專利名稱：：高粘度迪優(yōu)坦膠及其制備方法高粘度迪優(yōu)坦膠及其制備方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明描述了與重復(fù)單元類型相同的以前生產(chǎn)的多糖相比，顯示粘度特性增加的迪優(yōu)坦(diutan)多糖。通過產(chǎn)生鞘氨醇單孢菌(S/7/^"gomomw^.)ATCC53159的衍生物來制備這種改進(jìn)的迪優(yōu)坦多糖，所述衍生物含有其中克隆了迪優(yōu)坦多糖的生物合成基因的多拷貝廣譜宿主性質(zhì)粒。所述質(zhì)粒能在宿主鞘氨醇單孢菌菌株內(nèi)產(chǎn)生用于這種多糖合成的多個基因拷貝。以此方式提供的方法不僅能提高靶迪優(yōu)坦多糖的產(chǎn)量，還能產(chǎn)生物理特性改進(jìn)(上述較高的粘度)的迪優(yōu)坦多糖?，F(xiàn)已證實這種迪優(yōu)坦多糖在油田應(yīng)用和水泥材料中作為增粘劑(viscosifier)可能特別有用。本發(fā)明還包括產(chǎn)生這種改進(jìn)迪優(yōu)坦多糖的創(chuàng)造性方法以及這種方法中產(chǎn)生改進(jìn)迪優(yōu)坦所需的新克隆基因。此外，本發(fā)明包括含有所需DNA序列的工程改造的新鞘氨醇單孢菌菌株。
背景技術(shù)：
：多糖或樹膠一般用于使水溶液增稠或使之成為凝膠狀，通常分為兩類增稠劑和膠凝劑。典型的增稠劑包括淀粉、黃原膠、迪優(yōu)坦膠、文萊膠(welangum)、瓜爾膠、羧甲基纖維素、海藻酸鹽、甲基纖維素、刺梧桐樹膠和黃蓍膠。常見的膠凝劑包括明膠、結(jié)冷膠、淀粉、海藻酸鹽、果膠、角叉菜聚糖、瓊脂和甲基纖維素。多年來，某些多糖，或者更具體地說，生物膠，例如黃原膠、結(jié)冷膠、文萊膠和迪優(yōu)坦膠通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)。這些生物膠表現(xiàn)出不同特征，例如使其應(yīng)用于許多不同領(lǐng)域的粘度改進(jìn)能力。用于食品，例如糖果凝膠(confectioneryjdly)、果醬和果凍、甜食凝膠、糖霜和乳制品，以及微生物培養(yǎng)基組分的膠凝劑屬于該清單。此外，可將增稠劑用于許多最終應(yīng)用領(lǐng)域以改進(jìn)靶液體的粘度。特別感興趣的是這些膠能改變地下和/或水下石油液體粘度，從而有助于收集這些液體，雖然可能有許多其它不同的最終應(yīng)用存在(例如，包括水泥生產(chǎn))。己從不同的細(xì)菌來源產(chǎn)生了不同的生物膠，例如野油菜黃單孢菌(Za"&omomwcam網(wǎng)Wn》的黃原膠、伊樂藻鞘氨醇單孢菌(印/^"gomo"ose/o^a)的結(jié)冷膠、鞘氨醇單孢菌ATCC31555的文萊膠和鞘氨醇單孢菌ATCC53159的迪優(yōu)坦膠(S-657)。在過去已對這些菌株進(jìn)行了遺傳修飾以求明顯改變通過上述發(fā)酵方法產(chǎn)生的膠物質(zhì)。這種修飾能導(dǎo)致諸如除去酰基等變化，從而產(chǎn)生表現(xiàn)出不同物理特性的不同膠物質(zhì)。這些遺傳修飾的類型一般是通過改變宿主生物內(nèi)的基因表達(dá)來最終改變靶生物膠的組成，或者通過引入單獨顯示基因擴(kuò)增的質(zhì)粒來提高靶生物膠產(chǎn)量(例如授予Pollock等的美國專利號5，854,034，5,985,623和6,284,516以及授予Pollock個人的美國專利號6,709,845)。迪優(yōu)坦膠(也稱為雜多糖(heterpolysaccharide)S-657)通過發(fā)酵菌株鞘氨醇單孢菌ATCC53159制備，其在水溶液中表現(xiàn)出增稠、助懸和穩(wěn)定特性。迪優(yōu)坦通常表現(xiàn)為六聚體重復(fù)單元，所述重復(fù)單元由主鏈中的4個糖(葡萄糖-葡糖醛酸-葡萄糖-鼠李糖)以及與所述葡萄糖殘基之一相連的兩鼠李糖殘基的側(cè)鏈構(gòu)成。迪優(yōu)坦膠的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)見Chowdhury，T.A.，B.Lindberg，U.Lindquist和J.Baird，CarbohydrateResearch164(1987)117-122。迪優(yōu)坦顯示每個重復(fù)單元具有兩個乙?；〈瑓⒁奃iltz等，CarbohydrateResearch331(2001)265-270。兩篇參考文獻(xiàn)均通過引用全文納入本文。制備迪優(yōu)坦膠的細(xì)節(jié)可參見通過引用全文納入本文的美國專利號5,175,278。可采用標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵技術(shù)，例如利用碳水化合物源(非限制性例子如葡萄糖、麥芽糖等)、氮源和其它鹽類從鞘氨醇單孢菌菌株制備迪優(yōu)坦。某些工業(yè)需要各種野生型迪優(yōu)坦生物膠賦予的物理特征，特別是其粘度改進(jìn)特性和/或保水特性。不幸的是，已證實產(chǎn)生迪優(yōu)坦的成本效率低。此外，目前這些成本問題妨礙了迪優(yōu)坦的廣泛應(yīng)用，因為這種生物膠所表現(xiàn)出的粘度不足以替代其它更便宜但有效的生物膠(例如，黃原膠)。因此，需要提供至少能以較低成本生產(chǎn)這種有效迪優(yōu)坦的方法,和/或提供生產(chǎn)物理特性顯示明顯改進(jìn)的迪優(yōu)坦型生物膠的方式。目前，對任何類型的相關(guān)結(jié)冷膠類多糖(sphingan)生產(chǎn)的唯一描述(對于迪優(yōu)坦未證明有任何特異性)涉及較高的產(chǎn)率(見上述Pollock等的專利)?，F(xiàn)在還沒有任何方式討論或合理地提出能提供某種方法來生產(chǎn)分子量較高的迪優(yōu)坦膠，借助這種生產(chǎn)方法，所述迪優(yōu)坦膠在粘度測量值會體現(xiàn)出改善。發(fā)明簡述現(xiàn)己知道，在宿主鞘氨醇單孢菌微生物內(nèi)擴(kuò)增迪優(yōu)坦生物合成所用的某些新分離的DNA序列不僅能提高迪優(yōu)坦膠產(chǎn)量，還產(chǎn)生了表現(xiàn)出粘度特性增加的迪優(yōu)坦膠。因此，這種新的DNA序列(通過任何熟知的方法，例如但不限于利用質(zhì)粒引入宿主微生物內(nèi))提供了迪優(yōu)坦合成方法所尋求的所需結(jié)果。采用質(zhì)粒擴(kuò)增這些基因的這種方法的明顯優(yōu)點在于將這種分離DNA序列摻入迪優(yōu)坦合成過程較為簡單。另一優(yōu)點是能產(chǎn)生這種粘度特性較高的靶迪優(yōu)坦膠，同時還可能提高發(fā)酵生產(chǎn)效率(如果需要的話)。因此，本發(fā)明包括在許多不同的粘度測試中表現(xiàn)出改進(jìn)的迪優(yōu)坦膠。其中i)固有粘度高于150，優(yōu)選高于155，更優(yōu)選高于160dL/g;ii)海水3rpm粘度高于35，優(yōu)選高于37，更優(yōu)選高于40，最優(yōu)選高于42表盤讀數(shù)(dialreading);iii)海水0.3rpm粘度高于35,000，優(yōu)選高于39,000，更優(yōu)選高于40,000，最優(yōu)選高于41,000厘泊(cP);PEG低剪切率粘度高于3500，優(yōu)選高于3700，更優(yōu)選高于3900，最優(yōu)選高于4000cP。