專(zhuān)利名稱：抗幽門(mén)螺桿菌感染的尿素酶表位融合肽脂質(zhì)體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及霍亂毒素B亞單(CTB)位與幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位(UreB)表位融合肽(CtUBE)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、表達(dá)、純化及CtUBE脂質(zhì)體疫苗的制備，提供了一種抗幽門(mén)螺桿菌感染的預(yù)防與治療性疫苗。
背景技術(shù)：
幽門(mén)螺桿菌是引起胃炎、消化道潰瘍及胃癌等疾病的主要病因，所有臨床分離的幽門(mén)螺桿菌菌株均表達(dá)尿素酶，而且同時(shí)高度保守。尿素酶可以分解尿素產(chǎn)生氨氣，中和胃酸，為幽門(mén)螺桿菌的定植提供有利環(huán)境。由于尿素酶的這些特點(diǎn)，使其成為抗幽門(mén)螺桿菌疫苗研制中候選抗原的熱點(diǎn)。但有研究表明，用完整的尿素酶免疫動(dòng)物并不能很好的抑制尿素酶的活性，因而不能完全阻止幽門(mén)螺桿菌在胃內(nèi)的定植(Infect Immun 1992，604826-31)。進(jìn)一步研究表明，完整的尿素酶可以刺激機(jī)體產(chǎn)生兩種單克隆抗體，其中一種為可以促進(jìn)尿素酶活性的構(gòu)象表位特異性抗體，另一種為B亞單位上的線性表位特異性抗體，線性表位特異性抗體可以抑制構(gòu)象表位特異性抗體對(duì)尿素酶活性的促進(jìn)作用(Infect Immun 2001，696597-603；Biomedical Research 2005，2635-42)。已經(jīng)有大量實(shí)驗(yàn)表明，尿素酶B亞單位(UreB)不僅對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染具有預(yù)防作用，而且還可以在一定程度上清除體內(nèi)已經(jīng)感染的幽門(mén)螺桿菌。這些結(jié)果提示，如果用尿素酶B亞單位的表位刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，可以避免產(chǎn)生構(gòu)象表位特異性抗體，從而增強(qiáng)以尿素酶為免疫原所刺激的免疫反應(yīng)對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染的抑制和清除效果。
霍亂毒素(CT)是霍亂弧菌分泌的一種不耐熱腸毒素，由1個(gè)28kDa的A亞基(CTA)和5個(gè)完全相同的11.6kDa的B亞基(CTB)組成，形成AB結(jié)構(gòu)。其中CTA具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，為CT的毒性亞基；CTB可與大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1特異性結(jié)合，為CT的無(wú)毒性亞基，每個(gè)CTB與GM1都有很高的親和力，5個(gè)CTB彼此以非共價(jià)鍵結(jié)合形成五聚體，充當(dāng)CTA與受體細(xì)胞之間的橋梁。CTB與GM1結(jié)合后，將CTA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞膜上或胞漿內(nèi)，從而激活G蛋白，活化的G蛋白又激活腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高，最終引起腹瀉。由于CTB為CT的無(wú)毒性亞單位及其特異性結(jié)合GM1活性，因而被用作黏膜免疫佐劑受到了廣泛的研究。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CTB是一種很好的黏膜免疫佐劑和弱免疫原的載體，同時(shí)還可以賦予半抗原免疫原性，增強(qiáng)弱免疫原的免疫原性。
脂質(zhì)體為一種生物膜雙分子層囊性微球，由水相中脂質(zhì)雙層疏水區(qū)的脂肪鏈通過(guò)疏水鍵相互聚集自行收縮排列而形成，在其形成過(guò)程中可包裹水溶性成分獲得顆粒形態(tài)，被包裹的內(nèi)容物可以受到脂質(zhì)體膜的保護(hù)。水溶性抗原包被于脂質(zhì)體中可借助脂質(zhì)體的傳遞被直接送達(dá)抗原提呈細(xì)胞的胞質(zhì)中，脂質(zhì)體膜基質(zhì)及附加的修飾成分還可以直接活化免疫細(xì)胞的信號(hào)傳遞系統(tǒng)。在脂質(zhì)體膜的保護(hù)下，抗原分子可以不受體液成分的破壞，脂質(zhì)體類(lèi)疫苗可用于多種黏膜途徑的免疫接種。通過(guò)選擇脂質(zhì)體膜基質(zhì)組分及對(duì)脂質(zhì)體膜加以修飾，還可以選擇所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的類(lèi)型。淋巴結(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞都能夠吞噬脂質(zhì)體，在這些細(xì)胞內(nèi)抗原經(jīng)過(guò)加工表達(dá)于I型主要組織相容性分子(MHC I)，激發(fā)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫。因而，脂質(zhì)體被廣泛用作疫苗的傳遞載體和免疫佐劑。
