專利名稱：一種基于大腸桿菌的植物抗蒸騰劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于大腸桿菌的植物抗蒸騰劑的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著全球氣候變暖和人類活動(dòng)的影響，水資源已逐漸成為制約經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的主要因子之一。農(nóng)業(yè)作為國(guó)民經(jīng)濟(jì)的基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)，向來是用水大戶。在我國(guó)，由于水資源時(shí)空分布不均，基礎(chǔ)水利設(shè)施落后，農(nóng)業(yè)灌溉水分利用率只有40％左右，大大低于美國(guó)，以色列等西方發(fā)達(dá)國(guó)家。因此，開發(fā)新型植物節(jié)水抗旱劑，提高作物植被的水分利用效率，是我國(guó)發(fā)展節(jié)水農(nóng)業(yè)不可獲缺的組成部分。到目前為止，商品化的抗蒸騰劑多種多樣，就其原理而言，一般分為代謝型和薄膜型兩種代謝型抗蒸騰劑主要作用于植物光合代謝途徑，誘發(fā)氣孔關(guān)閉，增大氣孔阻力，從而減少植物體通過氣孔呼吸蒸騰而散失到環(huán)境中的水分。這一類型的抗蒸騰劑主要成分有醋酸汞苯，ABA，CaCl2，黃腐酸等。薄膜型抗蒸騰劑，則是通過外源噴施，在植物葉片表面形成一層薄膜，阻礙途經(jīng)氣孔的水分散失，這一類型的抗旱劑有高嶺土等。上述兩種抗蒸騰劑已經(jīng)大量應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，但同時(shí)也暴露出了一系列問題如毒性過大，對(duì)環(huán)境造成污染(如醋酸汞苯)，造價(jià)昂貴(ABA)，水溶性差，黏附力低(如黃腐酸)影響光合同化作用(薄膜型)等等。綜上所述，研制生態(tài)安全，造價(jià)低廉，適用性廣和作用明顯的新型抗蒸騰劑，具有迫切的需要。本發(fā)明采用生物工程常用DH5α型大腸桿菌。菌種來自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，商品編號(hào)SD8411。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生態(tài)安全的，價(jià)格低廉，適宜大規(guī)模生產(chǎn)的基基于大腸桿菌的植物抗蒸騰劑的制備方法。
基于大腸桿菌的植物抗蒸騰劑的制備方法包括如下步驟1)菌劑A的配制將保藏編號(hào)為CGMCC1.907大腸桿菌(Escherichia coli)菌株接入滅菌后的液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)18～24小時(shí)，搖床振蕩速度為90～120轉(zhuǎn)/分鐘，檢測(cè)菌液終濃度為109cfu/ml，將培養(yǎng)后的菌液置于高壓滅菌鍋內(nèi)，于121℃，0.12～0.15兆帕壓力下滅活20～30分鐘，待冷卻后，涂平板檢測(cè)細(xì)菌活性，若無菌斑出現(xiàn)，無菌封裝制成菌劑A；2)輔劑B的配制用無菌水配制輔劑B，輔劑B配方為2.0g/L氯化鈣，0.05g/L茉莉酸甲酯；3)將上述菌劑A∶輔劑B按1∶50～100的體積比混勻即可。
所述的液體培養(yǎng)基配方為葡萄糖20.0g/L，酵母膏6.0g/L，蛋白胨6.0g/L，1.5g/L磷酸二氫鉀，其余為無菌水，調(diào)PH值為7.0。
本發(fā)明具有的有益效果是1)基于自然界微生物-植物免疫應(yīng)答反應(yīng)機(jī)理，采用成熟的工程菌株，經(jīng)特殊處理后，去除致病性，對(duì)環(huán)境基本不造成污染，符合生態(tài)安全要求。
2)利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，可以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，成本低，產(chǎn)量高。
3)作用效果明顯，適用范圍廣，是干旱和半干旱地區(qū)農(nóng)林植物理想的抗蒸騰劑。


圖1(a)是擬南芥活體沒有噴施抗蒸騰劑的氣孔開度示意圖；圖1(b)是擬南芥活體噴施抗蒸騰劑一小時(shí)后，其氣孔開度示意圖；圖2是本發(fā)制備的抗蒸騰劑，噴施活體擬南芥，一小時(shí)后其氣孔開度變化情況示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明利用了自然界G-(革蘭氏陰性)細(xì)菌與植物間相互作用的特點(diǎn)。具體而言，自然界中，氣孔作為阻擋病原微生物入侵的第一道門戶，在植物免疫應(yīng)答中起到了不可替代的作用(Melotto et al 2006，Plant Stomata Functionin Innate Immunity against Bacterial Invasion，Cell 126，969-980)。革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞膜上特有引發(fā)子(elicitor)類物質(zhì)，能夠被植物氣孔保衛(wèi)細(xì)胞上特異性受體(Pattern Recognize Receptor，PRR)所識(shí)別，進(jìn)而引發(fā)氣孔關(guān)閉以防御微生物入侵。
在表皮條和活體噴施試驗(yàn)上都一致證明，一定濃度和處理的菌劑可以誘發(fā)植物氣孔開度大幅度下降，進(jìn)而增大氣孔阻力，減少因呼吸蒸騰而喪失的水分，在一定時(shí)期內(nèi)提高了植物的水分利用效率。
