)力學(xué)問題； 每個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞都支持一定數(shù)量的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖 也將間接的抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，即所謂的"旁觀者效應(yīng)"。目前已經(jīng)針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體(VEGFR)開發(fā)了多種抗腫瘤藥物，尤其是封閉VEGF 的單抗Avastin，在臨床上已得到了廣泛應(yīng)用，這在實(shí)際上證實(shí)了抑制血管生長(zhǎng)抗腫 瘤策略的有效性。目前抑制血管生長(zhǎng)類藥物所作用的靶點(diǎn)雖然在腫瘤組織有更為豐富的表達(dá)，但并 非在腫瘤血管內(nèi)皮特異性的表達(dá)。這在一定程度上限制了這類藥物的臨床應(yīng)用。因此， 要完全發(fā)揮抑制血管生長(zhǎng)抗腫瘤策略的潛能，需要探索并發(fā)現(xiàn)腫瘤血管內(nèi)皮特異性表 達(dá)的分子標(biāo)志物。幸運(yùn)的是，最近的一項(xiàng)研究通過比較正常組織與腫瘤組織中血管內(nèi) 皮細(xì)胞基因表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)了一類在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞有較高特異性表達(dá)的分子標(biāo) 志物。這類標(biāo)志物被命名為腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(tumor endothelial markers， TEMs)。 有意義的是，在九種該類分子標(biāo)志物中，有多種屬于細(xì)胞膜蛋白，分子結(jié)構(gòu)有明顯的 受體樣特征。從進(jìn)化上看，這類分子有很高的保守性。由于TEMs特異性表達(dá)于腫瘤
細(xì)胞和胚胎發(fā)育期的某些組織和細(xì)胞，正常細(xì)胞表達(dá)水平極少甚至不表達(dá)，有些TEMs 即便在傷口修復(fù)時(shí)也不表達(dá)，而表達(dá)VEGF,因此，可以推測(cè)，以TEMs為靶標(biāo)開發(fā)的 抑制腫瘤血管形成的藥物其特異性可能要高于VEGF靶標(biāo)，而藥物的副作用可能較小。 高度保守性、腫瘤表達(dá)特異性和受體樣特征三大特性決定了該類分子可能是開發(fā)抗體 類藥物，抑制血管生長(zhǎng)和治療腫瘤的極為理想的耙標(biāo)。目前國(guó)內(nèi)外還沒有研制TEM8-Fc融合蛋白用于腫瘤治療的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種安全、有效的基于TEM8的人源抗體類人 工蛋白TEM8-Fc融合蛋白。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供TEM8-Fc融合蛋白和表達(dá)該融合蛋白的 CHO細(xì)胞系在制備治療癌癥的藥物中的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物8的人源抗體樣分子(TEM8-Fc)融合蛋白，是腫瘤內(nèi) 皮細(xì)胞標(biāo)志物8 (TEM8)胞外區(qū)第1-227位氨基酸與人免疫球蛋白IgGl的Fc段(鉸 鏈區(qū)(Hinge region)、重鏈恒定區(qū)2(CH2)和重鏈恒定區(qū)3 (CH3)連接形成的二聚體 融合蛋白；單鏈TEM8-Fc分子具有序列表SEQ IDNo.l所示的氨基酸序列，共459 個(gè)氨基酸殘基；其中前27個(gè)氨基酸為ATR的信號(hào)肽；成熟的單鏈ATR-Fc有432個(gè) 氨基酸殘基，二聚體為864個(gè)氨基酸殘基。序列表SEQ ID No.l所示的氨基酸序列與中國(guó)專利200510084233. 5中的炭疽毒 素受體ATR-Fc融合蛋白相同。編碼上述腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物8的人源抗體樣分子融合蛋白單鏈的基因。 所述的單鏈的基因，具有序列表SEQIDNo.2所示的堿基序列。 含有編碼腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物8的人源抗體樣分子融合蛋白的基因的表達(dá)載體。 該載體為真核表達(dá)載體。含有所述的表達(dá)載體的細(xì)胞系。所述細(xì)胞為CHO細(xì)胞。 TEM8-Fc融合蛋白用于制備治療腫瘤的藥物的用途。 所述腫瘤為乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌及其他腫瘤。所述治療是指抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤組織內(nèi)血管生成和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞 的表型。TEM8-Fc基因工程融合蛋白，是根據(jù)中國(guó)專利200510084233. 5所述的技術(shù)方法，
