專利名稱：一株可代謝尼古丁的惡臭假單胞菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體的說涉及一株可代謝尼古丁的惡臭假單胞菌及其應用。
背景技術：
尼古丁(nicotine)，是許多煙草中的主要生物堿，含量達0.5～12％。由于它主要作用于中樞神經，許多人對煙草產生了很強的依賴性。然而，尼古丁是一種“有毒的危險物質”，一次性吸入量達40ml/人時，會抑制中樞神經，導致心臟麻痹，有致命的危險；尼古丁和煙草中的其它生物堿在煙草加工過程中和吸煙瞬間會被亞硝化生成煙草中特有的N-亞硝胺(tobacco-specific nitrosamines，TSNA)，如nitrosamine4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone(NNK)，它們是強烈的肺癌致癌劑。
由于尼古丁有很好的水溶性，在煙草加工中產生了大量的廢水，這些廢水含有以尼古丁為主的有毒物質，是一種有毒廢水，由于尼古丁不易被降解而長期存在于環(huán)境中，給人類健康和生態(tài)環(huán)境帶來了極大威脅。尤其是在制造低尼古丁含量的煙草產品時，廢水中尼古丁的含量更高。它們已經被歐盟法律定為“危險的有毒廢物”。1994年，美國環(huán)保局也將尼古丁列入有毒物質釋放目錄(Toxics Release Inventory，TRI)中。因此迫切需要采取一些措施來有效的處理煙草加工產生的有毒廢水的問題。
近幾十年，一些微生物由于具有代謝尼古丁的能力而受到人們的廣泛關注，一些微生物也相繼報道。如美國學者Rittenberg課題組(1959)分離自土壤的一株氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxidans)P-34。Uchida等(1983)考察了包括煙草致病菌在內的11株真菌和6株放線菌降解尼古丁的能力，發(fā)現只有絲核薄膜革菌(Pellicularia filamentosa)JTS-208和棘孢小克銀漢霉(Cuninghamella echinulata)IFO-4444具有降解尼古丁的能力。袁勇軍等(2005)報道從土壤中分離得到一株Ochrobactrum intermedium，該菌株可以尼古丁為唯一碳源生長，在其優(yōu)化條件下，可將0.5g/L的尼古丁在36h內降解97.6％。Ruan等(2005)報道從煙草廢物污染的土壤中分離得到一株假單胞菌(Pseudomonas sp.)HF-1，該菌株可以尼古丁為唯一碳源和氮源生長，在其優(yōu)化條件下，可將1.3g/L的尼古丁在25h內降解99.6％。雖然這些微生物可代謝尼古丁，但其代謝能力均較弱，對尼古丁毒性的抗性較弱，限制了它們在實際生產中的應用，而在煙草加工廢水中尼古丁的處理方面還未見有相關報道。

發(fā)明內容
針對上述現有的可代謝尼古丁微生物的缺點，本發(fā)明提供一株具有較強的尼古丁代謝能力和尼古丁毒性抗性的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，及以該菌株的完整細胞為生物催化劑生物降解煙草加工廢水中的尼古丁的應用。該方法反應時間短，操作簡單，可使廢水含有的有毒物質尼古丁徹底去除。
本發(fā)明涉及的可代謝尼古丁的菌株為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN。已于2005年4月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學，中國，武漢)，其保藏編號為CCTCC NO.M205038。
上述Pseudomonas putida XPSN CCTCC NO.M205038的菌落形態(tài)和細胞形態(tài)特征為菌落扁平半透明，珍珠灰白色，表面皺褶，有光澤，邊緣不整齊，老培養(yǎng)中央顏色濃重；細胞為卵圓到直桿狀，兩端鈍圓，長度為1.05～1.43μm，直徑為0.52～0.65μm(附圖1)；革蘭氏染色陰性，半固體穿刺為運動性。
上述Pseudomonas putida XPSN CCTCC NO.M205038的生理生化特征詳見表1。
表1 Pseudomonas putida XPSN CCTCC NO.M205038的生理生化特征

注+陽性，-陰性。
上述Pseudomonas putida XPSN CCTCC NO.M205038的碳源利用情況詳見表2。
表2.Pseudomonas putida XPSN CCTCC NO.M205038的碳源利用情況

注+可利用，-不利用。
上述Pseudomonas putida XPSN CCTCC NO.M205038的16SrDNA序列與其它惡臭假單胞菌以及假單胞菌屬的其他細菌的16SrDNA序列具有99％的同源性，詳見表3。
上述Pseudomonas putida XPSN CCTCC NO.M205038的16SrDNA序列長度為1453bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
表3 Pseudomonas putida XPSN CCTCC NO.M205038的16SrDNA序列比對結果

上述Pseudomonas putida XPSN CCTCC NO.M205038的脂肪酸分析由德國菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)測定，結果詳見表4。