如以上術(shù)語所定義的，本發(fā)明還包括產(chǎn)生這種迪優(yōu)坦膠的方法，所述方法通過將特定的基因簇引入宿主鞘氨醇微生物并發(fā)酵所述微生物以產(chǎn)生迪優(yōu)坦膠。此外，本發(fā)明包括特定的DNA序列和任何載體(例如質(zhì)粒)來提供基因的多個拷貝或利用更強的啟動子來提高這些基因表達(dá)，等等。另外，還包括遺傳修飾的鞘氨醇菌株，所述菌株含有這種獨特的分離DNA序列所確定的迪優(yōu)坦生物合成基因的多個拷貝。發(fā)現(xiàn)這種獨特的分離DNA序列需要至少一種迪優(yōu)坦生物合成酶，即DpsG聚合酶。在另一可能的實施方式中，這種迪優(yōu)坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和葡萄糖-l-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；dTDP-6-脫氧-葡萄糖-3-5-差向異構(gòu)酶；dTDP-D-葡萄糖-4,6-脫水酶；和dTDP-6-脫氧-L-甘露糖-脫氫酶。在還有另一可能的實施方式中，這種迪優(yōu)坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶8IV;)3-l，4-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶II;葡糖基-異戊二烯基磷酸轉(zhuǎn)移酶I;和葡糖基轉(zhuǎn)移酶III。在還有另一可能的實施方式中，這種迪優(yōu)坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和多糖輸出蛋白DpsD、DpsC和DpsE。在還有另一可能的實施方式中，這種diutab生物合成酶包括鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶IV;(3-l,4-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶II;葡糖基-異戊二烯基磷酸轉(zhuǎn)移酶I;葡糖基轉(zhuǎn)移酶III;葡萄糖-l-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖-3-5-差向異構(gòu)酶；dTDP-D-葡萄糖-4,6-脫水酶；和dTDP-6-脫氧-L-甘露糖-脫氫酶。本發(fā)明方法和屬于本發(fā)明產(chǎn)物的迪優(yōu)坦生物合成酶一般選自聚合酶；裂合酶；鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶IV;卩-l,4-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶II;葡糖基轉(zhuǎn)移酶III;多糖輸出蛋白；分泌蛋白；葡糖基-異戊二烯基磷酸轉(zhuǎn)移酶I;葡萄糖-l-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖-3-5-差向異構(gòu)酶；dTDP-D-葡萄糖-4,6-脫水酶；dTDP-6-脫氧-L-甘露糖-脫氫酶和它們的組合。本發(fā)明還包括分離的核酸分子(除靶染色體上可能存在的DNA外)，其編碼如以下SEQIDNO所示的至少一種迪優(yōu)坦生物合成酵5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43;或編碼與以下SEQIDNO有至少95%相同的酶5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43。因此，本發(fā)明方法(以及由此制備的產(chǎn)品)涉及結(jié)冷膠類多糖膠，特別是迪優(yōu)坦型，包括但不限于S88、S60和S657。如上所述，本發(fā)明是發(fā)展的頂點，并且實現(xiàn)了將多拷貝的特定DNA序列引入某些鞘氨醇單孢菌菌株增加高粘度迪優(yōu)坦多糖的生物合成產(chǎn)量。與非工程改造的細(xì)菌相比，含有用于提高產(chǎn)量的這些基因的工程改造細(xì)菌產(chǎn)生的迪優(yōu)坦多糖量明顯較高，同時產(chǎn)生了上述的高粘度特性。按照本發(fā)明，可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)分離、回收和克隆引入宿主微生物中的DNA序列(采取任何熟知的形式，例如非限制性的例子還是質(zhì)粒)，從而產(chǎn)生上述產(chǎn)量增加和粘度增加的特性(不想依賴于任何具體的科學(xué)理論，但據(jù)信這是經(jīng)由分子量范圍特性增加所致)。然后，將多拷貝的所述DNA遞送入鞘氨醇單孢菌屬細(xì)菌中(借助質(zhì)粒，其它已知的方式)或借助合適的例如更強啟動子提高基因表達(dá)。插入靶細(xì)菌后，可通過發(fā)酵該工程改造細(xì)菌并根據(jù)所產(chǎn)生的數(shù)量和質(zhì)量來比較產(chǎn)量從而測定迪優(yōu)坦的生產(chǎn)情況。通過比較本發(fā)明方法所得的迪優(yōu)坦產(chǎn)量和野生型迪優(yōu)坦生產(chǎn)菌株(ATCC53159)的可同時測定產(chǎn)量增加和粘度增加(量)。附圖簡述圖1圖示了迪優(yōu)坦膠生物合成的分離基因。標(biāo)出了推定的或已知的基因。還標(biāo)出了插入不同質(zhì)粒的區(qū)段。圖2圖示了利用這種創(chuàng)造性迪優(yōu)坦生物膠材料實現(xiàn)的固有粘度測量值的改善。發(fā)明詳述與本發(fā)明有關(guān)的以下術(shù)語用于通篇說明書中，其意義如下所示通篇說明書利用術(shù)語"鞘氨醇單孢菌"指鞘氨醇單孢菌屬的革蘭氏陰性細(xì)菌菌株。通篇說明書利用術(shù)語"提高的生產(chǎn)者"或"提高的生產(chǎn)"描述含有多拷貝DNA序列的工程改造細(xì)菌，所述DNA序列分離自與野生型細(xì)菌的相同菌株相比產(chǎn)生顯著較高(以重量計至少高約5%)迪優(yōu)坦多糖的相同菌株。利用術(shù)語"分離的"描述從某微生物中取出并經(jīng)歷至少一定程度純化，即一步或多步純化步驟的DNA，可利用限制性酶切割所述DNA并將其克隆或插入質(zhì)粒載體，或者插入或摻入細(xì)菌中。利用術(shù)語"序列"描述根據(jù)其核苷酸單位鑒定的具體DNA區(qū)段。通篇說明書利用術(shù)語"插入"描述將從生產(chǎn)迪優(yōu)坦的鞘氨醇單孢菌菌株的染色體DNA分離的DNA區(qū)段轉(zhuǎn)移入鞘氨醇單孢菌菌株的過程和結(jié)果(非限制性例子是借助質(zhì)粒)。首先可采用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)將這種分離的DNA引入(依然是非限制性的可能性)所需質(zhì)粒(此處是pLAFR3)，然后通過，例如接合或遷移將其轉(zhuǎn)移入受者鞘氨醇單孢菌細(xì)菌。插入受者鞘氨醇單孢菌細(xì)菌后，含有相關(guān)DNA序列的質(zhì)粒在受者細(xì)胞中復(fù)制，從而獲得產(chǎn)生高粘度(仍然相信是高分子量范圍的)迪優(yōu)坦多糖所需的DNA區(qū)段的若干(至少兩個，一般是4-10個)拷貝。