專利名稱：：抗病黃瓜屬植物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于抗病才直物和才直物育種領域，更具體地涉及抗白粉菌和線形病毒的黃瓜屬(黃瓜)植物的培育。
背景技術：
：大批生產的黃瓜(黃瓜屬，Cucumissatimis))產品可能遭受各種各樣的疾病。黃化病毒可引起一種這樣的疾病并且可以？1起黃瓜生產的顯著經濟損失。線形病毒的家族(長線形病毒科)，其形成影響黃瓜的黃化病毒的最高分類群，包括30種以上的之字形和線形的昆蟲傳播的4直物病毒。該家族包4舌三個屬，其中4分虱傳^番的Crinh)irus屬包括與黃瓜的密切相關的物種。該屬尤其包括物種南瓜黃矮化失調病毒(CYSDV)、萵苣傳染性枯黃病毒(LIYV)以及甜菜偽黃化病毒(BPYV)。CYSDV和BPYV形成對黃瓜培育者的最大威脅。這些病毒通常存在于昆蟲媒介中并通過昆蟲在植物上的攝食活動力口以傳播。因此，借助于施加殺蟲劑可以控制黃瓜線形病毒。然而，優(yōu)選地，在農業(yè)和園藝學中線形病毒的控制是通過^是供寄主^:物的抗病毒培養(yǎng)變種來實現。目前，在抗黃瓜變種的基因組中的至少兩個凄t量的性狀基因座或QTL^皮識別為與黃瓜中的線形病毒抗性有關(參看WO02/22836)。因此通過檢測連接于這些QTL的特定標記物就可以監(jiān)測與線形病毒抗性有關的遺傳物質適當基因'滲入后代it物系中。因it匕，QTL的知i只可以有助于i咅育^t線形病毒的培養(yǎng)變種。影響大批量黃瓜生產的另一種重要疾病是黃瓜白粉病(PM)。瓜菜中的PM可以由真菌瓜類白粉病菌(S.fuliginea)和煙草白4分病菌(E.cichoracearum)引起。該疾病是廣為-危4專的并且可以整年發(fā)生。癥狀開始為在受感染葉表面上的細白真菌線的小斑點，這些斑點可以向外生長并最終用白色、粉狀聚集的孢子和菌絲覆蓋莖和葉。嚴重感染導致葉的變色和凋落，同時伴隨果實數目和尺寸的減少。雖然許多殺真菌劑可有效抵抗白粉菌，但真菌對于化學制劑的抗性正在形成。各種黃瓜變種對于白4分菌呈現一定水平的抗性。這樣的品系包4舌例如印度野生黃瓜登記號(accession)PI197088、登記號PI200815、PI200818、以及培養(yǎng)變種Natsufushinari和Asomidori(Morishita等，2003)。此夕卜，與相對于PM的抗性有關的各種基因是已知的(Fanourakis，1984;Fujieda和Akiya，1962;Kooistra,1968，1971;Shanmugasundarum等，1971,1972)，其包4舌在Natsufushinari中的pw-7和pw-2、在PI200815和PI200818中的；m-3以及栽i備種(cultigen)Wis.SMR18中的"pm-A("(基因不使下文的/W2-Zz指示的pm基因座受到損害)。雖然幾種大批量黃瓜變種可獲得對PM的部分耐受性，但大多數批量培育者仍然依靠使用葉的殺真菌劑。這部分地是由于以下事實難以將PM抗性引入呈現其它類型抗性的品系。例如，培育者已想到以下缺點獲得PM抗性等位基因的品系變得對線形病毒敏感并且反過來也是一樣，而先前它們不是如此。事實上，雜交實-瞼迄今還沒有產生對PM和線形病毒均呈現抗性的黃瓜品系。迄今還沒有獲得這種有益的雙抗性重組體。這是意想不到的，因為一般說來通過相對直接的培育方法可以將不同的性狀并入單基因組中。本發(fā)明的一個目的是提供這樣的黃瓜屬植物，其對影響黃瓜的線形病毒家族的病毒(尤其是BPYV和CYSDV')呈現抗性，并且其另外對由真菌瓜類白粉病菌(S.fuliginea)和/或煙草白粉病菌(E.cichoracearum)引起的黃瓜白#分病呈現j元寸生。
發(fā)明內容本發(fā)明的發(fā)明人現已發(fā)現許多對CYSDV和PM均呈現抗性的黃瓜屬才直物。此外，他們發(fā)現，這些雙抗性黃瓜屬才直物包含與白并分菌抗性有關的兩種凄t量性狀基因座(QTL)(如本文描述的/7附-/和pm-ZO以及一種主要的與線形病毒抗性有關的QTL(如本文描述的QTL-1)。更重要地，他們發(fā)現，所有QTL都位于單基因連鎖群中。因此，本發(fā)明的發(fā)明人基本上發(fā)現，在這些植物中，用于抗線形病毒和白粉菌的基因存在于單染色體上。這樣的植物可非常有利地用于才直物育種。此外，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現，為何先前通過雜交實-瞼不能獲得雙抗性黃瓜屬植物的可能機制。不希望受到理論的限制，i^為對一種疾病的抗性來i兌必不可少的遺傳成^f分的基因滲入導致本發(fā)明的發(fā)明人已開發(fā)了培育方案，借助于這些方案可以解決這種問題，從而獲得所需要的雙抗性植物。在第一個方面，本發(fā)明提供了黃瓜屬物種的^i物，該植物呈現對黃瓜線形病毒的抗性以及對黃瓜白粉菌的抗性。在本發(fā)明的這樣的植物的一種優(yōu)選實施方式中，負責線形病毒抗性(QTL-1)的基因組區(qū)以及負責白粉菌抗性的基因組區(qū)(/w-Zz和/或/7W-Z)存在于單染色體上。在這樣的植物的一種甚至更優(yōu)選的實施方式中，/柳畫/z和均存在并且QTL隱1^f立于禾口p附畫/之間。在本發(fā)明的植物的一種進一步的實施方式中，QTL-1的存在是通過至少一種旁側標記物的存在來指示，其中旁側標記物選自由標i己物E16/M50-244、E16/M50-188、以及E11/M48-251組成的組，如在WO02/22836中所詳細描述的，在此上下文中特別提及它。在本發(fā)明的植物的另一種實施方式中，稱作/w-Zz的QTL的存在是通過核酸序列的存在來指示，其中核酸序列包含至少一個突變，該突變來自與所述植物的白粉菌抗性有關的單核苷酸多態(tài)性(SNP),其中所述至少一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)選自如下文表2所示的SNP1和SNP2。在本發(fā)明的沖直物的另一種實施方式中，稱作pm-/的QTL的存在是通過核酸序列的存在來指示，其中核酸序列包含至少一個突變，該突變來自與所述才直物的白4分菌抗性有關的并在下文表3中表示為SNP3的單核苷酸多態(tài)性(SNP),或包含至少一個突變，該突變表示為下文表3中的5-bp插入5'-AATTT-3'并與所述植物的白粉菌4元'性有關。因此本發(fā)明優(yōu)選地^是供了抗黃瓜線形病毒和黃瓜白4分菌的相_物，其中所述植物是黃瓜屬物種的植物，所述植物在單染色體上包含至少一個賦予線形病毒抗性的染色體區(qū)和至少一個賦予白沖分菌抗性的染色體區(qū)，其中所述至少一個f武予線形病毒抗性的區(qū)連4姿于至少一個標記物，該標i己物選自由標i己物E16/M50-244、E16艇50-188、以及E11/M48-251組成的組，以及其中所述至少一個貝武予白4分菌抗性的區(qū)連4妄于至少一個標i己物，該標i己物選自-SEQIDNO(序列識別號)1中的單核苷酸多態(tài)性標i己物39T—G;畫在SEQIDNO:2中的單核苷酸多態(tài)性標記物29G—A;-在SEQIDNO:3中的單核苷酸多態(tài)性標記物193C—T;畫在SEQIDNO:4中第221^f立置的4翁入突變5'-AATTT-3';和-標記物E16/M50畫F畫194、E11/M48-F-251、E23/M38-M001、E23/M40-M003、E24歸6-M002、E24緒6-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134以及E14/M59-F-200組成的組。本發(fā)明的才直物可以可選;也包含與線形病毒纟元性有關的第二QTL(如在WO02/22836中所描述的QTL-2，關于此QTL的定位和特性的詳細情況，特別^是及此文獻的i兌明書)。該QTL顯示為4立于分開的染色體上。在另一個方面，本發(fā)明提供了如上文所定義的本發(fā)明的部分黃瓜屬植物。優(yōu)選地，所述植物部分選自花粉、胚珠、葉、胚芽、根、根尖、花藥、花、果實、莖、枝條、接穗、根狀莖、種子、原生質體以及愈傷組織(calli),并且最優(yōu)選為種子。在另一個方面，本發(fā)明4是供了通過雜交如上所述的本發(fā)明的雙(線形病毒加上PM抗性[包4舌PM-leaf()和PM畫hypo(pw-/)抗性表型])抗性黃瓜屬植物和第二黃瓜屬植物或其它植物變種、優(yōu)選包含商業(yè)上所期望的特性的黃瓜品系的才直物而獲得的Fl種子。優(yōu)選地，所述第二黃瓜屬植物至少包含作為隱性基因的pw-;z。所述第二黃瓜屬植物那么至少是雜合的，優(yōu)選地對于隱性性狀為純合的。在另一種優(yōu)選實施方式中，所述第二黃瓜屬植物對線形病毒每丈感并且更優(yōu)選為近交^直物。在另一個方面，本發(fā)明提供了通過培育如上文所定義的本發(fā)明的Fl種子而獲得的雜交4直物。在另一個方面，本發(fā)明提供了如上文所定義的本發(fā)明的雜交柏:物的一部分。優(yōu)選地所述植物部分選自花粉、胚珠、葉、胚芽、根、根尖、花藥、花、果實、莖、枝條、接穗、根狀莖、種子、原生質體以及愈傷組織，并且最優(yōu)選為果實。如上所述，通過各自僅抗一種病的植物的雜交，對于抗性PM或線形病毒必不可少的遺傳成份的基因滲入被認為導致喪失對其它疾病的抗性必需的遺傳成份。通過這個發(fā)現，本發(fā)明的發(fā)明人已開發(fā)了培育方案，借助于這些方案可以解決這種問題，從而獲得所需要的雙抗性植物。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現，為了有效地從線形病毒抗性親本黃瓜品系的才直物(其中所述抗性產生自QTL-1)和PM抗性黃瓜品系的才直物(其中所述抗性產生自和pw-/)之間的雜交來產生雙抗性黃瓜屬植物，培育方法必須包括允許形成重組體的步驟(即，允許在一個染色體中發(fā)生同源重組事件)，接著是選擇在單染色體中具有QTL-1和/附-/或QTL-1和的4直物的步艱《。優(yōu)選地，所述選擇步驟包括選擇在單染色體中具有QTL-1、以及戶w-Zz的才直物。更優(yōu)選地，QTL-1被漸滲到在基因組區(qū)(含有(harbouring)pw-Zz和pm-/)之間的基因纟且區(qū)中，^f吏4尋有^U也，用于線形病毒4元'〖生的QTL1;故夾在用于PM^t'l"生的兩個QTL之間。如本文所定義的并與對PM或線形病毒的抗性有關的任何QTL存在的鑒定可以通過4企測連接于植物染色體上相應QTL的一種或多種基因標志、與植物染色體上相應QTL處于連鎖不平衡狀態(tài)的基因標志、或其組合來進行。一種適用于在所述才直物中4企測所述QTL的存在和/或位置的方法包括4吏用表征所述QTL的AFLP標記物。優(yōu)選地，選才奪在單染色體中具有QTL-1、尸附-/和/或的植物的所述步驟包括檢測至少一種AFLP標記物，該標記表4i凄史量性狀基因座QTL-1,其與在相同染色體(其含有用于/附-/的數量性狀基因座(QTL))上的線形病毒抗性有關，或可一辦換地，與在相同染色體(其含有用于與PM抗性有關的/^i-Zz的數量性狀基因座(QTL))上的線形病毒抗性有關，優(yōu)選地與在相同染色體(其含有數量性狀基因座/7附^和；附-/)上的線形病毒抗性有關，在這種情況下，所述QTL-1標記物位于QTLpm-Zz和QTL之間的染色體區(qū)。因此，該選擇方法可以涉及才全測一種或多種標記物，該標記物選自由表2、表3以及表4的才示i己凈勿纟且成的才示i己凈勿纟且。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于選擇黃瓜屬物種的植物的方法，該物種呈現對黃瓜線形病毒和黃瓜白4分菌的抗性，所述方法包括在所述植物中才企測在單染色體上QTL-1、以及至少QTLpm-/和/附-/之一的存在。在上述方法的一種實施方式中，該方法包4舌以下步艱《:艮a)提供來自黃瓜屬植物的基因組DNA樣品，所述樣品包含足夠長度的基因組DNA片段；b)進行純化反應以從由QTL-1、pw-/和/z組成的組選擇這樣的片段，其包含至少第一QTL、或與其有關的分子標記物；c)對所述選擇的片段進行核酸擴增反應以乂人由QTL-1、；wz-/和/m-A組成的組^r測這樣的片段，其包含至少第二QTL、或與其有關的分子標i己物，以及d)在步驟c)的反應產物中4企測具有預測長度或預測核酸序列的擴增的DNA片段。在一種優(yōu)選實施方式中，所述步艱《b)包括使用至少一《且限定用于所述第一QTL的分子標記物的引物、或至少一種具有石咸基序列的核酸纟罙針，其中所述石威基序列基本上互補于限定所述標記物的所述標記物的核酸序列在另一種優(yōu)選實施方式中，所述步艱《C)包括-使用至少一組限定用于所述第二QTL的分子標記物的引物，或至少一組引物，其在嚴格條件下特異性地雜交用于所述第二QTL的分子標記物的核酸序列。在本發(fā)明的方法的另一種實施方式中，在所述植物中才企測在單染色體上所述QTL存在的步驟是通過利用原位雜交技術或原位擴增技術來進行。此外，在這樣的方法中適宜使用這樣的探針和引物，其限定用于所述QTL的分子標記物或其在嚴格條件下特異性地雜交用于所述QTL的分子標記物的核酸序列。在本發(fā)明的幾個方面，分子標記物優(yōu)選為SNP、插入突變標記物或AFLP標記物更優(yōu)選這樣的標記物，其選自由列在表2-4中的標記物以及那些來自本文中為此目的明確引用的參考文獻的標記物組成的組。