專利名稱：三葉青的組培快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三葉青的組培快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
植物是藥物的天然寶庫(kù)，人類利用藥用植物來防病治病已有幾千年歷史。
全世界約有75%的人口以植物作為治療疾病的藥物來源(刑建民，2001)。當(dāng)今 的處方藥有25。^左右來自于藥用植物(邱德有,2000)。隨著經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療保健事 業(yè)的飛速發(fā)展，中藥資源的需求出現(xiàn)了空前的增長(zhǎng)，從中藥中提取有效成分應(yīng) 用于化妝品、食品及工業(yè)原料的研究也越來越深入，這些原因在不同程度上加 大了中藥資源的壓力。加之長(zhǎng)期以來，對(duì)開發(fā)利用中藥資源的認(rèn)識(shí)不足， 一些 地區(qū)不同程度上對(duì)中藥資源進(jìn)行了掠奪式的過度采收，致使很多中藥資源蘊(yùn)含 量下降，甚至耗竭， 一些種類瀕臨滅絕(黃璐琦，2001)。生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展 為從根本上改變傳統(tǒng)藥材的生產(chǎn)提供了一個(gè)嶄新的方法。植物組織和細(xì)胞培養(yǎng) 技術(shù)則是其中一個(gè)重要的手段。近年來，國(guó)內(nèi)外在這方面已做了大量工作，己 成功離體培養(yǎng)獲得試管植株的藥用植物有200多種。
三葉青(T^raWgma/zems/wam/mDielsetGilg)為葡萄科崖爬藤屬多年生常 綠草質(zhì)蔓生藤本。異名為蛇附子(《植物名實(shí)圖考》)，石抱子(《江西草藥》)， 金線吊葫蘆、三葉對(duì)(《浙江民間常用草藥》等，為民間常用的中草藥(中藥辭海， 1993)。三葉青常生長(zhǎng)于山坡或山溝，溪谷兩旁林下陰處。主要分布在浙江、江 西、福建、湖北、湖南，廣東、四川、貴州、云南、臺(tái)灣等地(浙江植物志，1993)。 三葉青以塊根或全草入藥，具有清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛的功能，用于 治療高熱驚厥、肺炎、哮喘、肝炎、風(fēng)濕、月經(jīng)不調(diào)、咽痛、瘰疬等癥，具有 很好的療效(中藥辭海，1993)。有關(guān)三葉青的化學(xué)成分研究近幾年非常熱門， 三葉青不同部位化學(xué)成分的鑒定也有較多報(bào)道。三葉青根中含槲皮素、山柰酚、 山柰酚一3—0—新橙皮糖苷、(3-谷甾醇、胡蘿卜苷及6 '—O-苯甲?；}卜苷 (楊大堅(jiān)，1998:李瑛琦，2003)。三葉青地上部分含蒲公英萜醇、蒲公英萜 酮、P—谷甾醇及麥角甾醇(劉東，1999)。藥理實(shí)驗(yàn)表明三葉青提取物具有一 定的腫瘤抑制作用(楊大堅(jiān)，1998; 丁鋼強(qiáng)，2005;馮正權(quán)，2006)、顯著的抗 病毒及抗出血熱的作用(楊學(xué)樓，1989;楊大堅(jiān)，1998)和明顯的消炎、鎮(zhèn)痛 與解熱作用(資古明，1989;黃真，2005)及保肝作用(伍昭龍，2006;鐘曉明， 2006)。大鼠經(jīng)口急性毒性實(shí)驗(yàn)表明(江月仙，2005)，按急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
判定，屬實(shí)際無毒；進(jìn)一步小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果均 為陰性，說明三葉青未顯示有致突變性。臨床上主要用于抗癌及抗艾滋病毒、 治療血液病與心腦血管疾病、肝炎、腦膜炎、急性支氣管炎、肺炎、腸炎及咽 喉炎等感染性疾病，小兒外感高熱等(伍昭龍，2006)。
由于本種植物用途廣泛、藥效顯著，毫無節(jié)制地狂采濫挖，加上三葉青對(duì) 生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻，這種珍貴的草藥現(xiàn)已瀕臨滅絕?，F(xiàn)有的三葉青野生資源根 本難以滿足日益增長(zhǎng)的醫(yī)藥領(lǐng)域的需要。為了保護(hù)野生的三葉青資源，同時(shí)又 能滿足醫(yī)藥工業(yè)的應(yīng)用，因此有必要建立三葉青的離體再生體系，這對(duì)豐富植 物組織培養(yǎng)的理論和應(yīng)用生物技術(shù)保護(hù)種質(zhì)資源以及滿足臨床應(yīng)用等均有重要 意義。