表4 Pseudomonas putida XPSN CCTCC NO.M205038的脂肪酸組成

上述Pseudomonas putida XPSN CCTCC NO.M205038的脂肪酸分析通過與TSBA404.10文庫比對，與惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)biotype A具有最高的相似指數，詳見表5。
表5 Pseudomonas putida XPSN CCTCC NO.M205038的脂肪酸分析比對結果

上述Pseudomonas putida XPSN CCTCC NO.M205038能以尼古丁為唯一碳源、氮源和能源生長，生長溫度范圍為20～37C，pH范圍為5.5～8.0，可代謝尼古丁的最大濃度為6g/L(附圖2和附圖3)。
本發(fā)明所述的利用一株具有較強的尼古丁代謝能力和尼古丁毒性抗性的惡臭假單胞菌的完整細胞為生物催化劑生物降解煙草加工廢水中的尼古丁的應用，該應用涉及的方法步驟如下(1)微生物菌株選用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質量體積比為0.02～03％的尼古丁的固體斜面基本培養(yǎng)基上，20℃～37℃條件下，靜止培養(yǎng)24～36小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于20～100mL含有質量體積比為0.02～0.3％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，20℃～37℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)6～30小時，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以5～10％的體積比的接種量，接一級種子于200～1000mL含有質量體積比為0.02～0.3％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，20℃～37℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)6～30小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以5～10％的體積比的接種量，接二級種子于5～20L含有質量體積比為0.1～0.6％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，25℃～37℃條件下培養(yǎng)，期間測定細胞濃度，當620nm下的OD值達到1.0～4.0，終止發(fā)酵培養(yǎng)；(6)收集細胞取步驟(5)的培養(yǎng)液5,000轉/分鐘條件下離心10～15分鐘，收集發(fā)酵培養(yǎng)的細胞，并用20～100mmol/LpH7.0磷酸緩沖液洗滌，再以相同的條件離心，重復2～3次，收集沉淀的細胞，此細胞即為生物催化劑，在4℃儲存，備用；(7)廢水中尼古丁的去除將步驟(6)制得的生物催化劑懸浮于煙草加工廢水中，混勻，使混合物中的生物催化劑在620nm下的OD值為2～10，尼古丁的終濃度不超過4.0g/L；調pH至6.0～9.0，在20℃～40℃、180～350轉/分鐘條件下振蕩；處理期間取樣，用氣相色譜法檢測尼古丁的降解情況，當混合物中尼古丁完全檢測不到后，繼續(xù)振蕩1～4小時后終止處理；
(8)生物催化劑的回收將步驟(7)終止處理后的混合物，以6,000～12,000轉/分10～30分鐘離心，去除不含有尼古丁的上清液，得到步驟(7)中所加入的生物催化劑；(9)生物催化劑的重復利用將步驟(8)收集得的生物催化劑按照步驟(7)所述的方法重復利用，重復該步驟5～10次，最后棄去離心的沉淀；(10)將步驟(8)和步驟(9)得到的上清液混合，隨同一般廢水一起進一步處理。上述步驟(3)、(4)(5)所述的液體基本培養(yǎng)基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，金屬離子混合液0.4mL/L；調節(jié)pH7.0，115℃條件下滅菌20分鐘；其中，金屬離子混合液的配方是以1mol/L鹽酸溶液為溶劑，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
上述步驟(2)所述的固體斜面基本培養(yǎng)基的配方是向所述的液體基本培養(yǎng)基中優(yōu)選加入質量體積比為1.5～2.0％的瓊脂。
上述步驟(2)、(3)、(4)(5)所述的菌體培養(yǎng)溫度優(yōu)選29～32℃。
上述步驟(2)所述的菌體培養(yǎng)時間優(yōu)選26～30小時。
上述步驟(3)、(4)所述的菌體培養(yǎng)時間優(yōu)選12～24小時。
上述步驟(2)、(3)、(4)(5)所述的尼古丁濃度優(yōu)選0.1～0.3％。
上述步驟(6)所述的磷酸緩沖液的濃度優(yōu)選50mmol/L。
上述步驟(7)所述的生物催化劑是指惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSNCCTCC NO.M205038的完整細胞。
上述步驟(7)所述的生物催化劑在620nm下的OD值優(yōu)選4～8。