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于產生黃瓜屬物種的植物的方法，其中所述才直物呈現對黃瓜線形病毒和對黃瓜白4分菌的抗性，所述方法包4舌以下步駛《a)通過才全測在所述植物的基因組中存在至少一種標記物來選擇第一黃瓜屬植物，該植物包含賦予對黃瓜線形病毒的抗性的染色體區(qū)，其中上述標記物連接于賦予黃瓜線形病毒抗性的QTL，其是由標記物E16/M50-244、E16/M50-188、以及E11/M48-251來指示；b)通過檢測在所述植物的基因組中存在至少一種標記物來選擇第二黃瓜屬植物，該植物包含賦予對黃瓜白粉菌的抗性的至少一個染色體區(qū)，其中上述標記物連接于I武予第一黃瓜白粉菌抗性的QTL,其是由以下標記物來指示在SEQIDNO:l中的單核苷酸多態(tài)性標記物39T—G，在SEQIDNO:2中的單核苷酸多態(tài)性標記物29G—A，以及標i己物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、以及E23/M38-M001;或通過在所述植物的基因組中檢測至少一種標記物的存在，該標記物連接于賦予第二黃瓜白粉菌抗性的QTL,其是由以下標記物來指示在SEQIDNO:3中的單核苷酸多態(tài)性標記物193C—T，在SEQIDNO:4中位置221處的插入突變5'-AATTT-3',以及標記物E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E1崔59-F-134和E1崔59-F-200;c)雜交來自步驟a)和步驟b)的所述才直物以產生Fl種子；d)將一定量的Fl種子培育到Fl植物，通過雜交或自交從所述F1才直物產生進一步的后代種群；以及e)從所述進一步的后代植物中選擇一種植物，該植物包含至少一種標記物，其連接于賦予黃瓜線形病毒抗性的-QTL(如在步驟a)中所定義的)以及至少一種標記物，其連接于賦予黃瓜白粉菌抗性的QTL(如在步驟b)中所定義的)。技術人員應當明了，所述進一步的后代種群應具有足夠的大小以可以在所述進一步的后代種群中檢測這樣的植物的存在，其已在單染色體中經歷至少兩個同源重組事件。通常，大約1，000抹植物的種群將是足夠的。目前建議的標記物選擇4支術的一個優(yōu)點是，對于這樣的種群大小可以容易地篩選感興趣的基因型的存在，其在表型上可以是不可4企測的。在本方法的一種優(yōu)選實施方式中，在步，《b)中的選擇第二黃瓜屬植物的步驟包括選4奪第二黃瓜屬植物，該植物僅具有賦予所述第一或第二黃瓜白^^分菌抗性的QTL之一，并且其中所述方法進一步包4舌以下步艱《f)選擇第三黃瓜屬植物，其具有另一種賦予所述第一或第二黃瓜白粉菌抗性的QTL(即，在所述第二黃瓜屬植物中并不存在的一種QTL);g)雜交在步驟e)獲得的Fl植物和所述第三黃瓜屬植物以產生進一步的后代^直物；以及h)從后代植物中選擇一種植物，其包含如在步驟a)中所定義的]3武予黃瓜線形病毒4元性的QTL以及如在步驟b)中所定義的兩種賦予黃瓜白粉菌抗性的QTL。在一種優(yōu)選實施方式中，選擇這樣的才直物，其包含兩種賦予白粉菌抗性的基因座；附-;7和/^-/并且，其中由QTL-1表征的賦予線形病毒抗性的基因座位于兩種賦予白粉菌抗性的基因座和pm"/之間。因此，在用于產生黃瓜屬物種的植物(其呈現對黃瓜線形病毒和對黃瓜白粉菌的抗性)的方法的另一種優(yōu)選實施方式中，選擇黃瓜屬植物(該植物包含染色體區(qū)，該染色體區(qū)賦予如在步驟b)、e)、f)或h)中所定義的對黃瓜白粉菌的抗性)的步驟包括-在所述;f直物的基因組中^r測至少一種標記物的存在，該標記物連接于賦予第一黃瓜白粉菌抗性的QTL并由在SEQIDNO:l中的SNP標記物39T—G、在SEQIDNO:2中的SNP標i己物29G—A、以及標i己物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、和E23/M38-M001來指示；以及-在所述才直物的基因纟且中才企測至少一種標i己物的存在，該標"i己物連接于賦予第二黃瓜白粉菌抗性的QTL并由在SEQIDNO:3中的SNP標記物193C—T、在SEQIDNO:4中在位置221的插入突變5'-AATTT-3'、以及標記物E23/M40-M003、E24認6畫M002、E24/M46-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134和E14艇59畫F畫200來指示。在用于產生黃瓜屬物種的植物(其呈現對黃瓜線形病毒和對黃瓜白粉菌的抗性)的方法的另一種優(yōu)選實施方式中，至少步驟a)、b)、e)、f)或h)之一包括以下步驟提供來自所述植物的基因組DNA樣品并在所述基因組DNA樣品中4全測所述至少一種標記物。在一種可替代的優(yōu)選實施方式中，步驟e)包括在才直物基因組中才企測至少一種與QTL-1有關的標i己物以及至少一種與/w-A或pw-/有關的標記物，優(yōu)選在才直物的基因組中和在單染色體上4企測至少一種與QTL-1有關的標記物、至少一種與pm-/2有關的標記物以及至少一種與/附_/有關的標記物，優(yōu)選包括如選自列在表2、3以及4中的標i己物組的標"i己物。在另一種優(yōu)選實施方式中，步驟e)的進4亍是通過本發(fā)明的用于選4奪如上所述的黃瓜屬物種的雙抗性一直物的方法。應當明了，如在步驟c)-e)中描述的方法，其中單染色體中的至少兩個同源重組事件已在單交中發(fā)生，其產生雙抗性Fl,也可以經多代實現，4吏得建議的(至少兩個)在單染色體中的同源重組事件，因此乂又抗性才直物的形成，可以在F2、F3、F4、F5iU壬4可后來的代中實現。這樣的變異是在本發(fā)明的范圍內，并且技術人員可以容易地獲得。在用于產生黃瓜屬物種的植物(其呈現對黃瓜線形病毒和對黃瓜白4分菌的抗性)的可替4灸方法中，所述方法可以包4舌以下步驟a)通過進行本發(fā)明的方法來選擇黃瓜屬物種的第一植物，其呈現對黃瓜線形病毒和黃瓜白粉菌的抗性；c)雜交來自步驟a)和步驟b)的所述才直物以產生Fl種子；d)使所述Fl種子生長成Fl植物。本發(fā)明的另一個方面涉及通過本發(fā)明的方法產生的植物、或其部分。本發(fā)明現在便于非?？焖俚睾Y選后代植物以便選擇可能呈現雙抗性的植物。例如，可以在后代植物中^r測那些植物，其具有至少/w-/2才示i己物之一、至少pw-/才示i己物之一以及至少QTL-1才示i己物之一。這樣的植物可能已獲得所期望的基因滲入。篩選另外的標記物可以提高預測后代才直物呈觀J又抗性的置信水平。在4企測才直物(對于三種QTL的每一種，其呈現至少一種標記物)以后，則可以選擇該才直物并用于培育方案、或用于另外的鑒定實-險。本發(fā)明的植物的一個優(yōu)點，其中性狀位于一個并且相同的染色體上，是它們提供改善的可能性，以當利用常規(guī)培育時，將控制兩種形式的抗性的基因更容易地移動到其它(雜種)植物中，而如果性狀位于分開的染色體上，通過利用常規(guī)培育技術將更難產生包含兩種組合性狀的雜種。圖1-6示出若干可能的重組方案，其中來自兩種分開的植物的白粉菌(pm)和線形病毒(QTL-1)抗性被結合到單種后代植物中。應當明了，表示為具有多重抗性基因座的各種親代本身可以是雜交或自交的結果。因此，具有QTLpw-/和的柏:物可以通過雜交具有單QTL的才直物而獲得。圖7示出在單連鎖群中來自黃瓜NPI的用于白粉菌抗性(pm)和來自Khira黃瓜的用于線形病毒抗性(QTL-1)的各種基因的位置。長口在本文中所4吏用的，Pm-leaf相當于pm-l以及Pm-hypo才目當于pm-h。圖8示出在SNP附近的DNA序列以及如由本文表2和3中的相應SEQID所指示的插入標記物。具體實施例方式定義如在本文中所使用的，術語"黃瓜"是指黃瓜屬物種的一種植物、或其部分，包括但不限于這樣的植物，其通常稱為黃瓜、美洲腌食用小黃瓜、香蕉瓜、小黃瓜、腌食用小黃瓜、溫室黃瓜、檸檬小黃瓜、Mandera(曼德拉黃瓜)、腌漬黃瓜、Serpent(蛇形黃瓜)、鮮食黃瓜、蛇王瓜、以及西印度腌食用小黃瓜。如在本文中所使用的，術語"植物部分"是指植物的一部分，包括單細胞和細胞組織，如在植物中為完整的植物細胞，細胞凝塊和組織培養(yǎng)物，從其可以再生植物。植物部分的實例包括但不限于來自花粉、胚珠、葉、胚芽、根、根尖、花藥、花、果實、莖、枝條、以及種子的單細胞和組織；以及花粉、胚珠、葉、胚芽、才艮、根尖、花藥、花、果實、莖、枝條、接穗、根狀莖、種子、原生質體、愈傷組織等。如在本文中所使用的，術語"線形病毒"是指Clostermiridae家族的病毒，包括但不限于這樣的病毒，其通常被稱為南瓜黃矮化失調病毒(CYSDV)、萵苣傳染性枯黃病毒(LIYV)以及甜菜偽黃化病毒(BPYV;還稱作黃瓜黃化斑點病毒(CCSV)、黃瓜黃化病毒、甜瓜黃化病毒或草莓灰白(pallidosis)病毒)，優(yōu)選為BPYV和CYSDV，最優(yōu)選為CYSDV。優(yōu)選地，對于黃瓜屬植物來說，術語"線形病毒，，是指對黃瓜屬才直物特別重要的屬，即Crinh)iideae。如在本文中所使用的，術語"白粉病"是指在黃瓜(黃瓜L.)中由真菌南瓜白4分病菌(還稱作白4分病菌和單絲殼白粉菌)和/或由真菌二孑包白粉菌(還稱作Golcn)inomycescichoracearum)和/或由真菌Lei)eillulataurica(還稱作辣椒白粉病菌、Erysiphetaurica、Omilariopsiscynarea、LeT)eillulasolanaceamm)引起的真菌寸生疾病。本文中所使用的術語"QTL"具有其
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認可的含義，是指染色體區(qū)，該染色體區(qū)包含與連續(xù)分布的(數量)表型性狀的表達有關的等位基因(例如，具有基因或調節(jié)序列的形式)。術語"用于疾病抗性的QTL"是指位于特定染色體上的區(qū)域，其與至少一種為抗性編碼的基因或至少一個調控區(qū)有關，即，染色體的區(qū)域，其控制與抗性有關的一種或多種基因的表達。為了稱呼與抗性有關的QTL，本文中使用了更短的等效短語"賦予抗性的基因座"?？梢酝ㄟ^利用一種或多種分子基因組標記物來指示它們在特定黃瓜登記號的基因組中的基因位置，從而限定QTL。一種或多種標記物本身又指示特定的基因座?；蜃g的距離通常通過在相同染色體上的基因座之間的交換頻率來度量。在分開較遠的兩個基因座之間更可能發(fā)生交換。相反地，如果兩個基因座靠在一起，則(在它們之間)較少可能發(fā)生交換。通常，一厘摩(Kosambi圖鐠函數(cM))大約等于基因座(標記物)之間的1%重組(Lui，1997)。當可以通過多重標記物來指示QTL時，終點標記物之間的遺傳距離表示QTL的大小。本文中所4吏用的術語"染色體"具有其4支術領域認可的含義，是指在細胞核中自復制遺傳結構，其包含細胞DNA并在其核苷酸序列中含有基因的線性陣列。如在本文中所使用的，術語"連鎖群"是指位于相同染色體上的所有基因或遺傳性狀。在連鎖群內，那些足夠靠在一起的基因座將在遺傳雜交中呈現連鎖。因為交換的可能性隨在染色體上的基因之間的物理距離的增加而增加，所以其在連鎖群內的位置4皮此遠離的基因不可能在直接遺傳試驗中呈現任何可檢測的連鎖。術語"連鎖群"最多地用來指在遺傳系統(tǒng)中呈現連鎖行為的遺傳座，其中還未進行染色體定位。因此，在本文范圍內，術語"連鎖群"與染色體(物理實體)是同義的。如在本文中所使用的，術語"等位基因"是指基因的任何一種或多種可替換形式，所有這些等位基因與至少一種性狀或特征有關。在雙倍體細胞中，給定基因的兩種等位基因占據在一對同源染色體上的相應的基因座。因為本發(fā)明涉及QTL,即，可以包含一種或多種基因或調節(jié)序列的基因組區(qū)，所以在某些情況下更準確地是指"單元型("(即，染色體節(jié)段的等位基因)而不是"等位基因，，，然而，在那些情況下，術語"等位基因，，應理解為包括術語"單元型"。在本文中"基因"定義為包括DNA序列的遺傳單位，其占據染色體上的特定位置并且其包含用于生物中特定特性或性狀的遺傳指令。在本文中"基因座"定義為給定基因或調節(jié)序列在給定物種的染色體上占據的位置。"同源重組"是指在相同核苷酸序列的區(qū)域中兩個DNA分子或成對染色體的染色單體之間DNA片,殳的交換。在本文中"重組事件"應理解為是指減數分裂交換。如在本文中所使用的，術語"分子標記物"是指一種指示劑，其用于顯示核酸序列的特性差異的方法中。這樣的指示劑的實例是限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標記物、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)標記物、單核苷酸多態(tài)性(SNP)標記物、插入突變標記物、孩i隨體標記物(SSR)、序列特征性擴增區(qū)域(SCAR)標記物、酶切擴增多態(tài)性序列(CAPS)標記物或同工酶標記物或本文所述標記物的組合，其限定了特定的遺傳和染色體位置。如在本文中所定義的，"連接于QTL的分子標記物"因此可以指SNP、插入突變以及更通常的AFLP標記物或在本領域中使用的任何其它類型的標記物。在本文列舉的AFLP標記物的范圍內，標記物是指旁側有兩個AFLP引物的黃瓜特異性DNA序列，這些？1物包括"核心引物"E和M,其對應于限制酶EcoRI和Msel的限制4立點，(Vosetal.，1995;Baietal.2003)接著是如所指出的2或3額外的選擇性堿基，各自接著是鑒定選擇性核苷酸的兩數字代碼，借此"核心引物"被延伸(關于代碼，參見表1)。E16/M50-244表示通過利用擴增引物EcoRI+CC和Msel+CAT所獲得的標記物，以產生總長度為244bp的片段。片段的長度可以取決于用來檢測片段的方法，并且是它的真實長度的近似，加上或減去幾個石咸基。在定義如本文提供的標記物時，應參考在連鎖圖中在染色體上該標記物相對于其它標記物的位置。因此，標記物E16/M50-244是通過其引物的序列、以及通過其作為擴增產物的長度、以及通過其相對于E14/M59-F-200和/或E23/M38-M003的4立置、或如本文才是供的通過其相^"于其它標i己物的位置(如在順序清單中所描述的，其中順序清單在表4的矩陣具有相應的距離，單位為cM)力口以限定。然而，應當考慮到，#:物之間的雜交可以導致某些標記物;帔喪失，所以沒有某些標i己物并不排除存在遺傳成4分，其賦予對疾病的抗性并且標記物被認為連接于其上。表l:如通常用于AFLP分析、以及如在本文中所^使用的引物延伸代碼(來源關4定基因(Keygene)，瓦格寧才艮(Wageningen)，荷蘭)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>術語"黃瓜特異性DNA序列"是指多核苷酸序列，其與黃瓜屬物種的基因組的序列(其顯示與它的最大相似性，優(yōu)選在用于QTL-l的標記物的情況下，旁側QTL-l標記物的黃瓜登記號PI250147的DNA序列的一部分)具有大于80%的核苷酸序列同源性、優(yōu)選大于85%、更優(yōu)選大于90%、甚至更優(yōu)選大于95%、還要更優(yōu)選大于97%、最優(yōu)選大于99%。