然而，由于野生三葉青對(duì)生境要求苛刻(須生長(zhǎng)在海拔700米的深山密林 和懸崖峭壁的背陰面，上面要有散射光，旁邊要有細(xì)水滲出，下面要有樹葉覆 蓋，常年氣溫保持在18。C左右)，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，黃酮類及酚類物質(zhì)含量高，非常 容易褐化，導(dǎo)致常規(guī)的組織培養(yǎng)技術(shù)十分難于對(duì)其進(jìn)行快繁。
迄今為止，在國(guó)內(nèi)外未見關(guān)于三葉青組織培養(yǎng)快繁成功的報(bào)道。我們通過 大量試驗(yàn)，終于摸索出一套成熟的方法，成功實(shí)現(xiàn)了三葉青的組培快繁，可以 快速培育出大量幼苗，為中藥材GAP種植提供一種切實(shí)可行的開發(fā)項(xiàng)目。
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文中所提及的縮寫字母的以及見如下縮略詞表
MSMurashige and SkoogMS培養(yǎng)基
medium
BA6- benzyladenine6-芐基腺嘌呤
KTkinetin激動(dòng)素
NAAa-naphthaleneacetic acidot-柰乙酸
IBAindole-3-butyric acid吲哚丁酸
ZTzeatin玉米素
GA3gibberellic acid;3赤霉素
PVPpolyvinylpyrrolidone聚乙烯吡咯烷酮
ACActivated charcoal活性炭

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種三葉青的組培快速繁殖方法。
三葉青的組培快速繁殖方法的步驟如下
1)優(yōu)選完整的腋芽為培養(yǎng)材料，經(jīng)洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗 30 40分鐘后，置于75%酒精中處理20 30秒，然后在經(jīng)0.1%的升汞Hgcl2 消毒6 10分鐘后用無菌水沖洗，將腋芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)為
MS+BA1.0mg/l或MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l;
2) 將生長(zhǎng)于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上外植體轉(zhuǎn)接于 MS+BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l、 MS+BA0.5mg/l +PVP0.5g/l、 MS+KTlmg/l+PVP0.5g/l、 MS+KT1.0 mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/域 MS+ZTlmg/l+PVP0.5g/l上的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
3) 將進(jìn)行增殖培養(yǎng)的高度為3 4公分壯苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基 為1/2MS+NAA0.3mg/1或l/2MS+BA0.05mg/l+NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l;
4) 將己生根的植株取出，栽培于珍珠巖泥炭土為l: 1 2的混合基質(zhì)上。 所述的將腋芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中將所選取的腋芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，
培養(yǎng)2 3周，看到有許多綠色的芽點(diǎn)和小的不定芽出現(xiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值 5.8 6.0，培養(yǎng)溫度25 27 °C，每天光照時(shí)間為16小時(shí)，光照強(qiáng)度為35 40 |umol.irf2.s-1。
所述的將生長(zhǎng)于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上芽轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)培養(yǎng) 20 25天，可見小芽可長(zhǎng)成3 4公分的無根苗，每個(gè)芽的周圍有2 6個(gè)新芽 出現(xiàn)，將叢生芽在無菌條件下取出，用解剖刀分開，置于上述增殖培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，在20 25天內(nèi)，各芽再生出一至數(shù)個(gè)新芽。