上述步驟(7)所述的尼古丁的終濃度優(yōu)選不超過3.5g/L。
上述步驟(7)所述的pH優(yōu)選6.5～8.5。
上述步驟(7)所述的轉化反應溫度優(yōu)選28℃～32℃。
上述步驟(7)所述的繼續(xù)振蕩的時間優(yōu)選2～3小時。
上述步驟(7)所述的氣相色譜法采用VARIAN CP3380氣相色譜儀，色譜柱為SPB-5毛細管柱(內徑0.32mm，長30m，膜厚0.25μm，美國Supelcol公司)，氮氣作為載氣，檢測條件為，進樣器溫度260℃，柱溫140℃，檢測器溫度280℃，進樣量1μl。
上述步驟(7)所述的處理期間所取樣品需要按照以下方法處理后利用氣相色譜法測定尼古丁樣品于6,000～12,000轉/分10～30分鐘離心，取0.2ml上清于一具有密封蓋的小瓶中，加入1.8ml蒸餾水，再加入50μl 1M碳酸鈉水溶液，用2ml氯仿30℃振蕩萃取30min，氯仿相溶液用于氣相色譜法測定。
本發(fā)明提供的一株可代謝尼古丁的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSNCCTCC NO.M205038，具有較強的尼古丁代謝能力和抗尼古丁毒性的能力，可代謝尼古丁的最大濃度為6g/L，較適宜的濃度為1.0～3.0g/L。這解決了目前已報道菌株尼古丁代謝能力和抗毒性低的問題。
本發(fā)明提供的利用可代謝尼古丁的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSNCCTCC NO.M205038的完整細胞做生物催化劑處理煙草加工廢水的方法，具有以下特點
(1)用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038的完整細胞作為生物催化劑，廢水處理速度快，節(jié)約時間和能源。
(2)制備生物催化劑采用的菌株所需的培養(yǎng)基簡單、成本低。
(3)該菌株的細胞通透性好，不需破碎，可直接用完整細胞降解尼古丁，操作方便。
(4)生物催化劑可以用離心法去除，并且可以回收重復使用5～10次。
(5)處理過程簡單，條件溫和，易操作，易控制。
(6)經處理，廢水中尼古丁的可被徹底去除。
因此，本發(fā)明提供的一株可代謝尼古丁的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSNCCTCC NO.M205038及其處理煙草加工廢水的方法具有重要的實際應用價值。


本發(fā)明涉及的一株可代謝尼古丁的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，名稱為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN，已于2005年4月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO.M205038。
圖1為本發(fā)明的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038細胞放大10000倍的掃描電鏡照片。
圖2為本發(fā)明的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038在含有4g/L尼古丁的液體基本培養(yǎng)基中生長和降解尼古丁的情況。
其中，符號■表示培養(yǎng)基中尼古丁的濃度(g/L)，符號●表示細菌生長后的細胞干重(g/L)。
圖3為本發(fā)明的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038在含有6g/L尼古丁的液體基本培養(yǎng)基中生長和降解尼古丁的情況。
其中，符號■表示培養(yǎng)基中尼古丁的濃度(g/L)，符號●表示細菌生長后的細胞干重(g/L)。
圖4為利用本發(fā)明的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038 620nm下OD值為6的細胞作生物催化劑處理含有約3.1g/L尼古丁的煙草加工廢水過程中尼古丁的降解情況。
圖5為利用本發(fā)明的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038 620nm下OD值為6的細胞作生物催化劑處理含有約3.1g/L尼古丁的煙草加工廢水0小時和6小時的氣相色譜圖。
具體實施例方式
實施例1惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038菌株的篩選從山東濰坊等地的長期種植煙草的大田中采集土樣，取2～4g加入到含有1g/L尼古丁的液體基本培養(yǎng)基中，30℃條件下在搖床上振蕩培養(yǎng)2～4天，然后轉接5mL到相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，照此方法連續(xù)轉接3～5次，將獲得的培養(yǎng)液稀釋后涂布到含有1g/L尼古丁的固體平板基本培養(yǎng)基上，30℃條件下培養(yǎng)1～3天，待長出菌落后，挑取大菌落在同樣的尼古丁的固體平板基本培養(yǎng)基上連續(xù)劃線，確認該菌株具有降解尼古丁的能力，并且為純培養(yǎng)，然后挑取單菌落到含有1g/L尼古丁的固體斜面基本培養(yǎng)基上，30℃條件下培養(yǎng)1～3天，得到本發(fā)明的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN，該菌株己于2005年4月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學，中國，武漢)，其保藏編號為CCTCC NO.M205038。
