專利名稱：基于線粒體dna g709a單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)高原肺水腫易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病檢測(cè)用的試劑盒，具體涉及基于線粒體DNA G709A單 核苷酸多態(tài)性檢測(cè)高原肺水腫易感性的試劑盒.
背景技術(shù)：
高原肺水腫(high altitude pulmonary edema, HAPE) ;1—種特發(fā)于高原1氐 氧環(huán)境的肺水胂，起病急，逸艮快，危害大，如果救治不及時(shí)，可在較短的時(shí) 間內(nèi)發(fā)展至呼吸衰竭，甚至死亡，是嚴(yán)重威脅i^v高原人群健康和生命的急性 重癥高原病.近年的調(diào)查表明，在ii^海拔3700 m高原的人群中，高原肺水腫 的發(fā)病率高達(dá)0.454-2%. HAPE發(fā)病的種族特異性以及家族和個(gè)體易感傾向提示， 環(huán)境因素和遺傳因素均可影響HAPE的發(fā)生，而機(jī)體對(duì)環(huán)境因素的易感性也受遺 傳因素的影響.近年來(lái)，遺傳因素在HAPE發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸受到重視張 雪峰，高原施工A^急性重型高原病患病率調(diào)查，《高原醫(yī)學(xué)雜志》，2005; 15 (3): 7-8;陳有，高原肺水腫發(fā)病機(jī)制研究*，《高原醫(yī)學(xué)雜志》，2005， 15 (2 ): 62-64;高鈺琪，高原肺水腫的發(fā)病機(jī)制及防治，《人民軍醫(yī)》，2005; 482 (2): 108-111，
由于線粒體是動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)唯一含有DNA和蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的細(xì)胞器，是氧 傳送鏈的生理終點(diǎn)站，是細(xì)胞氧耗的主要位點(diǎn)，是一個(gè)細(xì)胞氧易感性和適應(yīng)的 自然選擇者，因此關(guān)于線粒體適應(yīng)的研究逐漸成為熱點(diǎn)高文祥，低氧大鼠腦線粒體體外轉(zhuǎn)錄活性的研究，《中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志》，2001; 17: 323-326。 HAPE是一種低氧習(xí)服不良的急性高原病，因而線粒體在HAPE的發(fā)生中發(fā)生著 重要的作用Moudgil R， Hypoxic pulmonary vasoconstriction. 《J Appl Physiol》，2005; 98: 390-403。單核苦酸多態(tài)性(SNP)，是廣泛分布于人類 全基因組中穩(wěn)定的多態(tài)位點(diǎn)，代表了不同個(gè)體之間最大的遺傳差異.隨著人類 基因組計(jì)劃的*，人們愈來(lái)愈相信基因組中的這類多態(tài)性有助于解釋個(gè)體的
表型差異、不同群體和個(gè)體對(duì)疾病，特別是對(duì)復(fù)雜疾病的易感性、以;sj t各種
藥物的耐受性和對(duì)環(huán)境因子的反應(yīng)，
LDR (連接酶檢測(cè)反應(yīng))是一種經(jīng)濟(jì)、快速的檢測(cè)SNP常用的方法，其檢測(cè) 原理是利用高溫連接酶實(shí)現(xiàn)對(duì)基因多態(tài)性位點(diǎn)的識(shí)別，高溫連接酶一M測(cè)到 DNA與互補(bǔ)的兩條寡聚核苷酸接頭對(duì)應(yīng)處存在著基因點(diǎn)突變類型的4^錯(cuò)配，則 連接反應(yīng)就不能進(jìn)行.測(cè)序分型原理如下
(1) 本技術(shù)方案先通過(guò)PCR(聚合Sm反應(yīng))獲得含有待檢測(cè)突變位點(diǎn)的基 因片斷，然后進(jìn)行LDR，最后通過(guò)測(cè)序儀電泳讀取檢測(cè)結(jié)果；
(2) 檢測(cè)結(jié)果表明，左邊位點(diǎn)，即突變位點(diǎn)一為A/C雜合子，右邊位點(diǎn)，即 突變位點(diǎn)二為T純合子(見(jiàn)圖l).