采用接合或遷移將所述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移入受者細(xì)菌通常是有效的。還可利用純化的DNA以電穿孔或化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞?？衫闷渌d體或噬菌體將DNA轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞中。在產(chǎn)生迪優(yōu)坦的受者鞘氨醇單孢菌中，無需使DNA區(qū)段維持在質(zhì)粒(或其它熟知的遞送載體)上。將其它的數(shù)拷貝DNA區(qū)段引入細(xì)菌染色體是慣常的，從而可通過復(fù)制細(xì)菌DNA的相同機制復(fù)制各代區(qū)段?；蛘?，可利用更強的啟動子元件提高基因表達(dá)。利用術(shù)語"基因擴(kuò)增"表示例如通過將靶基因克隆到多拷貝質(zhì)粒上(例如，4-10個拷貝)或?qū)⒒虻亩鄠€拷貝(例如，4-10個)插入細(xì)菌基因組中來增加基因的拷貝數(shù)，或者表示通過修飾啟動子元件來增加基因表達(dá)。這些方法和其它方法均可增加所編碼蛋白質(zhì)的數(shù)量。通篇說明書利用術(shù)語"生物合成"描述通過鞘氨醇單孢菌細(xì)菌生物學(xué)產(chǎn)生或合成迪優(yōu)坦。通過許多細(xì)菌酶所調(diào)控的一系列步驟從單個碳水化合物單元合成迪優(yōu)坦多糖。可以任何選擇的形式(例如仍然優(yōu)選質(zhì)粒形式，但不一定)摻入受者細(xì)菌的相關(guān)DNA序列編碼已知對迪優(yōu)坦多糖的產(chǎn)量增加和分子量增加有益或必需的遺傳信息。此外，不依賴于具體的科學(xué)理論，雖然據(jù)信本發(fā)明具體DNA序列(例如質(zhì)粒pS8中的)能誘導(dǎo)，而不只是提高產(chǎn)量，但還增加了在迪優(yōu)坦本身的各聚合物內(nèi)聚合的重復(fù)單元數(shù)量。因此，據(jù)信重復(fù)單元的這種增加使得迪優(yōu)坦膠提供的粘度特性出乎意料地高。由于檢測到固有粘度增加，因而可假定分子量增加，二者有冪定律關(guān)系。因此，已知線形聚合物(如迪優(yōu)坦膠)的固有粘度實際上以那種關(guān)系與分子量成比例。采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和方法分離相關(guān)DNA序列，所述DNA序列是本發(fā)明方法的基礎(chǔ)并產(chǎn)生了粘度增加的迪優(yōu)坦多糖。因此，可采用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)產(chǎn)生迪優(yōu)坦的鞘氨醇單孢菌菌株，進(jìn)而從中產(chǎn)生這些序列。然后可通過，例如先將細(xì)菌細(xì)胞離心并重懸，再經(jīng)純化柱洗脫DNA進(jìn)行DNA提取。純化完成后，可用限制性核酸內(nèi)切酶消化分離的DNA，克隆入所需質(zhì)粒或其它遞送載體中，然后轉(zhuǎn)移至受者菌株。可采用本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)而不作具體限定。在本發(fā)明中，DNA的克隆取決于本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的常規(guī)技術(shù)和方法。應(yīng)該注意，可采用任何方法克隆本發(fā)明DNA區(qū)段，本發(fā)明不限于，例如利用質(zhì)?？寺≥d體。例如，可通過插入噬菌體載體來克隆DNA片段。然后可利用質(zhì)粒或其它遞送載體將克隆的DNA序列引入鞘氨醇單孢菌菌株。然后可通過發(fā)酵，利用遺傳修飾的鞘氨醇單孢菌菌株產(chǎn)生迪優(yōu)坦。適于發(fā)酵的培養(yǎng)基基本上是水性培養(yǎng)基，其通常含有碳源，例如包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖或麥芽糖糊精在內(nèi)的碳水化合物；氮源，例如無機銨，有機硝酸酯，有機氨基酸或蛋白物質(zhì)，如水解酵母菌、大豆粉或酪蛋白、蒸餾酒廠廢液濃縮物或玉米漿；和無機鹽。各種發(fā)酵培養(yǎng)基支持產(chǎn)生本發(fā)明迪優(yōu)坦。發(fā)酵肉湯中可含有各種含量的碳水化合物，但以重量計通常在發(fā)酵培養(yǎng)基的約1-10%之間(優(yōu)選2-8%)。可先加入碳水化合物，再發(fā)酵，或者可在發(fā)酵期間加入。以重量計，水性培養(yǎng)基中的氮含量在約0.01%-約0.4%?？墒褂靡环N碳源或氮源，也可使用這些碳氮源的混合物。發(fā)酵鞘氨醇單孢菌細(xì)菌可用的無機鹽是含有鈉、鉀、銨、硝酸根、鈣、磷酸根、硫酸根、氯、碳酸根和相似離子的鹽類。還優(yōu)選包含痕量金屬，例如鎂、錳、鈷、鐵、鋅、銅、鉬、碘化物和硼酸鹽。發(fā)酵可在約25。C-4(TC之間，優(yōu)選約27X:-35'C的溫度范圍進(jìn)行?？赏ㄟ^體積放大的標(biāo)準(zhǔn)方法制備接種物，包括搖瓶培養(yǎng)和小規(guī)模的深層攪拌發(fā)酵。制備接種物的培養(yǎng)基可以與生產(chǎn)培養(yǎng)基相同，或者可以是本領(lǐng)域熟知的幾種標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中的任一種，例如Luria肉湯或YM培養(yǎng)基。可采用多個種子階段(seedstage)以獲得所需的接種體積。典型的接種體積范圍是最終發(fā)酵總體積的約0,5%-約10%。發(fā)酵容器可裝有攪拌器來攪拌內(nèi)含物。該容器還可裝有自動pH和氣泡控制裝置。可將生產(chǎn)培養(yǎng)基加入容器中，通過加熱來適當(dāng)滅菌?；蛘?，可先將碳水化合物或碳源單獨滅菌再加入容器中?？蓪⒔?jīng)培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液加入冷卻的培養(yǎng)基中(通常在約27"C-約35'C的優(yōu)選發(fā)酵溫度)，攪拌發(fā)酵培養(yǎng)液約48-約110小時，從而產(chǎn)生高粘度的肉湯。通過用醇，一般是異丙醇沉淀等標(biāo)準(zhǔn)方法從肉湯中回收迪優(yōu)坦多糖。12本發(fā)明的優(yōu)選實施方式包括附圖詳述提供以下實施例是為說明本發(fā)明。實施例的描述不應(yīng)誤解為以任何方式限制了本發(fā)明的范圍。DNA序列分離/質(zhì)粒產(chǎn)生為首先分離和測定上述創(chuàng)造性結(jié)果的合適序列，如下所示構(gòu)建ATCC53159微生物的基因文庫分離鞘氨醇單孢菌ATCC53159的染色體DNA，用^"3AI限制性核酸內(nèi)切酶部分消化。用瓊脂糖凝膠純化15-50kb范圍內(nèi)的DNA片段，將這些片段連接入5"mHI消化的粘粒克隆載體pLAFR3(根據(jù)Staskawicz等，"分子表征丁香假單胞菌大豆致病變種群0和群1的克隆無毒力基因"(Molecularcharacterizationofclonedavirulencegenesfromrace0andrace1of尸sewfifo附o"flw5^Wwaepv.G7_yc/wea)，J.Bacteriology.1987.169:5789-94)，該載體分離自大腸桿菌C^c/eWc/aco/Z)菌株JZ279(Harding等，"在野油菜黃單孢菌中生物合成黃原膠必需的基因簇的遺傳學(xué)和物理分析，，(GeneticandphysicalanalysisofaclusterofgenesessentialforxanthangumbiosynthesisinX贈/zo附ow(XJcam/e5t"X)，J.Bacteriology.1987.169:2854-61)。