專利名稱：一種天然aflp接頭制備的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是采用基因工程方法，利用引入酶切位點(diǎn)構(gòu)建重組載體，由質(zhì)粒天然擴(kuò)繁接頭，最后制作出用于AFLP實(shí)驗(yàn)的接頭。
背景技術(shù)：
近十年來，大量的分子標(biāo)記技術(shù)用于分子生物學(xué)的研究，如基因組分析、基因克隆、品種鑒定、外源基因?qū)?。最早用來做圖的分子標(biāo)記技術(shù)是RFLP，目前已構(gòu)建了大批的RFLP圖譜。但是，RFLP技術(shù)比較費(fèi)時(shí)，難以分析大量的DNA，而且遺傳圖飽和度低，分子標(biāo)記間距離比較大，不利于定位克隆。
1990年以來，發(fā)展了RAPD、DAF、AP-PCR技術(shù)，這些方法主要根據(jù)PCR技術(shù)，用隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA，在不需要知道DNA序列情況下，產(chǎn)生DNA片段的指紋模式，這些方法最大的缺點(diǎn)是它們對(duì)反應(yīng)條件非常敏感，重復(fù)性差，因而限制了其應(yīng)用。
近年來，發(fā)展了一種新的DNA指紋技術(shù)，叫做AFLP技術(shù)(Amplified fragmentlength polymorphisms)。這種技術(shù)是由Zabeau發(fā)現(xiàn)，并由Vos發(fā)展起來。AFLP技術(shù)是一種選擇性擴(kuò)增限制性片段的方法，這種方法由于結(jié)合了RFLP和PCR的優(yōu)點(diǎn)，具有比RAPD更大的優(yōu)越性。自從AFLP技術(shù)問世以來，已廣泛用于基因鑒定、基因作圖、基因表達(dá)等方面，該方法有著廣闊的應(yīng)用前景。
AFLP技術(shù)是一項(xiàng)新的分子標(biāo)記技術(shù)，其原理是基于PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后把接頭DNA與酶切的基因組DNA片段進(jìn)行連接，再把接頭序列作為引物結(jié)合位點(diǎn)。限制性片段用二種酶切割產(chǎn)生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。這項(xiàng)技術(shù)包括三個(gè)步驟1.DNA被限制性內(nèi)切酶切割，然后與AFLP聚核苷酸接頭(adaptor)連接；2.利用PCR方法，通過變性、退火、延伸循環(huán)，選擇性擴(kuò)增成套的限制性片段，經(jīng)過多次循環(huán)，可使目的序列擴(kuò)增到0.5～1μg；3.利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增的DNA片段。利用一套特別的引物在不需要知道DNA序列的情況下，可在一次單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)到大量的片段。由于AFLP擴(kuò)增可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過引物誘導(dǎo)及DNA擴(kuò)增后得到的DNA多態(tài)性可作為一種分子標(biāo)記。所以說AFLP技術(shù)是一種新的而且有很大功能的DNA指紋技術(shù)。
本申請(qǐng)人的CN200410065679.制備DNA接頭的方法，公開了選擇有一個(gè)多克隆位點(diǎn)的長(zhǎng)度100bp-100K常用質(zhì)粒，以此質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)引物，通過突變PCR方法構(gòu)建突變質(zhì)粒，在ScaII和多克隆位點(diǎn)之間的片段引入新的酶切位點(diǎn)分別構(gòu)建兩種突變質(zhì)?；蛟谫|(zhì)粒中引入新的多克隆位點(diǎn)和單酶切位點(diǎn)SacII，得到突變質(zhì)粒pGAT4，導(dǎo)入細(xì)菌擴(kuò)增，最后酶切分離得到目的接頭。但AFLP技術(shù)中仍需要新的接頭及合成方法。
