專利名稱：用于鑒別大量野生型dna背景中多個(gè)dna突變標(biāo)記的方法
用于鑒別大量野生型DNA背景中多個(gè)DNA突變標(biāo)記的方法
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背景技術(shù)：
盡管有成Y象技術(shù)的最新進(jìn)展，癌癥仍然經(jīng)常在轉(zhuǎn)移已經(jīng)發(fā)生之后才被診斷 出來(lái)。作為轉(zhuǎn)移之后檢出的結(jié)果，出現(xiàn)來(lái)自癌癥的不必要的死亡。因此，在轉(zhuǎn) 移之前檢出癌癥具有急迫的社會(huì)優(yōu)先性。
一種用于這種早期檢出的方法是分子檢測(cè)法。使用分子標(biāo)記來(lái)檢測(cè)癌癥的 分子檢測(cè)法是作為一種用于癌癥篩查的具有吸引力的方法而出現(xiàn)的，是因?yàn)樗?能夠允許醫(yī)師通過(guò)分析一滴體液或少量的糞便樣品在最早的階段;險(xiǎn)出癌癥。
DNA突變和異常的基因曱基化是最常見的導(dǎo)致癌癥發(fā)育的DNA變異現(xiàn) 象。例如，在大約50~60%的所有癌癥中，出現(xiàn)基因p53突變。在許多種類的 癌癥中發(fā)現(xiàn)了異常的基因甲基化。因此，DNA突變和曱基化用作癌癥的指示 物或標(biāo)記，因此如果被鑒別出來(lái)，可以用于診斷癌癥。因?yàn)檫@一點(diǎn)，努力開發(fā) 基于DNA的^^測(cè)方法來(lái)篩查癌癥。例如，開發(fā)了基于突變分析幾個(gè)基因的糞 便DNA檢測(cè)法用于篩查結(jié)腸直腸癌(CRC)。
盡管被用作癌癥指示物，當(dāng)用于篩查時(shí)突變分析仍然存在技術(shù)難題。這是 因?yàn)閮蓚€(gè)原因。首先，檢出臨床樣品的突變需要高靈敏度的方法。因?yàn)榕R床試 樣在極其大量的野生型序列中含有少量的突變序列(常常小于1%),只有高靈 敏度檢測(cè)法才能夠使用。此外，癌癥可以由涉及不同基因中的突變累積的不同 途徑引起，因此沒有單個(gè)突變現(xiàn)象可以用作可靠的癌癥指示物。因此，必須使 用一組或一系列基因來(lái)檢出癌癥。例如，糞便DNA檢測(cè)法應(yīng)用k-ras、 p53、 APC和BAT26的突變作為標(biāo)記來(lái)檢測(cè)結(jié)腸直腸癌。此外，基因突變常常發(fā)生 在不同的石威基。例如，APC突變可以發(fā)生在其前1600個(gè)密碼子內(nèi)的任意位置。 因此，臨床檢測(cè)必須能夠在極其大量的野生型DNA中檢測(cè)出大量標(biāo)記的突變狀態(tài)。
其次，癌癥篩查必須是費(fèi)用低廉的，因?yàn)樵撘蛩刈罱K決定了該方法用于醫(yī)
療治療的程度。糞便隱血試驗(yàn)(fecal occult testing )是一個(gè)很好的例子。糞便 隱血試驗(yàn)不是特別靈敏的，但是比其他方法更有成本效益。結(jié)果，糞便隱血試 驗(yàn)成為美國(guó)預(yù)防服務(wù)特別小組推薦用于CRC篩查的方法。事實(shí)上，對(duì)于醫(yī)療 政策制定者和/或保險(xiǎn)公司來(lái)說(shuō)，不可能接受成本高昂的篩查方法。因此，除 了提供合理的靈敏度之外，好的臨床篩查試驗(yàn)必須是費(fèi)用低廉的。
已經(jīng)有許多方法用來(lái)4全測(cè)突變。通常，這些方法可以分為兩組。在一組方 法中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是檢測(cè)系統(tǒng)的組成部分。這些方法依賴于突變 體等位基因的選擇性擴(kuò)增，允許靈敏檢測(cè)極其大量的野生型等位基因中的突變 體等位基因。等位基因特異性擴(kuò)增法(ASA )和突變體富集PCR法(ME-PCR) 是用于該用途的兩個(gè)廣泛使用的方法，這兩個(gè)方法都能夠檢測(cè)出極其大量的野 生型DNA中的突變體DNA，該野生型DNA具有比突變體DNA高100,000 倍的量。不過(guò)，這些方法通過(guò)PCR富集突變體DNA,每一個(gè)PCR反應(yīng)一4殳 檢測(cè)一個(gè)突變。如前所述，必須使用大量突變來(lái)獲得高的篩查靈敏度。因此， 如果使用這組方法進(jìn)行癌癥篩查，將需要許多PCR反應(yīng)，從而增加了篩查成 本。因此，采用這組方法的檢測(cè)法不是費(fèi)用低廉的，因此不適合用于臨床篩查。
在第二組方法中，在通過(guò)PCR將靶序列擴(kuò)增之后來(lái)分析突變?？梢允褂?例如序列測(cè)定法、DHPLC、 DNA微陣列、DGGE和SSCP的技術(shù)來(lái)分析突變。 與第一組方法不同，第二組方法可以在長(zhǎng)的序列跨度內(nèi)檢測(cè)突變。不過(guò)，這些 方法不是足夠靈敏的以檢出大量野生型DNA背景中的突變。因此，雖然這組 方法常常被用于檢測(cè)來(lái)自于突變體DNA的豐度相對(duì)高的切除腫瘤樣品的
豐度較低的臨床試樣例如體液和糞便的DNA突變。因此，由于它們低的靈敏 度，第二組方法也不適合用于臨床篩查。
近來(lái)，已經(jīng)提出了用于突變分析的PCR7連接酶檢測(cè)反應(yīng)(LDR)法，該 方法用DNA微陣列組合了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)/連接酶檢測(cè)反應(yīng)。該方法的特征是 它能夠測(cè)量許多標(biāo)記的突變狀態(tài)，并且已經(jīng)被用于檢測(cè)來(lái)自臨床試樣的DNA 突變。不過(guò)，這種方法具有局限性。雖然對(duì)于單個(gè)突變系統(tǒng)，報(bào)道了高的靈敏 度，但是當(dāng)使用PCR/LDR來(lái)測(cè)量許許多多的突變時(shí)，仍然存在有獲得高靈敏 度的難題。這是因?yàn)閷?duì)于所有的序列來(lái)說(shuō)，LDR不是同等靈敏的，因?yàn)樗?賴于連接酶識(shí)別不同序列的能力。更重要的是，序列之間通過(guò)PCR的擴(kuò)增變 化很大，因此在復(fù)合設(shè)置(multiplexed setting)中一些突變可能不是可檢測(cè)出 的。因此，如果突變的序列在多重PCR中被低效地被擴(kuò)增，將難于檢測(cè)它們。