將連接反應(yīng)(產(chǎn)物)包裝入X噬菌體顆粒(利用吉格帕克III金包裝提取物(GigapackIIIGoldpackagingextract)，斯特拉基因公司(Stratagene)，拉霍亞，加利福尼亞州)，并轉(zhuǎn)染入文庫效率(LibraryEfficiency)大腸桿菌DH5aMCR細(xì)胞中(生命技術(shù)公司(LifeTechnologies),羅克維爾，馬里蘭州)。合并約10,000個四環(huán)素耐受性菌落以形成基因文庫。然后分離該文庫的各序列。該實施例所進(jìn)行的這項工作包括從鞘氨醇單孢菌ATCC53159微生物分離用于多糖生物合成的特定基因。通過與多糖合成缺陷型突變體，特別是第一個步驟，即葡糖基轉(zhuǎn)移酶I被阻斷的那些突變體互補來鑒定用于多糖生物合成的這些基因。由于最初未獲得ATCC53159的轉(zhuǎn)移酶I缺陷型突變體，利用與伊樂藻鞘氨醇單孢菌和野油菜黃單孢菌的轉(zhuǎn)移酶I缺陷型突變體互補來鑒定用于迪優(yōu)坦多糖生物合成的基因?？衫锰峁㊣ncP轉(zhuǎn)移功能的輔助質(zhì)粒，通過三-親本接合(tri-parentalconjugation)將質(zhì)粒pLAFR3從其大腸桿菌宿主轉(zhuǎn)移至其它革蘭氏陰性細(xì)菌(根據(jù)Ditta等，"革蘭氏陰性細(xì)菌的廣譜宿主性DNA克隆系統(tǒng)構(gòu)建苜蓿根瘤菌的基因庫，，(BroadhostrangeDNAcloningsystemforgram-negativebacteria:constructionofagenebankof7/n'zo6/訓(xùn)me/〃o"')，Proc.Natl.Acad.Sci.1980.77:7347-51.)。大腸桿菌中每個染色體的RK2型質(zhì)?？截悢?shù)估計有5-7個(Figurski等，"利用體外構(gòu)建的雜交質(zhì)粒中的IncP-I質(zhì)粒RK2抑制ColEl復(fù)帝'J特性"(SuppressionofCoIElreplicationpropertiesbytheIncP-IplasmidRK2inhybridplasmidsconstructedinvitro),J.Mol.Biol.1979133:295-318.)。通過三親本接合將大腸桿菌中的ATCC53159染色體DNA的基因文庫轉(zhuǎn)移入伊樂藻鞘氨醇單孢菌ATCC31461的非黏液突變體(nonmucoidmutant)(GPS2)，選擇四環(huán)素和氯霉素耐受性。所用的輔助質(zhì)粒是pRK2013(大腸桿菌菌株JZ279中)，其含有窄宿主性復(fù)制起點，但顯示出遷移pLAFR3所需的反式作用功能(transactingfunction)。質(zhì)粒pRK2013在鞘氨醇單孢菌菌株中不復(fù)制。伊樂藻鞘氨醇單孢菌ATCC31461產(chǎn)生多糖結(jié)冷膠。結(jié)冷膠和迪優(yōu)坦多糖均具有由[—4)-a-L-鼠李糖-(1—3)-(3-D-葡萄糖-(1—4)-(3-D-葡糖醛酸-(1—4)-P-D-葡萄糖-(1—]構(gòu)成的相同四糖重復(fù)單元。然而，迪優(yōu)坦還包含與所述葡萄糖殘基之一相連的兩個鼠李糖分子構(gòu)成的側(cè)鏈，該側(cè)鏈經(jīng)乙?；揎?，而結(jié)冷膠不具有側(cè)鏈糖并經(jīng)乙?；透视突揎?。突變型GPS2在多糖生物合成的第一步中有缺陷，即通過葡糖基轉(zhuǎn)移酶I將葡萄糖-l-磷酸從UDP-D-葡萄糖轉(zhuǎn)移至細(xì)菌異戊二烯基(bactoprenyl)磷酸脂質(zhì)載體。以非黏液菌落為背景，從四環(huán)素選擇平板分離產(chǎn)生多糖(黏液)的菌落。推測恢復(fù)產(chǎn)生多糖的克隆包含編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶I的ATCC53159基因加上約20-25kb毗連DNA。從8個黏液GPS2轉(zhuǎn)接合子分離質(zhì)粒DNA，通過電穿孔轉(zhuǎn)移至大腸桿菌菌株DH5oc(生命技術(shù)公司)。從大腸桿菌分離質(zhì)粒以而獲得用于限制性核酸內(nèi)切酶7//^/111/￡^111(切割多接頭中5amHI限制性核酸內(nèi)切酶位點的任一側(cè))進(jìn)行雙重消化的足夠DNA，進(jìn)而從載體上切下插入的DNA。通過凝膠電泳測定克隆中插入DNA的大小。通過從側(cè)接載體的B"mHI位點的質(zhì)粒序列的特異性引物開始測序來測定幾種質(zhì)粒的終序列。利用BLASTX比較計算機數(shù)據(jù)庫中的序列來分析各序列。這些質(zhì)粒中的兩個，pS8和pS6示于圖l。類似地，通過三親本接合將ATCC53159基因文庫轉(zhuǎn)移入轉(zhuǎn)移酶I缺陷的利福平耐藥性非黏液野油菜黃單孢菌突變體(CXC109)中(例如，上述Harding等的參考文獻(xiàn)所述)，選擇四環(huán)素和利福平耐藥性。野油菜黃單孢菌產(chǎn)生黃原膠多糖，轉(zhuǎn)移酶I將葡萄糖-l-磷酸從UDP-D-葡萄糖轉(zhuǎn)移至細(xì)菌異戊二烯基磷酸脂質(zhì)載體也能啟動其合成(Ielpi等，"在野油菜黃單孢菌中順序裝配和聚合黃原膠多糖的聚異戊烯醇連接的五糖重復(fù)單元"(Sequentialassemblyandpolymerizationofthepolyprenol-linkedpentasacchariderepeatingunitofthexanthanpolysaccharideinXaw^owowiwcampeW"'力，J.Bacteriology.1993.175:2490-500)。如上所述從黏液轉(zhuǎn)接合子純化質(zhì)粒并如上所述測定末端序列。圖1示出了這些質(zhì)粒中的兩種，pX6禾BpX4。德克薩斯州休斯頓市的拉克技術(shù)公司(LarkTechnologiesInc.,Houston,TX)采用雙鏈鳥槍測序?qū)寺≡谫|(zhì)粒pS8和pX6中的S657DNA進(jìn)行了完全測序。分析了這些序列以鑒定用于迪優(yōu)坦生物合成的基因(如圖l所示)。根據(jù)與數(shù)據(jù)庫中其它基因，特別用于S-88結(jié)冷膠類多糖(例如，上述'516Pollock等的專利所述的)、GeneBank登錄號U51197和結(jié)冷膠(GenBankAY217008和AY220099)生物合成的公布基因的同源性指定基因功能。鑒定了編碼主鏈中四種糖的轉(zhuǎn)移酶的基因和用于dTDP-鼠李糖合成的4種基因。用于多糖分泌的基因基于與生物合成其它多糖的基因的同源性。兩種基因編碼與參與蛋白質(zhì)分泌的蛋白質(zhì)同源的蛋白質(zhì)。推測兩種基因編碼聚合酶和裂合酶。