如在本文中所使用的，術語"核苷酸序列同源性"是指在兩種多核苦酸之間存在同源性。當為獲得最大對應加以排列時，如果在兩個序列中的核苷酸序列是相同的，則多核苷酸具有"同源"序列。酸之間的序列比較，以鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域。比較窗通常是大約20至200個鄰接的核苷酸。多核苷酸的"序列同源性的百分率"，4。百分之50、60、70、80、90、95、98、99或100的序列同源性，可以通過經比較窗比較兩個最佳排列序列來確定，其中當和參比序列(其并不包含添加或缺失)進行比較以獲得兩個序列的最佳排列時在比4交窗中的多核苷酸序列部分可以包4舌添加或缺失(即，缺口)。百分率是通過下述加以計算(a)確定相同核酸堿基出現在兩個序列中的位置數目以產生配對位置的數目；(b)配對位置的數目除以在比較窗中的位置總數；以及(c)將結果乘以100以產生序列同源性的百分率。用于比較的序列的最佳排列可以通過已知算法的計算機化實施或通過直觀檢查來進行。容易獲得的序列比4交和多序列對比算法分別是基本的局部比對搜索工具(BLAST)(Altschuletal"1990;Altschuletal,1997)和ClustalW程序，兩者均可從互聯網獲得。其它適宜的程序包括但不限于GAP、BestFit、PlotSimilarity、以及在WisconsinGeneticsSoftwarePackage(GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,WI，USA)(Devereuxetal，1984)中的FASTA。如在本文中所-使用的，術語"/7W-/7"是指在下胚軸中表達的推定的白粉菌抗性基因，優(yōu)選地如通過表2的特異性SNP的存在所限定。表2.顯示與白粉菌抗性表型(本文中表示為QTLpw-ZO完全關聯的SNP<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>如在本文中所使用的，術語》m-/，，是指推定的白粉菌抗性基因pm-leaf，優(yōu)選地如通過表3的特異性突變的存在所限定。表3.顯示與白粉菌抗性表型(本文中表示為QTLpw-/)完全關聯的突變<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>術語"QTL-l"是指連接于線形病毒抗性的基因組區(qū)，如由標記物E16/M50-244、E16艇50-188、和/或E11/M48-251所限定的，如詳細描述在WO02/22836中，對其本說明書特別提及。術語"后代"植物是指任何植物，其作為后代形成自一種或多種親本4直物或其后4氣的無性或有性生殖。例如，可以通過克隆或自交親本植物或通過雜交兩種親本植物來獲得后代植物，并且后代植物和F1或F2或更遠的代自交。Fl是產生自親代的第一代后代，至少其之一首次用作性狀的供體，而第二代(F2)或后來的代(F3、F4等)的后^是產生自Fl、F2等的自交的4f品。Fl因此可以是(并且通常是)兩種純育親代(對于性狀來說，純育是純合的)之間的雜交所產生的雜種，而F2可以是(并且通常是)由所述F1雜種的自花傳粉所產生的后代。如在本文中所使用的，術語"雜合的"是指當不同的等位基因存在于同源染色體上的相應基因座時存在的遺傳條件。如在本文中所使用的，術語"純合的"是指當相同的等位基因存在于同源染色體上的相應基因座時存在的遺傳條件。在植物育種的范圍內，術語"雜種"是指這樣的植物，其是遺傳上不相似的親代的后代并通過雜交不同品系或品種或物種的才直物而產生，其中雜交包括f旦不限于兩個近交品系之間的雜交。如在本文中所使用的，術語"近交的"是指基本上純合的個體或品系。如在本文中所使用的，術語"基因滲入"、"漸滲的"以及"漸滲"是指人工和天然過程，借此通過雜交那些物種，一個物種、變種或培養(yǎng)變種的基因組區(qū)^L移動進入另一個物種、變種或培養(yǎng)變種的基因組。該過程可以可選地通過回交到回歸親本來完成。"基因工程"、"轉化"以及"遺傳修飾，，在本文中均用作異名，是指將分離的和克隆的基因轉移到另一生物的DNA、通常為染色體DNA或基因《且中。如在本文中所使用的，術語"種群"是指遺傳上異種的植物集合，其共享共同的遺傳衍生物。如在本文中所使用的，術語"變種"或"培養(yǎng)變種"是指一組類似的植物，其通過結構或遺傳特點和/或性能可以與相同物種內的其它變種區(qū)別開來。術語"抗性的"和"抗性"包括對感染的部分的和完全的抗性。易感4直物可以是對感染無抗性的或具有^f氐水平抗性。該術"^吾用來包括這樣的可分開鑒定的抗性形式為"完全抗性"、"免疫性"、"中等抗性"、"部分抗性"、"過敏性"以及"耐受性"。"完全抗性，，是指在感染以后疾病完全不能發(fā)展，并且可以是疾病不能進入細^I包的結果(沒有初期感染)或可以是因子(agent)不能在細^^中增殖以及感染其后細^^的結果(沒有闊下感染、沒有擴散)。術語"易感的"在本文中用來指對疾病沒有抗性的才直物，其導致才直物-陂該疾病所感染、導致疾病癥狀。術i吾"易感的"因此相當于"無^t性的"。在核酸的范圍內，術語"雜種"是指雙鏈核酸分子、或雙鏈體，其是通過互補核苷酸石威基之間的氫4建結合所形成。術語"雜交"或"退火(anneal)"是指這樣的過程，通過該過程并借助于互補力成基之間的氫鍵結合，核酸序列的單鏈形成雙螺旋節(jié)段。術語"探針"是指單鏈寡核苷酸序列，其將與靶核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互補序列形成氫4建結合的雙鏈體。如在本文中所使用的，術語"引物"是指一種寡核苷酸，當置于一些條件下時，其中誘導引物延伸產物的合成，即，在有核苷酸和用于聚合作用的試劑(如DNA聚合酶)存在的情況下以及在適宜溫度和pH下，其能夠-使擴增革巴退火以^f吏DNA聚合酶可以附著，從而用作DNA合成的起始點。(擴增)引物優(yōu)選為單鏈，以獲得最大擴增效率。優(yōu)選地，引物是一種寡脫氧核苷酸。該引物必須足夠長以在有用于聚合作用的試劑存在的情況下引發(fā)延伸產物的合成。引物的準確長度將取決于許多因素，其包括引物的溫度和組成(A/T和/或G/C含量)。一對雙向引物包括一種正向引物和一種反向引物，如在DNA擴增(如PCR擴增)領域中所通常l吏用的。應當明了，如在本文中所4吏用的，"引物，，可以指一種以上的引物，尤其是在關于要擴增的靶區(qū)的末端序列信息存在某種歧義的情況下。因此，"引物"包括引物寡核苷酸的集合，其包含表示序列中可能變異的序列，或包括核苷酸，其允許典型的石威基配對。寡核苷酸引物可以通過任何適宜的方法加以制備。用于制備特定序列的寡核苷酸的方法在本領域是已知的，并且包括，例如，克隆和限制適當的序列、以及直接化學合成。化學合成方法可以包括，例如，磷酸二酯或磷酸三酯方法、二乙基氨基磷酸酯方法以及固體載體方法(披露在例如，美國專利第4,458,066號中)。如果需要的話，可以通過可檢測的結合方式，例如通過光譜、熒光、光化學的、生化的、免疫化學的、或4匕學的方式，來標"i己引物。在有適量的四種脫氧核津唐核苷酸三磷酸(dATP、dGTP、dCTP以及dTTP，即dNTP)或類似物存在的情況下，在由適當鹽、金屬陽離子、以及pH^爰沖系統(tǒng)組成的反應介質中，用聚合劑來催化寡核苷酸引物的模板相關延伸。適宜的聚合劑是已知可以催化引物相關DNA合成和模板相關DNA合成的酶。已知的DNA聚合酶包括，例如，大腸桿菌DNA聚合酶I或其克林諾片段、T4DNA聚合酶、以及TaqDNA聚合酶。用這些DNA聚合酶來催化DNA合成的反應條件在本領域是已知的。合成產物是由模板鏈和引物延伸鏈構成的雙鏈體分子，其包含靶序列。這些產物本身又作為用于另一次復制的模板。在第二次復制中，用其互補引物來使第一循環(huán)的引物延伸鏈退火；合成產生"短，，產物，通過引物序列或它們的補體，其結合于5'-末端和3'-末端。變性、引物退火、以及延伸的重復循環(huán)導致由引物限定的靶區(qū)的指數累積。運行足夠的循環(huán)以獲得所期望量的包含核酸靶區(qū)的多核苷酸。所期望的量可以變化，并且由產物多核苷S臾要發(fā)揮的功能來確定。PCR方法充分地描述在手冊中并且對于技術人員來說是已知的。在通過PCR進行擴增以后，靶多核苦酸的檢測可以通過與探針多核苷核普酸形成穩(wěn)定的雜交體。如果期望探針將基本上完全互補(即，大約99%或更大)于靶序列，則將使用嚴格條件。如果期望某種失配，例如，期望不同的品系，從而探針將不是完全互補的，則可以降低雜交的嚴格性。然而，選擇這樣的條件，其排除非特異性/不定結合。影響雜交、并且相對于非特異性結合進行選擇的條件在本領i或是已^口的，并JU葛述在，侈'J:fe口，SambrookandRussell,2001中。通常，更低的鹽濃度和更高的溫度會增加雜交條件的嚴格性。術語"嚴格雜交條件"是指這樣的條件，在該條件下，多核苷酸將雜交至它的靶亞序列，通常在核酸的復雜混合物中，^f旦基本上不雜交至其它序列。嚴格條件是與序列相關的并且在不同情況下將是不同的。尤其是在更高溫度下，更長的序列進行雜交。對于核酸雜交的詳盡的指導可參見Tijssen,1993。通常，選擇的嚴格條件是在規(guī)定的離子強度pH下低于特定序列的熱熔點(Tm)大約5-10°C。Tm是這樣的溫度(在規(guī)定的離子強度、pH、以及核酸濃度下)，在該溫度下，在平衡時，50%的與靶互補的探針雜交于靶序列(當靶序列過量存在時，在Tm下并在平衡時，50%的探針被占據)。嚴格條件將是那些條件，其中在pH7.0至8.3下，鹽濃度為小于大約1.0M鈉離子、通常大約0.01至l.OM鈉離子濃度(或其它鹽)并且對于短〗笨4十(例如，10至50個核苷酸)溫度為至少大約30°C而對于長探針(例如，大于50個核苦酸)溫度則為至少大約60°C。還可以借助于加入去穩(wěn)定劑如曱酰胺來實現嚴格條件。對于選"f奪性或特異性雜交，正信號是至少兩倍背景，優(yōu)選10倍背景雜交。典型的嚴格雜交條件經常是50%甲酰胺、5xSSC、以及1。/。SDS，在42°C下溫育，或5xSSC、1%SDS,在65。C下溫育，以及在65°C下在0,2xSSC、以及0.1%SDS中洗滌。對于PCR，大約36°C的溫度常用于4氐嚴格性擴增，雖然退火溫度可以在大約32°C和48。C之間，其取決于引物長度。用于確定雜交參數的另外的指導提供在許多參考文獻(例如，A腿bel,etal.1999)中。乾'逸其滋才X的描迷產生雙抗性植物在農業(yè)和園藝學中培育方案的目的是通過改善它們的遺傳組成來增強植物的性能。本質上，這種改善是通過對影響感興趣的性能特性的基因增加最有利等位基因的頻率來實現。野生植物品系提供了遺傳性和表型變異的豐富資源。傳統(tǒng)上，農業(yè)或園藝實踐利用了這種變異選擇具有所期望的基因型或潛在的表型特性的野生植物品系或其后代，使它和具有另外的所期望的基因型或潛在的表型特性的品系進行雜交，以及從后代植物中選擇那些植物，其呈現(增加頻率的)所期望的基因型或潛在的表型特性。增長的知識和應用孟德爾式遺傳定律連同分子遺傳工具已在過去的百年中促進了這種選4奪方法。例如，基于試驗所述植物是否存在數量性狀基因座(QTL),即，是否存在包含與連續(xù)分布(數量)表型性狀的表達有關的等位基因的染色體區(qū)，已可以獲得用于選擇具有所期望的基因型或潛在的表型特性的植物的方法。通常，QTL的特點在于一種或多種標記物，其統(tǒng)計上與表型性狀中的數量變異有關并且基本上與基因是同義的。QTL編圖便于鑒定影響感興趣的性狀表達的候選基因座。在植物育種中，它便于標記物輔助選擇(MAS),即，通過在那些才直物中才企測QTL伴隨標記物來選擇具有有利等位基因的植物。在栽培植物的培育方案中的主要問題之一是在分離的性狀之間存在負遺傳相關。例如，在各種疾病抗性#_物品系中，在生殖能力和生產之間就存在負遺傳相關性。人們理解到，DNA從一種植物品系的基因組基因滲入另一種植物品系的基因組可以干擾或影響基本的生殖性狀的表達。同樣，試圖將賦予抗性的基因序列從一種才直物漸'滲進入另一種才直物可以除去在受體品系中已經存在的抗性性狀。各種性狀的遺傳知識i^更于，例如，選4奪對與疾病抗性有關的QTL來說為純合的品系。同常規(guī)培育方案相比，在培育計劃中應用所期望性狀的遺傳性起點和4立置的知識爿奪增加所預測的培育結果的準確性并加快選擇。例如，以下事實，即所期望性狀的遺傳基礎遺傳上連接于另一種性狀，有助于在后代之間增加所述兩種性狀的均勻性，因為對于所期望的等位基因為純合的親代會將它們傳到大多數后代，其將在后代中呈現為降低的分離。如上所述，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現了對線形病毒和白粉菌均具有抗性的植物。這樣的植物至今還未發(fā)現。試圖將DNA從線形病毒抗性品系漸滲進入已經具有白4分菌抗性的4直物品系、或反過來也一樣，先前已表明是不成功的。本發(fā)明的發(fā)明人另外發(fā)現，在雙抗性植物中，對于線形病毒和白粉菌具有抗性的基因是如此緊密連接，以致實際上它們好像單個單位那樣被共遺傳。在如此緊密連接的基因之間的這樣的遺傳結構(geneticconfiguration)有時也稱作等位基因(基因)，其處于結合相(處于順式)。在這樣的情況下，一般認為，這些基因存在于單染色體上。事實上，當提及在單染色體上存在基因或QTL時，它是指它們處于結合相。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現，在雙抗性植物中，對線形病毒和白粉菌具有抗性的基因是存在于連鎖群4中。按照Horejsi等(2000)，黃瓜L的連鎖群4還包含對霜霉病(dm)抗性具有抗性的基因。