很清楚地，對(duì)于以靈敏的和費(fèi)用低廉的方式分析大量野生型DNA背景中 的DNA突變標(biāo)記的狀態(tài)，在本領(lǐng)域有迫切的需求。
如前所述，異常的基因曱基化是一種常常導(dǎo)致癌癥的DNA變異現(xiàn)象。甲 基化是指將曱基(-CH3)生化添加到生物分子中。在基因的5'調(diào)節(jié)區(qū)上的CpG 二核苷酸的異常曱基化是常見的導(dǎo)致基因沉默的現(xiàn)象。作為CpG島超甲基化 的結(jié)果，啟動(dòng)子的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)可以被改變，從而阻止了正常的與轉(zhuǎn)錄機(jī)制之間 的相互作用?，F(xiàn)在人們清楚，在癌癥中異常的曱基化是普遍的現(xiàn)象。如果這發(fā) 生在對(duì)生長(zhǎng)抑制關(guān)鍵的基因中，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄沉默可以促進(jìn)腫瘤發(fā)育。因此， 與突變一樣，啟動(dòng)子CpG島超曱基化是使腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)錄失活的常見機(jī)理。 曱基化分析具有相當(dāng)大的重要性，因?yàn)闀趸治霾粌H獲得了對(duì)癌癥的了解， 而且這種分析還導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)治療和診斷生物標(biāo)記。近來(lái)，監(jiān)測(cè)DNA甲基化的整 體變化已經(jīng)被用于癌癥的分子分類。最近，人們發(fā)現(xiàn)，甲基化與癌癥治療相關(guān)。 因此，還可以使用曱基化標(biāo)記來(lái)分類和預(yù)測(cè)癌癥的類型和階段，癌癥的治療結(jié) 果和成活率。
曱基化分析對(duì)于表征DNA曱基化是關(guān)鍵的。不過(guò)，盡管其非常重要，曱 基化分析仍然存在技術(shù)難題，尤其是分析生物樣品時(shí)。這是由于兩個(gè)原因。第 一個(gè)原因是靈壽丈度。用于分析臨床樣品的方法必須是靈敏的，因?yàn)樯飿悠肥?異質(zhì)的，常常在大量未甲基化序列中含有少量的曱基化序列。例如，組織帶檢 物例如植入石蠟的樣品含有低達(dá)1%的變異DNA，而且在其它臨床生物樣品例 如體液、血液、尿和糞便中它們的豐度甚至更低。因此，只有高靈敏度的分析 法能夠顯示出大量未曱基化DNA中的甲基化。
涉及曱基化分析是技術(shù)難題的第二個(gè)原因是倍增能力(multiplexing capability)。癌癥由涉及許多基因的曱基化累積的不同途徑產(chǎn)生，并且沒有單 個(gè)甲基化現(xiàn)象可以提供用于癌癥分析的準(zhǔn)確的指示物。因此，必須描述大量基
因的分布圖來(lái)表征與癌癥相關(guān)的曱基化。因此，用于曱基化分析的技術(shù)還應(yīng)該
具有高階倍增能力。此外，在臨床樣品中變異的DNA分子的數(shù)量是有限的。 對(duì)于曱基化分析來(lái)說(shuō)這尤其是一個(gè)問題，因?yàn)樵趤喠蛩釟潲}處理之后僅僅能夠 回收10-20% DNA分子。因此，對(duì)于甲基化分析來(lái)說(shuō)倍增能力是必需的，因?yàn)?在臨床生物樣品中沒有足夠量的變異DNA分子來(lái)允許一次分析一個(gè)基因。
曱基化分析能夠從整體上描繪出曱基化分布圖，鑒定一組CpG位點(diǎn)或基 因上的曱基化模式，以及測(cè)定單個(gè)CpG位點(diǎn)上的甲基化水平。曱基化限制性 酶消化法是一種用于曱基化分析的好方法，但是大多數(shù)目前使用的方法是基于 亞硫酸氫鹽處理，該亞硫酸氬鹽處理能夠?qū)奏まD(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化?嘧啶殘基保持不變。然后用特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增處理過(guò)的DNA以獲得所 有尿嘧咬殘基都被轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵偈揉さ钠?。作為由亞碌^酸氫鹽處理所產(chǎn)生的曱 基化和未曱基化DNA序列中的差別的結(jié)果，可以使用常規(guī)的突變分析法來(lái)測(cè) 定CpG位點(diǎn)上的甲基化狀態(tài)。因此，在亞硫酸氫鹽處理之后通過(guò)突變分析法 可以測(cè)定CpG位點(diǎn)的曱基化狀態(tài)。
可以將現(xiàn)行的用于曱基化分析的基于亞硫酸氫鹽的方法分為三種方法。第 一種方法是基于亞硫酸氫鹽的序列測(cè)定法，該方法能夠描繪出基因啟動(dòng)子內(nèi)部 的甲基化胞嘧咬殘基。其優(yōu)點(diǎn)是它鑒定出基因啟動(dòng)子內(nèi)部的每一個(gè)曱基化胞嘧 啶殘基，但是其缺點(diǎn)是靈敏度低以及缺乏倍增能力。第二種方法用DNA微陣 列組合了亞硫酸氳鹽法-PCR以在靶序列內(nèi)部使曱基化等位基因和未曱基化等 位基因區(qū)別。這種方法允許平行測(cè)定在許多目標(biāo)基因內(nèi)部的許多CpG位點(diǎn)上 的甲基化狀態(tài)。但是，它不是足夠靈敏的，以使測(cè)定大量未甲基化DNA背景 中的少量曱基化DNA。第三種方法是曱基化特異性PCR (MSP)以及它的許 多變化例如MethyLight。這種方法是高度靈敏的，能夠4全出10,000個(gè)拷貝的 未曱基化等位基因中的一個(gè)曱基化等位基因。此外，基于實(shí)時(shí)的MSP可以定 量曱基化DNA的豐度。但是，這種方法通常一次分析一個(gè)基因的曱基化狀態(tài)， 具有有限的倍增能力。此外，這種方法測(cè)定僅在幾個(gè)臨近CpG位點(diǎn)上的甲基 化狀態(tài)。很清楚地，這些方法或者是不足夠靈敏的，或者不具有倍增能力，或 者同時(shí)具有兩個(gè)缺點(diǎn)。