質(zhì)粒pX6中的插入物含有17種基因，包括編碼轉(zhuǎn)移酶I(啟動迪優(yōu)坦合成的第一步)的基因c/;wB，用于分泌的基因和用于dTDP-鼠李糖合成的4種基因，但缺乏轉(zhuǎn)移酶II、III和IV的基因，和聚合酶及裂合酶的推測基因。質(zhì)粒pS8含有^w基因簇的20種基因，包括所有4種主鏈糖轉(zhuǎn)移酶的基因，用于dTDP-鼠李糖合成的四種基因，用于多糖分泌的基因，包括聚合酶和連接酶的推測基因，但缺乏功能未知的基因，oW和or/7。質(zhì)粒pS6含有用于分泌和4種糖轉(zhuǎn)移酶的基因，但不含用于dTDP-鼠李糖合成的所有基因或聚合酶的基因。質(zhì)粒pX4只含有區(qū)域的一小部分，但包含Pollock等報道的用于dTDP-鼠李糖合成的4種基因和編碼轉(zhuǎn)移酶I的基因，從而足以導(dǎo)致鞘氨醇菌株中多糖產(chǎn)量增加。菌株產(chǎn)生然后通過上述的三親本接合將上述四種質(zhì)粒引入鞘氨醇單孢菌ATCC53159號菌株中，從而形成新的S657工程改造菌株(S657/pS8、S657/pS6、S657/pX6和S657/pX4)。然后如上所述進(jìn)行發(fā)酵，從而產(chǎn)生了下述的生物膠物質(zhì)。所有4種質(zhì)粒對迪優(yōu)坦生產(chǎn)量均產(chǎn)生有益作用；然而，pS8質(zhì)粒還出乎意料地極大提高了迪優(yōu)坦粘度并增加了其分子量。提供了pS8的DNA序列(26278bp)(1號DNA序列)，下表1和圖1中以表格的形式列出了編碼的基因。質(zhì)粒pS8中的插入物DNA包含基因D;^G到rm/D和基因c/;wS和or/7的一部分。以下基因列表基本上是圖1所示質(zhì)粒pS8中插入物的DNA序列所代表基因的清單。表l戸S微薪乂激J:游基厲起始終止名稱描述1054dpsS(部分)與gelS同源27381113CdpsG推測的聚合酶48952898CdpsR推測的裂合酶50936031dpsQ推測的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶IV70826111Cdpsl未知71218167dpsK|3-1，4-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1181649030dpsL葡糖基轉(zhuǎn)移酶in104679079CdpsJ未知1107612374dpsF未知1238913306dpsD推測的多糖輸出蛋白i334114687dpsC推測的多糖輸出蛋白1468715394dpsE推測的多糖輸出蛋白1540516286dpsM推測的多糖輸出蛋白1627016968dpsN推測的多糖輸出蛋白1845417060CatrD推測的分泌蛋白2063718451CatrB推測的分泌蛋白2122922641dpsB葡糖基-異戊二烯基磷酸轉(zhuǎn)移酶i2275723635rmlA葡萄糖-i-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶2363224198rmlCdTDP-6-脫氧-D-葡萄糖-3-5-差向異構(gòu)酶2420225263rmlBdTDP-D-葡萄糖-4,6-脫水酶2526326129rmlDdTDP-6-脫氧-L-甘露糖-脫氫酶26277*26146Corf7(部分)功能未知'*第一框內(nèi)密碼子，,起始密碼子不存在迪優(yōu)坦產(chǎn)生在Applikon20L發(fā)酵罐中用相同的液體培養(yǎng)基進(jìn)行三次發(fā)酵，同時攪拌并通氣，以測定含質(zhì)粒的工程改造鞘氨醇單孢菌S657菌株相對于不含質(zhì)粒的S657野生型菌株的dioutan產(chǎn)量。對于含質(zhì)粒的菌株，在整個發(fā)酵過程中加入5mg/L的抗生素四環(huán)素以確保質(zhì)粒的維持。視需要加入KOH以控制pH。釆用兩種子階段，接種轉(zhuǎn)移量為1%-6%。用于發(fā)酵的培養(yǎng)基含有玉米糖漿作為碳水化合物來源、可同化的氮源和鹽。本領(lǐng)域熟知可用于發(fā)酵的營養(yǎng)物，包括碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖或麥芽糊精；氮源，例如無機氮，如銨或硝酸鹽，有機氮，如氨基酸、水解酵母提取物、大豆蛋白或玉米漿；和含有，例如氯、磷酸根、磷酸根、鈣、銅、鐵、鎂、鉀、鈉或鋅的其它鹽。測定肉湯的粘度和沉淀的纖維來檢測所得的迪優(yōu)坦產(chǎn)量。利用布氏粘度計，4號紡錘，60rpm檢測發(fā)酵肉湯的粘度，結(jié)果見表2。發(fā)酵結(jié)束時，通過熟知的引入葡萄糖淀粉酶的方法處理肉湯來水解任何殘留的玉米糖漿寡糖。然后用兩體積的異丙醇沉淀肉湯試樣中產(chǎn)生的迪優(yōu)坦膠。用過濾器收集纖維，干燥。在表2中，術(shù)語DWY表示水解剩余的玉米糖漿寡糖后可沉淀生物膠的總干重得率。攜帶迪優(yōu)坦生物合成基因額外拷貝的質(zhì)粒pX4、pX6、pS6或pS8的所得物質(zhì)產(chǎn)率明顯較高。然而，與干重得率增加相比，pS8質(zhì)粒的肉湯粘度出乎意料地大大增加，表明除增加迪優(yōu)坦產(chǎn)量外的某些因素影響了粘度。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>上述四種質(zhì)粒的任一種所得物質(zhì)的產(chǎn)量明顯較高，而pS8和pS6質(zhì)粒的肉湯粘度出乎意料地高，因此還表明產(chǎn)物質(zhì)量高。然后測定了所得迪優(yōu)坦膠產(chǎn)物的質(zhì)量，即粘度。應(yīng)用測試中迪優(yōu)坦的流變學(xué)然后分析了這些迪優(yōu)坦膠樣品在兩個不同領(lǐng)域的的潛在有益用途用于原油回收的油田添加劑和用于保水性和快速配制的水泥添加劑。油田工業(yè)依賴于稱為"海水粘度"(SWV)的測試來估計原油回收用膠的可接受性能。這種測試基本上是膠增加海水粘度(例如，從海床重復(fù)回收)的有效性指標(biāo)。通常接受根據(jù)測試海水制劑的粘度改進(jìn)作用來預(yù)測得到的膠作為原油回收目的的合適粘度調(diào)節(jié)劑的可行性。將419.53克海鹽(ASTMD-l141-52)混合在9800克去離子水中來制備這種"合成海水"制劑。對于海水粘度測試，將0.86克樣品膠加入307.0g合成海水，用泛氏混合機(FannMultimixer)(9B5型，零件號N5020)以約11,500rpm混合35分鐘。35分鐘結(jié)束時，先將溶液冷卻至約26r，再檢測粘度。對于3-rpm讀數(shù)，將樣品置于泛氏樣品臺(泛氏，35A型；扭簧MOC34/35F0.2b;擺錘(Bob)Bl;轉(zhuǎn)子Rl)，將電動機調(diào)至低速并將變速器設(shè)置在中間位置從而將轉(zhuǎn)速設(shè)置為3rpm。然后使讀數(shù)穩(wěn)定，從儀表讀出剪切應(yīng)力值，記錄為SWV3rpm表盤讀數(shù)(DR)。對于0.3-rpm讀數(shù)，利用布氏粘度計(布氏LVDV-II或DV-II粘度計，裝有LV-2C紡錘)檢測粘度。紡錘的速度設(shè)置為0.3rpm，先使紡錘旋轉(zhuǎn)至少6分鐘再將粘度記錄為SWV-0.3rpm讀數(shù)并以厘泊(cP)表示。對于水泥應(yīng)用，PEGLSRV測試(如下所述，利用聚乙二醇作為分散劑的低剪切率粘度)為該工業(yè)提供了粘度添加劑的性能效力指標(biāo)。這種測試檢測了0.25。