將表達(dá)TEM8-Fc融合蛋白的基因，通過脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染至CHO-Kl細(xì)胞中，用G418篩選 并獲得TEM8-Fc表達(dá)水平為10-15叫/(106cells.d)的基因工程CHO細(xì)胞系A(chǔ)TR-Fc-1D5 (已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 1399，保存的細(xì)胞株名稱為ATR-Fc融合蛋白CHO工程細(xì)胞株，地址北京市海淀區(qū) 中關(guān)村北一條13號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100080;電話010-62542758;傳 真010-62537796 ; 電子郵件cgmcc@sun. im.ac.cn)。根據(jù)中國(guó)專利ZL 200310124257. X (胡顯文等，動(dòng)物細(xì)胞多孔微載體固定化高效培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)基， 中國(guó)專利ZL 200310124257. X)所述培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基，無(wú)血清培養(yǎng)ATR-Fc-1D5基因 工程CHO細(xì)胞(rCHO)，采用蛋白A親和層析方法純化重組蛋白(中國(guó)專利 200510084233. 5)。本發(fā)明基于腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物_一TEM8，開發(fā)了一種完全人源化的抗體樣分子 TEM8-Fc，初步的研究結(jié)果表明，該抗體對(duì)移植到裸鼠的多種組織來源的人體腫瘤有 超過90%的抑制率，顯示出了很好的廣譜抗腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的特性。本發(fā)明的基因重組TEM8-Fc融合蛋白用于制備治療腫瘤的藥物的應(yīng)用。用ELISA 法首次發(fā)現(xiàn)，TEM8的天然配體是uPA(尿激酶型纖溶酶原激活劑)，而很多研究表明， 幾乎所有的惡性腫瘤，尤其是晚期，其腫瘤細(xì)胞膜上都過量表達(dá)uPA及其受體(uPAR)， uPA在結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和肺癌等多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中 起著關(guān)鍵作用，參與了腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和轉(zhuǎn)移。鑒定TEM8-Fc與uPA的親和性， 提供了解釋TEM8-Fc抑制腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，即TEM8-Fc可以在體內(nèi)捕 獲uPA，從而阻止uPA與細(xì)胞膜上的TEM8結(jié)合，阻斷了 TEM8介導(dǎo)的與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、 遷移等有關(guān)的信號(hào)通路。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)TEM8-Fc可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì) 胞和肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，該融合蛋白值得進(jìn)一步研究并開發(fā)成治療乳腺癌、結(jié)腸 癌、肝癌及其他uPA或TEM8過度表達(dá)的腫瘤的抗體類藥物。選擇腫瘤血管生成做為腫瘤治療的靶標(biāo)，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)副作用小， 一般 成人正常組織極少發(fā)生血管生成，因此拮抗血管生成不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副作用；(2) 特異性高，由于腫瘤細(xì)胞的遺傳的不穩(wěn)定性，其膜表面的特異性標(biāo)志物的表達(dá)模式會(huì) 有很大差別，例如，即便都是乳腺癌，過度表達(dá)EGFR II的患者比例只有不到30%， 因此治療晚期乳腺癌的一線用藥抗-EGFRII的人源化抗體Herc印tin (赫塞汀)需要 篩選病人后使用才有效，而腫瘤的血管生成幾乎在所有實(shí)體瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程中都發(fā) 揮作用，并且不存在變異問題，因此抗血管生成治療的特異性較高；(3)適應(yīng)癥寬，
將來的市場(chǎng)大?？鼓[瘤血管生成，不僅局限于一種類型的癌癥，在許多實(shí)體瘤的治療 中可能都有效，適應(yīng)癥寬。實(shí)際上，2004年FDA批準(zhǔn)的用于治療結(jié)直腸癌的抗VEGF 的人源化抗體Avastin (阿瓦斯汀)，2005年上半年已完成了與化療藥物聯(lián)合使用用 于非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌治療的III期臨床試驗(yàn)，取得了較好的臨床療效，有望近期 獲得R)A批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌的治療。(4)靜脈輸注的抗腫瘤血管生長(zhǎng) 藥物能迅速到達(dá)并作用于腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞，這樣就避免了常規(guī)抗腫瘤藥物所 面臨的藥代動(dòng)力學(xué)問題。(5)臨床證明，腫瘤的抗血管生成治療的確具有很好的療 效和廣譜抗腫瘤的特性。此外，由于TEM8特異性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，因此使用TEM8-Fc 作為干擾TEM8與其他蛋白之間的相互作用，抗腫瘤作用更特異，不會(huì)損傷正常組織。下面結(jié)合附圖和較佳實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，以使公眾對(duì)發(fā)明內(nèi)容有整 體和充分的了解，而并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。前述部分己經(jīng)充分公開了本發(fā)明 可以實(shí)施的保護(hù)范圍，因此凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容進(jìn)行的任何本領(lǐng)域公知的等同替 換，均屬于對(duì)本發(fā)明的侵犯。