在幽門(mén)螺桿菌感染的預(yù)防與治療研究中，發(fā)展了各種動(dòng)物模型，利用這些動(dòng)物模型，可以揭示幽門(mén)螺桿菌在許多相關(guān)性疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中的作用，以及對(duì)幽門(mén)螺桿菌疫苗的預(yù)防和保護(hù)效果的評(píng)價(jià)。小鼠體型小、易繁殖、來(lái)源便利、屬系多樣是作為動(dòng)物模型的好材料。通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究，已經(jīng)成功地在小鼠體內(nèi)建立了胃炎和十二指腸炎模型，此模型炎癥部位同人類(lèi)相似，被廣泛應(yīng)用于抗幽門(mén)螺桿菌疫苗的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是提供一種抗幽門(mén)螺桿菌感染的尿素酶表位融合肽脂質(zhì)體疫苗。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該脂質(zhì)體疫苗的制備方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供幽門(mén)螺桿尿素酶B亞單位與黏膜佐劑霍亂毒素B亞單位融合肽的制備方法(包括融合肽的基因克隆與工程菌的構(gòu)造、表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化)。
本發(fā)明的最后一個(gè)目的是公開(kāi)該質(zhì)體疫苗的用途。
用CTB的融合肽進(jìn)行疫苗研究已經(jīng)有不少報(bào)道，但多數(shù)是將CTB與一完整的蛋白或亞基融合。本發(fā)明將CTB的編碼序列與幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)表位(CHHLDKSIKEDVQFADSRI)的編碼序列連接，克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a，構(gòu)建了新的幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)表位與CTB的融合肽(CtUBE)表達(dá)質(zhì)粒(pET-CtUBE)。通過(guò)熱激法將質(zhì)粒pET-CtUBE轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)、分離、復(fù)性及純化條件進(jìn)行摸索，建立了融合肽在大腸桿菌中表達(dá)、分離、復(fù)性及純化的體系。通過(guò)逆相蒸發(fā)法制備融合肽CtUBE脂質(zhì)體，對(duì)影響脂質(zhì)體包封率的主要因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，建立了融合肽CtUBE脂質(zhì)體疫苗的制備方法。利用BALB/c小鼠模型對(duì)此脂質(zhì)體疫苗的預(yù)防與治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明融合肽CtUBE脂質(zhì)全疫苗在不需要加入佐劑的情況下即可以有效誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異性抗UreB血清IgG和黏膜IgA抗體，預(yù)防幽門(mén)螺桿菌在BALB/c小鼠胃內(nèi)的定植，明顯降低被感染小鼠胃內(nèi)細(xì)菌量，促進(jìn)胃組織損傷的愈合。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明新型融合肽CtUBE脂質(zhì)體疫苗對(duì)H.pylori的感染具有明顯的預(yù)防與治療作用。


圖1ctb基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖(1DL2000 DNA Marker；2，3ctb基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4.陰性對(duì)照)。