LG4可以通過下述RFLP標記物的(4壬4可)一種或組合(如通過專欠件包INTMAP,Keygene，Wageningen,荷蘭；圖^f立以cM為單^f立并在4舌號中)來進一步表4正CsC032a/El(25.9);CsP357/H3(31.7);CsC588/H3(34.2);CsC477H3(35.3);CsC694/E5(38.5);CsP347/H3(38.5);CsC365/El(41);CsC386/El(41);CsC230/El(41.7);CsP06頻(45.5)。明確的染色體凄t還未f武予黃瓜染色體，在其上定位有用于線形病毒4元性的QTL1以及用于白4分菌4元性的/w-Z和pm-Zz。然而，染色體可以通過參照連鎖群(LG4)加以指明，其中在連鎖群上定位有這些和其它基因組區(qū)。術語連鎖群在本文中用來指物理遺傳單位，在其上定位有賦予抗性的等位基因，并且其具有和染色體相同的等級水平。用于線形病毒和pm抗性的基因是在單染色體上，這一發(fā)現的意義具有兩個方面。首先，對于培育目的來說非常有利的是，具有定位在單染色體上的基因，更優(yōu)選甚至在較小的鄰接染色體節(jié)段上，因為它們將被共同地傳到后代植物。由于在負責白粉菌抗性的基因和負責線形病毒抗性的那些基因之間的物理連鎖的結果，雜交的后代植物，其中本發(fā)明的雙抗性植物用作親本植物，可在后代植物中保證分離的低頻率。第二，這種知識可以有助于植物育種，因為它對兩種性狀為何如此難以結合到單個植物品系中提供了可能的解釋。不希望受到任4可理i侖的限制，i人為，負責線形病毒抗性的QTL的特定位置和對該QTL的選擇妨礙了所期望的基因滲入的形成或至少便于發(fā)生非常少的所期望的基因滲入。與白粉菌抗性有關的QTL和用于線形病毒抗性的QTL是如此靠近，以致用于第二抗性性狀(例如，線形病毒)的QTL基因滲入已經具有第一抗性(例如，白粉菌)的植物品系中可導致(部分)喪失第一抗性性狀。在植物品系具有用于白4分菌^t性的兩種QTL和/7W-Zz)的十青況下，用于線形病毒抗性的QTL的基因滲入僅可發(fā)生在基因組的非常小的部分，而沒有"損傷"作為白粉菌抗性的基礎的遺傳信息。因此，除了發(fā)現各種抗性基因位于單染色體中之外，還發(fā)現，當兩種白4分菌抗性等位基因均存在于雙抗性才直物中時，與線形病毒抗性(QTL-1)有關的QTL是位于與PM抗性有關的兩種QTL(pw-/z和/^-/)之間。此發(fā)現可以至少部分地進一步解釋觀測到的重組進入所期望的基因型的低頻率。此外，它推測這樣的植物如何可以形成的至少三種可能的方案，乂人而為用于它們生產的若干種可重復的方法創(chuàng)造條件第一種方法包括將賦予線形病毒抗性的基因座(QTL-1，如在本文中所定義的)乂人感興趣的第一品系的才直物沐斤滲到感興趣的第二品系的白粉菌抗性植物中，從而具有賦予兩種PM抗性的基因座和pw-/。如果這導致感興趣的第二品系的遺傳背景，則該方法將涉及將QTL-1基因滲入在賦予兩種PM抗性的基因座/w-Zz和pw-/之間的基因組區(qū)，以在具有感興趣的第二品系的遺傳背景的后4戈才直物中形成具有構型(configuration)pw-/-QTL-l~pw-/的基因組DNA序列裝配(參見圖1)。基于jt匕，可以預測，在單染色體的特定區(qū)域僅雙同源重組事件(即，對于每個交換的一個事件)能夠在感興趣的第二品系的遺傳背景中形成具有線形病毒和PM抗性的雙抗性表型。在后代植物中適當基因滲入的建立可以通過利用QTL-1、pm-1和pm-h特異性標i己物力口以監(jiān)測。在第二種方法中，可以希望將抗性性狀結合在不同的遺傳背景中，例如，結合在感興趣的第一品系中。這樣的方法可以包括將賦予兩種PM抗性的基因座/m-/z和pw-/乂人感興趣的第二品系的才直物漸滲到感興趣的第一品系的線形病毒抗性植物(其具有QTL-1基因座)中。在這種情況下，該方法將涉及/W-/7和/附-/基因座獨立地基因滲入QTL-1基因座的任何一側，以便在具有感興趣的第一品系的遺傳背景的后代植物中形成具有構型pm-/—QTL-l~^m-/2的基因組DNA序列裝配(參見圖2)?；诖藰嬓?，可以預測，需要在單染色體的特定區(qū)i或中的至少兩個雙同源重組事件(即，四個交換事件)以形成線形病毒和PM抗性的^又抗性表型。再一次，在后植物中適當基因滲入的建立可以通過利用QTL-1、pm-l和pm-h特異性標i己物加以監(jiān)測。上述可以解釋，為4可從例實于生物添力口(accession)到例4口PM抗性的CYSDV抗性的基因滲入的商用黃瓜品系是非常稀少的事4牛。它還可以解釋，為刊7人例如野生物添加到例如線形病毒抗性的兩種PM抗性基因座基因滲入的商用黃瓜品系是更稀少的事件。重組是在減數分裂期間在兩個同源染色體之間的信息交換。在一種重組才直物中，最初存在于染色體內特定位置上的DNA與另一種植物(即，對于父本為母性的，或反過來也是一樣)交換DNA。在雙重組體中，這種交換發(fā)生兩次，例如，在基因/基因座的兩側。為了僅交換所需要的物質，以及在染色體中保留盡可能多的有價值的最初信息，這將通常需要發(fā)生四個交換事件(參見上述)。發(fā)現這樣的雙重組體的正常方式是篩選F2植物的種群。此種群必須具有足夠的大小以檢測稀少(低頻率)雙重組體。雙重組的頻率是單重組體的頻率的積。例如，可以發(fā)現在10cM面積中的重組體具有10%的頻率，并且可以發(fā)i見雙重癥且體具有10°/"10%=1%的頻率(1厘摩一皮定義為在測交中1%的重組后4戈)?；乇苓@種低頻率問題的一種方式是進行"平行重組"。基本上這是指，使兩個重組事件可以分別在兩種不同的植物中發(fā)生，其后通過簡單雜交所述重組事件被結合到一種植物中并在獲得的F2中進行選擇。這導致減少要篩選的植物數目。因此，用于產生雙抗性植物的第三種方法包括將賦予兩種PM抗性的基因座或之一從感興趣的第一品系漸滲到感興趣的第二品系的線形病毒抗性4直物(其具有QTL-l基因座)中，以形成具有構型QTL-l或QTL-l^pw-/z的基因組DNA序列裝配，以及將賦予兩種PM抗性的基因座或pm-/的另一種乂人感興趣的第三品系漸滲到感興趣的第二品系的另一種線形病毒抗性才直物(其具有QTL-l基因座)中，以形成具有構型QTL-l—-pw-/或pm-/—QTL-l的基因組DNA序列裝配(參見圖3)。其后，包含來自每個獨立重組的基因滲入的后代才直物#皮雜交以形成具有構型pw-/—QTL-l^pw-Z的基因組DNA序列裝配(參見圖3)。再一次，在各種后代j直物中適當基因滲入的建立可以通過利用QTL-l、pm-l和pm-h特異性標記物加以監(jiān)測，基于此選擇用于進一步雜交的植物。本領域技術人員可以從圖4-6衍生其它方法。用于限制要篩選的植物數目的方法可以例如進行如下雜交兩個個體，一個包含兩種PM抗性等位基因(pm-l和pm-h)而另一個包含QTL抗性等位基因。選擇在pm等位基因之一和QTL-l之間具有1次交叉的才直物，如下如果兩個pm等4立基因的兩個鄉(xiāng)冬點之間的遺傳距離是10cM并且QTLl位于中間(所以在QTLl和pm-l或pm-h的4壬4可一個之間為5cM),那么在QTLl和4壬4可一種pm基因座之間的重^L以5%的頻率發(fā)生。因:t匕，在雜交的2004朱后^Ot物的首次篩選中，IO才朱將為A型重組體以及104朱將為B型重組體。自交如此鑒定的重組體并通過運4亍旁側QTL-l和pm基因座的標記物來篩選為純合體后代的10株植物。在純合體AxB之間進行10次雜交(IOA與10B雜交)并在獲得的F2中篩選10^M直物以發(fā)現1個雙重組體。最后，這將鄉(xiāng)合予IO種獨立的雙重組體。于是篩選的才直物總凄t為500，而在常*見方法中這將需要篩選40004朱才直物以形成10種獨立的雙重組體(在QTL-1和任何一種pm基因座之間距離為5cM，并且雙重組體的頻率為0.05x0.05=0.2%)。本發(fā)明現在可以提供用于標志輔助選擇(MAS)的更好模型。因此本發(fā)明涉及植物育種的方法以及涉及選擇植物的方法，尤其是黃瓜屬植物，特別是作為培育植物用于培育計劃的栽培的黃瓜屬植物或具有所期望的基因型或潛在的表型特性的栽培的黃瓜屬植物，尤其涉及產生有價值的黃瓜果實，在本文中也稱作商業(yè)上有價值的植物。在本文中，栽培植物被定義為這樣的植物，其是特意選擇的植物或衍生自在為獲得所期望的基因型或潛在的表型特性的農業(yè)或園藝實踐中已特意選擇的植物，尤其是通過近交獲得的植物。本發(fā)明的乂又抗性才直物可以例如具有基因型AABBcc、AABbcc、AaBBcc或AaBbcc，其中"A"是基于顯性；^-/基因座的抗性基因型，而"a"是其相應的無抗性等位基因；"B，，是基于顯性QTL-1基因座的抗性基因型，而"b，，是其相應的易感等位基因；以及"c"是基于隱性基因座的抗性基因型。因此，本發(fā)明的雙抗性柏:物包4舌純合才直物以及雜交才直物。通過進4于以下雜交(親代配子的基因型)可以獲得這些基因型ABcxABc、ABcxAbc、ABcxaBc、ABcxabc、以及AbexaBc。因jt匕可以看到，產生國己子abc的才直凈勿(該植物不是抗性的，除了pm-h)仍然可以用來產生本發(fā)明的雙抗性(雜種)植物。在一種特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的雙抗性植物是近交植物，對于抗性等位基因是純合的。因為/m-Z基因座是隱性基因座，所以在F1或BC1中不能通過利用生物測定對其進4亍監(jiān)測，即，如果易感親4戈用來產生F1/BC1(如在培育中常見的)。因此，特別有利的是，在后代植物中適當基因滲入的建立可以通過利用如本文提供的QTL-特異性標記物來加以監(jiān)測。通過利用MAS或MAB方法，因此本領域4支術人員4皮提供了選才奪植物的方法。因此本發(fā)明還提供了用于選擇黃瓜屬物種的植物的方法，上述才直物呈現對黃瓜線形病毒和黃瓜白4分菌的抗性，所述方法包括在所述植物中4企測在單染色體上如本文定義的QTL-1的存在，以及如本文定義的QTL和pm-/7的至少一種。在本發(fā)明的用于選擇這樣的植物的優(yōu)選方法中包括a)提供來自黃瓜屬植物的基因組DNA樣品；b)在所述基因組DNA樣品中4企測至少一種連4妻于QTL的分子標記物，其中QTL選自由QTL-1、和組成的組，更優(yōu)選地乂人所述組沖企測至少兩種分子標記物，其中一種標記物才企測線形病毒^t'l"生而另一種才示i己物才企測白并分菌4元寸生。提供來自黃瓜屬植物的基因組DNA樣品的步驟可以通過本領i或眾所周知的標準DNA分離方法來完成。在一種優(yōu)選實施方式中，才企測分子標記物的步艱《(步艱《b)可以包括^使用一組雙向引物，其用于AFLP方法以產生擴增產物，該擴增產物后來i正明是適用于QTL的標記物。在本文中這沖羊的一組引物稱作限定AFLP才示"i己物的引物或標i己物4爭異'性引物。雙向意p未著，引物的取向是如此，以致在核酸的擴增反應中一種作為正向引物而另一種作為反向引物。可替換地，在另一種優(yōu)選實施方式中，檢測分子標記物的步驟核酸序列的石咸基序列的核酸纟笨針并且該核酸纟笨針在嚴才各條件下特異性地雜交限定所述分子標i己物的核酸序列。適宜的核酸纟笨4十可以例如是對應于標記物的單l連擴增產物。才全測分子標記物的步驟(步驟b)還可以包括對所述基因組DNA進行核酸擴增反應以才企測一種或多種QTL。這可以適宜地通過進行PCR反應并利用一組標記物特異性引物來完成。在一種優(yōu)選實施方式中，所述步驟b)包括"使用至少一組為所述QTL限定AFLP標記物的引物、或一組這樣的引物，其在嚴格條件下特異性地雜交用于所述QTL的AFLP標記物的核酸序列。片段的步驟d)，使得擴增的DNA片段具有一定長度，其對應于(多少幾個石咸基，例如，或多或少一個、兩個或三個石咸基的長度)預期長度(如基于相同引物與來自植物的DNA的類似反應，其中首先才企測到標記物)，或核酸序列，其對應于(具有大于80%的同源性，優(yōu)選大于90%,更優(yōu)選大于95%,甚至更優(yōu)選大于97%，還要更優(yōu)選大于99%)預期的序列(如基于與才直物中的QTL有關的標記物序列，其中所述標記物#1首先檢測到)。本領域的4支術人員明了，在抗性植物中缺少的標記物，雖然它們存在于易感親代中(所謂的反式才示i己物)，也可以在測定中用于4企測后代^直物中的^t性，雖然通過試—瞼標記物的缺少來4僉測特定性狀的存在不是最佳的。才企測具有預測長度或預測核酸序列的擴增DNA片,殳的步駛《可以通過標準凝力交電泳技術或通過利用自動DNA測序儀來進行。這里不必描述這些方法，因為對于才支術人員來"i兌它們是眾所周知的。為了在植物中檢測在單染色體上兩種QTL的存在，還可以使用染色體著色方法。在這樣的方法中，通過原位雜交或原位PCR技術可以在相同的染色體中4企測至少第一QTL和至少第二QTL。這沖羊的4支術還可以用來估計在所述染色體中QTL-1相對于pm-/和pm-/的位置并且在本
