專利名稱：一種準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的蓑羽鶴性別鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的蓑羽鶴性別鑒定的方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
性染色體連鎖的EE0.6(0.6kb-EcoRI-fragment)基因是從雞的W染色體克隆而來(lái)的，是一段單一序列，在目前已被檢測(cè)過(guò)的平胸和非平胸鳥類中都是保守的，可以選擇合適的引物對(duì)Z、W染色體上的同源拷貝進(jìn)行特異性擴(kuò)增來(lái)鑒定性別。由于雌性為ZW型，雄性為ZZ型，因此對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)時(shí)，可在雌性得到不同長(zhǎng)度的片段，而雄性只能得到相同長(zhǎng)度的片段。Itoh等(2001)通過(guò)利用EE1和EE4引物組合、EE2和EE3引物組合對(duì)EE0.6基因上的片段進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)鑒定丹頂鶴、白枕鶴、蛇鷲、東方白鸛等數(shù)種鳥類的性別，并獲得了較好的結(jié)果；陳武等(2006)利用單對(duì)引物分別對(duì)W和Z染色體上的同源序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增，也成功地對(duì)丹頂鶴、戴冕鶴、黑鸛等幾種鳥類的性別進(jìn)行了鑒定。
目前，作為一種簡(jiǎn)便的性別鑒定方法，應(yīng)用EE0.6對(duì)鳥類，尤其是蓑羽鶴進(jìn)行性別鑒定的研究很少，比較常用的是CHD基因，即染色體螺旋蛋白基因(Chromobox-heli-case-DNA binding gene)，EE0.6基因這兩對(duì)引物組合的應(yīng)用也很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)性強(qiáng)的蓑羽鶴性別鑒定的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是先通過(guò)兩對(duì)引物組合對(duì)蓑羽鶴基因組DNA的W、Z染色體上的特異序列進(jìn)行擴(kuò)增，再經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，用Gene Genius凝膠成像儀進(jìn)行拍照記錄，根據(jù)帶型判斷性別雌性為兩條帶，雄性為一條帶；所述兩對(duì)引物組合為EE1(5’-ACAGTTTGTCTGTCTCCGGGGAA/AGCTGGAYTTCAGWSCATCTTCT-3’)、EE2(5’-TAGGCTGCAGAATACAGCAT/TTGTGCAGTTCTAGTCCATA-3’)和EE3(5’-CACCCTGGATTGGACAACCTATTTC/TCAGAGCACTCTTTCCAGGAA-3’)、EE4(5’-AAGCATAGAAACAATGTGGGAC/AACTCTGTCTGGAAGGACTT-3’)。
本發(fā)明利用對(duì)EE0.6基因在W、Z染色體上的特異序列的擴(kuò)增所產(chǎn)生的不同帶型來(lái)判斷蓑羽鶴性別。本發(fā)明無(wú)需特殊的儀器要求，只需要掌握一般的PCR和瓊脂糖凝膠電泳的操作，就可進(jìn)行簡(jiǎn)便的鑒定，可重復(fù)性強(qiáng)，簡(jiǎn)便易行。采用兩個(gè)引物組合EE1和EE2組合、EE3和EE4組合，對(duì)蓑羽鶴的性連鎖基因EE0.6在W和Z染色體上的特異片段進(jìn)行擴(kuò)增鑒定其性別，證明了EE0.6基因在鶴中是保守的，這兩對(duì)引物組合可以準(zhǔn)確地鑒定蓑羽鶴的性別。利用分子方法對(duì)蓑羽鶴進(jìn)行性別鑒定，能盡量減小對(duì)蓑羽鶴的傷害，盡早將繁殖期的蓑羽鶴進(jìn)行配對(duì)，保證人工繁殖和人工育種的正確進(jìn)行，方便不同動(dòng)物園和保護(hù)區(qū)之間蓑羽鶴的交流。本發(fā)明所采用的引物組合同樣適合于其它非平胸鳥類的性別鑒定。
本發(fā)明在對(duì)蓑羽鶴基因組DNA的W、Z染色體上的特異序列進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，采用10μL體系取0.5 U Taq DNA聚合酶、1.5mM MgCl2、200μM dNTP、4pmol引物和100ng蓑羽鶴基因組DNA，加雙蒸水補(bǔ)至10μL。
蓑羽鶴基因組DNA的提取方法是有所改進(jìn)的酚-氯仿萃取法取抗凝血30μL于1.5mL離心管中，加入300μL裂解液，裂解24小時(shí)后，加入6μL蛋白酶K和2μL RNase，55℃水浴10～15小時(shí)后，分別加等體積的飽和酚、苯酚-氯仿-異戊醇混合液和氯仿-異戊醇混合液各抽提一次，留上清，加冰無(wú)水乙醇沉淀DNA，70％酒精洗滌，干燥，TE溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?br>

圖1為EE1和EE2引物組合對(duì)蓑羽鶴的性別鑒定結(jié)果(一條帶為雄性，兩條帶為雌性)。
圖2為EE3和EE4引物組合對(duì)蓑羽鶴的性別鑒定結(jié)果(一條帶為雄性，兩條帶為雌性)。
具體實(shí)施例方式
1、采用有所改進(jìn)的酚-氯仿萃取法提取蓑羽鶴基因組DNA取抗凝血30μL于1.5mL離心管中，加入300μL裂解液(2M尿素，100mM Tris-HCl，100mM EDTA，1％SDS，pH8.0)裂解一天后，加入6μL蛋白酶K(PrK，濃度為5μg/μL)和2μLRNase(濃度為2.5μg/μL)，55℃水浴10～15小時(shí)。