圖2融合肽表達(dá)質(zhì)粒pET-CtUBE結(jié)構(gòu)圖(ctb編碼序列插入在NcoI和EcoRI位點(diǎn)之間，UreB表位編碼序列UB-33插入在EcoRI和XhoI位點(diǎn)之間)。
圖3融合肽表達(dá)質(zhì)粒pET-CtUBE測(cè)序圖(3個(gè)實(shí)線框分別標(biāo)出XhoI、EcoRI和NcoI酶切位點(diǎn)，虛線框標(biāo)出表位編碼序列，下劃線部分為ctb基因序列)。
圖4融合肽CtUBE的表達(dá)分析(12％SDS-PAGE；1-4分別為在1mM IPTG誘導(dǎo)5h、4h、3h和2h后的表達(dá)情況；5蛋白質(zhì)分子量Marker；6未經(jīng)誘導(dǎo)的工程菌)。
圖5融合肽CtUBE純化后的SDS-PAGE分析(1經(jīng)Wash Buffer洗滌后的CtUBE包涵體；2DEAE Sepharose FF柱純化后的CtUBE；3蛋白質(zhì)分子量Marker)。
圖6復(fù)性純化后CtUBE的ELISA分析。
圖7負(fù)染后CtUBE脂質(zhì)體的透射電鏡照片。
圖8特異性血清IgG和黏膜IgA滴度測(cè)定結(jié)果。
圖9快速尿素酶測(cè)驗(yàn)(RUT)、細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)及胃炎組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果。
圖10胃炎組織病理切片圖(HE染色，100X；A為PBS對(duì)照組小鼠感染幽門(mén)螺桿菌后的胃組織切片，B為CtUBE脂質(zhì)體疫苗預(yù)防免疫后受到保護(hù)的胃組織切片，C為CtUBE脂質(zhì)體疫苗治療接種后的未完全愈合的胃組織切片)。
圖8和9中Liposome+CtUBE表示CtUBE脂質(zhì)體免疫組；Liposome表示空白脂質(zhì)體組；PBS表示PBS對(duì)照組；Uninfected表示無(wú)免疫無(wú)細(xì)菌侵染組。
具體實(shí)施例方式
材料(1)菌株與質(zhì)粒大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)，Escherichia coli DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。
質(zhì)粒pET28a購(gòu)自Novagen公司。
(2)動(dòng)物無(wú)特殊病原菌(SPF)級(jí)雌性BALB/c小鼠，5周齡，重16-20g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)SCXK(滬)2003-0003。
(3)工具酶Taq DNA聚合酶購(gòu)自上海賽百勝基因技術(shù)有限公司；限制酶NcoI、EcoRI、XhoI及DNA連接酶購(gòu)自MBI Fermentas公司；溶菌酶購(gòu)自上海生工，DNase I購(gòu)自華美生物工程公司。
(4)其它主要試材3、3′、5、5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、弗氏完全和不完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京博奧森公司；DEAE Sepharose FF購(gòu)自Whatman公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工；考馬斯亮蘭檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司。
(5)主要緩沖溶液裂解液1mg/ml溶菌酶、1mmol/L EDTA、50mmol/L NaCl、50mmol/L Tris，pH 8.0；Wash Buffer50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl、0.5％Triton X-100，pH8.0；包涵體溶解緩沖液50mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、100mmol/L NaCl、0.1mmol/L PMSF、8mol/L脲；
Renaturation Buffer50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，50mmol/L甘氨酸，5％甘油，3mmol/L半胱氨酸，0.4mmol/L胱氨酸；平衡緩沖液30mmol/L Tris-HCl，pH9.0；PBS8mM Na2HPO4，4.5mM KH2PO4，137mM NaCl，2.6mM KCl，pH8.04。