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是已知的(例如，參看Jiang等，1995)。更方使_地，兩種QTL存在于單染色體上的事實可以通過確定它們處于結合相來證實，即，當與存在于分開的染色體上的基因比較時，性狀顯示出減少的分離。分子標i己物和QTL分子標記物用于顯示核酸序列的差異。這種顯示可能起因于在用限制酶(RFLP)消化后的DNA-DNA雜交4支術和/或起因于利用聚合酶鏈反應的技術(例如，STS、微隨體、AFLP)。基于這些親代基因型的雜交，在兩種親代基因型之間的所有差異將在編圖種群中分離(例如，Bd、F2;參見圖2)?？梢员容^不同標記物的分離并可以計算重組頻率。在不同染色體上分子標^己物的重組頻率通常為50%。在位于相同染色體上的分子標記物之間，重組頻率取決于標記物之間的3巨離。^氐重組頻率對應于染色體上標記物之間的j氐的遺傳距離。比較所有重組頻率將導致在染色體上分子標記物的最合乎邏輯的次序。這種最合乎邏輯的次序可以描繪在連鎖圖中(Paterson，1996)。在連鎖圖上的一組相鄰或鄰^^妄標記物可以準確定位與對疾病的抗性有關的QTL的位置，其中連鎖圖與對疾病的增加7K平的抗性(例:fe口，在感染4妄觸疾病因子以后降4氐的患病發(fā)生率)和/或在建立感染以后降低的病變生長速率有關。如將要現在說明的，這里鑒定的標記物可以用于本發(fā)明的各個方面。本發(fā)明的方面并不限于應用這里鑒定的標記物。應當強調的是，這些方面還可以利用在本文中未明確4皮露的或甚至還未鑒定的標記物。不同于遺傳單位"基因"，在其上表型表達取決于大量不能預測的因素，遺傳單位"QTL"是指在基因組上的區(qū)域，其直接與表型可量化性狀有關。因此，雖然基因本身與植物育種具有很少的關系或沒有關系，4旦QTL可直4矣應用于才直物育種。本發(fā)明的發(fā)明人現在已經發(fā)現，如本文定義的用于黃瓜中線形病毒抗性和白粉菌抗性的QTL在后代植物的基因組中應具有相對于彼此的特殊構造。本發(fā)明的發(fā)明人基于以下觀測結果獲得該發(fā)現在黃瓜基因組中在單染色體上屬于不同QTL的一串鄰接基因組標記物的存在與兩種表型抗性性狀的存在有關，并且它們表明，這種染色體組的組織可以按照一4殳孟德爾遺傳定律進行遺傳。如本文定義的QTL是位于單染色體或連鎖群上，并且它們的位置最好通過若干在不同的情況下任意的標記物加以表征。在本研究中，使用了擴增的片段長度多態(tài)性(AFLP)標記物、單核苷酸多態(tài)'l"生(SNPs)、以及4翁入突變標i己物，雖然也可以4吏用限制性片l殳長度多態(tài)性(RFLP)標i己物、孩i隨體標"i己物(例如，SSR)、序列特征性擴增區(qū)域(SCAR)標記物、酶切擴增多態(tài)性序列(GAPS)標記物或同工酶標記物或這些標記物的組合。通常，QTL可以跨越幾百萬堿基的區(qū)域。因此，提供QTL的全序列信息實際上是不能實行的而且也無必要，因為首先4企測QTL的方式(通過在一串鄰關性)使得可以在后代植物的種群中追蹤那些植物，其具有用于呈現特定表型性狀的遺傳潛力。通過提供非限制性的標記物清單，本發(fā)明因此便于在培育計劃中有效使用QTL。標記物對于品種的特定品系是特異的。因此，特定性狀與特定標記物有關。如在本申請中指出的標記物不僅指示QTL的位置，它們還與植物中特定表型性狀的存在有關。重要的是注意到，指示在基因組上QTL位置的鄰接基因組標記物基本上是任意的或非限制性的。通常，QTL的位置由鄰接的一串標記物來指示，其中標記物呈現與表型性狀的統(tǒng)計相關性。在發(fā)現標記物在上述串之外后(即，具有LOD得分低于一定閾值的標記物，這表明該標記物是如此遠離以致在該標記物和QTL之間區(qū)i或中的重組如此頻繁地發(fā)生，從而標記物的存在并不以統(tǒng)計顯著的方式與表型的存在有關)，QTL的邊界^皮i殳定。因此，還可以通過位于所述失見定區(qū)域內的其它標記物來指示QTL的位置。進一步重要的是要注意到，鄰接基因組標記物也可以用來指示個體植物中QTL的存在(并且由此指示表型的存在)，即，它們可以用于標志輔助選擇(MAS)方案。原則上，潛在有用標記物的數目是有限的但可以是非常大，并且技術人員可以容易地鑒定在本申請?zhí)峒暗哪切擞浳镏獾臉擞浳?。在MAS方案中可以使用任何連4妾于QTL的標記物，例如，屬于由標記物^爭越基因組區(qū)的物理邊界，其中標記物具有建立的LOD得分高于一定閾值，從而表明雜交中在標記物和QTL之間不發(fā)生或發(fā)生非常少的重組；以及在與QTL處于連鎖不平衡狀態(tài)的任何標記物；以及表示在QTL內實際因果突變的標記物。這意p未著，在本申請中鑒定為與QTL有關的標i己物，如用于QTL-1的AFLP標記物E16/M50-244、E16/M50-188、以及Ell/M48-251，僅是適用于MAS方案的標記物實例。此外，當QTL、或其賦予特定性狀的部分4皮漸滲到另一個遺傳背景中時(即，進入另一植物物種的基因組)，那么在后代中可能不再會發(fā)現某些標記物，雖然性狀存在于其中，這表明這樣的標記物是在基因組區(qū)(其僅表示在最初親代品系中QTL的賦予特定性狀的部分)之外，以及新的遺傳背景具有不同的基因組組織。這樣的標記物(其缺少表明在后代中成功引入了遺傳成份)被稱作"反式標記物，，并且才艮據本發(fā)明可以同樣適用于MAS方案。在鑒定QTL以后，QTL效應(抗性)可以例如通過評估BC2S后代(分離用于在研究中的QTL)中的抗性加以證實?？梢赃m當地通過利用如本領域已知的用于黃瓜線形病毒和黃瓜白粉菌的抗性生物測定來評價抗性。例如，可以^吏用CYSDV分離物(isolate),登記號為PV-0592/EWSN—6，在德國孩史生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(Braunschweig,德國)的收集中，并且可以通過例如煙#分虱(B生物型)的傳4番來產生實-驗感染此外，可以進4于在天然感染條件下的(現場)試驗以評估對CYSDV或其它線形病毒的抗性?？梢酝ㄟ^植物材料的人工接種來評估白粉菌抗性。本發(fā)明提供的標記物可以非常適用于在可疑的白粉菌和/或線形病毒抗性黃瓜屬植物中檢測本發(fā)明的一種或多種QTL的存在，并且因此可以用于這樣的方法，其涉及標記物輔助培育以及選擇白粉菌和線形病毒抗性黃瓜屬4直物。優(yōu)選地，借助于至少一種如本文定義的用于QTL的標記物來檢測本發(fā)明的QTL的存在。因此本發(fā)明在另一個方面涉及才企測用于白粉菌和/或線形病毒抗性的QTL存在的方法，該方法包括在可疑的白粉菌和/或線形病毒抗性黃瓜屬植物中檢測所述QTL的核酸序列的存在，該存在可以通過利用所述標記物加以檢測。本發(fā)明的QTL的4亥苷酸序列的分辨可以例如通過確定與所述QTL有關的一種或多種標i己物的一亥苷S臾序列并i殳計用于所述標i己物序列的內部引物，其然后可以用來進一步確定在所述標記物序列之外的QTL的序列。例如，來自表2、3以及4的AFLP標記物的核苷酸序列可以通過下述步-驟來獲得/人電泳凝月交(其用于在主體植物的基因組中確定所述標記物的存在)分離所述標記物，以及通過例如本領域眾所周知的雙脫氧鏈終止法確定所述標記物的核苷酸序列。用于在可疑的白粉菌和/或線形病毒抗性黃瓜屬植物中沖全測QTL存在的上述方法的實施方式中，該方法還可以包括以下步驟提供寡核苷酸或多核苷酸，其能夠在嚴格雜交條件下雜交到連接于所述QTL的標記物的核酸序列，優(yōu)選選自表2、3以及4的標記物；用可疑的白粉菌和/或線形病毒抗性黃瓜屬植物的消化的基因組核酸4妻觸所述寡核苷酸或多核苷酸；以及確定存在所述寡核苷酸或多核普酸與所述消^f匕的基因組核酸的特定雜交。優(yōu)選i也，雖然還可以采用原4立雜交方法，用獲自所述可lt的白粉菌和/或線形病毒抗性黃瓜屬4直物的核酸樣品進行所述方法?？商鎿Q地，以及在一種更優(yōu)選的實施方式中，在已確定QTL的核香酸序列以后，技術人員可以設計特定的雜交探針或寡核苷酸，其能夠在嚴才各雜交條件下雜交于所述QTL的核酸序列，并且可以在用于在可疑的白粉菌和/或線形病毒抗性黃瓜屬植物中檢測本發(fā)明的QTL的存在的方法中〗吏用這樣的雜交纟笨針。通過選擇性擴增來自抗性的個體和從親代變種傳下來的敏感個體的黃瓜DNA的片段，可以獲得用于主要線形病毒抗性基因的基因座的標記物。-其中所述片段已經受到了緊跟連接作用的使用限制酶(例如，EcoRI和MseI)的消化階段，以在片,殳的末端附著用于引物的互補銜接子，其在它們的末端具有一個或多個特定的核苷酸，其中引物對的引物之一為了4企測目的凈皮標記物；-通過在變性條件下的凝膠電泳，分離擴增產物，以及-用衍生自抗性后代的片段混合物和來自敏感后代的混合物獲得的凝膠電泳分布圖同來自親代變種的片段進行比較，以鑒定在遺傳上連接于抗性基因座多態(tài)帶。所述鑒定以后是證實步驟，其中對所有個體進行證實并計算標記物和抗性基因座之間的遺傳重組率。原則上，如本文4吏用的個體AFLP標記物具有指定的標記物代碼。此代碼限定兩種引物，可選地連同附圖，指出在限定的添加物中引物的擴增產物的長度(還參見上文關于表1的描述)。因此，AFLP標記物限定了單或雙鏈DNA片段，如通過對黃瓜基因組DNA進行擴增反應所獲得的，其在指定的添加物的情況下導致指定長度的片段。此外，標記物在5'-3'方向包含由第一引物序列、黃瓜特異性DNA序列和第二引物序列構成的序列，以及其補體。因此黃瓜特異性DNA序列旁側有兩個引物。術語"黃瓜特異性DNA序列"是指旁側有相應引物的區(qū)域的核苷酸序列并且表示擴增自黃瓜登記號KhiraPI250147的序列，如在專利申請WO02/22836中所描述的，其中通過4吏用失見定的引物，或與其的序列同源性至少為90%的序列，4尤選至少95%,最優(yōu)選至少98%。通過轉基因方法生產白粉菌和線形病毒抗性黃瓜屬^fc物才艮據本發(fā)明的另一個方面，包含至少QTL-1和一種、優(yōu)選兩種/附-/和；^-/2或其賦予抗性的部分的核酸(優(yōu)選DNA)序列可以用于生產本發(fā)明的雙抗性黃瓜屬植物。在此方面，本發(fā)明便于使用如該應用涉及在適宜的受體植物中引入包含所述QTL的核酸序列。如上所述，所述核酸序列可以衍生自適宜的線形病毒和/或白粉菌抗性供體才直物。本文中鑒定為QTL-1的線形病毒抗性基因座的適宜來源是來自巴基斯坦的黃瓜當地品種Khira，PI250147。許多PM抗性黃瓜i咅養(yǎng)變種連同它們的商業(yè)來源例如列在http:〃cuke.hort.ncsu.edu/cucurbit/cuke/cukemain.html。PM抗性植物可以侈'W口通過T.C.^Wehner(CucurbitGeneticsCooperative(CGC),DepartmentofHorticulturalSciepce，NorthCarolinaStateUniversity,Raleigh,NC27695-7609U.S.A.的黃瓜基因管理者)獲得。如本文描述的兩種pm基因座的來源均是NPI，其是通過雜交Natsufushinari(PI279465)和PI200815而獲得。登記號可以例如獲自基因資源中心(CentreforGeneticResources),荷蘭(CGN),瓦才各寧才艮，荷蘭。若干才直物tt據庫可用來幫助選擇適宜的儲存庫集合，如由西班牙瓦倫西亞的農業(yè)生物多樣性的保護和繁殖中心(CenterfortheConservationandBreedingofAgrodiversity)(COMAV)主持收集的ECP/GR瓜菜數據庫、或由美國農業(yè)部的國家種質資源實驗室，貝爾茨維爾，馬里蘭(USDA'sNationalGermplasmResourcesLaboratory,Beltsville,Maryland)主持收集的種質資源信息網(GermplasmResourcesInformationNetwork)(GRIN)。乂十線形病毒或白4分菌呈現抗性的其它黃瓜屬植物也可以用作抗性供體才直物，因為本發(fā)明描述了如何可以鑒定這種物質。在適宜的供體植物中鑒定以后，包含用于線形病毒或白粉菌抗性的QTL或其賦予抗性部分的核酸序列可以通過任何可獲得的方法被轉移到適宜的受體植物。例如，所述核酸序列可以通過雜交線形病毒或白粉菌抗性供體植物和易感受體植物(即，通過基因滲入)、通過轉化、通過原生質體融合、通過雙單倍體纟支術或通過胚芽才倉;救或通過任zf可其它核酸轉移系統(tǒng)加以4爭移，可選;也繼之以選擇包含QTL和呈現抗性的后代植物。對于轉移的轉基因方法，包含用于線形病毒或白并分菌抗性的QTL或其J3武予抗性部分的核酸序列可以通過利用本領域已知的方法分離自所述供體植物并且如此分離的核酸序列可以通過轉基因方法被轉移到受體植物，例如借助于載體、在配子中、或在4壬<可其它適宜的傳遞元素中，如涂布有所述片亥酸序列的轟擊顆4立(ballisticparticle)。植物轉化通常涉及構建將在植物細胞中起作用的表達性載體。在本發(fā)明中，這才羊的載體包括核酸序列，其包含用于線形病毒或白4分菌4元性的QTL或其f武予4元性部分，該載體可以包含f武予線形病毒或白粉菌抗性的基因，其是在調節(jié)元素(element)的控制下或操作上連4妾于調節(jié)元素，如啟動子。表達性載體可以含有一種或多種這樣的操作中連接的基因/調節(jié)元素組合，只要包含在組合中的至少一種基因為線形病毒或白4分菌抗性編碼。載體可以具有質并立的形式，并且可以單獨或連同其它質粒一起使用，以提供對線形病毒和白粉菌具有抗性的轉基因植物，其中使用本領域已知的轉化方法，如土壤桿菌轉化系統(tǒng)。表達性載體可以包括至少一種標記物基因，操作上連接于調節(jié)元素(如啟動子)，其4吏轉化細月包可以包含通過負選4奪(通過抑制并不包含選擇性標記物基因的細胞的生長)或通過正選擇(通過篩選由標記物基因編碼的產物)恢復的標記物。許多通常使用的用于植物轉化的選擇性標記物基因在本領域是已知的，并且包括，例如，為代謝上對選4,性化學試劑(其可以是抗生素或除草劑)進行脫毒的酶編石馬的基因、或為對抑制劑不每丈感的自身l'務飾革巴(alteredtarget)編碼的基因。若干正選擇方法在本領域是已知的，如甘露糖選擇。可4齊換地，無標記物轉化可以用來獲得沒有所一是及的標記物基因的植物，與其有關的技術在本領域是已知的。將表達性載體；I入植物中的一種方法是基于土壤桿菌屬的天然轉化系統(tǒng)(參見例如，Horsch等，1985)。才艮瘤土壤桿菌和發(fā)才艮土壤桿菌是植物病原土壤細菌，其遺傳上轉化植物細胞。根瘤土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌的Ti和Ri質粒分別攜帶負責植物的遺傳轉化的基因(參見例如，Kado,1991)。將表達性載體引入植物組織的方法包括用根瘤土壤桿菌直接感染或共培養(yǎng)植物細胞(Horsch等，1985)。土壤桿菌屬載體系統(tǒng)的描述和用于土壤桿菌屬介導的基因轉移的方法由Gruber和Crosby,1993以及Moloney等，1989提供，還參見美國專利第5,591,616號。植物表達性載體、報道基因以及轉化方案的相克況描述和土i裏桿菌屬載體系統(tǒng)以及土i裏桿菌屬介導的基因轉移的方法的描述可以參見Gruber和Crosby,1993。例如由Miki等，1993和由Phillips等，1988提供了培養(yǎng)植物組織的一般方法。用于分子克隆技術和適當的表達性載體的合適的參考手冊是Sambrook和Russell,2001。用于將表達性載體引入植物的另一種方法是基于微轟擊粒子介導的轉化，其中DNA被攜帶在微轟擊粒子表面上。借助于基因槍(biolistic)裝置將表達性載體引入植物組織，其中基因槍裝置將孩史轟擊粒子加速到300至600m/s的速度，其足以穿過植物細胞壁和纟田胞膜(參見，Sanford等，1987，1993;Sanford，1988,1990;Klein等，1988,1992)。將DNA引入植物的另一種方法是通過對靶細胞進行超聲處理(參見Zhang等，1991)?？商鎿Q地，脂質體或原生質球融合已用來將表達性載體引入植物(參見例如，Deshayes等，1985和Christou等，1987)。還有才艮道，利用CaCl2沉淀作用、聚乙烯醇或聚-L-鳥氨酸將DNA直接吸收進入原生質體(參見例如，Hain等，1985和Draper等，1982)。也已經描述了原生質體以及全細胞和組織的電穿孑L(D'Halluin等，1992和Laursen等，1994)。其它眾所周知的技術如使用BAC,其中部分黃瓜基因組被引入細菌人工染色體(BAC)，即用來基于在細菌大腸桿菌中發(fā)現的天然存在的P因子質粒(Zhao和Stodolsky,2004)在大腸桿菌細胞中克隆DNA片段(100至300kb插入片段大??；平均150kb)的載體，可以例如連同BIBAC系統(tǒng)(Hamilton,1997)—起4吏用，以產生轉基因植物。在轉化黃瓜耙組織以后，利用現為本