/。的生物膠標(biāo)準(zhǔn)自來水(STW)溶液的粘度。將10.0克NaCl和1.47克CaCl2，2H20加入10升去離子水中來制備STW。對于粘度檢測，將0.75克生物膠加入400-mL燒杯中的4.5克聚乙二醇200(CAS25322-68-3)中，徹底分散。然后，將299克STW加入該燒杯，利用低調(diào)(low-pitched)攪拌槳型攪拌器以800±20rpm混合約4小時?；旌?小時后，將燒杯置于25'C水浴中，靜置約30分鐘。然后，利用裝有2.5+扭矩彈簧的布氏LV粘度計(或相當(dāng)?shù)膬x器，例如DEV2.5+型)，以3rpm，使用LV1紡錘檢測粘度，先使紡錘旋轉(zhuǎn)3分鐘再檢測，以厘泊(cP)表示。以此方式測試以上產(chǎn)生的迪優(yōu)坦樣品，結(jié)果如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>swv=海水中的粘度LSRV=低剪切率粘度出乎意料的是，一些含質(zhì)粒的工程改造菌株產(chǎn)生的本發(fā)明迪優(yōu)坦膠表現(xiàn)出粘度增加有限。然而，最出乎意料的是，pS8菌株的3rpmSWV粘度增加是80%,而對pX6菌株所作的相同分析只比野生型結(jié)果高9.6%。質(zhì)粒pS6和pX4沒有明顯增加。類似地，較低的SWVrpm測試顯示pS8型高于野生型51.5。/。，而pX6只高2。/。。最后，聚乙二醇LSRV測試顯示與野生型膠相比，pS8造成粘度增加超過77%，而pX6迪優(yōu)坦增加不到16%，pX4增加7.2。/。，質(zhì)粒pS6沒有顯著增加。這些情況中極其出乎意料的結(jié)果再次顯示通過在pS8質(zhì)粒中利用示例的所需基因序列，例如將這種序列引入產(chǎn)迪優(yōu)坦的耙細(xì)菌中的一種方式，(粘度的)極大改善與迪優(yōu)坦膠產(chǎn)量一致。因此，通過引入pS8產(chǎn)生的本發(fā)明迪優(yōu)坦顯示驚人地提高了所有三種計數(shù)的粘度檢測值，特別是與野生型和pX6質(zhì)粒產(chǎn)生的種類相比。因此，估計這種新的迪優(yōu)坦能在典型的油田條件和水泥應(yīng)用中起到非常好的作用。流變學(xué)改善的基礎(chǔ)解釋以上實施例顯示S67/pS8菌株的迪優(yōu)坦的流變學(xué)參數(shù)顯著增加。因此，海水和PEG低剪切率粘度測量值的這種實質(zhì)性增加不能單單歸因于產(chǎn)量增加，因為pX6菌株也顯示了相同的產(chǎn)率結(jié)果(如果不大于的話)。實際上，在表2所示的以上實施例中，S657/pS8菌株的干重產(chǎn)率(醇可沉淀的物質(zhì))增加了8%，而流變學(xué)參數(shù)增加得更為顯著(52-80%)。進(jìn)行了基礎(chǔ)研究來解釋為何菌株S657/pS8獲得的流變學(xué)改善勝過野生型菌株。固有粘度是聚合物科學(xué)中推測大分子分子量的熟知技術(shù)(C.Tanford，1961.《大分子的物理化學(xué)》(PhysicalChemistryofMacromolecules)約翰威利父子公司(JohnWiley&Sons,紐約)。通過繪制比濃粘度(粘度對濃度標(biāo)準(zhǔn)化)與溶液濃度的關(guān)系圖，并將數(shù)據(jù)的線性回歸外推至0濃度可獲得固有粘度(圖中的y-截距)。如下表所示，所得的膠出乎意料地顯示固有粘度增加。評估了五種迪優(yōu)坦樣品的固有粘度、中性糖并作了有機酸分析，其中兩種來自野生型菌株(對照1，對照2)，三種來自S657/pS8菌株(樣品1、樣品2、樣品3)。通過以下步驟純化這些樣品醇沉淀、再水合、用次氯酸鹽處理、用葡萄糖淀粉酶處理、用溶菌酶處理并最終用蛋白酶處理(按照該順序)。然后按照4:1的CBM:肉湯之比回收迪優(yōu)坦，干燥并研磨。CBM是以重量計包含約82M異丙醇的異丙醇/水共沸混合物。如下所示測試各樣品的水分含量通常采用MettlerHB43鹵素水分平衡(halogenmoisturebalance)測試兩份0.7克樣品試樣。然后求出兩次試驗結(jié)果的平均值，利用這些結(jié)果校正水分。獲得水分?jǐn)?shù)據(jù)后，根據(jù)校正的水分用0.01MNaCl制備0.2%的膠溶液。對于這些試驗，制備總共200克0.2%溶液。在分析天平上稱取最接近千分之十的膠，將其加入最接近千分之一稱取的水中。在400ml高型燒杯(tallformbeaker)中用2.5英寸直徑的攪拌槳混合器以1000rpm攪拌各樣品兩小時。最初的水合后，用O.OlMNaCl將各樣品稀釋至0.02y。。稱取20克所述0.2y。溶液加入400ml燒杯中，然后加入180ml該稀釋劑實現(xiàn)所述稀釋。將稀釋的樣品再混合30分鐘。最后從該樣品制備用于測定固有粘度的最終稀釋液。評估以下濃度的各迪優(yōu)坦樣品0.004%、0.008%、0.010%和0.012%。利用VilasticVE系統(tǒng)檢測粘度。先用水將Vilastic校正到誤差低于2.0%，再進(jìn)行檢測。采用2Hz計時器程序、應(yīng)力為l和剪切率約121/秒檢測各樣品，所有檢測均在23"C進(jìn)行。各樣品檢測5次并求出平均值。然后，利用平均粘度數(shù)據(jù)計算固有粘度。以下圖2和表4提供了這些試驗的最終結(jié)果。表4裙麟存搭度將靴麥逆汰智迪優(yōu)坦檢測的固有樣品固體粘度S657對照193.76138.3S657對照292.42143S657/pS8樣品191.7170,7S657/pS8樣品291.4162.2S657/pS8樣品391.94162.8這些結(jié)果表明S657/pS8菌株一致地產(chǎn)生固有粘度顯著較高的迪優(yōu)坦；事實上，本發(fā)明菌株的平均比濃粘度是165.2，而對照是140.7，檢測的固體水平均相似。這些結(jié)果表明S657/pS8產(chǎn)生的迪優(yōu)坦的分子量高于野生型對照。圖2顯示了在對照和本發(fā)明菌株之間固體含量相似時檢測到的固有粘度一致較高的這些趨勢。為測定S657/pS8的較高粘度迪優(yōu)坦膠是否與野生型菌株的迪優(yōu)坦組成相同，通過測試中性糖和有機酸來確定組成。中性糖分析利用固有粘度檢測所用的純化樣品。用三氟乙酸將各純化樣品的等份試樣水解(10(TC/約18小時)成組分糖。通過高效陰離子交換層析，利用脈沖電流計檢測來定量測定水解產(chǎn)物中性糖。通過高效離子交換層析，利用化學(xué)抑制電導(dǎo)率檢測來定量測定水解產(chǎn)物有機酸。表5總結(jié)了中性糖分析的結(jié)果。如其所示，S657/pS8菌株的中性糖分布與S657野生型菌株的中性糖分布幾乎相同。雖然兩種結(jié)果不同于理論值，但這些結(jié)果表明利用pS8產(chǎn)生的迪優(yōu)坦膠的重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)與野生型產(chǎn)生的相同，pS8物質(zhì)導(dǎo)致粘度有任何增加是因為鏈較長，即分子量較高。表5盧浙夢主K抓鄉(xiāng)逆汰邀廣樣游^性薪浙夯教麼分橋<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>因此，S657/pS8工程改造菌株所產(chǎn)生迪優(yōu)坦的海水粘度和PEG低剪切率粘度的極大增加是因為迪優(yōu)坦分子的分子量或長度增加，即每個分子中重復(fù)單元更多，而不是因為其組成改變，因此不是因為重復(fù)結(jié)構(gòu)本身的改變。