專利名稱：一種灰色鏈霉菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的灰色鏈霉菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
由于我國(guó)境內(nèi)的地理環(huán)境、氣候條件千差萬別，微生物資源相當(dāng)?shù)刎S富。人們通過在各種不同緯度、海拔以及氣候的地域?qū)ふ倚碌奈⑸锞N。一般地，通過菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征以及生理生化特征等對(duì)微生物菌種進(jìn)行分類鑒別，同時(shí)還常常采用檢測(cè)微生物菌種的16srDNA的序列來明確該菌種的分類地位。
通過對(duì)在全國(guó)各地采集得來的微生物菌種進(jìn)行培養(yǎng)，在得到的代謝產(chǎn)物中尋找各種活性成分，并進(jìn)而研究開發(fā)成各種藥物(包括醫(yī)藥、農(nóng)藥、獸藥等)。這種技術(shù)正在被廣泛應(yīng)用，如用作醫(yī)用抗生素的青霉素、鏈霉素等，在農(nóng)用、獸用方面有防治水稻紋枯病的井岡霉素、防治多種螨蟲和夜蛾的阿維菌素等。


發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)的發(fā)明人在我國(guó)上海郊區(qū)的土壤中采集并分離到一株菌株，命名為SPRI-90827，經(jīng)鑒定其為鏈霉菌屬的灰色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)，通過對(duì)其16SrDNA序列的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該菌株為一株新的菌株；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，該菌株的發(fā)酵液對(duì)于多種植物病害具有殺菌活性。
因此，本發(fā)明的首要目的就在于提供一種灰色鏈霉菌SPRI-90827。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述灰色鏈霉菌用于制備農(nóng)用殺菌劑的應(yīng)用。
本發(fā)明的灰色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-90827，已于2007年5月16日提交中國(guó)普通微生物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.2048。
經(jīng)測(cè)定，該菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO1所示。
本發(fā)明的灰色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-90827經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，可用于制備農(nóng)用殺菌劑。
根據(jù)本發(fā)明，所述灰色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-90827的發(fā)酵培養(yǎng)條件如下 在28℃下通氣攪拌培養(yǎng)90-96小時(shí)；培養(yǎng)基的重量百分比組成為葡萄糖2％、淀粉5％、花生餅粉2％、黃豆餅粉1％、蛋白胨0.1％、酵母膏0.4％、氯化鈉0.2％、硫酸鎂0.5％、硝酸胺0.2％、磷酸氫二鉀0.05％。
根據(jù)本發(fā)明，所述灰色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-90827經(jīng)發(fā)酵后的發(fā)酵液可直接用于制備農(nóng)用殺菌劑。
根據(jù)本發(fā)明，所述制備的農(nóng)用殺菌劑可用于防治灰霉病(Botrytis cinerea)、瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)、瓜類炭疽病(Colletotrichum lagenarium)和水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae)。



圖1是對(duì)灰色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-90827進(jìn)化樹分析的示意圖。

具體實(shí)施例方式 下面通過具體實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明。
本發(fā)明的灰色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-90827已于2007年5月16日提交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.2048。
以下實(shí)施例所涉及的原材料皆可通過市售得到，且涉及到的濃度均為重量濃度。
本發(fā)明的灰色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-90827的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征及16SrDNA的序列和菌種分類結(jié)果如下 1、SPRI-90827菌株在大多數(shù)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好(見表1)，在高氏培養(yǎng)基上，菌落微絨狀，基內(nèi)菌絲體無橫隔，不斷裂，氣生菌絲體分支，纖細(xì)柔曲，生長(zhǎng)豐盛。孢子絲較長(zhǎng)，右旋螺旋約1環(huán)圈，長(zhǎng)度15個(gè)以上，孢子扁圓型，表面光滑。