實(shí)施例1 融合肽CtUBE表達(dá)載體的構(gòu)建(1)設(shè)計(jì)合成PCR引物，同時(shí)引入NcoI和EcoRI位點(diǎn)PCTB015′-AAAAACCATGGGCACACCTCAAAATATTACTGATTTG-3′，PCTB025′-AAGAATTCGCCGCCATTTGCCATACTAATTGCGGCAATCGCAT-3′；(2)以霍亂弧菌基因組DNA為模板，通過(guò)PCR方法(94℃預(yù)變性3min；94℃ 45s，56℃ 50s，72℃ 50s，40循環(huán)；72℃延伸10min)擴(kuò)增CTB編碼序列(附圖1)；(3)PCR產(chǎn)物用NcoI和EcoRI雙酶切后克隆至pET-28a的多克隆位點(diǎn)，獲得中間載體pET-CtUBE-Pre，中間載體轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH5α進(jìn)行擴(kuò)增；(4)合成UreB表位編碼序列，同時(shí)引入EciRI和XhoI位點(diǎn)UBP15′-AATTCTGCCACCACTTGGATAAAAGCATTAAAGAAGATGTTCAGTTCGCTGATTCAAGGATCTAATAAC-3′；UBP25′TCGAGTTATTAGATCCTTGAATCAGCGAACTGAACATCTTCTTTAATGCTTTTATCCAAGTGGTGGCAG-3′；(5)UBP1和UBP2混合退火(94℃ 2min，56 5min)后，克隆到中間載體pET-CtUBE-Pre的EcoRI和XhoI位點(diǎn)，獲得融合蛋白表達(dá)載體pET-CtUBE(附圖2)；(6)質(zhì)粒pET-CtUBE轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，用含Kan(70mg/L)的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定，PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序確證(附圖3)。
結(jié)果表明，融合肽編碼序列插入位點(diǎn)、拼接順序及編碼堿基均與設(shè)計(jì)相符，克隆的ctb基因序列通過(guò)BLAST比較分析，與GENBANK中的ctb基因序列同源性在98％以上。
實(shí)施例2 融合肽CtUBE表達(dá)、分離、復(fù)性及純化體系的建立(1)將測(cè)序正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接入LB培養(yǎng)基，1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(附圖4)，經(jīng)12％SDS-PAGE分析融合蛋白表達(dá)形式，同時(shí)用電子掃描分析表達(dá)量；(2)融合肽以包涵體形式表達(dá)，擴(kuò)大表達(dá)培養(yǎng)后，用含溶菌酶的裂解液裂解細(xì)菌細(xì)胞，離心收集包涵體；(3)包涵體用Wash Buffer洗滌5次后，用包涵體溶解緩沖液溶解，并緩緩加入約10倍體積的Renaturation Buffer，轉(zhuǎn)入4℃復(fù)性48小時(shí)以上；(4)復(fù)性好的融合蛋白經(jīng)平衡緩沖液充分透析后，上DEAE Sepharose FF陰離子交換層析柱純化，并進(jìn)行SDS-PAGE分析純度；(5)用5μg/ml神經(jīng)節(jié)苷脂GM1包被96孔板，ELISA方法分析融合蛋白與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1及抗UreB血清的識(shí)別結(jié)合活性(附圖5)。
結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化菌在1mM IPTG誘導(dǎo)4h時(shí)，融合肽表達(dá)量占菌體總蛋白34.7％(附圖4)；溶菌酶裂解細(xì)胞，分離收集的包涵體經(jīng)Wash Buffer洗滌后純度可達(dá)91.9％，經(jīng)一次陰離子交換層析后，純度可達(dá)95.6％(附圖5)；ELISA分析CtUBE可與GM1結(jié)合，同時(shí)也可被抗UreB血清識(shí)別(附圖6)。