所述將高度為3 4公分的壯苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中首先在黑暗條件下培養(yǎng) 2 3天，隨后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)7 10天可誘導(dǎo)形成根，再培養(yǎng)20 25天形成發(fā)達(dá) 的根系。
所述的將已生根的植株取出，栽培于珍珠巖泥炭土為1: 1 2的混合基 質(zhì)上將裝有生根幼苗的培養(yǎng)容器置于自然溫度、光照的環(huán)境下鍛煉5 7天， 然后打開瓶蓋，放置1 2天后，將植株基部的瓊脂洗凈，將苗移栽到珍珠巖
泥炭土為1: 1的混合基質(zhì)培養(yǎng)20 35天，開始的10 14天溫度為23 25 。C， 相對(duì)濕度為70 80%。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)三葉青的生產(chǎn)可以在人為控制條件下進(jìn)行，不受季節(jié)、 氣候條件與土壤等因素的制約，可排除病蟲害的侵染和農(nóng)藥殘留的影響，嚴(yán)格
控制三葉青藥材的質(zhì)量。(2)增殖速度快，生產(chǎn)周期短，設(shè)備簡(jiǎn)單，占地面積 少，能節(jié)省人力、物力等，便于工廠化生產(chǎn)。(3)在組培過程中進(jìn)行脫毒處理， 提高三葉青的品質(zhì)，有效解決野生三葉青品質(zhì)不穩(wěn)定，外觀和有效成分不勻的 問題，為生產(chǎn)道地藥材和產(chǎn)后加工銷售提供保障條件。(4)該技術(shù)方法解決了 三葉青快速繁殖和穩(wěn)定生根的重要技術(shù)環(huán)節(jié)，達(dá)到技術(shù)穩(wěn)定，繁殖系數(shù)高的要 求，可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的目的。(5)使用本發(fā)明提供的組培快繁技術(shù)得到的
三葉青幼苗進(jìn)行人工栽培，可以得到個(gè)體差異小，品質(zhì)均一的三葉青成品，可 以為臨床應(yīng)用提供品質(zhì)穩(wěn)定的原材料。(6)可以保存三葉青的種質(zhì)資源，同時(shí) 有利于保護(hù)野生資源，減少對(duì)自然資源的破壞。
具體實(shí)施例方式
三葉青的組培快繁技術(shù)，包括外植體的選取與處理、誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、 生根培養(yǎng)、移栽等步驟。具體地操作中，可優(yōu)選三葉青的腋芽為培養(yǎng)材料。經(jīng)
洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗30 40分鐘后，75%酒精處理20 30秒， 0.1%HgCl2 (內(nèi)加2 3滴吐溫T-20)滅菌處理6 10分鐘，無菌水沖洗3 5次后， 接種于MS+BA1 .Omg/l或MS+BAl.0+IBAO. 1的啟動(dòng)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。在溫 度為25 27。C，每天光照16小時(shí)，光強(qiáng)35 40nmoLm-ls"的溫室中培養(yǎng)15 20 天。然后將每個(gè)外植體基部得到的從生芽切開，置于MS+BA0.5mg/1、 BA0.5mg/l+NAA0.05mg/1、 KT1.0mg/1、 KT1.0mg/l+NAA0.05mg/l或ZTlmg/l培養(yǎng) 基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基。20 30天后，每個(gè)外植體可 以得到2 6株綠色健壯、高度達(dá)到3 4公分的植株。將需要生根的幼苗轉(zhuǎn)移至 1/2MS+NAA 0.3mg/l或1/2MS+BA0.05 mg/1 +NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l培養(yǎng)基上 進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同上述誘導(dǎo)培養(yǎng)。7 10天后可以看到有根原基形成， 20 25天完成生根。將裝有生根植株的培養(yǎng)容器取出，于自然環(huán)境下放置5 7 天后打開瓶蓋，在培養(yǎng)基表面澆少量水，再放置1 2天，然后將苗取出，將植 株基部的瓊脂洗凈，將苗移栽到珍珠巖泥炭土 (h 1)的混合基質(zhì)上。開始 10天保持環(huán)境溫度23 25。C，相對(duì)濕度在70% 80%，隨后即可逐漸過渡到自然 的環(huán)境條件。煉苗一個(gè)月后移栽到大田，可達(dá)到90%的存活率。