實(shí)施例11)菌劑A的配制將保藏編號(hào)為CGMCC1.907大腸桿菌(Escherichia coli)菌株接入滅菌后的液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)18小時(shí)，搖床振蕩速度為90轉(zhuǎn)/分鐘，檢測(cè)菌液終濃度為109cfu/ml，將培養(yǎng)后的菌液置于高壓滅菌鍋內(nèi)，于121℃，0.12兆帕壓力下滅活20分鐘，待冷卻后，涂平板檢測(cè)細(xì)菌活性，若無菌斑出現(xiàn)，無菌封裝制成菌劑A；所述的液體培養(yǎng)基配方為葡萄糖20.0g/L，酵母膏6.0g/L，蛋白胨6.0g/L，1.5g/L磷酸二氫鉀，其余為無菌水，調(diào)PH值為7.0；2)輔劑B的配制用無菌水配制輔劑B，輔劑B配方為2.0g/L氯化鈣，0.05g/L茉莉酸甲酯；3)將上述菌劑A∶輔劑B按1∶50的體積比混勻即可。
實(shí)施例21)菌劑A的配制將保藏編號(hào)為CGMCC1.907大腸桿菌(Escherichia coli)菌株接入滅菌后的液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，搖床振蕩速度為120轉(zhuǎn)/分鐘，檢測(cè)菌液終濃度為109cfu/ml，將培養(yǎng)后的菌液置于高壓滅菌鍋內(nèi)，于121℃，0.15兆帕壓力下滅活30分鐘，待冷卻后，涂平板檢測(cè)細(xì)菌活性，若無菌斑出現(xiàn)，無菌封裝制成菌劑A；所述的液體培養(yǎng)基配方為葡萄糖20.0g/L，酵母膏6.0g/L，蛋白胨6.0g/L，1.5g/L磷酸二氫鉀，其余為無菌水，調(diào)PH值為7.0；2)輔劑B的配制用無菌水配制輔劑B，輔劑B配方為2.0g/L氯化鈣，0.05g/L茉莉酸甲酯；3)將上述菌劑A∶輔劑B按1∶100的體積比混勻即可。
實(shí)施例31)菌劑A的配制將保藏編號(hào)為CGMCC1.907大腸桿菌(Escherichia coli)菌株接入滅菌后的液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，搖床振蕩速度為100轉(zhuǎn)/分鐘，檢測(cè)菌液終濃度為109cfu/ml，將培養(yǎng)后的菌液置于高壓滅菌鍋內(nèi)，于121℃，0.13兆帕壓力下滅活25分鐘，待冷卻后，涂平板檢測(cè)細(xì)菌活性，若無菌斑出現(xiàn)，無菌封裝制成菌劑A；所述的液體培養(yǎng)基配方為葡萄糖20.0g/L，酵母膏6.0g/L，蛋白胨6.0g/L，1.5g/L磷酸二氫鉀，其余為無菌水，調(diào)PH值為7.0；2)輔劑B的配制用無菌水配制輔劑B，輔劑B配方為2.0g/L氯化鈣，0.05g/L茉莉酸甲酯；3)將上述菌劑A∶輔劑B按1∶80的體積比混勻即可。
本發(fā)明的使用方法為使用時(shí)，將混合均勻的抗蒸騰劑噴施到植物葉片表面即可。按上述3種實(shí)施例配制抗蒸騰劑，在活體擬南芥上噴施，1小時(shí)后，如圖1(b)所示，大部分氣孔開度降低。隨機(jī)測(cè)量50個(gè)氣孔開度，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果如圖2所示。
由上面結(jié)果可知，本發(fā)明能夠明顯減低氣孔開度，達(dá)到良好的植物抗蒸騰的效果。
權(quán)利要求
1.一種基于大腸桿菌的植物抗蒸騰劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟1)菌劑A的配制將保藏編號(hào)為CGMCC1.907大腸桿菌(Escherichia coli)菌株接入滅菌后的液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)18～24小時(shí)，搖床振蕩速度為90～120轉(zhuǎn)/分鐘，檢測(cè)菌液終濃度為109cfu/ml，將培養(yǎng)后的菌液置于高壓滅菌鍋內(nèi)，于121℃，0.12～0.15兆帕壓力下滅活20～30分鐘，待冷卻后，涂平板檢測(cè)細(xì)菌活性，若無菌斑出現(xiàn)，無菌封裝制成菌劑A；2)輔劑B的配制用無菌水配制輔劑B，輔劑B配方為2.0g/L氯化鈣，0.05g/L茉莉酸甲酯；3)將上述菌劑A∶輔劑B按1∶50～100的體積比混勻即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于大腸桿菌的植物抗蒸騰劑的制備方法，其特征在于所述的液體培養(yǎng)基配方為葡萄糖20.0g/L，酵母膏6.0g/L，蛋白胨6.0g/L，1.5g/L磷酸二氫鉀，其余為無菌水，調(diào)PH值為7.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于大腸桿菌的植物抗蒸騰劑的制備方法。它包括如下步驟1)菌劑A的配制將來自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)CGMCC1.907的大腸桿菌菌株接入滅菌后的液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)18～24小時(shí)，檢測(cè)菌液終濃度為10
文檔編號(hào)C12R1/19GK101041812SQ200710066799
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2007年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月22日
發(fā)明者王根軒, 甘毅, 錢陳, 沈竹夏 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)