上述所述的液體基本培養(yǎng)基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，金屬離子混合液0.4mL/L；調節(jié)pH7.0，115℃條件下滅菌20分鐘；其中，金屬離子混合液的配方是以1mol/L鹽酸溶液為溶劑，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
上述所述的固體平板基本培養(yǎng)基和固體斜面基本培養(yǎng)基的配方是向所述的液體基本培養(yǎng)基中加入質量體積比為1.5％的瓊脂。
實施例2上述惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038菌株16SrDNA的獲取收集生長到穩(wěn)定期的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038的培養(yǎng)物2mL，6,000轉/分鐘離心5分鐘，去上清；沉淀物中加入565μL TE溶液，TE溶液的配方為10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用鹽酸調整pH為8.0；用吸管反復吹打使沉淀物懸浮，再加入30μL質量體積比濃度為10％的十二烷基磺酸鈉(SDS)和5μL 20mg/mL的蛋白酶K(Merck公司，美國)，混勻，于37℃下水浴1小時；加入100μL 5mol/L的NaCl，充分混勻，再加入80μL的CTAB/NaCl溶液，CTAB/NaCl溶液的配方為將質量體積比濃度為10％的十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)溶于0.7mol/L的NaCl溶液中；混勻后于65℃水浴10分鐘；加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12,000轉/分鐘離心5分鐘，將上清轉入一支新管中；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，12,000轉/分鐘離心5分鐘，將上清轉入一支新管中；加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕混勻直至DNA沉淀，12,000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清，用70％乙醇洗滌；12,000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清，沉淀于室溫下干燥10分鐘，加入100μl TE緩沖液重溶，該溶液為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCCNO.M205038的基因組DNA溶液。以提取的基因組DNA為模板，利用真細菌引物27f和1492r，進行PCR擴增，在50μL的反應體系中依次加入下列試劑38μL H2O，5μL 10倍濃度的PCR反應緩沖液，10倍濃度的PCR反應緩沖液配方如下500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)、100mmol/L的用鹽酸調整pH為8.8的Tris緩沖液、1mg/mL的牛血清白蛋白，4μl 25mmol/LMgCl2，1μL4種dNTP的混合物，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，0.5μL模板DNA即上述惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038的基因組DNA溶液，0.5μL Taq DNA聚合酶，混勻后離心5秒鐘，將混合物在94℃加熱5分鐘。按照94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘的程序反應，總共進行30個循環(huán)。最后一個循環(huán)后，于72℃下保溫10分鐘，得到的混合物即為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038的16S rDNA的PCR擴增產物，將產物測序。
測序結果惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038的16SrDNA序列長度為1453bp，核苷酸序列如下
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上述步驟(3)、(4)(5)所述的液體基本培養(yǎng)基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，金屬離子混合液0.4mL/L；調節(jié)pH7.0，115℃條件下滅菌20分鐘；其中，金屬離子混合液的配方是以1mol/L鹽酸溶液為溶劑，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