LDR與傳統(tǒng)的SNP分型手段相比，LDR技術(shù)有多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)
(1) 準(zhǔn)確度高與PCR等技術(shù)的假陰性假陽(yáng)性相比，LDR技術(shù)可以比較準(zhǔn)確的 對(duì)SNP進(jìn)行分型；
(2) 操作簡(jiǎn)單和目前的PCR技術(shù)相似，LDR反應(yīng)操作簡(jiǎn)單，對(duì)技術(shù)人員沒(méi)有 特殊的專業(yè)要求；
(3) 成本低:使用LDR檢測(cè)系統(tǒng)只需現(xiàn)有的PCR儀等分子實(shí)驗(yàn)室儀器即可，無(wú)需再投入大量的資金購(gòu)置設(shè)備；
(4) 通用性強(qiáng)成熟的LDR檢測(cè)系統(tǒng)適用于各種SNP位點(diǎn)的分型；
(5) 高通量:LDR檢測(cè)系統(tǒng)可同時(shí)對(duì)多ili百個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，檢測(cè)效率 高，滿足復(fù)雜疾病及藥物基因組學(xué)的診斷需求，

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于線粒體DNA G709A單核苷酸多態(tài)'j4^r測(cè)高原 肺水腫易感性的試劑盒，能用于高原肺水腫(簡(jiǎn)稱HAPE)易感者的篩選，指導(dǎo) HAPE的預(yù)防.
發(fā)明人根據(jù)LDR的檢測(cè)原理，對(duì)206例漢族HAPE患者和144例漢族^ft^t 照的線粒體DNA (mtDNA)的709位點(diǎn)SNP進(jìn)行對(duì)比分析，探討mtDNA G709A 與HAPE的相關(guān)性，尋找出了敏感可信的HAPE易感生物遺傳標(biāo)記，步驟是先通 i±Xt 26例漢族無(wú)關(guān)個(gè)體的mtDNA的全長(zhǎng)擴(kuò)增，測(cè)序，初步提示mtDM的709 SNP 位點(diǎn)為漢;^AmtDM的高頻位點(diǎn).然后利用mtDNA的10398位點(diǎn)多態(tài)性，通過(guò) RFLP(限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性)將所有標(biāo)本分為單倍群M和N。再通過(guò)PCR(聚 合Sl^Jl應(yīng))-LDR反應(yīng)在單倍群M和N中檢測(cè)mtDNA G709A單核苦酸多態(tài)性， 在單倍群N中，709A在HAPE病例組頻率為23. 5%，在對(duì)照組中的頻率為6. 9X (P-0. 004 ).結(jié)論在單倍群N中，709A是HAPE發(fā)病的危險(xiǎn)因素?？梢宰鳛?HAPE的遺傳標(biāo)志之一。因此，基于該SNP位點(diǎn)，可以設(shè)計(jì)適當(dāng)長(zhǎng)度的引物與探 針，用于PCR-LDR檢測(cè)高原肺水腫的易感性.
本發(fā)明所述的基于線粒體DM G709A單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)高原肺水腫易 感性的試劑盒，其特征是該試劑盒包括以下分離包裝的試劑
試劑一，引物混合液，序列如下上游引物HP4-F: 5， -ATAGGTTTGGTCCTAGCCTTTCTATTAGCT-3，； 下游引物HP4-R: 5， -CTGCGTGCTTGATGCTTGTTCCTTTTGATC-3，； 試劑二， PCR反應(yīng)混合液；
試劑三，線粒體DNA 709位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性G對(duì)照DNA; 試劑四，線粒體DNA 709位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性A對(duì)照DNA; 試劑五，探針混合液，三種探針序列如下
① P4-F: 5， -GATGCTTGCATGTGTAATCTTATTTTTTTTTTTTTTTT-3，，為熒光 物FAM標(biāo)記；
② P4 - Dl:線粒體DNA的709位點(diǎn)為單核苷酸多態(tài)性G:
5' 一 TTTTTTTTTTTTTTTTATTTAGAGGGTGAACTCACTGGAAC -3，；
③ P4 - D2:線粒體DNA的709位點(diǎn)為單核苷酸多態(tài)性A:
5， _TTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTTAGAGGGTGAACTCACTGGAAT -3，； 試劑六，連接反應(yīng)混合液； 試劑七，電泳混合、液.