上述技術(shù)中誘導(dǎo)、增殖及生根步驟的培養(yǎng)基的pH值均為5.8 6.0，培養(yǎng)溫度 25 27°C，每天光照16小時(shí)，光照強(qiáng)度35 40pmol，m'2.s"。
使用本發(fā)明將三葉青的腋芽接種后，20 30天可誘導(dǎo)形成叢生芽， 一般誘 導(dǎo)率達(dá)到78 95%。在此基礎(chǔ)上繼代培養(yǎng)，叢生芽可大量繁殖，大約每25天繼代 一次，平均增殖倍數(shù)為5.4。把繼代后的叢生芽轉(zhuǎn)移到本發(fā)明提供的生根培養(yǎng)基 中20 25天可大量發(fā)根，出根率在90%左右，培養(yǎng)30 45天可出瓶煉苗。
采用上述措施的本發(fā)明，掌握了三葉青組織培養(yǎng)中叢生芽的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)， 壯苗、生根等關(guān)鍵階段的技術(shù)，成功解決了三葉青組培中生根困難、增殖率低、 成活率低等困難，使三葉青這一珍稀藥用植物實(shí)現(xiàn)快速育苗、工廠化栽培成為 可能。使用本發(fā)明同時(shí)可以有效地保護(hù)這一珍稀野生植物資源、減少私挖濫采、 形成可持續(xù)利用和合理開發(fā)相互協(xié)調(diào)的良性循環(huán)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在提供了三葉青的組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)，摸索出 了快速繁殖及其穩(wěn)定生根等重要環(huán)節(jié)的關(guān)鍵性技術(shù)， 一個(gè)外植體一年就可克隆 繁殖出數(shù)萬株后代，為該藥用植物的商品化生產(chǎn)提供了一套切實(shí)可行的生產(chǎn)技 術(shù)路線，可以應(yīng)用于三葉青的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。 本發(fā)明采用下述非限定性實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例l
取采自富陽新登的三葉青的腋芽進(jìn)行表面滅菌處理流水沖洗30分鐘后，
置于75%酒精中處理30秒，然后用0.1XHgCl2 (內(nèi)力B2滴吐溫T-20)滅菌處理6 分鐘后用無菌水沖洗3次后，接種于MS+BA1.0mg/l培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室的溫度為 25°C，光照強(qiáng)度為35 pmol.m々s"，培養(yǎng)15天，可見每個(gè)外植體上有3 6個(gè)新芽 出現(xiàn)，將長(zhǎng)有芽的外植體在無菌條件下取出，將芽用解剖刀分開，分別置于裝 有上述相同培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，20天后，各培養(yǎng)容器內(nèi)的芽可再生出數(shù) 個(gè)新芽。再將每個(gè)芽分開，轉(zhuǎn)接于MS+BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l上培 養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，以達(dá)到快速增殖的目的，其中加入抗氧化齊UPVP0.5g/l防 止褐化。培養(yǎng)20天后，將需要生根的三葉青植株轉(zhuǎn)移至
1/2MS+NAA0.3mg/l+AC0.5g/l培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。20天可生根。將已生根植 株的培養(yǎng)瓶取出，于自然環(huán)境下放置5天后打開瓶蓋，在培養(yǎng)基表面澆少量水， 再放置1天，然后將苗取出，將植株基部的瓊脂洗凈，將苗移栽到珍珠巖泥炭 土 (1: 1)混合基質(zhì)上。保持環(huán)境相對(duì)濕度在70%左右。最初兩周避免直射光照 射， 一個(gè)月后移栽到大田中，可達(dá)到85%的存活率。 實(shí)施例2
取采自富陽新登的三葉青的腋芽進(jìn)行表面滅菌處理流水沖洗40分鐘后， 置于75%酒精中處理20秒，然后用0.1XHgCl2 (內(nèi)力口3滴吐溫T20)滅菌處理IO 分鐘后用無菌水沖洗5次后，接種于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 室的溫度為27。C，光照強(qiáng)度為40^imol.rr^.s"，培養(yǎng)20天，可見每個(gè)外植體上有 4 7個(gè)新芽出現(xiàn)，將長(zhǎng)有芽的外植體在無菌條件下取出，將芽用解剖刀分開， 分別置于裝有上述相同培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，20天后，各培養(yǎng)容器內(nèi)的芽 可再生出數(shù)個(gè)新芽。再將每個(gè)芽分開，轉(zhuǎn)接于MS+BA0.5mg/1十PVP0.5g/l上培養(yǎng) 基上進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，以達(dá)到快速增殖的目的，其中加入抗氧化劑PVP0.5g/l防止 褐化。培養(yǎng)20天后，將需要生根的三葉青植株轉(zhuǎn)移至