技術領域：
眾所周知的再生和選擇方法，上述選擇性標記物基因的表達便于優(yōu)先選擇轉化的細月包、ia織和/或才直物。通過非轉基因方法生產線形病毒和白粉菌抗性黃瓜屬植物在用于產生線形病毒和白粉菌抗性黃瓜屬植物的一種可替換的實施方式中，原生質體融合可以用來將核酸從供體才直物轉移到受體植物。原生質體融合是一種在兩種或更多種原生質體(細胞，其細胞壁通過酶促處理被除去)之間的誘導或自發(fā)聯合，如體細胞雜交，以產生單、雙或多核細胞。融合細胞，其甚至可以是借助于在自然界不能雜種繁殖的植物物種所獲得，被組織培養(yǎng)成雜交植物，其呈現所期望的性狀組合。更具體地說，第一原生質體可以獲自黃瓜屬植物或其它植物品系，其對由線形病毒或白粉菌引起的感染呈現抗性。第二原生質體可以獲自第二黃瓜或其它4直物變種，優(yōu)選包含商業(yè)上有^f介值特性的黃瓜品系，如，^旦不限于疾病抗性、昆蟲抗性、有價值的果實特性等。然后利用本
技術領域：
已知的傳統(tǒng)原生質體融合方法來融合原生質體?？商鎿Q地，在將包含如本文所述的一種或多種QTL的核酸從供體植物轉移到受體植物時可以采用胚芽搶救。胚芽搶救可以作為一種方法用來/人雜交中分離胚芽的核酸，其中才直物不能產生能發(fā)芽的種子。在這種方法中，植物的受精子房或未成熟的種子被組織培養(yǎng)以產生新才直物(Pierik，1999)。本發(fā)明還涉及用于產生線形病毒或白粉菌抗性黃瓜屬植物的方法，該方法包括以下步驟根據如上所述的本發(fā)明，在供體黃瓜屬植物中檢測與對線形病毒或白粉菌的抗性有關的數量抗性基因座(QTL)的存在，以及將包含至少一種如此檢測的QTL、或其賦予線形病毒或白粉菌抗性部分的核酸序列從所述供體植物轉移到線形病毒或白4分菌易感受體黃瓜屬才直物。可以通過本文先前描述的任何方法來轉移所述核酸序列。這才羊的方法的一種優(yōu)選實施方式包4舌借助于雜交所述一直物并通過基因滲入將所述核酸序列乂人線形病毒或白粉菌-抗性供體黃瓜屬植物轉移到線形病毒或白粉菌易感受體黃瓜屬植物。這種轉移可以因此適當地通過利用傳統(tǒng)的培育技術來完成。優(yōu)選通過利用標記物壽甫助選4奪(MAS)或標"i己物4肅助;咅育(MAB)4尋QTL'漸:參到商業(yè)性黃瓜變種中。MAS和MAB涉及使用一種或多種分子標記物，用于鑒定和選擇那些后代植物，其包含為所期望的性狀編碼的一種或多種基因。在本情況下，這樣的鑒定和選擇是基于選擇本發(fā)明的QTL或與其有關的標記物。MAS也可以用來開發(fā)藏有(harboring)感興趣的QTL的近等基因系(NIL),從而可以更詳細研究每種QTL效應，并且也是用于開發(fā)回交近交系(BIL)種群的一種有效方法(參見例長口，Nesbitt等，2001;vanBerloo等，2001)。按照這種實施方式開發(fā)的黃瓜屬植物可以有利地從受體植物衍生大多數它們的性狀，以及從供體植物衍生線形病毒和白粉菌抗性。如以上簡要說明的，傳統(tǒng)的培育技術可以用來將為線形病毒或白粉菌抗性編碼的核酸序列漸滲到線形病毒和白粉菌易感受體黃瓜屬植物中。在一種方法中，其稱作譜系培育，對線形病毒或白粉菌呈現抗性并且包含為線形病毒或白粉菌抗性編碼的核酸序列的供體黃瓜屬植物與線形病毒或白粉菌易感受體黃瓜屬植物雜交，其中上述易感受體黃瓜屬植物優(yōu)選呈現商業(yè)上所期望的特性，如但不限于疾病抗性、昆蟲抗性、有價值的果實特性等。形成的植物種群(表示Fi雜種)然后自花傳粉并結種子(F2種子)。然后篩選生長自F2種子的F2才直物的對線形病毒和白4分菌的抗性?？梢杂迷S多不同的方式來篩選上述種群。首先，可以利用傳統(tǒng)疾病篩選來篩選該種群。這才羊的疾病篩選在本^支術領域是已知的。優(yōu)選地，使用定量生物測定。第二，可以利用一種或多種上文描述的分子標記物來進^亍標記物輔助選擇以鑒定那些后代，其包含為線形病毒或白4分菌抗性編碼的核酸序列?？梢允褂迷谏衔闹忻枋鰴z測QTL的存在的方法時所提及的其它方法。此外，標記物輔助選擇可以用來證實從定量生物測定所獲得的結果，并且因此，若干種方法也可以聯合4吏用。可以利用專侖回選4奪和回交、自交和/或雙單倍體的4支術或用來形成親代品系的任何其它技術來開發(fā)近交的線形病毒和白粉菌抗性黃瓜屬植物品系。在4侖回選4奪和回交的方法中，通過雜交回歸親本和第一供體才直物(其不同于回歸親本并在本文中稱作"非回歸親本")，可以將線形病毒和白4分菌抗性漸滲到革巴受體才直物(回歸親本)?；貧w親本是這樣一種才直物，其是無抗性的或對線形病毒和白粉菌具有低水平抗性并且具有商業(yè)上所期望的特性，如但不限于(另外的)疾病抗性、昆蟲抗性、有1^介值的果實特性等。非回歸親本呈現線形病毒和白4分菌抗性并且包含為線形病毒和白4分菌抗性編碼的核酸序列。非回歸親本可以任何植物變種或近交系，其與回歸親本是雜交結實的。來自回歸親本和非回歸親本之間的雜交的后代回交于回歸親本。然后對獲得的#_物種群篩選所期望的特性，可以以i午多不同方式進4亍上述篩選。例如，可以利用本4頁i或已知的表型病理學篩選或定量生物測定來篩選上述種群?？商?灸地，代^齊利用生物測定，可以利用一種或多種上文描述的分子標記物、雜交揮:4十或多核苷酸來進4亍標記物輔助選擇(MAS)，以鑒定那些后^，其包含為線形病毒和白粉菌抗性編碼的核酸序列。此外，MAS可以用來證實從定量生物測定獲得的結果。再一次，的隱性特性意味著，通過利用表型篩選如抗性生物測定不能在Fi或BC,種群中篩選這種基因。本文定義的標記物因此最終適用于通過基因型篩選來選擇適當的后代植物。在篩選以后，選擇這樣的Fi雜交植物，其呈現線形病毒和白粉菌抗性表型或更優(yōu)選地基因型并且因此包含為線形病毒和白粉菌抗性編碼所必要的核酸序列，然后回交于回歸親本若干代以1"更于黃瓜屬植物變成愈加近交的。此過程可以進行二至五或更多代。原則上，來自回歸親本與線形病毒和白粉菌抗性非回歸親本的雜交過程的后代對于編碼線形病毒和白4分菌抗性的一種或多種基因來i兌是雜合的。應當明了，例如，當將；附-/和；^-;7基因座均漸滲到植物品系中時，/m-A基因座是隱性的并且僅在可以形成純合的pm-h植物的條件下才在后代植物中出現抗性表型。通常，將所期望的性狀引入雜種黃瓜變種的方法包括以下步驟(a)雜交近交的黃瓜親代與另一種黃瓜屬植物，其包含一種或多種所期望的性狀，以產生F1后代植物，其中所期望的性狀選自由線形病毒抗性和白4分菌抗性組成的組；(b)優(yōu)選利用如本文描述的分子標記物，選擇具有所期望的性狀的所述Fl后代才直物，以產生所選纟奪的Fl后代4直物；生回交后代^直物；(d)選擇這樣的回交后代植物，其具有所述近交的黃瓜親本植物的所期望的性狀以及形態(tài)和生理特性，其中所述選擇包括分離基因組DNA和試驗所述DNA是否存在至少一種用于QTL-1、和/或/w-A的分子標i己物，優(yōu)選如本文描述的；(e)連續(xù)地重復步驟(c)和(d)兩次或更多次以產生所選才奪的第三或更高的回交后代才直物；(f)可選地自交所選擇的回交后代以鑒定純合的植物；以及(g)雜交至少所述回交后^f戈之一或與另一種近交的黃瓜親本植物(優(yōu)選為pm-hypo抗性的，即是純合的自交，以當生長在相同環(huán)境條件下時，產生具有雜種黃瓜變種的所期望的性狀和所有形態(tài)和生理特性的雜種黃瓜變種。如前所述，最后回交代可以被自交以為純合的純育(近交的)后代提供線形病毒和白粉菌抗性。因此，輪回選擇、回交以及自交的結果是產生這樣的品系，其在遺傳上同源于與線形病毒和白粉菌抗性有關的基因以及與商業(yè)上感興趣的性狀有關的其它基因。線形病毒和白粉菌抗性黃瓜屬植物和種子植物育種的目標是在單個變種或雜種中結合各種所期望的性狀。對于商業(yè)性農作物來說，這些性狀可以包括對疾病和昆蟲的抗性、耐熱性以及耐旱性、減少的農作物成熟期、更高的產量、以及更好的農學質量。植物特性(如萌發(fā)和群落地段、生長速率、成熟期、以及植物高度)的均勻性可能也具有重要意義。通過一些技術來培育商業(yè)性農作物，其中所述技術利用了植物的傳粉方法。如果花粉從一個花被轉移到相同植物的相同花或另一個花，則植物被自花傳粉。當相同家族或品系中的個體用于傳粉時，則植物被近緣授粉。如果花粉來自不同植物(來自不同家族或品系)上的花，則植物被異花傳粉。已自花傳粉并選擇類型許多代的植物在幾乎所有基因座變成純合的并產生純育后代的均勻種群。兩種不同純合品系之間的雜交可產生雜交植物的均勻種群，其對于許多基因座可以是雜合的。在若干基因座各自雜合的兩種植物的雜交將產生異種植物的種群，其在遺傳上是不同的并且將不是均勻的。在黃瓜屬植物育種計劃中雜種黃瓜變種的開發(fā)涉及三個步驟(1)從各種種質庫選擇植物，用于最初的培育雜交；(2)自交從培育雜交選擇的植物若干代，以產生一系列近交品系，其明顯地是純育的并且是高度均勻的；以及(3)雜交所選擇的近交系和不相關的近交系以產生雜種后代(Fl)。在足夠量的培育以后，連續(xù)子代將^5L用來增加開發(fā)的近交的種子。優(yōu)選地，近交系應在大約95%或更多的其基因座處包含純合的等位基因。近交品系的純合性和同質性的一個重要結果是，通過雜交規(guī)定的一對近交所產生的雜種將總是相同的。在已鑒定了產生優(yōu)越雜種的近交以后，則可以利用這些近交親代連續(xù)供給雜種種子并且從這種雜種種子供給可以產生雜種黃瓜屬植物。本發(fā)明的一個方面是通過本發(fā)明的方法獲得的線形病毒和白粉菌抗性黃瓜屬植物、或其部分。本發(fā)明的另一個方面涉及線形病毒和白粉菌抗性黃瓜屬植物、或其部分，包4舌如上文詳細描述的具有<壬<可構型的QTL,其中至少所述QTL之一不是處于其天然遺傳背景。本發(fā)明的線形病毒和白粉菌抗性黃瓜屬植物可以具有任何遺傳類型如近交、雜種、單倍體、雙單倍體或轉基因的。另外，本發(fā)明的植物對于抗性性狀來說可以是雜合的或純合的，優(yōu)選純合的。雖然本發(fā)明的QTL、以及其賦予抗性部分可以被轉移到任何植物以提供線形病毒和白粉菌抗性植物，但本發(fā)明的方法和植物優(yōu)選地涉及黃瓜屬物種的植物。本文描述的線形病毒和白4分菌抗性近交的黃瓜品系可以用于另外的雜交以產生線形病毒和白粉菌抗性雜交植物。例如，本發(fā)明的第一線形病毒和白粉菌抗性近交的黃瓜屬植物可以雜交于第二近交的黃瓜屬才直物，其具有商業(yè)上所期望的性狀如^f旦不限于疾病抗性、昆蟲抗性、所期望的果實特性等。該第二近交的黃瓜品系可以或可以不具有線形病毒或白粉菌抗性。優(yōu)選地，該品系對于pm-h而言是純合的，以便這種隱性性狀表達在雜種后代植物中。本發(fā)明的另一個方面涉及用于生產種子的方法，其中種子可以生長成線形病毒和白粉菌抗性黃瓜屬植物。在一種實施方式中，該方法包括以下步驟提供本發(fā)明的線形病毒和白粉菌抗性黃瓜屬植物，雜交所述線形病毒和白粉菌抗性植物與另一種黃瓜屬植物，以及收集從所述雜交獲得的種子，當種植時其產生線形病毒和白粉菌抗性黃瓜屬纟直物。在另一種實施方式中，該方法包4舌以下步驟4是供本發(fā)明的線形病毒和白粉菌抗性黃瓜屬植物，雜交所述線形病毒和白粉菌抗性植物與黃瓜屬植物，收集從所述雜交獲得的種子，再生所述種子成植物，通過本文描述的任何方法選擇線形病毒和白粉菌抗性植物，自花傳粉所選4奪的植物足夠數目的代以獲得具有固定等位基因的植物，其中等位基因賦予植物中的線形病毒和白粉菌抗性，回交如此產生的^直物和具有所期望的表型性狀的黃瓜屬一直物足夠凄t目的代以獲得具有線形病毒和白粉菌抗性以及具有所期望的表型性狀的黃瓜屬植物，以及收集從植物(來自最后一次回交)產生的種子，當種植時其產生具有線形病毒和白粉菌抗性的黃瓜屬植物。中標記物已知具有pm抗性或線形病毒抗性親代起源(指示為在抗性親代中的存在)。該陣列進一步指出與雙(PM和線形病毒)抗性才直物品系有關的AFLP標i己物的起源和相對位置。由術語和/7W-Z7指示的"標記物"指出在本文中提及的兩個相應的白粉菌抗性基因座的中心位置。對QTL-1基因座沒有確立位置，雖然通過利用線形病毒伴隨標記物的位置可以確定該基因座位于兩個戶w基因座之間。乂人該表可以明了，同遺傳庫號(poolnrs.)10-15相比，遺傳庫號1-6已從線形病毒抗性親代獲得更短的基因滲入。陣列的解釋^口下才示i己4勿E23/M40-M003(56.9cM)，侈寸3口，存在于pm4元寸生親代中并且也存在于雙抗性后代中，而標記物E11/M80-M003(79.1cM)存在于線形病毒抗性親代中但不存在于雙抗性后代中。因此，標記物E23/M40-M003是PM伴隨標記物，其存在表明在所試-瞼的才直物品系中存在4半隨遺傳區(qū)，而另一方面標記物E11/M80-M003表示在與線形病毒抗性有關的QTL-1基因座附近的遺傳區(qū)，但其對于pm-hypo(/w-;)抗性的表達不是必要的。表4.