最近，開發(fā)出了兩種基于連接作用的方法用于曱基化分析。在第一種方法
中，PCR/LDR法被用于甲基化分析。這種方法與先前提到的為突變分析而開 發(fā)的技術(shù)類似。簡(jiǎn)言之，它首先利用多重PCR來(lái)擴(kuò)增多個(gè)靶DNA序列，接著 進(jìn)行連接反應(yīng)。然后使用微陣列分析連接產(chǎn)物來(lái)測(cè)定每一個(gè)靶CpG位點(diǎn)上的 曱基化狀態(tài)。在第二種方法中，使用基因分型體系來(lái)進(jìn)行曱基化檢測(cè)。與第一 種方法不同，第二種方法應(yīng)用連接作用來(lái)生產(chǎn)曱基化和未曱基化的等位基因， 然后接著進(jìn)行多重PCR以擴(kuò)增含有每一個(gè)靶CpG位點(diǎn)的序列。使用微陣列分 析每一個(gè)CgG位點(diǎn)上的曱基化狀態(tài)?；谶B接作用的方法可以檢測(cè)許多目標(biāo) 基因的多個(gè)CgG位點(diǎn)上的甲基化狀態(tài)。但是，它們的檢出靈敏度仍然相對(duì)較 低，因此通常被用于分析含有大于等于10。/。的變異DNA的樣品。這種靈敏度 無(wú)疑不是足夠高，以使檢出許多類型的臨床生物樣品中低豐度的曱基化DNA, 尤其是變異DNA的豐度小于1%的樣品。
很清楚地，對(duì)于以靈敏的和費(fèi)用低廉的方式分析大量野生型DNA背景中 許多目標(biāo)基因的大量CpG位點(diǎn)上的曱基化狀態(tài)，在本領(lǐng)域有迫切的需求。
發(fā)明內(nèi)容
本示例性實(shí)施方式涉及通過(guò)DNA分析收集自患者的臨床樣品進(jìn)行癌癥篩 查。具體地，本發(fā)明涉及同時(shí)測(cè)定大量野生型DNA背景中多個(gè)DNA標(biāo)記的 變異狀態(tài)。
在第一方面，本發(fā)明提供了 一種用于測(cè)量大量野生型DNA背景中多個(gè)突 變標(biāo)記的方法。該方法包括提供含有突變體DNA和野生型DNA的樣品。 所述突變體DNA含有突變。所述方法還包括通過(guò)第一 PCR擴(kuò)增樣品以生產(chǎn)含 有突變位點(diǎn)的DNA片段。所述方法還包括通過(guò)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)突變體特異性 富集循環(huán)富集含有突變的突變體DNA片段，從而形成富集體系。所述方法還 包括通過(guò)第二 PCR擴(kuò)增該富集體系以生產(chǎn)足夠量的突變體DNA用于檢測(cè)。以 及，所述方法包括測(cè)量靶DNA樣品中突變位點(diǎn)的狀態(tài)。
在另 一方面，本發(fā)明提供了 一種用于生產(chǎn)足夠純的突變體DNA片段的方 法，所述突變體DNA片段用于測(cè)定大量野生型DNA背景中多個(gè)DNA突變位 點(diǎn)的突變狀態(tài)。所述方法包括提供含有突變體DNA和野生型DNA的DNA 樣品。所述方法還包括通過(guò)多重PCR擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)的DNA序列，從而生 產(chǎn)擴(kuò)增子。以及，所述方法包括從PCR的擴(kuò)增子中富集具有突變的突變體DNA 片段。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)量大量未曱基化DNA背景中大量 CpG位點(diǎn)的曱基化狀態(tài)的方法。所述方法包括提供含有曱基化DNA和未曱基 化DNA的樣品。所述方法還包括處理樣品以將未曱基化DNA的胞嘧咬基團(tuán) 轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏せ鶊F(tuán)，而不改變CpG位點(diǎn)上的曱基化胞嘧啶。所述方法還包括 用引物通過(guò)第一 PCR擴(kuò)增該處理過(guò)的樣品，從而獲得所有的尿嘧啶基團(tuán)都轉(zhuǎn) 變?yōu)樾叵汆滓Щ鶊F(tuán)的DNA片段。所述方法還包括通過(guò)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)曱基化 特異性富集循環(huán)富集曱基化DNA,從而形成富集體系。所述方法還包括通過(guò) 第二PCR擴(kuò)增所述富集體系以生產(chǎn)足夠量的甲基化DNA用于檢測(cè)。以及，所 述方法還包括測(cè)量CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。
在另 一方面，本發(fā)明提供了 一種用于生產(chǎn)足夠純的曱基化DNA片段的方 法，所述甲基化DNA片段用于測(cè)定大量未甲基化DNA背景中多個(gè)DNA CpG 位點(diǎn)上的曱基化狀態(tài)。所述方法包括提供含有曱基化DNA和未曱基化DNA 的DNA樣品。所述方法還包括將DNA樣品進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。所述方法 還包括通過(guò)多重PCR擴(kuò)增處理后的DNA,從而生產(chǎn)擴(kuò)增子。以及，所述方法 包括從PCR的擴(kuò)增子中富集含有曱基化CpG位點(diǎn)的曱基化DNA片段。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于除去由多重PCR產(chǎn)生的引物-引物相 互作用產(chǎn)物的方法。所述方法包括通過(guò)多重PCR擴(kuò)增靶DNA序列，以及通過(guò) 序列特異性俘獲除去引物-引物相互作用產(chǎn)物來(lái)純化多重PCR的擴(kuò)增靶序列。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于使多級(jí)多重PCR更強(qiáng)大的方法。所 述方法包括提供含有靶序列的樣品。所述方法還包括通過(guò)第一多重PCR擴(kuò)增 樣品來(lái)形成含有引物-引物相互作用產(chǎn)物的第一擴(kuò)增樣品。所述方法還包括除 去至少一部分引物-引物相互作用產(chǎn)物。以及，所述方法在除去引物-引物相互 作用產(chǎn)物之后，通過(guò)第二PCR形成第二擴(kuò)增樣品。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于平衡多個(gè)PCR產(chǎn)物產(chǎn)率的方法，其 包括提供含有將要進(jìn)行擴(kuò)增的耙序列的DNA樣品。所述方法還包括通過(guò)第一 PCR擴(kuò)增靶DNA序列。所述方法還包括平衡由第一 PCR擴(kuò)增出的耙序列的 量。以及，所述方法包括通過(guò)第二PCR擴(kuò)增平衡過(guò)的靶DNA序列。