1/2MS+NAA0.3mg/l+AC0.5g/l培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。20天可生根。將已生根植 株的培養(yǎng)瓶取出，于自然環(huán)境下放置7天后打開瓶蓋，在培養(yǎng)基表面澆少量水，洗凈培養(yǎng)基，將苗移栽到珍珠巖泥炭土 (1: 2) 混合基質(zhì)上。保持環(huán)境相對(duì)濕度在80%左右。最初兩周避免直射光照射， 一個(gè)月
后移栽到大田中，可達(dá)到85%的存活率。 實(shí)施例3
取采自富陽新登的三葉青的腋芽進(jìn)行表面滅菌處理流水沖洗30分鐘后， 置于75%酒精中處理30秒，然后用0.1XHgCl2 (內(nèi)加2滴吐溫T-20)滅菌處理8 分鐘后用無菌水沖洗4次后，接種于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 室的溫度為25。C，光照強(qiáng)度為36(111101.111-2.^，培養(yǎng)20天，可見每個(gè)外植體上有 4 7個(gè)新芽出現(xiàn)，將長(zhǎng)有芽的外植體在無菌條件下取出，將芽用解剖刀分開， 分別置于裝有上述相同培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，20天后，各培養(yǎng)容器內(nèi)的芽 可再生出數(shù)個(gè)新芽。再將每個(gè)芽分開，轉(zhuǎn)接于MS+KTlmg/l+PVP0.5g/l上培養(yǎng)基 上進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，以達(dá)到快速增殖的目的，其中加入抗氧化劑PVP0.5g/l防止褐 化。培養(yǎng)20天后，將需要生根的三葉青植株轉(zhuǎn)移至l/2MS+BA0.05mg/1 +NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l+AC0.5g/l培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。25天可生根。將已 生根植株的培養(yǎng)瓶取出，于自然環(huán)境下放置5天后打開瓶蓋，在培養(yǎng)基表面澆少 量水，再放置2天，然后將苗取出，洗凈培養(yǎng)基，將苗移栽到珍珠巖泥炭土 (1: 1)混合基質(zhì)上。保持環(huán)境相對(duì)濕度在80%。 一個(gè)月后移栽到大田中，可達(dá)到85% 的存活率。 實(shí)施例4
取采自富陽新登的三葉青的腋芽進(jìn)行表面滅菌處理流水沖洗30分鐘后，
置于75%酒精中處理30秒，然后用0.1。/。HgCl2 (內(nèi)加2滴吐溫T-20)滅菌處理8 分鐘后用無菌水沖洗4次后，接種于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 室的溫度為26。C，光照強(qiáng)度為38拜01.1^2.8-1，培養(yǎng)20天，可見每個(gè)外植體上有 4 7個(gè)新芽出現(xiàn)，將長(zhǎng)有芽的外植體在無菌條件下取出，將芽用解剖刀分開， 分別置于裝有上述相同培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，20天后，各培養(yǎng)容器內(nèi)的芽 可再生出數(shù)個(gè)新芽。再將每個(gè)芽分開，轉(zhuǎn)接于MS+KT1.0 mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l上培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，以達(dá)到快速增殖的目 的，其中加入抗氧化劑PVP0.5g/l防止褐化。培養(yǎng)20天后，植株生長(zhǎng)健壯，高度 達(dá)到3 4公分，部分植株的基部出現(xiàn)根。將需要生根的三葉青植株轉(zhuǎn)移至 1/2MS+BA0.05 mg/1 +NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l+AC0.5g/l培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培 養(yǎng)。25天可生根。將已生根植株的培養(yǎng)瓶取出，于自然環(huán)境下放置7后打開瓶蓋， 在培養(yǎng)基表面澆少量水，再放置2天，然后將苗取出，將植株基部的瓊脂洗凈，