在本發(fā)明的雙抗性才直物中，AFLP標記物4尋分遺傳庫號(從io株植物匯集來的DNA)標記物名稱cME23/M40-M00456.9E23/M40-M00356.9pm-l575E24/M46-M00258.4E24/M46-M00358.4E12/M91-M003594E26/M43-M003594E12/M91-M002594E26/M43-M002594E14/M59-F-134617E14/M59-F-200639E16/M50陽F陽244713E23/M38-M003716E16/M50-F-108737E16/M50-F-109737P12/M11-F-146747P12/M11-F-147747E14/M59-267.64CS76E23/M40-M005768S2/M14M15掘01768S2/M14M15-M002768E18/M59-F-14878E18/M59-F-14978E11/M80-M001781E11/M80-M002791E11/M80-M004791E11/M80-M003791pm-h793E16/M50-F-18879E16/M50-F-194795E11/M48-F-251796E23/M38-M005796E23/M38-M00180E23/M38掘0480E26/M43-M00480E11/M48-F-148912124678101112131415++++++;;巾十出出;;十,;,,;,,;卡;;出關十,;,,+:;十;出;4i出N;出::4^出4i出;4！;:巾+4^::;::書出,卡,巾,出出;+出出;+:"H謂4i出:Ki,"(ii+:,:"H;+/~*——一;，—————f卄++++++++++++++++++++++++++++(Ml頃4i:++固國關l!W讀+MlMl++++++++++++++++++++++++++++++++隨國+IMIMl髮幽;關!+++++++++++++++++++++++++++++1—|++++MlM霧+Ml量M護+M變I,)++++Ml++|國臺MI++『——————————Jf/-4/-++++++++++++Mi,出M;歸"HM出Ki山M出l"i出N!i出:,!ii十l關M出l"Hi,"H:;;+,,出出十;,.+,;+,:;,,;;十:,;:十,;^,:+;出,十;,"十,;十:;+=純合存在(高強度帶)-=不存在(沒有帶)+/-=雜合存在(低強度帶)D=中等存在(中等強度帶)■=標記物值(存在[+]和不存在[-]均為指示性的)國=標記物值，如在線形病毒抗性親代中□=未確立在親代品系中存在標記物如在PM抗性親代中參考文獻AusubelFM，BrentR，KingstonRE,MooreDD,SeidmanJG，SmithJA,StruhlK(eds.)(1998)CurrentProtocolsinMolecularBiologyWiley,NewYork.BaiYL,HuangCC，vanderHulstR,MeijerDekensF，BonnemaG，LindhoutP(2003)QTLsfortomatopowderymildewresistance(Oidiumlycopersici)inLycopersiconparviflorumG1.1601co-localizewithtwoqualitativepowderymildewresistancegenes.Mol.plantmicrobeinteractions16:169-176.ChristouP,MurphyJE，andSwainWF(1987)Stabletransformationofsoybeanbyelectroporationandrootformationfromtransformedcallus.Proc,Natl.Acad.Sci.USA84:3962-3966.DeshayesA,Herrera-EstrellaL，CabocheM(1985)Liposome-mediatedtransformationoftobaccomesophyllprotoplastsbyanEscherichiacoliplasmid.EMBOJ,4:2731-2737.D'HalluinK,BonneE，BossutM，DeBeuckeleerM，LeemansJ(1992)Plant.Cell4:1495-1505.DraperJ,DaveyMR，FreemanJP,CockingECandCoxBJ(1982)TiplasmidhomologoussequencespresentintissuesfromAgrobacteriumplasmid-transformedPetuniaprotoplasts.PlantandCellPhysiol,23,451-458.FanourakisNE(1984)Inheritanceandlinkagestudiesofthefruitepidermisstructureandinvestigationoflinkagerelationsofseveraltraitsandofmeiosisincucumber.Ph.D.Diss.,Univ.ofWisconsin,Madison.FujiedaK，andAkiyaR(1962)Geneticstudyofpowderymildewresistanceandspinecoloronfruitincucumber.J.Jpn.Soc.Hort.Sci,31:30-32.GanalMW(1996)Isolationandanalysisofhigh-molecular-weightDNAfromplants,In:NonmammalianGenomicAnalysis:APracticalGuide.AcademicPressInc,,SanDiego，61-73.GruberMY,CrosbyWL(1993)Vectorsforplanttransformation.InBRGlick,JEThompson,eds，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology.CRCPress,BatonRouge,LA,pp89-119.HainR,StabelP，CzernilofskyAP,SteinblissHH,tterrera-EstrellaL，SchellJ(1985)Uptake,integration,expressionandgenetictransmissionofaselectablechimaericgenetoplantprotoplasts.Mol.Gen.Genet.199:161-168.HamiltonCM.(1997)Abinary-BACsystemforplanttransformationwithhigh-molecular-weightDNA.Gene200:107-116.HorejsiT,StaubJEandThomasC.(2000)LinkageofrandomamplifiedpolymorphicDNAmarkerstodownymildewresistanceincucumber(CucumissativusL)Euphytica115(2):105-113，HorschRB,FraleyRT,RogersSG,SandersPR,LloydA(1985)Asimpleandgeneralmethodfortransferringgenesintoplants.Science227:1229-1231.JiangJ，GillBS，WangGL,RonaldPCandWardDC(1995)Metaphaseandinterphasefluorescenceinsituhybridizationmappingofthericegenomewithbacterialartificialchromosomes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:4487-4491.KadoCI(1991》Molecularmechanismsofcrowngalltumorigenesis.Crit.Rev.PlantSci.10,1-32.KleinTM,GradzielT，FrommME,SanfordJC(1988).Factorsinfluencinggenedeliveryintozeamayscellsbyhighvelocitymicroprojectiles.Biotechnology6:559-563.KleinTM,ArentzenR，LewisPA,andFitzpatrick-McElligottS(1992)Transformationofmicrobes,plantsandanimalsbyparticlebombardment.Bio/Technology10:286-291.KleineM，CaiD,HermannRG,andJungC(1995)Physicalmappingandcloningofatranslocationinsugarbeet(BetavulgarisL.)carryingagenefornematode(Heteroderaschachtii)resistancefromB.procumbens.TheorApplGenet90:399-406.KooistraE(1968)Powderymildewresistanceincucumber.Euphytica17:236-244.KooistraE(1971)Inheritanceoffleshandskincolorsinpowderymildewresistantcucumbers(CucumissativusL),Euphytica20:521-523.LuiBH(1997)StatisticalGenomics:LinkageMappingandQTLAnalysis.CRCPress,pg18-19,MikiBL,FobertPF,CharestPJ,IyerVN.1993.ProceduresforIntroducingForeignDNAintoPlants.In:GlickBRandThompsonJE(Eds.)MethodsinPlantMolecularBiology&Biotechnology,CRCPress，pp.67-88.MoloneyMM，WalkerJM,SharmaKK(1989)HighefficiencytransformationofBrassicanapususingAgrobacteriumvectors.PlantCellRep8:238-242,MorishitaM,SugiyamaK，SaitoT，andSakataY(2003)Review:PowderyMildewResistanceinCucumber.JARQ37(1),7-14.NesbittTC，TanksleySD(2001)fw2.2directlyaffectsthesizeofdevelopingtomatofruit,withsecondaryeffectsonfruitnumberandphotosynthatedistzdbution.PlantPhysiol.127:575-583.PatersonAH(1996)Mappinggenesresponsiblefordifferencesinphenotype.p.41-54.InA.H.Paterson(ed.)Genomemappinginplants.R.G.LandesCompany.PhillipsRL，SomersDA,HibberdKA.1988.Cell/tissuecultureandinvitromanipulation.In:G.F.Sprague&J.W.Dudley,eds.Cornandcornimprovement,3rded.，p.345-387.Madison，WI,USA，AmericanSocietyofAgronomy.Pierik，R丄.M.(1999)InvitroCultureofHigherPlants,4thedition.MartinusNijhoffPublishers,Dordrecht,SambrookJ,andRussellDW(2001).MolecularCloning:ALaboratoryManual.NewYork,NY,USA.，ColdSpringHarborLaboratoryPress.SanfordJC,KleinTM,WolfED,AllenN(1987).Deliveryofsubstancesintocellsandtissuesusingaparticlebombardmentprocess.J.ParticulateSci.Technol.5:27-37.SanfordJC(1988)Thebiolisticprocess.TrendsinBiotechnology6:299-302，SanfordJC(1990)Biolisticplanttransformation.PhysiologicaPlantarum,79,206-209.SanfordJC，SmithFD,andRussellJA(1993)Optimizingthebiolisticprocessfordifferentbiologicalapplications.MethodsinEnzymology217:483-509.ShanmugasundarumS，WilliamsPH，andPetersonCE(1971)Inheritanceofresistancetopowderymildewincucumber.Phytopathology61:1218-1221.ShanmugasundarumS,WilliamsPH，andPetersonCE(1972)Arecessivecotyledonmarkergeneincucumberwithpleiotropiceffects.HortScience7:555-556.TijssenP(1993)HybridizationwithNucleicAcidProbes.PartI.TheoryandNucleicAcidPreparation.In:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology.Elsevier.VanBerlooR,AalbersH，WerkmanA,NiksRE(2001)ResistanceQTLconfirmedthroughdevelopmentofQTL-NILsforbarleyleafrustresistance.Mol.Breeding8:187-195.VosP,HogersR,BleekerM,ReijansM,vandeLeeT,HornesM,FrijtersA,PotJ,PelemanJ,KuiperM(1995)AFLP:anewtechniqueforDNAfingerprinting.Nucl.AcidsRes.23:4407-4414.ZhangL,ChengL,XuN,ZhaoM,LiC,YuanJ,andJiaS(1991)Efficienttransformationoftobaccobyultrasonication.Biotechnology.9:996-997.ZhaoS,andStodolskyM(2004)BacterialArtificialChromosomes.MethodsinMolecularBiologyVol255.HumanaPressInc.Totowa,NJ,USA.