在另 一方面，本發(fā)明提供了 一種用于平衡由多級(jí)多重PCR生產(chǎn)的PCR產(chǎn)
物產(chǎn)率的方法。所述方法包括提供含有第一耙序列和第二靶序列得樣品。所述 方法還包括鑒別第一靶序列和第二耙序列的相對(duì)擴(kuò)增效率。以及，所述方法包 括將適合于以第 一靶序列為靶點(diǎn)的第 一探針和適合于以第二靶序列為靶點(diǎn)的 第二探針加入到樣品中。第 一探針與第二探針的摩爾比基于第 一和第二把序列
的相對(duì)擴(kuò)增效率。
圖1是說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的方法的示意圖2是說(shuō)明涉及使用兩輪PCR的多重PCR方法的示意圖3顯示了用不同比例的正常竟?fàn)幪结樑c突變體探針富集序列的結(jié)果，該 序列含有在k-ras的第12位密碼子的第一個(gè)^5威基處的G —T突變(A)無(wú)正常 竟?fàn)幪结槪?B)突變體探針超過(guò)正常竟?fàn)幪结?.5倍；(C)突變體探針超過(guò)正 常竟?fàn)庢A針7.5倍；(D)突變體探針超過(guò)正常竟?fàn)幪结?5倍。樣品含有1% 的突變體DNA，被富集一次。將突變體探針固定為2.5pmol;
圖4顯示了使用以下用量的突變體探針富集序列的結(jié)果，該序列含有在 k-ras的第12位密碼子的第一個(gè)堿基處的G —T突變(A )1 pmol; (B )0.2 pmol 和(C) 0,1 pmol。樣品含有1。/。的突變體DNA,僅被富集一次。將正常探針 與突變體探針的比例固定為7.5;
圖5顯示了分別使用一個(gè)(A)、兩個(gè)(B)和三個(gè)(C)富集循環(huán)富集序 列的結(jié)果，該序列含有在APC的第1450位密碼子的第一個(gè)堿基處的C —T突 變。該樣品分別含有1% (A)、 0.1% (B)和0.01% (C)突變DNA;
圖6分別顯示了富集98bp (A)、 278bp (B)和575bp (C)的PCR產(chǎn)物 的結(jié)果，所有的PCR產(chǎn)物含有相同的在APC的第1450位密碼子的第一個(gè)堿 基處的C —T突變。樣品含有1。/。的突變體DNA,僅被富集一次；
圖7顯示了測(cè)量6個(gè)DNA樣品中突變狀態(tài)的結(jié)果。每一樣品含有0.1%的 突變體DNA并通過(guò)兩個(gè)循環(huán)的雜交得到富集。樣品(A)含有在k-ras的第 12位密碼子的第一個(gè)堿基處的G —T突變；樣品(B)含有在p53的第190位 密碼子的第二個(gè)堿基處的C — T突變；樣品(C)含有在p53的第248位密碼 子的第一個(gè)堿基處的C —T突變；樣品(D)含有在p53的第267位密碼子的 第二個(gè)堿基處的G —C突變；樣品(E)含有在p53的第274位密碼子的第一
個(gè)堿基處的G —T突變；樣品(F)含有在APC的第1450位密碼子的第二個(gè) 堿基處的C —T突變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從每一個(gè)樣品都鑒定出正確的突變，并且沒 有觀察到假陽(yáng)性鑒定；
圖8是顯示根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式方法的示意圖； 圖9是用于MMPA分析法的竟?fàn)幮噪s交策略的原理的示意圖； 圖IO顯示了在不同的條件下用MMPA法檢測(cè)曱基化DNA的結(jié)果(a) 不使用甲基化特異性富集>^測(cè)含有0.1%甲基化DNA的樣品；(b)使用曱基化 特異性富集檢測(cè)含有0.1%曱基化DNA的樣品；(c )使用曱基化特異性富集檢 測(cè)含有0.01%甲基化DNA的樣品；以及(d)使用甲基化特異性富集檢測(cè)不含 有甲基化DNA的樣品；
圖ll顯示了由以下方法生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物的DNA片段分析譜圖(a)在 兩輪PCR之間沒有序列特異性提取步驟；以及(b)有序列特異性提取步驟。 發(fā)明詳述
在本文中所用的術(shù)語(yǔ)"野生型"是指當(dāng)從天然源分離時(shí)具有該基因特征的 基因。野生型基因是在人群中最常見的，從而被指定為基因的"正常型，，或"野 生型"的基因。與之相反，術(shù)語(yǔ)"修飾的"或"突變體"是指當(dāng)與野生型基因 相比時(shí)，顯示出序列修飾(即，改變的特征)的基因。
在本文中所用的術(shù)語(yǔ)"等位基因"是指僅僅一個(gè)或幾個(gè)堿基不同的兩個(gè)序列。
術(shù)語(yǔ)"延伸引物"或"引物"是指與耙序列互補(bǔ)的多核苷酸。延伸引物能 夠使耙序列退火，并且可以作為用于多核苷酸合成的引物，使用野生型或突變 體多核苷酸或者兩者作為模板。
術(shù)語(yǔ)"探針，，是指與把序列互補(bǔ)并且能夠優(yōu)先結(jié)合到把序列的多核香酸。 如本文中所用的，"雜交，，是指由于互補(bǔ)的堿基配對(duì)，通過(guò)核酸鏈如單鏈 形成復(fù)合結(jié)構(gòu)，尤其是二重結(jié)構(gòu)。雜交可以發(fā)生在完全互補(bǔ)的核酸鏈之間，或 者在含有少量不匹配區(qū)域的核酸鏈之間。雜交條件應(yīng)該是足夠嚴(yán)格的，以使具 有在等位基因之間的雜交強(qiáng)度上的差異性。探針優(yōu)先與完全互補(bǔ)的靶序列雜交
的雜交條件在本領(lǐng)域是公知的，例如如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè) (Molecular Cloning - A Laboratory Manual),第三版(Third Edition),冷泉港