將苗移栽到珍珠巖泥炭土 (1: 1)混合基質(zhì)上。保持環(huán)境相對(duì)濕度在80%左右。 一個(gè)月后移栽到大田中，可達(dá)到85%的存活率。
實(shí)施例5
取采自富陽新登的三葉青的腋芽進(jìn)行表面滅菌處理流水沖洗40分鐘后，
置于75%酒精中處理20秒，然后用0.1XHgCl2 (內(nèi)加2滴吐溫T20)滅菌處理9 分鐘后用無菌水沖洗4次后，接種于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 室的溫度為26t:，光照強(qiáng)度為36^mol.m—2.^,培養(yǎng)20天，可見每個(gè)外植體上有 4 7個(gè)新芽出現(xiàn)，將長(zhǎng)有芽的外植體在無菌條件下取出，將芽用解剖刀分開， 分別置于裝有上述相同培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，20天后，各培養(yǎng)容器內(nèi)的芽 可再生出數(shù)個(gè)新芽。再將每個(gè)芽分開，轉(zhuǎn)接于MS+ZTlmg/l+PVP0.5g/l上培養(yǎng)基 上進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，以達(dá)到快速增殖的目的，其中加入抗氧化劑PVP0.5g/l防止褐 化。培養(yǎng)20天后，植株高度達(dá)到4 5公分。將需要生根的三葉青植株轉(zhuǎn)移至 1/2MS+BA0.05 mg/1 +NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l+AC0.5g/l培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培 養(yǎng)。25天即可生根。將已生根植株的培養(yǎng)瓶取出，于自然環(huán)境下放置7天后打開 瓶蓋，在培養(yǎng)基表面澆少量水，再放置2天，然后將苗取出，將植株基部的瓊脂 洗凈，將苗移栽到珍珠巖泥炭土 (1: 1)混合基質(zhì)上。保持環(huán)境相對(duì)濕度在 80%左右。 一個(gè)月后移栽到大田中，可達(dá)到85%的存活率。 實(shí)施例6
煉苗與移栽將實(shí)施例5得到的三葉青試管苗，在自然光照下煉苗7天后打
開瓶蓋，在培養(yǎng)基表面澆少量水，再放置2天，然后將苗取出，將植株基部的瓊 脂洗凈，將苗移栽到以珍珠巖泥炭土 (1: 1)為基質(zhì)的12公分塑料盆，每盆l
株，每15盆為一個(gè)單位。置于溫室大棚中，保持最高晝溫〈32°C，最低夜溫〉 18°C，保持環(huán)境相對(duì)濕度在70 80%，遮光70%。移栽后用塑料膜覆蓋，每天對(duì) 葉面噴1次水，IO天后除去覆蓋的塑料薄膜，20天澆一次1/4MS營(yíng)養(yǎng)液。l個(gè)月后， 幼苗成活率達(dá)到90%以上，可以移栽到大田。
權(quán)利要求
1.一種三葉青的組培快速繁殖方法，其特征在于方法的步驟如下1)優(yōu)選完整的腋芽為培養(yǎng)材料，經(jīng)洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗30～40分鐘后，置于75％酒精中處理20～30秒，然后在經(jīng)0.1％的升汞Hgcl2消毒6～10分鐘后用無菌水沖洗，將腋芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)為MS+BA1.0mg/l或MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l；2)將生長(zhǎng)于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上外植體轉(zhuǎn)接于MS+BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l、MS+BA0.5mg/l+PVP0.5g/l、MS+KT1mg/l+PVP0.5g/l、MS+KT1.0mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l或MS+ZT1mg/l+PVP0.5g/l上的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)；3)將進(jìn)行增殖培養(yǎng)的高度為3～4公分壯苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.3mg/l或1/2MS+BA 0.05mg/l+NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l；4)將已生根的植株取出，栽培于珍珠巖∶泥炭土為1∶1～2的混合基質(zhì)上。