所述的基于線粒體DNA G709A單核苷酸多態(tài)',測(cè)高原肺水腫易感性的試 劑盒，其特征是
試劑一，引物混合液100[il;上游引物和下游引物各50pl混合，濃度均 為10pmo1/ n1;
試劑二， PCR反應(yīng)》^液1000 p 1;成分有1 x PCR buffer, 2. 0 mMMgCh， 200 mM dNTPs， 1 U Taq酶，余量為蒸餾水；
試劑三，線粒體DNA的709位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性G對(duì)照DM 50 p 1,濃度為 50ng/ p 1;試劑四，線粒體DNA的709位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性A對(duì)照DNA 50 p 1,濃度為 50ng/p 1;
試劑五，探針混合液120 m 1,三種探針各40 n 1混合，該三種探針濃度均 為12. 5pmol/ul;
試劑六，連接反應(yīng)混合液100pl;成分有pH7. 6的20mMTris-HCl， 25 mM
醋酸鉀，lOmM醋酸鎂，10 mM 二硫蘇糖醇，ImM氧化型輔酶I ， 0.1% Triton X-IOO， 0. 5 pi Taq DM連接酶，余量為蒸餾水；
試劑七，電泳混合液100 ji 1;熒光物質(zhì)1 x ROX和上樣緩沖液6 x loading buffer各為50 m 1,
本發(fā)明能用于平原Ait^高原前對(duì)高原肺水腫易感者的篩選，指導(dǎo)HAPE的 預(yù)防和治療，減輕急性重癥高原病的威脅，有利于進(jìn)入高原人群健康；該試劑 盒使用簡(jiǎn)單，操作方便，檢測(cè)快速.


圖l LDR分型原理.
圖2線粒體DM 709位點(diǎn)為單核苷酸多態(tài)性G。 圖3線粒體DM 709位點(diǎn)為單核苷酸多態(tài)性A。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所述的基于線粒體DM G709A單核苷酸多態(tài)'l^測(cè)高原肺水腫易感 性的試劑盒，包括以下分離包裝的試劑
試劑一，引物混合液100nl;上游引物和下游引物各50ul混合，濃度均
為10pmo1/ p 1，序列如下
上游引物HP4-F: 5， -ATAGGTTTGGTCCTAGCCTTTCTATTAGCT-3';下游引物HP4-R: 5， -CTGCGTGCTTGATGCTTGTTCCTTTTGATC-3，； 試劑二， PCR ^L混合液1000 ji 1;成分有1 x PCR buffer, 2. 0 mMMgCl2， 200
mM dNTPs， 1 U Taq酶，余量為蒸餾水；
試劑三，線粒體DM的709位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性G對(duì)照DNA 50 p 1,濃度為
50ng"l;
試劑四，線粒體DNA的709位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性A對(duì)照DNA 50 u 1，濃度為 50ng/M 1;
試劑五，探針混合液120Ml;三種探針各40nl混合，該三種探針濃度均 為12. 5pmol/ul ，探針序列如下
① P4 - F:
5， -GATGCTTGCATGTGTAATCTTATTTTTTTTTTTTTTTT-3，，為熒光物FAM標(biāo)記；
② P4 - Dl:線粒體DM的709位點(diǎn)為單核苷酸多態(tài)性G: 5， 一 TTTTTTTTTTTTTTTTATTTAGAGGGTGAACTCACTGGAAC -3，；
③ P4 - D2:線粒體DNA的709位點(diǎn)為單核苷酸多態(tài)性A: 5， -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTTAGAGGGTGAACTCACTGGAAT -3，；
試劑六，連接反應(yīng)混合液100n 1;成分有pH7.6的20mMTris-HCl， 25mM 醋酸鉀，10mM醋酸鎂，10 mM 二硫蘇糖醇，lmM氧化型輔酶1, 0.1% Triton X-100, 0. 5 nl Taq MA連接酶，余量為蒸餾水；
試劑七，電泳混合液100 m 1;熒光物質(zhì)1 x rox和上樣緩沖液6 x loading buffer各為50 p 1,
該試劑盒的所有試劑和耗材均能在上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司，寶生 物工程(大連)有限公司等國(guó)內(nèi)試劑公司購(gòu)買到，引物與探針也可按照以上序列在上述生物公司合成。
該試劑盒的使用說(shuō)明
第一步，采用上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司uniq-10柱式臨床樣品基因 組抽提試劑盒(貨號(hào)SK1342 )提取待測(cè)個(gè)體靜脈血液中白細(xì)胞基因組總DNA， 然后用紫外分光光度^Uf DNA進(jìn)行定量；