步驟(2)所述的固體斜面培養(yǎng)基的配方是向所述的液體培養(yǎng)基中加入質量體積比為1.7％的瓊脂。
上述步驟(7)所述的氣相色譜法采用VARIAN CP3380氣相色譜儀，色譜柱為SPB-5毛細管柱(內徑0.32mm，長30m，膜厚0.25μm，美國Supelcol公司)，氮氣作為載氣，檢測條件為，進樣器溫度260℃，柱溫140℃，檢測器溫度280℃，進樣量1μl。
上述步驟(7)所述的處理期間所取樣品需要按照以下方法處理后利用氣相色譜法測定尼古丁樣品于8,000轉/分20分鐘離心，取0.2ml上清于一具有密封蓋的小瓶中，加入1.8ml蒸餾水，再加入50μl 1M碳酸鈉水溶液，用2ml氯仿30℃振蕩萃取30min，氯仿相溶液用于氣相色譜法測定。
實施例4利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的完整細胞處理煙草加工廢水的方法，其中煙草加工廢水中尼古丁的終濃度為2.0g/L(1)微生物菌株選用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質量體積比為0.1％的尼古丁的固體斜面基本培養(yǎng)基上，30℃條件下，靜止培養(yǎng)30小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1環(huán)于50mL含有質量體積比為0.1％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，30℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)12小時，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以8％的體積比的接種量，接一級種子于500mL含有質量體積比為0.2％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，30℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)18小時，制得二級種子；
(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以8％的體積比的接種量，接二級種子于10L含有質量體積比為0.4％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)，期間測定細胞濃度，當620nm下的OD值達到2.9，終止發(fā)酵培養(yǎng)；(6)收集細胞取步驟(5)的培養(yǎng)液5,000轉/分鐘條件下離心12分鐘，收集發(fā)酵培養(yǎng)的細胞，并用50mmol/L pH7.0磷酸緩沖液洗滌，再以相同的條件離心，重復3次，收集細胞沉淀，此細胞沉淀即為生物催化劑，在4℃儲存，備用；(7)廢水中尼古丁的去除將步驟(6)制得的生物催化劑懸浮于煙草加工廢水中，混勻，使混合物中的生物催化劑在620nm下的OD值為5，尼古丁的終濃度為2.0g/L；調pH至7.0，在30℃、250轉/分鐘條件下振蕩；處理期間取樣，用氣相色譜法檢測尼古丁的降解情況，當混合物中尼古丁完全檢測不到后，繼續(xù)振蕩2小時后終止處理；(8)生物催化劑的回收將步驟(7)終止處理后的混合物，以8,000轉/分20分鐘離心，去除不含有尼古丁的上清液，得到步驟(7)中所加入的生物催化劑(9)生物催化劑的重復利用將步驟(8)收集得的生物催化劑按照步驟(7)所述的方法重復利用，重復該步驟7次，最后棄去離心的沉淀；(10)將步驟(8)和步驟(9)得到的上清液混合，隨同一般廢水一起進一步處理。
上述步驟(3)、(4)(5)所述的液體基本培養(yǎng)基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，金屬離子混合液0.4mL/L；調節(jié)pH7.0，115℃條件下滅菌20分鐘；其中，金屬離子混合液的配方是以1mol/L鹽酸溶液為溶劑，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
步驟(2)所述的固體斜面培養(yǎng)基的配方是向所述的液體培養(yǎng)基中加入質量體積比為1.9％的瓊脂。
上述步驟(7)所述的氣相色譜法采用VARIAN CP3380氣相色譜儀，色譜柱為SPB-5毛細管柱(內徑0.32mm，長30m，膜厚0.25μm，美國Supelcol公司)，氮氣作為載氣，檢測條件為，進樣器溫度260℃，柱溫140℃，檢測器溫度280℃，進樣量1μl。
上述步驟(7)所述的處理期間所取樣品需要按照以下方法處理后利用氣相色譜法測定尼古丁樣品于8,000轉/分20分鐘離心，取0.2ml上清于一具有密封蓋的小瓶中，加入1.8ml蒸餾水，再加入50μl 1M碳酸鈉水溶液，用2ml氯仿30℃振蕩萃取30min，氯仿相溶液用于氣相色譜法測定。