出版社(Cold Spring Harbor Press ) ， N.Y., 2001所記載的，通過(guò)引用并入本文。 嚴(yán)格條件是序列依賴型的，在不同的環(huán)境下是不同的。
"PCR擴(kuò)增"或者簡(jiǎn)單的"PCR"通常涉及使用核酸序列作為模板用于生 產(chǎn)大量的該序列的互補(bǔ)鏈。可以使該模板與具有與該模板序列的一部分互補(bǔ)的 序列的引物雜交，并使之與含有dNTP和聚合酶的適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)混合物接觸。引 物被聚合酶延長(zhǎng)，產(chǎn)生與該初始模板互補(bǔ)的核酸。為了擴(kuò)增雙鏈核酸分子的兩 條鏈，可以使用兩個(gè)引物，每一個(gè)引物具有與一條核酸鏈的一部分互補(bǔ)的序歹'J。 例如通過(guò)加熱使核酸分子鏈變性，重復(fù)該操作，此時(shí)前面步驟新合成出的鏈作 為后續(xù)步驟的模板。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增程序可以涉及幾個(gè)到很多個(gè) 變性、雜交和延長(zhǎng)反應(yīng)循環(huán)，以生產(chǎn)足夠量的所需要的核酸。
"多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)'，是PCR的變形，在該P(yáng)CR中，在相同 的反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或兩個(gè)以上的序列或基因座(loci )。
"DNA微陣列"(也常常被稱為DNA芯片或DNA陣列)是將多個(gè)微觀 DNA點(diǎn)粘附于固體表面例如玻璃、塑料或硅片上，形成分析多個(gè)核酸靶的陣 列。
部分人基因組被稱為"CpG島"，因?yàn)楫?dāng)與它們的周邊區(qū)域比較時(shí)，這些 區(qū)域富含CpG 二核苷酸(即緊接著胞嘧啶脫氧核糖磷酸的是鳥嘌呤脫氧核糖 磷酸)。CpG位點(diǎn)上的曱基化胞嘧啶通過(guò)亞硫酸氫鹽處理時(shí)保持不變，而未甲 基化的胞嘧咬轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?。然后可以使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增該 DNA,使得曱基化胞嘧啶被復(fù)制為胞嘧啶，而尿嘧啶被復(fù)制為胸腺嘧啶。因 此，在特定CpG位點(diǎn)上檢測(cè)出胞嘧啶顯示了甲基化，而在正常地含有胞嘧啶 的CpG位點(diǎn)上出現(xiàn)胸腺嘧啶顯示了在該CpG位點(diǎn)上存在未甲基化的胞嘧啶。 結(jié)果，在使樣品進(jìn)行亞^5克酸氫鹽處理之后使用突變分析方法可以實(shí)現(xiàn)測(cè)定CpG 位點(diǎn)上的甲基化狀態(tài)。
本發(fā)明提供了一種在本文中被稱為PEPD (PCR-富集-PCR-檢測(cè))的方法， 該方法以靈敏的和費(fèi)用低廉的方式同時(shí)測(cè)定大量DNA突變標(biāo)記的狀態(tài)。圖1 顯示了PEPD的原理，其一般包括四個(gè)主要步驟。第一步，通過(guò)第一多重PCR 擴(kuò)增含有突變體和野生型DNA的DNA樣品以產(chǎn)生足夠量的DNA片段，該 DNA片段含有用于富集標(biāo)靶的所有突變位點(diǎn)。第二步，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)突變
體特異性富集循環(huán)使突變體DNA富集。這可以通過(guò)減少野生型DNA或選擇 性俘獲突變體DNA或者兩者的結(jié)合來(lái)進(jìn)行。例如，PCR可以與生物素標(biāo)記的 突變體特異性探針雜交以選擇性俘獲突變體序列，接著減少野生型序列。在從 探針中分離之后，可以使富集的DNA再富集，直到得到滿意的富集。第三步， 然后通過(guò)第二多重PCR擴(kuò)增富集的DNA分子，以產(chǎn)生足夠量的突變體DNA 用于檢測(cè)。第四步，使用例如DNA微陣列的方法來(lái)測(cè)定每一個(gè)DNA標(biāo)記的 突變狀態(tài)。
有幾個(gè)方面有助于提高PEPD的能力來(lái)測(cè)定大量野生型DNA中許許多多 DNA突變標(biāo)i己的狀態(tài)。
第一，可以在PEPD中進(jìn)行多個(gè)富集循環(huán)，直到獲得滿意的富集，從而使 通過(guò)單個(gè)陣列^r測(cè)各種各樣的突變成為可能。例如，為了在具有比目的突變體 DNA的量高1000倍的正常DNA中檢出突變體DNA,如果一個(gè)循環(huán)富集一些 突變體等位基因IOOO倍，而對(duì)其他突變體等位基因只有10倍，那么一個(gè)富集 循環(huán)將會(huì)遺漏一些突變。相反地，如果進(jìn)行三個(gè)富集循環(huán)，通過(guò)使用相同的陣 列可以檢出所有的突變。
根據(jù)PEPD的優(yōu)選方法，突變體特異性富集技術(shù)或循環(huán)的循環(huán)數(shù)可以根據(jù) 特定的應(yīng)用和系統(tǒng)參數(shù)進(jìn)行改變。不過(guò)， 一般來(lái)說(shuō)，循環(huán)數(shù)范圍為1至5。優(yōu) 選地，循環(huán)it范圍為l至3。
第二，在PEPD中在兩輪PCR之間進(jìn)行富集。這對(duì)于PEPD的成功來(lái)說(shuō) 是關(guān)鍵的。在多個(gè)富集循環(huán)之后回收的DNA的量可能較低，因?yàn)樾枰獓?yán)格條 件來(lái)獲得所要求的富集。例如，如果對(duì)于每一個(gè)循環(huán)DNA回收率為1%,在 三個(gè)循環(huán)之后，總回收率將是0.0001%。因此，如果在PCR之前進(jìn)行富集， 將不能夠從突變體DNA的量較低的臨床樣品中回收甚至一個(gè)突變體DNA拷 貝。這就是不能使用多個(gè)富集循環(huán)直接從初始臨床樣品中富集突變體DNA的 原因。相反地，在PCR之后，可以回收足夠量的突變體DNA。此外，如果沒 有第二PCR就進(jìn)刊"險(xiǎn)測(cè)，在富集之后，將沒有剩余足夠量的突變體DNA用于 檢測(cè)。相反地，在富集之后進(jìn)行另一擴(kuò)增可以確保有足夠量的突變體DNA用 于檢測(cè)。如接下來(lái)所描述的，在多重設(shè)置中，在兩輪PCR之間的富集還使突 變體的擴(kuò)增與^r測(cè)更強(qiáng)大和特異。