流變學(xué)(參數(shù))的這種改善也不是單純因為迪優(yōu)坦產(chǎn)量增加。雖然對克隆有迪優(yōu)坦生物合成基因簇不同部分的4種質(zhì)粒pS6、pS8、pX4和pX6的評估顯示生產(chǎn)量均有所增加，但只有質(zhì)粒pS8顯示回收的迪優(yōu)坦產(chǎn)物的流變學(xué)參數(shù)有出乎意料且非常高的增加。對克隆在測試質(zhì)粒中的迪優(yōu)坦生物合成基因進(jìn)行比較提示，最有可能導(dǎo)致分子量增加的基因是基因^wG，因為該基因存在于pS8中而不存在于其它質(zhì)粒中?；騘wG編碼與參與多糖合成的其它膜蛋白同源性強的疏水性膜蛋白。該蛋白質(zhì)的一部分與催化重復(fù)單元連接以形成高分子量多糖的聚合酶蛋白具有同源性。已有人推測S60中的同源基因ge/G起到結(jié)冷膠合成聚合酶的功能(Harding,N.E.等2004."組織伊樂藻鞘氨醇單孢菌ATCC31461中結(jié)冷膠多糖生物合成所需的基因"(Organizationofgenesr叫uiredforgellanpolysaccharidebiosynthesisin;S^/nVzgowo"a51e/ocfeoATCC31461)J.Ind.Microbiol.Biotech.31:70-82。Sa-Correia，I.等2002."在少動鞘氨醇單孢菌ATCC31461中生物合成結(jié)冷膠基因、酶和表多糖產(chǎn)生工程改造"(GellangumbiosynthesisinS^/z/wgomo"<xs/aMc//no6//z'>sATCC31461:Genes，enzymesandexopolysaccharideproductionengineering)J.Ind.Microbiol.Biotechnol.29:170-176)。還從產(chǎn)生多糖S88和S7的鞘氨醇單孢菌菌株ATCC31554和ATCC21423分離了d戸G的同源物(Pollock等，美國專利號5，854，034，5,985,623和6,284,516;Pollock,T.J.美國專利號6,709,845)。因此，聚合酶基因的額外拷貝很可能對迪優(yōu)坦分子的分子長度增加有影響。也不能排除c/;w(可能需要與迪優(yōu)坦生物合成基因簇中的其它基因組合以實現(xiàn)觀察到的粘度增加。可能的候選對象是編碼糖轉(zhuǎn)移酶i、n、ni和iv的基因c^w、傘A、傘^c和傘s2，特別是編碼將重復(fù)單元的第一個糖加入脂質(zhì)載體的轉(zhuǎn)移酶I的基因^w5。其它重要的基因可以是傘sD、c/戸C和4^五，它們與基因gwm5和gwmC同源，而后二者在多拷貝質(zhì)粒上擴(kuò)增時顯示能增加黃原膠分子量。實現(xiàn)粘度極大增加可能需要克隆在質(zhì)粒pS8中所有的基因。雖然聯(lián)系某些優(yōu)選實施方式和實踐描述和揭示了本發(fā)明，但絕非要將本發(fā)明局限于那些具體的實施方式，而應(yīng)涵蓋所附權(quán)利要求書及其等價方式的范圍所限定的結(jié)構(gòu)等價物和所有其它的實施方式及改進(jìn)。保藏根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約，以下細(xì)菌菌株于2005年10月21日由美國模式培養(yǎng)物保藏所(弗吉尼亞州，馬納薩斯，大學(xué)大道10801，20110)的專利保藏部門(PatentDepository)保藏含質(zhì)粒pS8的鞘氨醇單孢菌菌株S657。權(quán)利要求1.一種迪優(yōu)坦膠，其顯示固有粘度高于150deciL/g。2.如權(quán)利要求l所述的迪優(yōu)坦膠，其特征在于，其顯示固有粘度高于155deciL/g。3.如權(quán)利要求2所述的迪優(yōu)坦膠，其特征在于，其顯示固有粘度高于160deciL/g。4.一種迪優(yōu)坦膠，其顯示海水3卬m粘度高于35表盤讀數(shù)。5.如權(quán)利要求4所述的迪優(yōu)坦膠，其特征在于，其顯示海水3rpm粘度高于37表盤讀數(shù)。6.如權(quán)利要求5所述的迪優(yōu)坦膠，其特征在于，其顯示海水3rpm粘度高于40表盤讀數(shù)。7.如權(quán)利要求6所述的迪優(yōu)坦膠，其特征在于，其顯示海水3卬m粘度高于42表盤讀數(shù)。8.—種迪優(yōu)坦膠，其顯示海水0.3rpm粘度高于35,000cp。9.如權(quán)利要求8所述的迪優(yōu)坦膠，其特征在于，其顯示海水0.3卬m粘度高于35,000cp。10.如權(quán)利要求9所述的迪優(yōu)坦膠，其特征在于，其顯示海水0.3rpm粘度高于38,000cp。11.如權(quán)利要求IO所述的迪優(yōu)坦膠，其特征在于，其顯示海水0.3rpm粘度高于40,000cp。12.如權(quán)利要求ll所述的迪優(yōu)坦膠，其特征在于，其顯示海水0.3rpm粘度高于41,000cp。13.—種迪優(yōu)坦膠，其顯示在存在聚乙二醇分散劑時低剪切率粘度高于3500cp。14.如權(quán)利要求13所述的迪優(yōu)坦膠，其特征在于，其顯示在存在聚乙二醇分散劑時低剪切率粘度高于3700cp。15.如權(quán)利要求14所述的迪優(yōu)坦膠，其特征在于，其顯示在存在聚乙二醇分散劑時低剪切率粘度高于3900cp。16.如權(quán)利要求15所述的迪優(yōu)坦膠，其特征在于，其顯示在存在聚乙二醇分散劑時低剪切率粘度高于4000cp。17.—種生產(chǎn)迪優(yōu)坦膠的方法，所述方法包括將至少一種迪優(yōu)坦生物合成酶的編碼序列引入產(chǎn)生迪優(yōu)坦的鞘氨醇單孢菌宿主微生物；在發(fā)酵條件下培養(yǎng)該宿主微生物，從而使得該宿主微生物產(chǎn)生至少顯示以下特征之一的迪優(yōu)坦膠-a)固有粘度大于150dL/G;b)海水3rpm粘度高于35表盤讀數(shù)；c)海水0.3rpm粘度高于35,000厘泊；和d)聚乙二醇分散劑存在時的低剪切率粘度高于3500厘泊。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述至少一種迪優(yōu)坦生物合成酶是DpsG聚合酶。19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述至少一種迪優(yōu)坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和葡萄糖-l-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；dTDP-6-脫氧-葡萄糖-3-5-差向異構(gòu)酶；dTDP-D-葡萄糖-4,6-脫水酶；和dTDP-6-脫氧-L-甘露糖-脫氫酶。20.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述至少一種迪優(yōu)坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶IV;葡糖基-異戊二烯基磷酸轉(zhuǎn)移酶I;P-1，4-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶II;和葡糖基轉(zhuǎn)移酶III。