實施例5利用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的完整細胞處理煙草加工廢水的方法，其中煙草加工廢水中尼古丁的終濃度為4.0g/L(1)微生物菌株選用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質量體積比為0.3％的尼古丁的固體斜面基本培養(yǎng)基上，37℃條件下，靜止培養(yǎng)36小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于100mL含有質量體積比為0.3％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，37℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)30小時，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以10％的體積比的接種量，接一級種子于1000mL含有質量體積比為0.3％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，37℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)30小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以10％的體積比的接種量，接二級種子于20L含有質量體積比為0.6％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)，期間測定細胞濃度，當620nm下的OD值達到4.0，終止發(fā)酵培養(yǎng)；(6)收集細胞取步驟(5)的培養(yǎng)液5,000轉/分鐘條件下離心15分鐘，收集發(fā)酵培養(yǎng)的細胞，并用100mmol/L pH7.0磷酸緩沖液洗滌，再以相同的條件離心，重復3次，收集細胞沉淀，此細胞沉淀即為生物催化劑，在4℃儲存，備用；(7)廢水中尼古丁的去除將步驟(6)制得的生物催化劑懸浮于煙草加工廢水中，混勻，使混合物中的生物催化劑在620nm下的OD值為10，尼古丁的終濃度為4.0g/L；調pH至9.0，在40℃、350轉/分鐘條件下振蕩；處理期間取樣，用氣相色譜法檢測尼古丁的降解情況，當混合物中尼古丁完全檢測不到后，繼續(xù)振蕩4小時后終止處理；(8)生物催化劑的回收將步驟(7)終止處理后的混合物，以12,000轉/分10分鐘離心，去除不含有尼古丁的上清液，得到步驟(7)中所加入的生物催化劑(9)生物催化劑的重復利用將步驟(8)收集得的生物催化劑按照步驟(7)所述的方法重復利用，重復該步驟10次，最后棄去離心的沉淀；(10)將步驟(8)和步驟(9)得到的上清液混合，隨同一般廢水一起進一步處理。
上述步驟(3)、(4)(5)所述的液體基本培養(yǎng)基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，金屬離子混合液0.4mL/L；調節(jié)pH7.0，115℃條件下滅菌20分鐘；其中，金屬離子混合液的配方是以1mol/L鹽酸溶液為溶劑，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L。
步驟(2)所述的固體斜面培養(yǎng)基的配方是向所述的液體培養(yǎng)基中加入質量體積比為2.0％的瓊脂。
上述步驟(7)所述的氣相色譜法采用VARIAN CP3380氣相色譜儀，色譜柱為SPB-5毛細管柱(內徑0.32mm，長30m，膜厚0.25μm，美國Supelcol公司)，氮氣作為載氣，檢測條件為，進樣器溫度260℃，柱溫140℃，檢測器溫度280℃，進樣量1μl。
上述步驟(7)所述的處理期間所取樣品需要按照以下方法處理后利用氣相色譜法方法測定尼古丁樣品于8,000轉/分20分鐘離心，取0.2ml上清于一具有密封蓋的小瓶中，加入1.8ml蒸餾水，再加入50μl 1M碳酸鈉水溶液，用2ml氯仿30℃振蕩萃取30min，氯仿相溶液用于氣相色譜法測定。
序列表<110>山東大學<120>一株可代謝尼古丁的惡臭假單胞菌及其應用<141>2007-01-16<160>1<210>1<211>1453<212>DNA<213>惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)<221>惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)CCTCC NO.M205038 16S rDNA<222>(1)...(1453)<400>1cgaaagctgg cctcggacta acacatgcaa gtcgagcgga tgacgggagc ttgctccttg 60attcagcggc ggacgggtga gtaatgccta ggaatctgcc tggtagtggg ggacaacgtt 120tcgaaaggaa cgctaatacc gcatacgtcc tacgggagaa agcaggggac cttcgggcct 180tgcgctatca gatgagccta ggtcggatta gctagttggt gaggtaatgg ctcaccaagg 240cgacgatccg taactggtct gagaggatga tcagtcacac tggaactgag acacggtcca 300gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttggacaatg ggcgaaagcc tgatccagcc 360atgccgcgtg tgtgaagaag gtcttcggat tgtaaagcac tttaagttgg gaggaagggc 420agtaagttaa taccttgctg ttttgacgtt accgacagaa