第三，癌癥篩查采用大量的DNA標(biāo)記，因此強(qiáng)大的多重PCR對(duì)于多重分 析法來(lái)說(shuō)是必須的。進(jìn)行兩輪PCR的多重PCR策略是已知的。第一輪PCR 引物具有靶特異性部分和通用尾部。靶特異性部分允許擴(kuò)增靶序列，而尾部導(dǎo) 入用于第二 PCR的序列，該第二 PCR使用與在第一 PCR中所導(dǎo)入的尾部互 補(bǔ)的引物。PEPD還可以使用該策略來(lái)擴(kuò)增多個(gè)序列。伴隨該策略的主要問題 是由于在第一 PCR過(guò)程中形成引物-引物相互作用產(chǎn)物，在該多重設(shè)置中第 二PCR經(jīng)常不能充分地?cái)U(kuò)增一些序列。不過(guò)，根據(jù)本發(fā)明，在PEPD中可以 使該問題最小化，因?yàn)樽鳛楦患慕Y(jié)果，也除去了引物-引物相互作用產(chǎn)物， 這使第二PCR更強(qiáng)大。實(shí)際上，可以將該富集方法延伸以提供提高多重PCR 的擴(kuò)增的一般方法。
第四，多重PCR的擴(kuò)增隨著序列的變化而變化。也就是說(shuō)，在多重PCR 中一些序列會(huì)被低效地?cái)U(kuò)增。這已經(jīng)是伴隨現(xiàn)有方法的問題，因?yàn)楸贿@些低效 擴(kuò)增的序列所含有的突變將會(huì)被遺漏，這導(dǎo)致假陰性。不過(guò)，該問題被PEPD 最小化了 。如圖1和2所示，在富集之后突變體DNA成為主要部分。第二 PCR 的擴(kuò)增依賴于每一序列的拷貝數(shù)。結(jié)果，在第二PCR之后，突變體序列將是 占優(yōu)勢(shì)的，即使當(dāng)它們?cè)诘谝?PCR被低效地?cái)U(kuò)增。因此，富集確保了足夠的 突變體DNA擴(kuò)增。因?yàn)橥蛔兎治鲆髢H僅檢出突變體DNA， PEPD使突變分 析在多重設(shè)置中更強(qiáng)大(robust )。
PEPD法是簡(jiǎn)單的，但是也是強(qiáng)大的，因此可以成為通用的突變檢測(cè)技術(shù) 平臺(tái)。上皮衍生癌構(gòu)成大多數(shù)癌癥，可以取出例如血和其他體液的樣品，技術(shù) 人員可以尋找突變體DNA來(lái)檢測(cè)癌癥。例如，基于PEPD平臺(tái)，技術(shù)人員可 以容易地開發(fā)出分析法以在取自支氣管肺泡灌洗液(BAL)的DNA中檢測(cè)與 肺癌相關(guān)的突變的狀態(tài)，用來(lái)篩查肺癌。
可以以幾種不同程序來(lái)進(jìn)行PEPD策略中的富集。可以例如通過(guò)突變特異 性雜交和提取程序來(lái)進(jìn)行富集，在該突變特異性雜交和提取程序中，在雜交條 件下，使多個(gè)突變體特異性探針與PCR產(chǎn)物接觸，該P(yáng)CR產(chǎn)物即通常是目標(biāo) DNA片段的擴(kuò)增子。每一個(gè)突變體特異性探針優(yōu)先與突變體序列形成雜交物。 優(yōu)選使突變體特異性探針連接到能夠與第二分子結(jié)合的第一結(jié)合分子上，該第 二分子又優(yōu)選連接到固體載體上。雜交之后，雜交物可以被含有第二結(jié)合分子
的固體載體俘獲。
也可以通過(guò)竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s交和提取程序來(lái)進(jìn)行PEPD策略中的富
集。在雜交條件下，使多個(gè)突變體特異性探針和正常竟?fàn)幪结樑cPCR產(chǎn)物接 觸，或者相反暴露于PCR產(chǎn)物中，PCR產(chǎn)物即擴(kuò)增子例如目標(biāo)DNA片段。 每一個(gè)突變體特異性探針優(yōu)先與突變體序列(例如含于DNA片段中的)形成 雜交物，而其對(duì)應(yīng)的正常竟?fàn)幪结槂?yōu)先與對(duì)應(yīng)的野生型序列形成雜交物。還將 所述突變體特異性探針連接到第一結(jié)合分子上，所述第一結(jié)合分子能夠與連接 到固體載體上的第二結(jié)合分子相結(jié)合。雜交之后，雜交物可以被含有第二結(jié)合 分子的固體載體所俘獲。優(yōu)選地，每一種突變體特異性探針與其對(duì)應(yīng)的正常竟 爭(zhēng)探針的摩爾比為約0.02:1至約10:1。
合適的結(jié)合分子的例子包括，但不限于生物素、鏈霉親和素以及它們的組合。
在突變特異性雜交和提取富集策略，以及竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s交和提取富 集策略兩者中，可以通過(guò)以下步驟來(lái)富集目標(biāo)DNA片段在固體載體上提取， 從該固體載體上釋放所述片段，然后使該系統(tǒng)和剩余DNA片段進(jìn)行另外的富 集循環(huán)。
先前提到的突變體特異性探針和對(duì)應(yīng)的正常竟?fàn)幪结樋梢允沁m宜特定應(yīng) 用的任意探針。這些探針的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于寡核苷酸、肽核酸、鎖核 酸(LNA)以及它們的組合。LNA是一類雙環(huán)核酸，其中用亞甲基單元將核 糖核香連接在2，-氧和4，-碳原子之間。鎖核酸(LNA)作為一類新的構(gòu)型嚴(yán)格 的寡核苷酸類似物最先為Wengel及其同事于1998年報(bào)道。