實(shí)施例3 融合肽CtUBE脂質(zhì)體疫苗的制備(1)在茄形瓶中分別加入0.314g卵磷脂和0.126g膽固醇，并加入6ml氯仿使卵磷脂和膽固醇溶解混勻；(2)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干氯仿，加入2.26ml氯仿和3.74ml乙醚，溶解卵磷脂和膽固醇薄膜；(3)加入2ml 1mg/ml的CtUBE溶液(溶解于pH8.04的PBS)，冰浴超聲4min；(4)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓至0.05MPa左右，在37℃下蒸發(fā)除盡有機(jī)溶劑；(5)向茄形瓶中加入10ml PBS(pH8.04)高速旋轉(zhuǎn)3-4h，得到淡乳黃色脂質(zhì)體混懸液；(6)依次用1.0μm、0.8μm和0.4μm微孔濾膜調(diào)節(jié)脂質(zhì)體粒徑；(7)取脂質(zhì)體混懸液1ml加入1.5ml離心管，4℃ 40000×g離心1h；(8)吸出上清后加入pH8.04的PBS緩沖液600μl，混勻后于4℃ 40000×g繼續(xù)離心1h，吸出上清，同法繼續(xù)清洗脂質(zhì)體1次；(9)將上清液合并為一管，用考馬斯亮蘭檢測(cè)試劑盒測(cè)定上清液中總蛋白含量；(10)按以下計(jì)算公式計(jì)算包封率包封率(Qw％)＝(加入總蛋白量-上清中蛋白量)/加入總蛋白量×100％；(11)取少量脂質(zhì)體，負(fù)染后用電鏡觀測(cè)脂質(zhì)體的形狀及粒徑；(12)脂質(zhì)體存于4℃存放30天，觀察穩(wěn)定性，檢測(cè)包封率，確定其滲濾情況。
結(jié)果表明，制備的脂質(zhì)體淡黃色，無(wú)沉淀及團(tuán)聚顆粒，分散均勻，無(wú)沉降無(wú)分層；包封率71.4％，粒徑分布在100-500nm(附圖7)，球形或楕球形；4℃存放30天后，脂質(zhì)體無(wú)明顯變化，檢測(cè)包封率為68.6％，表明低溫下存放穩(wěn)定。
實(shí)施例4 融合肽CtUBE脂質(zhì)體疫苗的藥效學(xué)研究SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為7組(n＝14)，3組小鼠實(shí)行方案1(預(yù)防方案，1組為免疫組，另2組分別為空白脂質(zhì)體對(duì)照和PBS對(duì)照組)，3組小鼠實(shí)行方案2(治療方案，1組為免疫組，另2組分別為空白脂質(zhì)體對(duì)照和PBS對(duì)照組)，1組小鼠用作空白對(duì)照(無(wú)免疫接種和感染接種)。
方案1(預(yù)防方案)1.禁食12h后，在免疫組每只小鼠灌喂0.2ml CtUBE脂質(zhì)體疫苗(約40μg CtUBE)，PBS對(duì)照組和空白脂質(zhì)體對(duì)照組則分別灌喂0.2ml PBS或空白脂質(zhì)體，灌胃后繼續(xù)禁食3h；2.1周后，再次以等量的CtUBE脂質(zhì)體疫苗、PBS或空白脂質(zhì)體灌喂各對(duì)應(yīng)組小鼠，同法在每隔1周后進(jìn)行灌喂，共灌喂4次；3.第4次灌胃2周后，各組每只小鼠用0.3ml新鮮培養(yǎng)的H.pylori SS1(懸浮于0.2MNaHCO3溶液中，細(xì)菌濃度約1×108CFUs/ml)灌胃接種；4.細(xì)菌接種每隔3天進(jìn)行1次，共接種4次，接種后小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)3周后，進(jìn)行方案3(檢測(cè)方案)。
方案2(治療方案)
1.禁食12h后，各組每只小鼠用0.3ml新鮮培養(yǎng)的H.pylori SS1(懸浮于0.2M NaHCO3溶液中，細(xì)菌濃度約1×108CFUs/ml)灌胃接種，灌胃后繼續(xù)禁食3h；2.細(xì)菌接種每隔3天進(jìn)行1次，共接種4次；3.第4次灌胃接種細(xì)菌2周后，進(jìn)行免疫接種免疫組每只小鼠灌喂0.2ml CtUBE脂質(zhì)體疫苗(約40μg CtUBE)，PBS對(duì)照組和空白脂質(zhì)體對(duì)照組則分別灌喂0.2ml PBS或空白脂質(zhì)體；4.1周后，再次以等量的CtUBE脂質(zhì)體疫苗、PBS或空白脂質(zhì)體灌喂各對(duì)應(yīng)組小鼠，同法在每隔1周后進(jìn)行灌胃，免疫接種共4次；5.第4次免疫接種完成后，小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)3周，進(jìn)行方案3(檢測(cè)方案)。
方案3(檢測(cè)方案)1.IgG檢測(cè)處死小鼠，收集血清，用ELISA方法檢測(cè)血清抗UreB特異性抗體IgG滴度(滴度表示為OD450nm值高于對(duì)照0.4時(shí)血清的稀釋倍數(shù)，附圖8)；2.IgA檢測(cè)取出胃體，沿小彎處剪開(kāi)，并將胃組織縱向均分為3份，其中1份連同胃內(nèi)容物轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，加入0.3ml Extraction Buffer，離心后取上清用ELlSA方法檢測(cè)黏膜抗UreB特異性抗體IgA滴度(滴度表示為OD450nm值高于對(duì)照0.2時(shí)提取液的稀釋倍數(shù)，附圖8)；3.