表1、培養(yǎng)特征 2、菌株SPRI-90827的生理生化特性和碳源利用情況為明膠液化完全，脫脂牛奶中呈環(huán)狀深褐色生長(zhǎng)，有凝固和胨化，淀粉水解完全，H2S產(chǎn)生陽性，酪氨酸激酶產(chǎn)生陽性。能利用的碳源為D-葡萄糖、D-甘露醇、D-果糖、L-阿拉伯糖。不能利用纖維素、L-肌醇、蔗糖、D-木糖、L-鼠李糖、棉子糖。
3、菌株SPRI-90827細(xì)胞壁含有LL-DAP和甘氨酸，胞壁I型；全細(xì)胞糖水解無特征性糖，為C型。
4、本發(fā)明所述的菌株SPRI-90827的16srDNA序列如SEQ ID NO1所示。
16SrDNA序列的測(cè)定委托上海申能博彩生物科技有限公司(上海市漕河涇開發(fā)區(qū)欽江路333號(hào)38號(hào)樓一樓，郵編200233)進(jìn)行，具體如下用溶菌酶法從新鮮菌體提取基因組DNA，采用通用引物進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)、純化后直接用Taq Deoxy Terminator Cyele Sequencing Kit測(cè)序，電泳及數(shù)Applied BiosystemsDNA Sequencer(model377)自動(dòng)進(jìn)行。
5、進(jìn)化樹分析與菌株90827 16SrRNA序列相似性最高的為Streptomyces cellostaticusHamada 1958，相似性達(dá)99.31％，但兩者51％自展值聚合在一起，這一數(shù)值從統(tǒng)計(jì)學(xué)上無法充分支持兩者為同一種，表明可能存在一定的進(jìn)化差異。且經(jīng)過查閱資料，發(fā)現(xiàn)Streptomyces cellostaticus，制胞鏈霉菌(產(chǎn)cellostatin)無原始菌種描述情況(伯杰氏手冊(cè)第八版，1161頁)。90827與Streptomyces griseochromogenes 16srRNA相似性達(dá)98.65％，兩者在進(jìn)化樹中同屬一大支。一般16SrDNA序列同源性小于97％，可以認(rèn)為屬于不同種。故SPRI 90827與Streptomyces griseochromogenes應(yīng)有較近的親緣關(guān)系(見圖1)。
此外經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)SPRI 90827生理生化性質(zhì)等指標(biāo)與Streptomyces griseochromogenes相近，同屬灰色類群。
根據(jù)形態(tài)與化學(xué)分類定屬原則，菌株SPRI 90827基內(nèi)菌絲體無橫隔，不斷裂，氣生菌絲體分支，纖細(xì)柔曲，生長(zhǎng)豐盛。孢子絲較長(zhǎng)，右旋螺旋約1環(huán)圈，長(zhǎng)度15個(gè)以上，孢子扁園型，表面光滑。細(xì)胞壁化學(xué)組份屬于I型，屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)。
根據(jù)以上形態(tài)觀察以及生理生化特征，結(jié)合16srDNA進(jìn)化樹分析，認(rèn)為菌種SPRI90827應(yīng)為Streptomyces griseochromogenes。
本發(fā)明所述的灰色鏈霉菌培養(yǎng)方法既可為深層液體培養(yǎng)，也可為固體培養(yǎng)。為了有利于工業(yè)性的培養(yǎng)，宜將上述生產(chǎn)菌的孢子懸浮液接種到培養(yǎng)基上，并進(jìn)行通氣攪拌。
對(duì)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)源并無特殊的規(guī)定，可使培養(yǎng)基中含有常用于微生物培養(yǎng)的碳源、氮源及其他營(yíng)養(yǎng)源。其中碳源可為淀粉、糊精、葡萄糖、甘油、蔗糖、甘露醇等，氮源可為肉胨、黃豆餅粉、花生粉、酵母、肉膏、米糠、玉米漿、麥皮、銨鹽、尿素、硝酸鹽以及其他有機(jī)或無機(jī)含氮化合物。其他營(yíng)養(yǎng)源可適當(dāng)添加一些無機(jī)鹽類，例如食鹽、磷酸鹽及鉀、鈣、錳、鐵等金屬鹽。必要時(shí)可添加一些動(dòng)、植、礦物油等作為消泡劑。
對(duì)溫度、PH、時(shí)間等培養(yǎng)條件并無嚴(yán)格的限制，以適于產(chǎn)生菌的生產(chǎn)為準(zhǔn)，并以選擇活性組份產(chǎn)量最高的條件為好。例如，培養(yǎng)基的PH范圍可為6-8，以接近中性為好；培養(yǎng)溫度在20-35℃，通氣量以通氣比1∶0.3到1比4之間(通氣比指每分鐘通過培養(yǎng)液的空氣體積與培養(yǎng)液體積之比)。這些培養(yǎng)基的組份、PH、培養(yǎng)溫度、通氣條件等均應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以獲得最好的效果。
本發(fā)明所述的灰色鏈霉菌經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)，得到的培養(yǎng)物可用于防治各種作物病害，主要針對(duì)因病原真菌引起的植物病害。具體來說，可防治灰霉病(Botrytis cinerea)、瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)、瓜類炭疽病(Colletotrichum lagenarium)、水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae)。
實(shí)施例1、灰色鏈霉菌SPRI-90827的發(fā)酵培養(yǎng) 按以下配方配制培養(yǎng)基，然后消毒滅菌 葡萄糖2％、淀粉5％、花生餅粉2％、黃豆餅粉1％、蛋白胨0.1％、酵母膏0.4％、氯化鈉0.2％、硫酸鎂0.5％、硝酸胺0.2％、磷酸氫二鉀0.05％，pH 7.2。