如上所述，在某些應(yīng)用中，第一或初始PCR可以是多元的(multiplex) 或多重(multiplexed) PCR。在該策略中，使用兩對(duì)或兩對(duì)以上的引物。每一 對(duì)引物包括一個(gè)正向引物和反向引物。每一對(duì)引物用于擴(kuò)增含有一個(gè)或多個(gè)突 變位點(diǎn)的序列。每一個(gè)引物優(yōu)選含有靶特異部分和通用尾部。該靶特異部分側(cè) 接于目標(biāo)序列，或相反使其與目標(biāo)序列連接以允許擴(kuò)增該序列。對(duì)于所有的正 向和反向引物，通用尾部的序列優(yōu)選是相同的。優(yōu)選地，該通用尾不能夠與人 基因組序列相結(jié)合。優(yōu)選地，正向引物和反向引物的通用尾的序列可以相同或 不相同。
此外，在應(yīng)用第二PCR的程序中，優(yōu)選的是，當(dāng)?shù)谝籔CR的正向和反向 引物的通用尾相同時(shí)，第二 PCR使用一個(gè)通用引物。以及，優(yōu)選的是，當(dāng)正 向和反向引物的通用尾不相同時(shí)， 一個(gè)通用引物與正向引物的通用尾配對(duì)，另 一個(gè)通用引物與反向引物的通用尾配對(duì)。通常，在使用第二 PCR的程序中， 使含有突變的富集突變體DNA片段與通用引物接觸，或相反使其暴露于通用 引物中。使通用引物與正向和反向引物的通用尾雜交以擴(kuò)增富集的DNA片段。
本發(fā)明也提供了一種用于生產(chǎn)足夠純的突變體DNA片段的方法，所述突 變體DNA片段是用于測(cè)定大量野生型DNA背景中多個(gè)DNA突變位點(diǎn)的突變 狀態(tài)。該方法包括提供含有突變體DNA和野生型DNA的DNA樣品。所述方 法還包括擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)的DNA序列，從而生產(chǎn)擴(kuò)增子。優(yōu)選地，通過(guò)多 重PCR進(jìn)行該擴(kuò)增操作。所述方法還包括從PCR的擴(kuò)增子中富集具有突變的 突變體DNA片段。如前所述，多重PCR使用兩對(duì)或兩對(duì)以上的PCR引物， 其中使每一對(duì)引物與含有一個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn)的序列雜交用于擴(kuò)增該序列。以 及，從擴(kuò)增產(chǎn)物即擴(kuò)增子中富集含有突變的突變體DNA片段，可以通過(guò)突變 特異性雜交和提取技術(shù)，或者竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s交和提取技術(shù)來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明也提供了一種在本文被稱為MMPA (多重曱基化剖析陣列)的用 于曱基化分析的方法。具體地，該方法允許使用單陣列來(lái)同時(shí)測(cè)定在非常大量 的未曱基化DNA背景中多個(gè)CpG位點(diǎn)上的甲基化狀態(tài)。圖9顯示了 MMPA 的原理，其一般包括5個(gè)步驟。第一步，使用亞硫酸氫鹽反應(yīng)來(lái)對(duì)同時(shí)含有曱 基化和未曱基化DNA的樣品進(jìn)行處理，該亞硫酸氫鹽反應(yīng)將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟?嘧啶而甲基化胞嘧啶殘基抵抗這種轉(zhuǎn)變。第二步，用特異性引物通過(guò)第一PCR 擴(kuò)增處理后的DNA以獲得片段，在該片段中所有的尿嘧啶殘基都被轉(zhuǎn)變?yōu)樾?腺嘧啶，而CpG位點(diǎn)上的曱基化胞嘧啶殘基保持不變。該P(yáng)CR將生產(chǎn)出足夠 量的DNA用于富集。第三步，使用一個(gè)或多個(gè)曱基化特異性富集技術(shù)的循環(huán) 來(lái)富集甲基化DNA。這些技術(shù)的實(shí)例包括減少未曱基化DNA,選擇性俘獲曱 基化DNA,或者它們的組合。第四步，然后通過(guò)第二PCR來(lái)擴(kuò)增富集的DNA 分子以生產(chǎn)出足夠量的DNA用于檢測(cè)。以及，第五步，接著測(cè)定在每一個(gè)靶 CpG位點(diǎn)上的曱基化狀態(tài)。
有幾個(gè)方面與MMPA相關(guān)，從而使其可以同時(shí)研究在大量過(guò)量的未曱基
化DNA中多個(gè)CpG位點(diǎn)上的曱基化狀態(tài)。
第一，MMPA采用竟?fàn)幮噪s交來(lái)提高雜交的特異性，其中由第一輪PCR 生產(chǎn)的DNA片段同時(shí)與針對(duì)所選的曱基化等位基因的甲基化特異性探針和與 對(duì)應(yīng)的未曱基化等位基因互補(bǔ)的竟?fàn)幪结樳M(jìn)行雜交。因?yàn)闀趸禺愋蕴结樖?生物素化的，而竟?fàn)幪结槃t沒有被生物素化，因此只有曱基化特異性探針/靶 雜交物可以被例如鏈霉親和素包被珠所俘獲。然后將所俘獲的雜交物洗脫，得 到用于曱基化等位基因富集的單鏈靶?？梢詫⑺患腄NA再次富集直到所 有的甲基化等位基因比對(duì)應(yīng)的未甲基化等位基因含量更高。圖9顯示了用于 MMPA實(shí)施方式中的竟?fàn)幮噪s交的原理。
第二，雜交特異性可以隨著序列而極大地變化，從而導(dǎo)致富集的極大的改 變。但是，雜交是一種物理過(guò)程，因此不會(huì)人為地產(chǎn)生曱基化DNA。因此， 在MMPA中使用多個(gè)雜交循環(huán)以能夠獲得每一個(gè)耙序列的令人滿意的富集。 例如，為了檢測(cè)在過(guò)量未曱基化DNA中的曱基化，其中所述未曱基化DNA 具有比目標(biāo)曱基化物質(zhì)高1,000倍的量，并且一個(gè)雜交循環(huán)富集一些序列l(wèi)，OOO 倍，而對(duì)于其他序列只有20倍，可以使用三個(gè)雜交循環(huán)以確保所有的甲基化 等位基因都被充分地富集。這就是一次分析能夠同時(shí)在大量未曱基化DNA背 景中顯示出很多CpG位點(diǎn)上的甲基化狀態(tài)的原因。
根據(jù)MMPA的優(yōu)選方法，曱基化特異性富集技術(shù)或循環(huán)的數(shù)量可以隨著 特定應(yīng)用和系統(tǒng)參數(shù)而變化。不過(guò)， 一般來(lái)說(shuō)，循環(huán)數(shù)范圍可以為1至5。優(yōu) 選地，循環(huán)婆t為1至3。