21.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述至少一種迪優(yōu)坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和多糖輸出蛋白DpsD、DpsC和DpsE。22.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述至少一種迪優(yōu)坦生物合成酶包括鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶IV;P-1,4-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶II;葡糖基轉(zhuǎn)移酶III;葡萄糖-l-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；葡糖基-異戊二烯基磷酸轉(zhuǎn)移酶I;dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖-3-5-差向異構(gòu)酶；dTDP-D-葡萄糖-4,6-脫水酶；和dTDP-6-脫氧-L-甘露糖-脫氫酶。23.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一種迪優(yōu)坦生物合成酶選自聚合酶；裂合酶；鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶IV;(3-l,4-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶II;葡糖基轉(zhuǎn)移酶III;多糖輸出蛋白；分泌蛋白；葡糖基-異戊二烯基磷酸轉(zhuǎn)移酶I;葡萄糖-l-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖-3-5-差向異構(gòu)酶；dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫水酶；dTDP-6-脫氧-L-甘露糖-脫氫酶和它們的組合。24.—種制備結(jié)冷膠類多糖膠的方法，所述結(jié)冷膠類多糖的平均聚合物長度較長，所述方法包括將至少一種結(jié)冷膠類多糖聚合酶的編碼序列引入產(chǎn)生結(jié)冷膠類多糖的鞘氨醇單孢菌宿主微生物；在發(fā)酵條件下培養(yǎng)該宿主微生物，從而使得該宿主微生物產(chǎn)生的結(jié)冷膠類多糖膠的平均聚合物長度長于引入所述編碼序列前該鞘氨醇微生物產(chǎn)生的。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述結(jié)冷膠類多糖膠是S88。26.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述結(jié)冷膠類多糖膠是S60。27.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述結(jié)冷膠類多糖膠是S657。28.—種分離的核酸分子，其編碼如以下SEQIDNO所示的至少一種迪優(yōu)坦生物合成酶5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43;或編碼與以下SEQIDNO有至少95%相同的酶5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41和43。29.如權(quán)利要求28所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼迪優(yōu)坦聚合酶。30.如權(quán)利要求28所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼迪優(yōu)坦聚合酶和多糖輸出蛋白。31.如權(quán)利要求28所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼迪優(yōu)坦聚合酶和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶IV;葡糖基-異戊二烯基磷酸轉(zhuǎn)移酶I;P-1,4-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶II;和葡糖基轉(zhuǎn)移酶III。32.如權(quán)利要求28所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼迪優(yōu)坦聚合酶和葡萄糖-l-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖畫3-5-差向異構(gòu)酶；dTDP-D-葡萄糖-4,6-脫水酶；和dTDP-6-脫氧-L-甘露糖-脫氫酶。33.如權(quán)利要求28所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼迪優(yōu)坦聚合酶；裂合酶；鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶IV;P-l,4-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶II;葡糖基轉(zhuǎn)移酶III;多糖輸出蛋白；分泌蛋白；葡糖基-異戊二烯基磷酸轉(zhuǎn)移酶I;葡萄糖-l-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖-3-5-差向異構(gòu)酶；dTDP-D-葡萄糖-4,6-脫水酶；和dTDP-6-脫氧-L-甘露糖-脫氫酶。34.如權(quán)利要求28所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含SEQIDNO:l所示核酸序列。全文摘要本發(fā)明描述了迪優(yōu)坦多糖的生產(chǎn)，與以前生產(chǎn)的重復(fù)單元類型相同的多糖相比，所述多糖顯示粘度特性提高。通過產(chǎn)生鞘氨醇單孢菌ATCC53159的衍生物生產(chǎn)這種改進(jìn)的迪優(yōu)坦多糖，所述衍生物含有其中克隆了迪優(yōu)坦多糖的生物合成基因的多拷貝廣譜宿主性質(zhì)粒。所述質(zhì)粒能在宿主鞘氨醇單孢菌菌株內(nèi)產(chǎn)生用于這種多糖合成的多個基因拷貝。以這種方式提供的方法不僅能提高靶迪優(yōu)坦多糖的產(chǎn)量，還能產(chǎn)生物理特性改進(jìn)(上述較高的粘度)的迪優(yōu)坦多糖。已證實這種迪優(yōu)坦多糖在油田應(yīng)用和水泥材料中作為增粘劑可能特別有用。本發(fā)明還包括產(chǎn)生這種改進(jìn)迪優(yōu)坦多糖的創(chuàng)造性方法以及這種方法中產(chǎn)生改進(jìn)迪優(yōu)坦所需的新克隆基因。此外，本發(fā)明包括含有所需DNA序列的工程改造的新鞘氨醇單孢菌菌株。文檔編號C12P19/04GK101558165SQ200680048801公開日2009年10月14日申請日期2006年10月31日優(yōu)先權(quán)日2005年11月1日發(fā)明者R·科爾曼,S·馬茨克,Y·N·帕特爾申請人:Cp凱爾科美國股份有限公司