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三葉青的組培快速繁殖方法，其特征在于所 述的將腋芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中將所選取的腋芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 2 3周，看到有許多綠色的芽點(diǎn)和小的不定芽出現(xiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值5.8 6.0，培養(yǎng)溫度25 27 °C，每天光照時(shí)間為16小時(shí)，光照強(qiáng)度為35 40 |imol.m-2.s-1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三葉青的組培快速繁殖方法，其特征在于所 述的將生長(zhǎng)于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上芽轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)培養(yǎng)20 25 天，可見小芽可長(zhǎng)成3 4公分的無根苗，每個(gè)芽的周圍有2 6個(gè)新芽出現(xiàn)， 將叢生芽在無菌條件下取出，用解剖刀分開，置于上述增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在 20 25天內(nèi)，各芽再生出一至數(shù)個(gè)新芽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三葉青的組培快速繁殖方法，其特征在于所 述將高度為3 4公分的壯苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中首先在黑暗條件下培養(yǎng)2 3 天，隨后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)7 10天可誘導(dǎo)形成根，再培養(yǎng)20 25天形成發(fā)達(dá)的根 系。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三葉青的組培快速繁殖方法，其特征在于所述的將已生根的植株取出，栽培于珍珠巖泥炭土為1: 1 2的混合基質(zhì)上 將裝有生根幼苗的培養(yǎng)容器置于自然溫度、光照的環(huán)境下鍛煉5 7天，然后打 開瓶蓋，放置1 2天后，將植株基部的瓊脂洗凈，將苗移栽到珍珠巖泥炭土為l: 1的混合基質(zhì)培養(yǎng)20 35天，開始的10 14天溫度為23 25 °C,相對(duì) 濕度為70 80%。
全文摘要
本發(fā)明公開一種三葉青的組培快速繁殖方法。包括外植體的選取與處理，誘導(dǎo)培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)，生根培養(yǎng)，移栽等步驟。本發(fā)明以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入了輔助劑活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、6-芐基腺嘌呤、激動(dòng)素、玉米素、萘乙酸、吲哚丁酸等，用于三葉青叢生芽誘導(dǎo)、壯苗及生根三個(gè)關(guān)鍵階段的組織培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)三葉青的生產(chǎn)可以在人為控制條件下進(jìn)行，不受季節(jié)、氣候條件與土壤等因素的制約，可排除病蟲害的侵染和農(nóng)藥殘留的影響，嚴(yán)格控制三葉青藥材的質(zhì)量。(2)增殖速度快，生產(chǎn)周期短，設(shè)備簡(jiǎn)單，占地面積少，能節(jié)省人力、物力等，便于工廠化生產(chǎn)。(3)可以保存三葉青的種質(zhì)資源，同時(shí)有利于保護(hù)野生資源，減少對(duì)自然資源的破壞。
文檔編號(hào)C12N5/04GK101103700SQ20071007070
公開日2008年1月16日 申請(qǐng)日期2007年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月6日
發(fā)明者傅承新, 姜維梅, 趙云鵬 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)