引物和接頭合成是AFLP技術(shù)中重要的步驟，AFLP技術(shù)成功的關(guān)鍵所在就是接頭能否與酶切產(chǎn)物進(jìn)行很好的連接，AFLP是一個(gè)技術(shù)性很強(qiáng)的操作，其中接頭的制作與連接是實(shí)驗(yàn)?zāi)芊袢〉贸晒Φ年P(guān)鍵因素，引物和接頭的改進(jìn)是AFLP較RAPD、RFLP最主要的變革。目前引物和接頭多采用化學(xué)合成法，原理是人工合成兩個(gè)20-30bp的寡核苷酸，寡核苷酸大部分序列是完全匹配的，然后把兩個(gè)寡核苷酸在90多度的高溫下變性后再降低溫度退火變性，匹配的區(qū)域可以形成雙鏈結(jié)構(gòu)，末段不匹配的區(qū)域就成為一個(gè)酶的粘性末段，其特點(diǎn)是合成迅速，可以大量制備，但是其也有明顯的缺點(diǎn)，就是變性退火后的產(chǎn)物是一個(gè)混雜的分子，雖然大部分的寡核苷酸都成為雙鏈，但是仍然存在大量的寡核苷酸單鏈片段，影響到接下來的與基因組酶切產(chǎn)物的連接，連接效率不高。為此，我們采用基因工程手段，利用細(xì)菌天然擴(kuò)增AFLP所用的接頭，是對(duì)化學(xué)人工合成接頭的一個(gè)很好的彌補(bǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是應(yīng)用現(xiàn)代基因工程方法解決現(xiàn)有的化學(xué)合成法制作AFLP的接頭連接效率低，接頭的純化困難以及兩個(gè)接頭不能完全等量連接的問題。
本發(fā)明的目的還在于通過選取目標(biāo)接頭序列，用PCR擴(kuò)增引入酶切位點(diǎn)的方法，構(gòu)建重組質(zhì)粒包含AFLP接頭核心序列，同時(shí)為使串聯(lián)多拷貝接頭穩(wěn)定，在核心序列兩邊連上不同側(cè)翼序列，通過質(zhì)粒擴(kuò)增天然接頭，最后酶切得出接頭，該接頭天然純凈，兩個(gè)接頭等量，完全雙鏈，是一種簡(jiǎn)便、高效、適用范圍廣泛的接頭制備方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，制備AFLP接頭的方法，首先選擇質(zhì)粒DNA作為載體，利用兩個(gè)互補(bǔ)的DNA作為引物，且這兩個(gè)引物序列中有AFLP需要的酶切位點(diǎn)EcoR I/Mse I、Apa I/Taq I酶切位點(diǎn)或其他的酶切位，通過PCR方法，擴(kuò)增出具有酶切位點(diǎn)EcoR I和Mse I、Apa I和Taq I的接頭核心區(qū)域序列，把核心區(qū)域序列連入pGEM-T載體，同時(shí)在核心區(qū)域序列的兩翼加上不同的Genome DNA片段各構(gòu)建成接頭單元序列，然后把不同的接頭單元序列通過pBluescript KS載體串聯(lián)起來，構(gòu)建為含有多拷貝接頭DNA的載體，再導(dǎo)入大腸桿菌內(nèi)天然擴(kuò)增接頭，最后利用EcoRI和Mse I、Apa I和Taq I酶切出接頭序列，得到兩個(gè)等摩爾量的AFLP天然接頭DNA。
本發(fā)明所述選取的兩個(gè)互補(bǔ)的DNA引物，這個(gè)引物序列構(gòu)成接頭的核心序列，且這段序列符合引物設(shè)計(jì)的要求，不含二級(jí)結(jié)構(gòu)，這兩個(gè)引物互為引物和模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增片段，把這個(gè)接頭核心片段克隆連接到T載體。
本發(fā)明在質(zhì)粒載體上引入AFLP中使用的酶切位點(diǎn)的序列，在核心區(qū)域側(cè)翼加上不同的Genome DNA片段，這樣每個(gè)單元序列都是核心區(qū)域相同，側(cè)翼序列不同。把接頭序列通過不同的酶串聯(lián)起來，成為多拷貝接頭，且引入了不同側(cè)翼序列，使載體更穩(wěn)定，最后用這兩個(gè)酶切DNA片段后，就成為兩個(gè)天然的接頭。引入AFLP實(shí)驗(yàn)中所使用的EcoR I/Mse I、Apa I/Taq I酶切位點(diǎn)或其他的酶切位點(diǎn)，從而制備AFLP所使用的接頭或者其他的雙鏈DNA接頭。
采用PCR擴(kuò)增的方法用引物擴(kuò)增出接頭的核心區(qū)域，然后把這個(gè)含有接頭序列的核心片段連到一個(gè)載體上構(gòu)建成一個(gè)重組的載體，在核心區(qū)域兩翼連上不同的片段成為不同的單元，再用基因工程方法把不同的單元串聯(lián)起來，然后讓載體在大腸桿菌里大量的天然繁殖，最后提取重組質(zhì)粒后用相應(yīng)的酶切質(zhì)粒，即可得到等摩爾量的兩個(gè)含有不同酶切位點(diǎn)的接頭。
本發(fā)明提出了一種天然AFLP接頭制備的方法，系采用PCR擴(kuò)增的方法，用引物擴(kuò)增出接頭核心序列，同時(shí)為使串聯(lián)多拷貝接頭穩(wěn)定，在核心序列兩邊連上不同側(cè)翼序列，通過質(zhì)粒擴(kuò)繁天然接頭，最后酶切得出接頭，該接頭天然純凈，兩個(gè)接頭等量，完全雙鏈，是一種簡(jiǎn)便、高效、適用范圍廣泛的接頭制備方法。