分別加等體積的飽和酚、苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)混合液和氯仿-異戊醇(24∶1)混合液各抽提一次，留上清，加冰無(wú)水乙醇沉淀DNA，70％酒精洗滌，干燥，TE溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、以所得的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)采用10μL體系取0.5 U Taq DNA聚合酶、1.5mM MgCl2、200μMdNTP、4pmol引物EE1和EE2或EE3和EE4，100ng模板DNA，加雙蒸水補(bǔ)至10μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃/10min；95℃/50s，57.4℃/50s或56.2℃/50s，72℃/50s，30個(gè)循環(huán)；72℃/10min，4℃保存。
3、1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)1.5％瓊脂糖凝膠120V電泳30分鐘，用Gene Genius凝膠成像儀進(jìn)行拍照記錄，根據(jù)帶型判斷性別雌性為兩條帶，雄性為一條帶。
(1)EE1和EE2引物組合擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為EE0.6Z 151bp，EE0.6W190bp(如圖1)；(2)EE3和EE4引物組合擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為EE0.6Z 252bp，EE0.6W300bp(如圖2)。
權(quán)利要求
1.一種準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的蓑羽鶴性別鑒定方法，其特征在于先通過(guò)兩對(duì)引物組合對(duì)蓑羽鶴基因組DNA的W、Z染色體上的特異序列進(jìn)行擴(kuò)增，再經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，用Gene Genius凝膠成像儀進(jìn)行拍照記錄，根據(jù)帶型判斷性別雌性為兩條帶，雄性為一條帶；所述兩對(duì)引物組合為EE1(5’-ACAGTTTGTCTGTCTCCGGGGAA/AGCTGGAYTTCAGWSCATCTTCT-3’)、EE2(5’-TAGGCTGCAGAATACAGCAT/TTGTGCAGTTCTAGTCCATA-3’)和EE3(5’-CACCCTGGATTGGACAACCTATTTC/TCAGAGCACTCTTTCCAGGAA-3’)、EE4(5’-AAGCATAGAAACAATGTGGGAC/AACTCTGTCTGGAAGGACTT-3’)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的蓑羽鶴性別鑒定方法，其特征在于在對(duì)蓑羽鶴基因組DNA的W、Z染色體上的特異序列進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，采用10μL體系取0.5 U Taq DNA聚合酶、1.5mM MgCl2、200μM dNTP、4pmol引物和100ng蓑羽鶴基因組DNA，加雙蒸水補(bǔ)至10μL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的蓑羽鶴性別鑒定方法，其特征在于蓑羽鶴基因組DNA的提取方法是取抗凝血30μL于1.5mL離心管中，加入300μL裂解液，裂解24小時(shí)后，加入6μL蛋白酶K和2μL Rnase，55℃水浴10～15小時(shí)后，分別加等體積的飽和酚、苯酚-氯仿-異戊醇混合液和氯仿-異戊醇混合液各抽提一次，留上清，加冰無(wú)水乙醇沉淀DNA，70％酒精洗滌，干燥，TE溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
一種準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的蓑羽鶴性別鑒定方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。先通過(guò)兩對(duì)引物組合對(duì)蓑羽鶴基因組DNA的W、Z染色體上的特異序列進(jìn)行擴(kuò)增，再經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，用Gene Genius凝膠成像儀進(jìn)行拍照記錄，根據(jù)帶型判斷性別雌性為兩條帶，雄性為一條帶。本發(fā)明利用對(duì)EE0.6基因在W、Z染色體上的特異序列的擴(kuò)增所產(chǎn)生的不同帶型來(lái)判斷蓑羽鶴性別。無(wú)需特殊的儀器要求，只需要掌握一般的PCR和瓊脂糖凝膠電泳的操作，就可進(jìn)行簡(jiǎn)便的鑒定，可重復(fù)性強(qiáng)，簡(jiǎn)便易行。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101086013SQ20071002438
公開日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2007年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月18日
發(fā)明者陳國(guó)宏, 張紅霞, 包文斌, 吳信生, 徐琪, 胡飛, 孫志明, 束婧婷, 程金花, 陳同海, 王金美, 劉鑫, 吳云良, 陳清, 謝飛 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)