第二步，PCR反應(yīng)體系配制，共配制三管；
第一管為待測(cè)樣本，取待測(cè)個(gè)體的DNA 0. 5 y 1，試劑一 1 p 1，試劑二 18. 5 jLil，混勻；
笫二管為線粒體dna的709位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性g對(duì)照，取試劑三0. 5 m 1， 試劑一 lpl，試劑二 18. 5nl，混勻；
第三管為線粒體dm的709位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性a對(duì)照，取試劑四0. 5 m 1， 試劑一 lnl，試劑二 18. 5m1，混勻；
第三步，將笫二步的三管已經(jīng)混勻的物質(zhì)分別放入PCR儀中，均按以下條 件進(jìn)行PCR反應(yīng)94"C變性15分鐘—94TC變性30秒—65X3退火1 64TC延伸1分鐘—94"變性30秒—65*C退火1 64C延伸1 94
t:變性30秒—65匸退火1分鐘—64C延伸l分鐘……，其中94TC變性30秒 —65"C退火1分4中—64t:)^伸1分鐘循環(huán)35次，最后64TC終末延伸10min, 得到三管PCR產(chǎn)物；
第四步，用3%瓊脂糖亂歐電泳(電壓80V， 電泳時(shí)間40分鐘)檢查第三 步所得的三管PCR產(chǎn)物，片斷長(zhǎng)度均為Ulbp;
第五步，又取三只PCR管，每管均加入試劑五lpl，試劑六1.15pl，然 后每管分別加入第三步所得的三管PCR產(chǎn)物各7.85Ml，混勻；當(dāng)mtDNA 709G時(shí)探針長(zhǎng)度82bp，當(dāng)為709A時(shí)，探針長(zhǎng)度85bp;
第六步，將第五步三管混勻物分別放入PCR儀，進(jìn)行LDR連接反應(yīng)，LDR 反應(yīng)程序均為，95"C 94*C 30秒—601C 2分鐘—94"C 30秒—601C 2
分鐘—941C 30秒—60"C 2分鐘……，其中94" 30秒—60"C 2分鐘共循環(huán)15 次，得到3管連接產(chǎn)物；
第七步，分別從第六步所得3管連接產(chǎn)物中各取2 均各與試劑七的2 Hl混勻；在3730測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序電泳，電泳時(shí)電壓為3KV,電泳時(shí)間1. 5 小時(shí)；
第八步，結(jié)果通過(guò)Genema卯er軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，連接產(chǎn)物長(zhǎng)度為183bp 時(shí)為單核苷酸多態(tài)性G，參見(jiàn)圖2;連接產(chǎn)物長(zhǎng)度為186bp時(shí)為單核苷酸多態(tài)性 A,參見(jiàn)圖3。當(dāng)結(jié)果如圖3所示時(shí)，為HAPE易感個(gè)體。序列表
<110>中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
<120>基于線粒體DM G709A單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)高原肺水腫易感性的試劑盒 <130>
<140>200710092814. 2 <141>2007-10-09 <160> 5
<170> Patentln 3. 3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213>人工合成
〈221〉上游引物HP4-F
<400> 1
ataggtttgg tcctagcctt tctattagct 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213>人工合成
〈221〉下游引物HP4-R
<400> 2
ctgcgtgctt gatgcttgtt ccttttgatc 30
<210> 3 <211> 38 <212> DM <213>人工合成 <221> P4-F <400> 3
gatgcUgca tgtgtaatct tattttUtt Utttttt 38
<210> 4 <211> 41 <212> DNA <213>人工合成 <221> P4-D1 <400> 4
tttttttttt ttttttattt agagggtgaa ctcactggaa c 41
<210> 5 <211> 44<212> ■ <213>人工合成 <221> P4-D2 <400> 5
tttttttttt ttttttttta tttagagggt gaactcactg gaat
權(quán)利要求