圖1是本發(fā)明的流程示意圖1制備AFLP接頭通過PCR方法，擴(kuò)增出具有酶切位點(diǎn)EcoR I和Mse I的接頭核心區(qū)域序列，把核心區(qū)域序列連入pGEM-T載體的示意2是本發(fā)明的流程示意圖2在核心區(qū)域序列的兩翼加上不同的基因(Genome)DNA片段各構(gòu)建成一個(gè)接頭單元序列，然后把不同的接頭單元序列通過pBluescriptKS載體串聯(lián)起來，構(gòu)建為含有多拷貝接頭DNA的載擴(kuò)增，酶切出接頭序列的示意圖。
具體實(shí)施例方式
1.首先選擇兩段互補(bǔ)的單璉引物DNA序列，各60-70bp，互補(bǔ)的序列中含有接頭核心序列和AFLP所需要的兩種內(nèi)切酶，如最常用的酶EcoR I和Mse I，單鏈DNA互為引物和模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的片段連入T載體中，得載體pGT-L然后測(cè)序驗(yàn)證序列的正確性。
2.用Spe I和Pst I酶切水稻基因組DNA，割膠回收100bp左右的片段，同樣的用Nco I和Sac II酶切水稻基因組DNA，割膠回收100bp左右的片段。
3.用Spe I和Pst I酶切pGT-L載體，回收大片段后與2中的相應(yīng)100bp小片段進(jìn)行連接，挑選不同的克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，選擇插入序列不含任何酶切位點(diǎn)的克隆，得pGT-L-C載體。
4.對(duì)不同的pGT-L-C載體進(jìn)行Nco I和Sac II酶切，分別回收載體大片段，再與同樣酶切水稻基因組回收的DNA進(jìn)行連接，挑選不同的克隆(pGT-L-2C)進(jìn)行測(cè)序，選擇核心區(qū)域的兩翼序列是不同片段的克隆進(jìn)行下一步的構(gòu)建。(圖1)5.用引物和酶切手段使不同的單元序列末段加上同樣的酶切位點(diǎn)，如圖所示，共五種酶被用于這個(gè)構(gòu)建，分別是Xho I、Kpn I、BamH I、Apa I、Sac I，這樣就得到五個(gè)只有含有不同粘性末段和不同側(cè)翼序列的單元片段。
6.對(duì)pBluescript Ks載體進(jìn)行Xho I酶切，堿性磷酸酶進(jìn)行去磷酸化處理，然后與Xho I的粘性末段的單元片段進(jìn)行連接，篩選重組子pGT-L-C-1A，對(duì)重組子再進(jìn)行酶切，重復(fù)以上步驟，即依次采用Kpn I、BamH I、Apa I和Sac I酶切，堿性磷酸酶進(jìn)行去磷酸化處理重組子，依次把五個(gè)不同單元片段都連入載體中，得到重組載體pB1-L-2C-5A。
7.這樣五個(gè)拷貝接頭的單元片段就已經(jīng)構(gòu)建在同一載體中了，利用大腸桿菌的天然擴(kuò)增來大量繁殖含有多拷貝接頭的重組載體，提取含有接頭的天然質(zhì)粒，用PvuII酶切出整個(gè)串聯(lián)的接頭序列1.8Kb左右，割膠回收DNA片段。
8.用Sph I和EcoR1與Mse I酶切這個(gè)串聯(lián)接頭序列，則各接頭之間分開，所需要的EcoR1與Mse I粘性末段顯露，然后用酶切純化試劑盒純化酶切后的片段，側(cè)混雜的小于50bp的小片段都被去除，得到的是150bp左右的等摩爾的兩個(gè)接頭的混合物。(圖2)
權(quán)利要求
1.天然AFLP接頭的制備方法，其特征是首先選擇質(zhì)粒作為載體，利用兩個(gè)互補(bǔ)的DNA作為引物，且這兩個(gè)引物序列中有AFLP需要的酶切位點(diǎn)EcoR I/Mse I、Apa I/Taq I酶切位點(diǎn)或其他的酶切位點(diǎn)，通過PCR方法，擴(kuò)增出具有酶切位點(diǎn)EcoRI和Mse I、Apa I和Taq I的接頭核心區(qū)域序列，把核心區(qū)域序列連入pGEM-T載體，同時(shí)在核心區(qū)域序列的兩翼加上不同的基因DNA片段各構(gòu)建成一個(gè)接頭單元序列，然后把不同的接頭單元序列通過pBluescript KS載體串聯(lián)起來，構(gòu)建為含有多拷貝接頭DNA的載體，再導(dǎo)入大腸桿菌內(nèi)天然擴(kuò)增接頭，最后利用EcoR I和Mse I、Apa I和Taq I酶切出接頭序列，得到兩個(gè)等摩爾量的AFLP接頭DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然AFLP接頭的制備方法，其特征是選取的兩個(gè)互補(bǔ)的DNA引物，引物序列構(gòu)成接頭的核心序列，這兩個(gè)引物互為引物和模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增片段，把這個(gè)接頭核心片段克隆連接到T載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然AFLP接頭的制備方法，其特征是選取兩段互補(bǔ)的單璉DNA序列，各60-70bp，互補(bǔ)的序列中含有接頭核心序列和AFLP所需要的兩種內(nèi)切酶，如最常用的酶EcoR