快速尿素酶檢測(cè)(RUT)取1份胃組織，稱重后加入0.5ml生理鹽水，勻漿后取0.25ml勻漿液加入3ml含有酚紅的尿素肉湯，37℃培養(yǎng)4h后，測(cè)OD550nm值，若測(cè)得OD550nm值高于空白對(duì)照平均值2倍時(shí)，判斷為幽門(mén)螺桿菌感染(附圖9)；4.細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)取胃組織勻漿液進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)丅HI瓊脂平板(含TMB，多粘菌素和萬(wàn)古霉素)，于微需氧環(huán)境下37℃培養(yǎng)4-5天，對(duì)菌落克隆(半透明淺灰色菌落)進(jìn)行計(jì)數(shù)(附圖9)，并對(duì)細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生化反應(yīng)檢測(cè)(氧化酶、過(guò)氧化氫酶等)。
5.組織病理學(xué)檢測(cè)取1份胃組織，經(jīng)甲醛固定石蠟包埋后，于光鏡下HE染色觀察痰癥程度(附圖10)，并對(duì)胃炎進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分(附圖9)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下0分-無(wú)明顯可見(jiàn)白細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)浸潤(rùn)；1分在胃粘膜固有層深部有少許散在白細(xì)胞浸潤(rùn)；2分-在胃粘膜深部至中部固有層有中等程度白細(xì)胞浸潤(rùn)；3分-在胃粘膜深部至中部固有層有大量白細(xì)胞浸潤(rùn)，少量微膿腫；4分-在胃粘膜固有層全層至黏膜下層有嚴(yán)重的彌散性白細(xì)胞浸潤(rùn)，微膿腫較多。
結(jié)果顯示1.對(duì)比PBS對(duì)照組CtUBE脂質(zhì)體疫苗預(yù)防組小鼠血清抗UreB特異性IgG和黏膜抗UreB特異性IgA均有極顯著增加(p＜0.001)；空白脂質(zhì)體組與PBS組的血清抗UreB特異性IgG和黏膜抗UreB特異性IgA無(wú)顯著差異(p值分別為0.499和0.122；附圖8A、C)。
2.對(duì)比PBS對(duì)照組CtUBE脂質(zhì)體疫苗治療組小鼠血清抗UreB特異性IgG有顯著增加(p＝0.001＜0.01)，而黏膜抗UreB特異性IgA有極顯著增加(p＜0.001)；空白脂質(zhì)體組與PBS組的血清抗UreB特異性IgG和黏膜抗UreB特異性IgA無(wú)顯著差異(p值分別為0.390和0.244；附圖8B、D)。
3.對(duì)比PBS對(duì)照組CtUBE脂質(zhì)體疫苗預(yù)防組小鼠的RUT、胃內(nèi)細(xì)菌定植量及胃炎組組織病理評(píng)分均具有極顯著差異(p＜0.001)；空白脂質(zhì)體組小鼠的RUT、胃內(nèi)細(xì)菌定植量及胃炎組組織病理評(píng)分無(wú)差異(p值分別為0.954、0.631和0.470；附圖9A、C、E)。
4.對(duì)比PBS對(duì)照組CtUBE脂質(zhì)體疫苗治療組小鼠的RUT、胃內(nèi)細(xì)菌定植量及胃炎組組織病理評(píng)分均具有極顯著差異(p＜0.001)；空白脂質(zhì)體組小鼠的RUT、胃內(nèi)細(xì)菌定植量及胃炎組組織病理評(píng)分無(wú)差異(p值分別為0.764、0.198和0.828；附圖9B、D、F)。
5.對(duì)比PBS對(duì)照組CtUBE脂質(zhì)體疫苗預(yù)防組小鼠胃受到明顯保護(hù)，胃組織切片經(jīng)顯微觀察很少有炎細(xì)胞侵潤(rùn)，CtUBE脂質(zhì)體疫苗治療組小鼠胃的炎性損傷有不同程度的愈合，炎細(xì)胞侵潤(rùn)程度與PBS級(jí)相比有明顯好轉(zhuǎn)(附圖10)。
結(jié)果說(shuō)明1.用CtUBE脂質(zhì)體疫苗免疫小鼠，無(wú)論是預(yù)防接種還是治療接種，均可明顯增加血清抗UreB特異性IgG和黏膜抗UreB特異性IgA的分泌。
2.用CtUBE脂質(zhì)體疫苗免疫小鼠，預(yù)防接種后可明顯抑制H.pylori在小鼠胃內(nèi)的定植，治療接種后，可明顯降低胃內(nèi)菌量，促進(jìn)胃損傷愈合，表明融合肽CtUBE脂質(zhì)體疫苗具有免疫預(yù)防和治療H.pylori感染的作用。
權(quán)利要求
1.抗幽門(mén)螺桿菌感染的尿素酶表位融合肽脂質(zhì)體疫苗，其特征在于該疫苗是將幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位表位與黏膜佐劑霍亂毒素B亞單位融合后的融合蛋白包被于脂質(zhì)體內(nèi)而形成的載藥脂質(zhì)體。