圖1為TEM8-Fc的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2 (a)為SDS-PAGE檢測(cè)純化的糖基化TEM8-Fc融合蛋白。 圖2 (b)為SDS-PAGE檢測(cè)純化的去除糖鏈的TEM8-Fc融合蛋白。 圖3為ELISA檢測(cè)TEM8-Fc與uPA特異性結(jié)合。圖4 (a)為用流式細(xì)胞儀分析肝癌細(xì)胞H印G2的表面過度表達(dá)TEM8。圖4 (b)為TEM8-Fc體外抑制LMW-UK誘導(dǎo)的H印G2細(xì)胞的遷移。圖5 (a)和圖5 (b)為TEM8-Fc對(duì)裸鼠接種結(jié)直腸癌細(xì)胞LS180抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用結(jié)果(體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng))。圖6 (a)和圖6 (b)為TEM8-Fc對(duì)裸鼠接種乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用結(jié)果(體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng))。圖7為在MCF-7乳腺癌裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)中，TEM8-Fc融合蛋白對(duì)腫瘤組織內(nèi)抑制血管生成作用的結(jié)果。圖8為在LS180結(jié)直腸癌裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)中，TEM8-Fc融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為正常表型的結(jié)果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l.SDS-PAGE分析基因重組產(chǎn)物 按中國(guó)專利200510084233. 5所述方法，在rCH0細(xì)胞中表達(dá)基因重組TEM8-Fc融 合蛋白，并且用無(wú)血清培養(yǎng)基(中國(guó)專利ZL 200310124257. X)培養(yǎng)rCH0細(xì)胞，用 nProtein A Sepharose 4 Fast Flow親禾口柱(Amersham Biosciences)純化細(xì)胞培 養(yǎng)上清中的TEM8-Fc。 TEM8-Fc融合蛋白的分子結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。如果TEM8-Fc 能夠在CHO細(xì)胞中正確表達(dá)，表達(dá)的蛋白預(yù)計(jì)應(yīng)是同源二聚體抗體樣分子，即TEM8-Fc 單鏈在鉸鏈區(qū)通過鏈間二硫鍵連接成二聚體(圖l)。單鏈TEM8-Fc分子共有459個(gè) 氨基酸殘基，其中前27個(gè)氨基酸為TEM8的信號(hào)肽，胞外分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中時(shí)被 切除，所以實(shí)際的單鏈TEM8-Fc有432aa， 二聚體為864aa。由于TEM8和Fc段都有 糖基化位點(diǎn)，因此單鏈TEM8-Fc的分子量預(yù)期在60-65kD。親和層析純化得到的 TEM8-Fc融合蛋白，分別在還原和非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE分析(濃縮膠濃度為 5%,分離膠濃度為10%)，考馬斯亮藍(lán)染色。在非還原條件下，在120-130kD處有一 條蛋白帶，而在還原條件下，在60-65kD處有一條明顯的蛋白帶，并且沒有其他的蛋 白帶(圖2 (a))。由于還原條件下所有二硫鍵包括鏈間二硫鍵都被打斷，測(cè)得的 分子量為單鏈TEM8-Fc分子，而非還原條件下不同肽鏈仍通過二硫鍵連接，在非還原 條件下的分子量正好是還原條件下分子量的兩倍，表明我們獲得的TEM8-Fc融合蛋白 為同源二聚體抗體樣分子，與預(yù)期的結(jié)果相符。將20 u g TEM8-Fc用20 u 1變性緩沖液(O. 5% SDS, 1% 2-巰基乙醇)在100° C 條件下煮沸10分鐘變性，然后加入2y 1 IOX反應(yīng)緩沖液(500mM磷酸鈉，pH 7. 5, 10% NP-40)和200活性單位的糖苷酶PNGase F (Sigma)。在37° C條件下孵育1 小吋，去除TEM8-Fc分子屮的N-糖鏈。在還原條件下用SDS-PAGE(分離膠的濃度為 12%)分析。結(jié)果表明，去糖基化的TEM8-Fc單鏈分子的分子量約為50kD (圖2 (b)), 與理論值一致，表明我們得到的基因重組TEM8-Fc融合蛋白是同源二聚體的糖蛋白。實(shí)施例2. ELISA證實(shí)TEM8與uPA或tPA的特異性結(jié)合以基因重組尿激酶原(Pro-UK，來源HuXianwen, Xiao Chengzu， Li Zuohu. Pilot production of u—PA with porous microcarrier cell culture. Cytotechnology. 2000. 33(1 3): 13-19)、基因重組低分子量尿激酶(LMW-UK，中國(guó)專利低分子 量尿激酶突變體及其表達(dá)載體，申請(qǐng)?zhí)?00610065813.4,
發(fā)明者段海峰, 胡顯文, 郗永義, 陳惠鵬, 陳金龍, 高麗華 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所