I和Mse I，單鏈DNA互為引物和模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的片段連入載體中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然AFLP接頭的制備方法，其特征是選擇Genome DNA為模板，用Spe I和Pst I酶切Genome DNA，割膠回收100bp左右的片段，同樣的用NcoI和Sac II酶切Genome DNA，割膠回收100bp左右的片段；用Spe I和Pst I酶切pGT-L載體，回收大片段后與Nco I和Sac II酶切Genome DNA回收的100bp小片段進(jìn)行連接，選擇插入序列不含任何酶切位點(diǎn)的克隆，得pGT-L-C載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的天然AFLP接頭的制備方法，其特征是對(duì)不同的pGT-L-C載體進(jìn)行Nco I和Sac II酶切，分別回收載體大片段，再與同樣Nco I和Sac II酶切水稻基因組回收的DNA進(jìn)行連接，挑選不同的克隆(pGT-L-2C)進(jìn)行測(cè)序，選擇核心區(qū)域的兩翼序列是不同片段的克隆，進(jìn)行下一步的構(gòu)建。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的天然AFLP接頭的制備方法，其特征是對(duì)用引物和酶切手段使不同的單元序列末段加上不同的酶切位點(diǎn)，共5種酶被用于這個(gè)構(gòu)建，分別是Xho I、Kpn I、BamH I、Apa I、Sac I，這樣就得到五個(gè)只有含有不同粘性末段和不同側(cè)翼序列的單元片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的天然AFLP接頭的制備方法，其特征是對(duì)pBluescriptKs載體進(jìn)行Xho I酶切，堿性磷酸酶進(jìn)行去磷酸化處理，然后與Xho I的粘性末段的單元片段進(jìn)行連接，篩選重組子，對(duì)重組子再進(jìn)行酶切，重復(fù)以上步驟，直到把五個(gè)不同單元片段都連入載體中，得到重組載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的天然AFLP接頭的制備方法，其特征是利用大腸桿菌天然繁殖含有接頭的質(zhì)粒，5個(gè)拷貝接頭的單元片段就已經(jīng)構(gòu)建在同一載體中了，提取大腸桿菌中天然的質(zhì)粒，用Pvu II酶切出整個(gè)串聯(lián)的接頭序列，割膠回收DNA片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的天然AFLP接頭的制備方法，其特征是用Sph I和EcoR1與Mse I酶切串聯(lián)接頭序列，則各接頭之間分開，所需要的EcoR1與Mse I粘性末段顯露，然后用酶切純化試劑盒純化酶切后的片段，側(cè)混雜的小于50bp的小片段都被去除，得到的是150bp左右的等摩爾的兩個(gè)接頭的混合物。
全文摘要
天然AFLP接頭的方法制備，選擇質(zhì)粒作為載體，利用兩個(gè)互補(bǔ)的DNA作為引物，且這兩個(gè)引物序列中有AFLP需要的酶切位點(diǎn)EcoR I/Mse I、Apa I/Taq I酶切位點(diǎn)或其他的酶切位點(diǎn)，通過PCR方法，擴(kuò)增出具有酶切位點(diǎn)EcoR I和Mse I、Apa I和Taq I的接頭核心區(qū)域序列，把核心區(qū)域序列連入pGEM－T載體，同時(shí)在核心區(qū)域序列的兩翼加上不同的基因DNA片段各構(gòu)建成一個(gè)接頭單元序列，然后把不同的接頭單元序列通過pBluescript KS載體串聯(lián)起來，構(gòu)建為含有多拷貝接頭DNA的載體，再導(dǎo)入大腸桿菌內(nèi)天然擴(kuò)增接頭，最后利用EcoR I和Mse I、Apa I和TaqI酶切出接頭序列，得到AFLP接頭DNA。
文檔編號(hào)C12N15/66GK101037685SQ200710020069
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2007年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日
發(fā)明者田大成, 江海洋, 唐萍 申請(qǐng)人:南京大學(xué)