taagcaccgg ctaactctgt 480gccagcagcc gcggtaatac agagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc 540gcgcgtaggt ggttcgttaa gttggatgtg aaagccccgg gctcaacctg ggaactgcat 600ccaaaactgg cgagctagag tacggtagag ggtggtggaa tttcctgtgt agcggtgaaa 660tgcgtagata taggaaggaa caccagtggc gaaggcgacc acctggactg atactgacac 720tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780cgatgtcaac tagccgttgg aatccttgag attttagtgg cgcagctaac gcattaagtt 840gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaat gattgacggg ggcccgcaca 900agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gccttgacat 960gcagagaact ttccagagat ggattggtgc cttcgggaac tctgacacag gtgctgcatg 1020gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgtaacgagc gcaacccttg 1080tccttagtta ccagcacgtt atggtgggca ctctaaggag actgccggtg acaaaccgga 1140ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacgg cctgggctac acacgtgcta 1200caatggtcgg tacagagggt tgccaagccg cgaggtggag ctaatctcac aaaaccgatc 1260gtagtccgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcga 1320atcagaatgt cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1380gagtgggttg caccagaagt agctagtcta accttcggga ggacggttac cacggtgtga 1440ttgatgctgt agg 145權利要求
1.一株可代謝尼古丁的惡臭假單胞菌，其特征在于，該菌株名為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN，已于2005年4月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NO.M 205038。
2.如權利要求1所述的可代謝尼古丁的惡臭假單胞菌，其特征在于，菌落扁平半透明，珍珠灰白色，表面皺褶，有光澤，邊緣不整齊；細胞為卵圓到直桿狀，兩端鈍圓，長度為1.05～1.43μm，直徑為0.52～0.65μm；革蘭氏染色陰性；半固體穿刺為運動性；可產生有熒光的擴散性的藍色素和無熒光的非擴散性乳黃色素；4℃和41℃下均不能生長；不積累聚β-羥基丁酸；不需要有機生長因子；過氧化氫酶陽性；甲基紅試驗和V-P試驗均為陰性；該菌的16S rDNA序列長度為1453bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；上述的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M 205038能以尼古丁為唯一碳源、氮源和能源生長，生長溫度范圍為20～37℃，pH范圍為5.5～8.0，可代謝尼古丁的最大濃度為6g/L。
3.以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M 205038的完整細胞為生物催化劑生物降解煙草加工廢水中尼古丁的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述應用涉及的方法步驟如下(1)微生物菌株選用惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038；(2)斜面培養(yǎng)將上述菌株接種于含有質量體積比為0.02～0.3％的尼古丁的固體斜面基本培養(yǎng)基上，20℃～37℃條件下，靜止培養(yǎng)24～36小時；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于20～100mL含有質量體積比為0.02～0.3％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，20℃～37℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)6～30小時，制得一級種子；(4)擴大培養(yǎng)以5～10％的體積比的接種量，接一級種子于200～1000mL含有質量體積比為0.02～0.3％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，20℃～37℃條件下，在搖床上振蕩培養(yǎng)6～30小時，制得二級種子；(5)發(fā)酵罐培養(yǎng)以5～10％的體積比的接種量，接二級種子于5～20L含有質量體積比為0.1～0.6％的尼古丁液體基本培養(yǎng)基中，25℃～37℃條件下培養(yǎng)，期間測定細胞濃度，當620nm下的OD值達到1.0～4.0，終止發(fā)酵培養(yǎng)；(6)收集細胞取步驟(5)的培養(yǎng)液5,000轉/分鐘條件下離心10～15分鐘，收集發(fā)酵培養(yǎng)的細胞，并用20～100mmol/L