將生長(zhǎng)于高氏斜面的SPRI-90827菌種Streptomyces griseochromogenes CGMCCNo.2048接種于該培養(yǎng)基中，28℃、150rpm搖床培養(yǎng)36-40小時(shí)； 以此培養(yǎng)物為種子，以5-20％的比例接種于上述培養(yǎng)基組成的發(fā)酵培養(yǎng)液中，28℃通氣攪拌培養(yǎng)90-96小時(shí)，獲得的發(fā)酵液備用。
實(shí)施例2、灰色鏈霉菌SPRI-90827的應(yīng)用 在實(shí)施例1所培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物中，取適量發(fā)酵液用水稀釋2-4倍，均勻噴灑在四張真葉期黃瓜苗上，直到葉片上形成水層，并且有多余的液體下滴為止。
待藥液干后分別在四張黃瓜葉片中央接種灰霉病病菌、瓜白粉病菌、瓜類炭疽病菌和稻瘟病菌，在20℃下保濕72小時(shí)，同時(shí)以四組清水作空白對(duì)照。檢查發(fā)病情況，結(jié)果如表2所示。
表2、灰色鏈霉菌SPRI-90827的發(fā)酵液對(duì)植物病害試驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例3、灰色鏈霉菌SPRI-90827的應(yīng)用 將實(shí)施例1所培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物過濾后取上清液，均勻噴灑在四張真葉期黃瓜苗上，直到葉片上形成水層，并且有多余的液體下滴為止。
待藥液干后分別在四張黃瓜葉片中央接種灰霉病病菌、瓜白粉病菌、瓜類炭疽病菌和稻瘟病菌，在20℃下保濕72小時(shí)，同時(shí)以四組清水作空白對(duì)照。檢查發(fā)病情況，結(jié)果如表3所示。
表3、灰色鏈霉菌SPRI-90827的發(fā)酵液對(duì)植物病害試驗(yàn)結(jié)果
根據(jù)實(shí)施例2和實(shí)施例3的結(jié)果表明，本發(fā)明所述的灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)SPRI-90827 CGMCC No.2048經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)，其發(fā)酵液中含有殺菌活性物質(zhì)，對(duì)因病原真菌引起的植物病害，如灰霉病(Botrytis cinerea)、瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)、瓜類炭疽病(Colletotrichum lagenarium)、水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae)等均有較好的防治效果，可以進(jìn)一步開發(fā)為一種新型的農(nóng)用殺菌劑。
序列表
<110>上海市農(nóng)藥研究所
<120>一種灰色鏈霉菌及其應(yīng)用
<130>P5071043
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1478
<212>DNA
<213>Streptomyces griseochromogenes
<220>
<221>16SrDNA
<222>(1)..(1478)
<400>1
gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gatgaagccc ttcggggtgg 60
attagtggcg aacgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc cttcactctg ggacaagccc 120
tggaaacggg gtctaatacc ggatatcact cctgcaggca tctgcggggg tcgaaagctc 180
cggcggtgaa ggatgagccc gcggcctatc agcttgttgg tgaggtaatg gctcaccaag 240
gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca ctgggactga gacacggccc 300
agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc 360
gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct ctttcagcag ggaagaagcg 420
aaagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480
cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag agctcgtagg cggcttgtca 540
cgtcgggtgt gaaagcccgg ggcttaaccc cgggtctgca ttcgatacgg gctagctaga 600
gtgtggtagg ggagatcgga attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga 660
acaccggtgg cgaaggcgga tctctgggcc attactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg720
gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acggtgggaa ctaggtgttg780
gcgacattcc acgtcgtcgg tgccgcagct aacgcattaa gttccccgcc tgcggagtac840
cggcgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaaccagc ggagcatgtg900
gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatacaccg gaaagcatta960
gagatagtgc cccccttgtg gtcggtgtac aggtggtgca tggctgtcgt cagctcgtgt1020
cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgttctgtgt tgccagcatg1080
cccttcgggg tgatggggac tcacaggaga ccgccggggt caactcggag gaaggtgggg1140
acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca cacgtgctac aatggccggt1200
acaatgagct gcgataccgt gaggtggagc gaatctcaaa aagccggtct cagttcggat1260
tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagttgctag taatcgcaga tcagcattgc1320
tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcacga aagttggtaa1380
cacccgaagc cggtggccca accccttgtg ggagggagtc gtcgaaggtg ggactagcga1440
ttgggacgaa gtcgtaacaa ggtagccgta ccggaagg1478
權(quán)利要求
1、一種灰色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-92827，其特征在于，該菌株的保藏號(hào)為CGMCC No.2048。
2、如權(quán)利要求1所述的灰色鏈霉菌SPRI-90827，其特征在于，該菌株的種子培養(yǎng)條件為
在28℃下培養(yǎng)36-40小時(shí)；培養(yǎng)基重量百分比組成葡萄糖2％、淀粉5％、花生餅粉2％、黃豆餅粉1％、蛋白胨0.1％、酵母膏0.4％、氯化鈉0.2％、硫酸鎂0.5％、硝酸胺0.2％、磷酸氫二鉀0.05％，PH 7.2。
3、如權(quán)利要求1所述的灰色鏈霉菌SPRI-90827，其特征在于，該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件為
在28℃下通氣攪拌培養(yǎng)90-96小時(shí)；培養(yǎng)基重量百分比組成葡萄糖2％、淀粉5％、花生餅粉2％、黃豆餅粉1％、蛋白胨0.1％、酵母膏0.4％、氯化鈉0.2％、硫酸鎂0.5％、硝酸胺0.2％、磷酸氫二鉀0.05％。
4、如權(quán)利要求1所述的灰色鏈霉菌SPRI-90827，其特征在于，該菌株具有SEQ IDNO1所示的16SrDNA序列。
5、權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的灰色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-92827的應(yīng)用，其特征在于，用于通過發(fā)酵生產(chǎn)農(nóng)用殺菌劑。
6、如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵的條件為
在28℃下通氣攪拌培養(yǎng)90-96小時(shí)；培養(yǎng)基重量百分比組成葡萄糖2％、淀粉5％、花生餅粉2％、黃豆餅粉1％、蛋白胨0.1％、酵母膏0.4％、氯化鈉0.2％、硫酸鎂0.5％、硝酸胺0.2％、磷酸氫二鉀0.05％。
7、如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，以所述灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)SPRI-92827的發(fā)酵液生產(chǎn)農(nóng)用殺菌劑。
8、如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述農(nóng)用殺菌劑用于防治灰霉病(Botrytiscinerea)、瓜白粉病(Sphaerotheca filiginea)、瓜類炭疽病(Colletotrichum lagenarium)和水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種灰色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-92827CGMCC No.2048，通過發(fā)酵培養(yǎng)該菌株得到的培養(yǎng)物可用于防治灰霉病(Botrytis cinerea)、瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)、瓜類炭疽病(Colletotrichum lagenarium)和水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae)等多種作物病害。
文檔編號(hào)C12R1/545GK101311262SQ20071004099
公開日2008年11月26日 申請(qǐng)日期2007年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月22日
發(fā)明者顧學(xué)斌, 陶黎明, 倪長(zhǎng)春, 徐文平, 磊 王, 宙 沈, 楊巍民, 磊 郭, 張育雷, 倪瑋韡, 星 楊, 沈寅初 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)藥研究所, 上海南方農(nóng)藥研究中心