1、基于線粒體DNA G709A單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)高原肺水腫易感性的試劑盒，其特征是該試劑盒包括以下分離包裝的試劑試劑一，引物混合液，序列如下上游引物HP4-F5’-ATAGGTTTGGTCCTAGCCTTTCTATTAGCT-3’；下游引物HP4-R5’-CTGCGTGCTTGATGCTTGTTCCTTTTGATC-3’；試劑二，PCR反應(yīng)混合液；試劑三，線粒體DNA的709位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性G對(duì)照DNA；試劑四，線粒體DNA的709位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性A對(duì)照DNA；試劑五，探針混合液，三種探針序列如下①P4-F5’-GATGCTTGCATGTGTAATCTTATTTTTTTTTTTTTTTT-3’，為熒光物FAM標(biāo)記；②P4-D1線粒體DNA的709位點(diǎn)為單核苷酸多態(tài)性G5’-TTTTTTTTTTTTTTTTATTTAGAGGGTGAACTCACTGGAAC-3’；③P4-D2線粒體DNA的709位點(diǎn)為單核苷酸多態(tài)性A5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTTAGAGGGTGAACTCACTGGAAT-3’；試劑六，連接反應(yīng)混合液；試劑七，電泳混合液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于線粒體DNA G709A單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)高原肺水腫易感性的試劑盒，其特征是試劑一，引物混合液100nl;上游引物和下游引物各50nl混合，濃度均為10pmo1/ ji h試劑二， PCR A^^^液1000 p 1;成分有1 x PCR buffer, 2. 0 mMMgCh， 200 mM dNTPs， 1 U Taq酶，余量為蒸餾水；試劑三，線粒體DM的709位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性G對(duì)照DNA 50 n 1，濃度為 50ng/p 1;試劑四，線粒體DM的709位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性A對(duì)照DNA 50 n 1，濃度為 50ng/pl;試劑五，探針混合液120nl，三種探針各40iil混合，該三種揮:針濃度均 為12. 5p邁ol/ul;試劑六，連接反應(yīng)混合液100Ml;成分有pH7.6的20mMTris-HCl， 25 mM 醋酸鉀，lOmM醋酸鎂，10 mM 二琉蘇糖醇，lmM氧化型輔酶1, 0.1% Triton X-100, 0.5 Ml Taq DNA連接酶，余量為蒸餾水；試劑七，電泳混合液100 ji 1;熒光物質(zhì)1 x ROX和上樣緩沖液6 x loading buffer各為50 p 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于線粒體DNA G709A單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)高原肺水腫易感性的試劑盒，其特征是該試劑盒包括以下分離包裝的試劑試劑一，引物混合液；試劑二，PCR反應(yīng)混合液；試劑三，線粒體DNA的709位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性G對(duì)照DNA；試劑四，線粒體DNA的709位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性A對(duì)照DNA；試劑五，探針混合液；試劑六，連接反應(yīng)混合液；試劑七，電泳混合液。本發(fā)明使用簡(jiǎn)單，操作方便，檢測(cè)快速，能用于平原人進(jìn)入高原前對(duì)高原肺水腫易感者的篩選，指導(dǎo)HAPE的預(yù)防和治療，減輕急性重癥高原病的威脅，有利于進(jìn)入高原人群健康。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101469345SQ20071009281
公開日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2007年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月1日
發(fā)明者劉福玉, 羅勇軍, 羽 翟, 蔣春華, 建 陳, 高文祥, 高鈺琪, 黃慶愿 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)