pH7.0磷酸緩沖液洗滌，再以相同的條件離心，重復2～3次，收集沉淀的細胞，此細胞即為生物催化劑，在4℃儲存，備用；(7)廢水中尼古丁的去除將步驟(6)制得的生物催化劑懸浮于煙草加工廢水中，混勻，使混合物中的生物催化劑在620nm下的OD值為2～10，尼古丁的終濃度不超過4.0g/L；調pH至6.0～9.0，在20℃～40℃、180～350轉/分鐘條件下振蕩；處理期間取樣，用氣相色譜法檢測尼古丁的降解情況，當混合物中尼古丁完全檢測不到后，繼續(xù)振蕩1～4小時后終止處理；(8)生物催化劑的回收將步驟(7)終止處理后的混合物，以6,000～12,000轉/分10～30分鐘離心，去除不含有尼古丁的上清液，得到步驟(7)中所加入的生物催化劑；(9)生物催化劑的重復利用將步驟(8)收集得的生物催化劑按照步驟(7)所述的方法重復利用，重復該步驟5～10次，最后棄去離心的沉淀；(10)將步驟(8)和步驟(9)得到的上清液混合，隨同一般廢水一起進一步處理。
5.如權利要求4所述的以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038的完整細胞為生物催化劑生物降解煙草加工廢水中尼古丁的應用涉及的方法，其特征在于，步驟(3)、(4)、(5)所述的液體培養(yǎng)基的配方是K2HPO4·3H2O 13.3g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，金屬離子混合液0.4mL/L；調節(jié)pH7.0，115℃條件下滅菌20分鐘；其中，金屬離子混合液的配方是以1mol/L鹽酸溶液為溶劑，CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO40.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，Na2WO4·2H2O0.05g/L；步驟(2)所述的固體斜面培養(yǎng)基的配方是向所述的液體培養(yǎng)基中加入質量體積比為1.5～2.0％的瓊脂。
6.如權利要求4所述的以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038的完整細胞為生物催化劑生物降解煙草加工廢水中尼古丁的應用涉及的方法，其特征在于，步驟(2)、(3)、(4)、(5)所述的尼古丁的質量體積比濃度為0.1～0.3％。
7.如權利要求4所述的以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038的完整細胞為生物催化劑生物降解煙草加工廢水中尼古丁的應用涉及的方法，其特征在于，步驟(7)所述的混合物中的生物催化劑在620nm下的OD值為4～8。
8.如權利要求4所述的以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038的完整細胞為生物催化劑生物降解煙草加工廢水中尼古丁的應用涉及的方法，其特征在于，步驟(7)所述的尼古丁的終濃度不超過3.5g/L。
9.如權利要求4所述的以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M205038的完整細胞為生物催化劑生物降解煙草加工廢水中尼古丁的應用涉及的方法，其特征在于，步驟(7)所述的pH調至6.5～8.5。
10.如權利要求4所述的以惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)XPSN CCTCC NO.M 205038的完整細胞為生物催化劑生物降解煙草加工廢水中尼古丁的應用涉及的方法，其特征在于，步驟(7)所述的當混合物中尼古丁完全檢測不到后，繼續(xù)振蕩2～3小時后終止處理。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可以代謝尼古丁的惡臭假單胞菌，該菌株已于2005年4月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學，中國武漢)，其保藏編號為CCTCC NO.M205038。該菌株具有較強的尼古丁代謝能力和尼古丁毒性抗性能力，最高可在6g/L尼古丁濃度下生長。通過大量培養(yǎng)該菌株，利用該菌株的完整細胞為生物催化劑，可將煙草加工廢水中的尼古丁徹底生物降解。本發(fā)明的惡臭假單胞菌的應用方法具有操作簡單，容易控制，廢水處理速度快，節(jié)約能源等特點，在煙草加工廢水處理方面具有很大的應用前景。
文檔編號C12R1/40GK101016528SQ200710013068
公開日2007年8月15日 申請日期2007年1月22日 優(yōu)先權日2007年1月22日
發(fā)明者王書寧, 許平 申請人:山東大學