權利要求1.一種對黃瓜線形病毒和對黃瓜白粉菌具有抗性的植物，其中，所述植物是黃瓜屬物種的植物，所述植物在單染色體上包括至少一個賦予線形病毒抗性的染色體區(qū)和至少一個賦予白粉菌抗性的染色體區(qū)，其中所述至少一個賦予線形病毒抗性的區(qū)連接于至少一種標記物，所述標記物選自由標記物E16/M50-244、E16/M50-188、以及E11/M48-251組成的組，以及其中所述至少一個賦予白粉菌抗性的區(qū)連接于至少一種標記物，所述標記物選自由下述組成的組在SEQIDNO1中的單核苷酸多態(tài)性標記物39T→G，在SEQIDNO2中的單核苷酸多態(tài)性標記物29G→A，在SEQIDNO3中的單核苷酸多態(tài)性標記物193C→T，在SEQIDNO4中在第221位置的插入突變5′-AATTT-3′，以及標記物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、E23/M38-M001、E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134以及E14/M59-F-200。2.根據權利要求1所述的植物，其中，所述植物包含至少兩個賦予白4分菌抗性的染色體區(qū)，其中所述至少兩個區(qū)的第一個區(qū)連4妄于至少一種標記物，所述標記物選自由下述組成的組在SEQIDNO:l中的單核苷酸多態(tài)性標記物39T—G，在SEQIDNO:2中的單核苷酸多態(tài)性標記物29G—A，以及標記物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、以及E23/M38-M001,以及其中所述至少兩個區(qū)的第二區(qū)連接于至少一種標記物，所述標i己物選自由下述組成的組在SEQIDNO:3中的單核苷酸多態(tài)性標記物193C—T，在SEQIDNO:4中在第221位置的插入突變5'-AATTT-3'，以及標記物E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134以及E14艇59-F畫200。3.4艮據4又利要求2所述的才直物，其中，所述至少一個f武予線形病毒抗性的區(qū)位于所述至少兩個斥又利要求2中所述的賦予白粉菌^U生的區(qū)之間。4.4又利要求1-3中4壬一項所述的黃瓜屬才直物的部分。5.根據權利要求4所述的植物部分，其中，所述植物部分選自花粉、胚珠、葉、胚芽、根、根尖、花藥、花、果實、莖、枝條、接穗、根狀莖、種子、原生質體以及愈傷組織。6.通過雜交權利要求1-3中的任一項所述的黃瓜屬植物和第二種黃瓜屬植物或其它植物變種、優(yōu)選包含商業(yè)上所期望特性的黃瓜品系所獲得的Fl種子，其中，所述種子包括至少一種用于線形病毒4元性的才示i己物，所述標"i己物選自由標i己物E16/M50-244、E16/M50-188、以及E11/M48-251組成的組，以及至少一種用于白粉菌抗性的標記物，所述標記物選自由下述組成的纟且在SEQIDNO:l中的單核苷酸多態(tài)性標記物39T—G，在SEQIDNO:2中的單核苦酸多態(tài)性標i己物29G—A,在SEQIDNO:3中的單核苷酸多態(tài)性才示i己物193C—T，在SEQIDNO:4中在第2214立置的插入突變5'-AATTT-3'，以及標記物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、E23/M38-M001、E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134以及E14/M59-F-200。7.根據權利要求6所述的種子，其中，所述第二種黃瓜屬植物對線形病毒每文感并且其中所述至少一種用于白粉菌抗性的標記物是純合子地存在。8.根據權利要求6或7所述的種子，其中，所述第二種黃瓜屬植物是近交植物。9.通過栽培權利要求4-8中任一項所述的種子所獲得的雜交植物。10.纟又利要求9所述的雜交纟直物部分。11.才艮據4又利要求10所述的雜交植物部分，其中，所述雜交才直物部分選自花粉、胚珠、葉、胚芽、根、根尖、花藥、花、果實、莖、枝條、接穗、根狀莖、種子、原生質體以及愈傷組織。12.—種用于選擇對黃瓜線形病毒和對黃瓜白^^分菌具有抗性的相:物的方法，其中，所述植物是黃瓜屬物種的植物，所述方法包括進行標記物才企測試驗，其中所述試驗包括以下步驟a)^r測在所述植物的基因組中存在至少一種連接于線形病毒抗性的標i己物，所述標i己物選自由標記物E16/M50-244、E16/M50-188、以及Ell/M48-251組成的組，以及b)檢測在所述植物的基因組中存在至少一種連接于白4分菌抗性的標記物，所述標i己物選自由下述組成的組在SEQIDNO:l中的單核普酸多態(tài)性標i己物39T—G，在SEQIDNO:2中的單核香酸多態(tài)性標記物29G—A，在SEQIDNO:3中的單核苷酸多態(tài)性標記物193C—T，在SEQIDNO:4中在第221位置的插入突變5'-AATTT-3',以及標記物E16/M50-F畫194、E11/M48-F-251、E23/M38-M001、E23/M40-M003、E24緒6-M002、E24/M46-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134以及E14/M59-F國200。13.根據權利要求12所述的方法，其中，步驟包括才企測在所述植物的基因組中存在至少一種連4妻于賦予第一黃瓜白粉菌抗性的QTL的標記物，其中所述QTL是由SEQIDNO:l中的SNP標記物39T—G、SEQIDNO:2中的SNP標記物29G—A、和標記物E16/M50-F曙194、E11/M48-F-251、以及E23/M38-M001指示；以及檢測在所述植物的基因組中存在至少一種連接于賦予第二黃瓜白粉菌抗性的QTL的標記物，其中所述QTL是由SEQIDNO:3中的SNP標記物193C—T、在SEQIDNO:4中在第2214立置的插入突變5'-AATTT-3'、和標記物E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134以及E14/M59隱F誦200指示。14.才艮據^又利要求12或13所述的方法，其中，所述方法包4舌a)提供來自所述植物的基因組DNA樣品；b)在所述植物的所述基因組DNA樣品中4全測所述至少一種連4妄于線形病毒抗性的標記物以及所述至少一種連4妄于白并分菌抗性的標記物。15.根據權利要求14所述的方法，其中，所述步驟b)包括使用至少一《且限定所述才示i己物的引物、或至少一種具有^咸基序列的核酸探針，所述堿基序列基本上互補于限定所述標記物的核酸酸序列特異性地雜交'16.根據權利要求12-15中任一項所述的方法，其中，另外，通過表明所述標記物是存在的并處于結合相，例如，當與非結合標記物比專支時，通過表明在雜交實-驗中所述標記物之間減少的分離，確定所述沖示"i己物存在于相同的染色體上。17.通過根據權利要求12-16中任一項所述的方法選擇的植物。18.—種產生黃瓜屬物種的植物的方法，所述植物呈現對黃瓜線形病毒和只于黃瓜白^分菌的抗性，所述方法包4舌以下步驟a)通過在所述植物的基因組中檢測存在至少一種連接于賦予黃瓜線形病毒抗性的QTL的標記物，來選4奪包括賦予對黃瓜線形病毒抗性的染色體區(qū)的第一黃瓜屬植物，其中所述QTL由標記物E16/M50-244、E16/M50-188、以及E11/M48-251指示；b)通過在所述才直物的基因組中才企測存在至少一種連4妄于賦予第一黃瓜白粉菌抗性的QTL的標記物，其中所述QTL由以下標i己物指示在SEQIDNO:l中的單核苦酸多態(tài)性標記物39T—G，在SEQIDNO:2中的單核苦酸多態(tài)性標記物29G—A,以及標i己物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、以及E23/M38畫M00r，或通過在所述植物的基因組中檢測存在至少一種連接于賦予第二黃瓜白^分菌抗性的QTL的標記物，其中所述QTL由以下標記物指示在SEQIDNO:3中的單核苷酸多態(tài)性標記物193C—T，在SEQIDNO:4中在第2214立置的插入突變5'-AATTT-3'，以及標記物E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12歸l-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134以及E14/M59-F-200;來選擇包括至少一個賦予對黃瓜白粉菌抗性的染色體區(qū)的第二黃瓜屬植物；c)雜交來自步艱艮a)和步驟b)的所述才直物以產生F1種子；d)將一定量的F1種子栽培成F1才直物，通過雜交或自交從所述F1植物產生進一步的后代種群；以及e)乂人所述進一步的后代才直物中選才奪一種才直物，所述植物包括至少一種連接于如在步驟a)中所限定的賦予黃瓜線形病毒抗性的QTL的標記物；以及至少一種連接于如在步驟b)中所限定的賦予黃瓜白粉菌抗性的QTL的標記物。19.根據權利要求18所述的方法，其中，在步驟b)中選擇第二黃瓜屬植物的步驟包括選擇具有賦予所述第一或第二黃瓜白粉菌抗性的QTL之一的第二黃瓜屬植物，以及其中所述方法進一步包"fe以下步艱《f)選擇第三黃瓜屬植物，所述第三黃瓜屬植物具有另一種賦予所述第一或第二黃瓜白粉菌抗性的QTL(即一種在所述第二黃瓜屬植物中不存在的QTL);g)雜交在步驟e)中獲得的Fl植物和所述第三黃瓜屬才直物以產生進一步的后代j直物，以及h)/人后代植物中選擇一種才直物，所述植物包括步驟a)中所述的賦予黃瓜線形病毒抗性的QTL以及步驟b)中所述的賦予黃瓜白粉菌抗性的兩種QTL。20.根據權利要求17-19中任一項所述的方法，其中，選擇黃瓜屬植物的步驟包含步驟b)、e)、f)或h)中所述的賦予對黃瓜白粉菌抗性的染色體區(qū)，包括才企測在所述植物的基因組中存在至少一種連4妾于賦予第一黃瓜白粉菌抗性的QTL的標記物，其中所述QTL是由SEQIDNO:l中的SNP標記物39T—G、SEQIDNO:2中的SNP標記物29G—A、和標記物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、以及E23/M38-M001沖旨示；以及才全測在所述植物的基因組中存在至少一種連接于賦予第二黃瓜白粉菌抗性的QTL的標記物，其中所述QTL是由SEQIDNO:3中的SNP標記物193C—T、在SEQIDNO:4中在第221位置的插入突變5'-AATTT-3'、和標記物E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12艇91匿M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134以及E14/M59-F-200指示。21.根據權利要求17-20中任一項所述的方法，其中，步驟a)、b)、e)、f)或h)的至少之一包括以下步驟提供來自所述植物的基因組DNA樣品并在所述基因組DNA樣品中檢測所述至少一種標記物。22.—種用于產生黃瓜屬物種的植物的方法，所述植物呈現對黃瓜線形病毒和對黃瓜白粉菌的抗性，所述方法包括以下步驟a)通過運用權利要求12-16中任一項所述的方法，選擇黃瓜屬物種的植物，所述植物包括賦予對黃瓜線形病毒和黃瓜白粉菌抗性的染色體區(qū)；b)近交所述才直物以產生對于所述QTL為純合的才直物品系；c)雜交來自步-驟a)和步駛《b)的所述才直物以產生F1種子；以及d)將所述F1種子栽培成F1后代植物。23.通過根據權利要求18-22中任一項所述的方法可獲得的植物或其部分。全文摘要本發(fā)明涉及一種抗黃瓜線形病毒和抗黃瓜白粉菌的植物，其中所述植物是黃瓜屬物種的植物，所述植物在單染色體上包含至少一個賦予線形病毒抗性的染色體區(qū)以及至少一個賦予白粉菌抗性的染色體區(qū)，其中所述至少一個賦予線形病毒抗性的區(qū)連接于至少一個標記物，該標記物選自由標記物E16/M50-244、E16/M50-188、以及E11/M48-251組成的組，以及其中所述至少一個賦予白粉菌抗性的區(qū)連接于至少一個標記物，該標記物選自由在SEQIDNO1中的單核苷酸多態(tài)性標記物39T^G、在SEQIDNO2中的單核苷酸多態(tài)性標記物29G^A、在SEQIDNO3中的單核苷酸多態(tài)性標記物193C^T、在SEQIDNO4中的第221位置的插入突變5′-AATTT-3′、以及標記物E16/M50-F-194、E11/M48-F-251、E23/M38-M001、E23/M40-M003、E24/M46-M002、E24/M46-M003、E12/M91-M003、E26/M43-M003、E14/M59-F-134以及E14/M59-F-200組成的組。文檔編號C12Q1/68GK101351116SQ200680050235公開日2009年1月21日申請日期2006年11月6日優(yōu)先權日2005年11月4日發(fā)明者勒內·約翰內斯·馬里亞·霍夫斯泰德,沃特·彼得·約翰內斯·德·魯伊特申請人:德魯伊特種子研發(fā)有限公司