2.按照權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體疫苗，其特征在于該疫苗使用了幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位表位與黏膜佐劑霍亂毒素B亞單位的融合肽作為免疫原，該融合肽結(jié)構(gòu)為幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位表位連接在黏膜佐劑霍亂毒素B亞單位的碳未端。
3.按照權(quán)利要求1和2所述的脂質(zhì)體疫苗，其特征在于使用了幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位表位，該表位的氨基酸序列為CHHLDKSIKEDVQFADSRI。
4.幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位表位與黏膜佐劑霍亂毒素B亞單位的融合肽表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)?；诖竽c桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-28a構(gòu)建，融合肽的編碼序列插入在質(zhì)粒pET-28a的NcoI和XhoI位點(diǎn)，可以在大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞內(nèi)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位表位與霍亂毒素B亞單位的融合肽。
5.幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位表位與黏膜佐劑霍亂毒素B亞單位的融合肽的制備方法，融合肽表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，并通過(guò)IPTG誘導(dǎo)后提取包涵體，經(jīng)洗滌、復(fù)性和DEAE Sepharose FF陰離子交換層析純化后，可得到純度為95.6％的融合肽。
6.按照權(quán)權(quán)利要求4和5所述制備的融合肽，其特征在于可以誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位的血清IgG和黏膜IgA抗體，可單獨(dú)用于疫苗或與藥物載體或其它成分組合制成藥物組合物，或用于生產(chǎn)出能夠有效地防止幽門(mén)螺桿菌附著的抗體藥物。
7.抗幽門(mén)螺桿菌感染的尿素酶表位融合肽脂質(zhì)體疫苗的制備方法，通過(guò)逆向蒸發(fā)法將幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位表位與黏膜佐劑霍亂毒素B亞單位的融合肽包被于脂質(zhì)體，可以獲得包封率71.4％，粒徑分布在100-500nm，分散均勻的球形或楕球形脂質(zhì)體。
8.按照權(quán)權(quán)利要求4、5、6和7制備的脂質(zhì)體疫苗，其特征在于誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位的血清IgG和黏膜IgA抗體，可明顯抑制幽門(mén)螺桿菌在胃內(nèi)的定植，還可以明顯降低已經(jīng)在胃內(nèi)定植的幽門(mén)螺桿菌的細(xì)菌量，可以用作抗幽門(mén)螺桿菌疫苗，或用于生產(chǎn)出能夠有效地防止幽門(mén)螺桿菌附著的抗體藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗幽門(mén)螺桿菌感染的尿素酶表位融合肽脂質(zhì)體疫苗。該疫苗以幽門(mén)螺桿菌尿素酶B亞單位與黏膜佐劑霍亂毒素B亞單位的融合肽為免疫原，用脂質(zhì)體包被該免疫原制備脂質(zhì)體疫苗。該脂質(zhì)體疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，抑制幽門(mén)螺桿菌在胃內(nèi)的定植，同時(shí)可明顯降低已在胃內(nèi)定植的幽門(mén)螺桿菌的菌量。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明提供的疫苗可以用于幽門(mén)螺桿菌感染的預(yù)防和治療。
文檔編號(hào)C12N15/62GK101062015SQ20071002248
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月22日
發(fā)明者吳梧桐, 趙文鋒, 徐旭東 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)