第三，在MMPA中在兩輪PCR之間進(jìn)行曱基化特異性富集。這對(duì)于MMPA 的成功來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵的。在多個(gè)富集循環(huán)之后回收的DNA的量可能較低，因?yàn)?使用嚴(yán)格的雜交和洗滌條件用于富集。例如，如果對(duì)于一個(gè)循環(huán)DNA回收率 為1%,那么在三個(gè)循環(huán)之后，總回收率為0.0001%。因此，如果在PCR之前 進(jìn)行富集，將不能夠從曱基化DNA的量較低的生物樣品中回收甚至一個(gè)拷貝 的甲基化DNA。在富集之前的PCR可以生產(chǎn)足夠量的曱基化DNA用于富集。 此外，如果在富集之后沒有另外的擴(kuò)增即進(jìn)行檢測(cè)，將沒有剩余足夠量的曱基 化DNA用于檢測(cè)。因此，富集之后的擴(kuò)增確保有足夠量的曱基化DNA用于 檢測(cè)。如下所述，在多重設(shè)置中，在兩輪PCR之間的富集還使曱基化的擴(kuò)增
與檢測(cè)更強(qiáng)大和特異。
第四，在MMPA中優(yōu)選使用兩輪PCR策略。第一 PCR引物具有靶特異 性部分和通用尾部。該靶特異性部分允許擴(kuò)增靶序列，而尾部導(dǎo)入用于第二 PCR的通用序列，該第二 PCR使用與被第一 PCR所導(dǎo)入的尾部互補(bǔ)的引物。 與兩輪PCR策略相關(guān)的 一個(gè)問題是由于在第一 PCR過(guò)程中形成引物-引物 相互作用產(chǎn)物，在該多重設(shè)置中第二輪PCR經(jīng)常不能充分地?cái)U(kuò)增某些序列。 不過(guò)，該問題^皮MMPA顯著地最小化。這是因?yàn)椋鳛楦患慕Y(jié)果，除去了 引物-引物相互作用產(chǎn)物，使第二輪PCR更強(qiáng)大。實(shí)際上，該方法可以成為 改進(jìn)高階(high-order)多重PCR的通用方法。
第五，多重PCR的另一問題是PCR擴(kuò)增效率隨著序列的變化而變化。對(duì) 于曱基化分析來(lái)說(shuō)這尤其是一個(gè)問題，因?yàn)榈托U(kuò)增的曱基化序列可能是不可 檢測(cè)出的。不過(guò)，在MMPA中該問題也被最小化了，因?yàn)樵诟患髸趸?特異性富集使曱基化DNA比未曱基化DNA含量更高。因?yàn)榈诙?PCR的擴(kuò)增 主要依賴于每一序列的拷貝數(shù)，在第二輪PCR之后，曱基化序列將是占優(yōu)勢(shì) 的，即使當(dāng)它們被第一 PCR低效地?cái)U(kuò)增。此外，探針提取工藝可以平衡多重 PCR擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率。這可以通過(guò)以下方法來(lái)實(shí)現(xiàn)優(yōu)化雜交探針 的摩爾比例使得在雜交過(guò)程中，低效擴(kuò)增的序列能夠被更有效地俘獲，而高效 擴(kuò)增的序列被較低效地俘獲。例如，如果被第一PCR進(jìn)行的序列A的擴(kuò)增比 序列B更有效，使用較低量的以序列A為標(biāo)靶的探針來(lái)俘獲序列A，從而使 富集之后的所回收的序列A和序列B的量平衡，使檢測(cè)兩個(gè)序列成為可能。
MMPA提供了優(yōu)于現(xiàn)有曱基化分析方法的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。第一， 一個(gè)MMPA 分析能夠顯示出很多目標(biāo)基因的多個(gè)CpG位點(diǎn)上的曱基化狀態(tài)，因此允許使 用少量原材料的分析。第二， MMPA極大地提高了檢測(cè)靈敏度，同時(shí)保持其 高階倍增能力。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)證實(shí)，MMPA能夠在過(guò)量的具有比甲基化 等位基因高1,000倍的量的未曱基化等位基因中檢測(cè)出 一個(gè)曱基化等位基因。 實(shí)際上，該靈敏度與曱基化特異性PCR (MSP)的靈敏度相當(dāng)，其中MSP是 最靈敏的方法，但是具有有限的倍增能力。第三，通過(guò)雜交實(shí)現(xiàn)MMPA的富 集，其中與PCR和絡(luò)合不同，雜交是物理過(guò)程，不會(huì)人為地產(chǎn)生甲基化DNA， 從而使MMPA高度特異。相反地，對(duì)于擴(kuò)增法，以增加假陽(yáng)性為代價(jià)，可以 獲得更高的靈敏度。第四，MMPA費(fèi)用低廉，因?yàn)橐淮畏治瞿軌蛲瑫r(shí)顯示出
很多目標(biāo)基因的多個(gè)CpG位點(diǎn)上的曱基化狀態(tài)。第五，用于MMPA的富集程 序是簡(jiǎn)單的，在相當(dāng)短的時(shí)間內(nèi)即可以完成三個(gè)雜交循環(huán)。此外，可以使用液 態(tài)處理系統(tǒng)進(jìn)行MMPA的樣品制備，因此MMPA檢測(cè)是高處理量的方法，并 且適合于自動(dòng)化控制。
可以通過(guò)幾種不同的方法來(lái)進(jìn)行MMPA策略的富集。可以例如通過(guò)甲基 化特異性雜交和提取程序來(lái)進(jìn)行富集，在該突變特異性雜交和^是取程序中，在 雜交條件下，使多個(gè)曱基化特異性探針與PCR產(chǎn)物，即擴(kuò)增子接觸，該擴(kuò)增 子通常是目標(biāo)DNA片段。每一個(gè)曱基化特異性探針優(yōu)先與甲基化序列形成雜 交物。優(yōu)選地，使曱基化特異性探針連接到能夠與第二分子結(jié)合的第一結(jié)合分 子上，該第二分子又優(yōu)選連接到固體載體上。雜交之后，雜交物可以被含有第 二結(jié)合分子的固體載體俘獲。
也可以通過(guò)竟?fàn)幮詴趸禺愋噪s交和提取程序進(jìn)行MMPA策略的富 集。在雜交條件下，使多個(gè)曱基化特異性探針和未曱基化竟?fàn)幪结樑cPCR產(chǎn) 物接觸，或相反使其暴露于PCR產(chǎn)物中，PCR產(chǎn)物即擴(kuò)增子例如目標(biāo)DNA 片段。每一個(gè)曱基化特異性探針優(yōu)先與曱基化序列(例如DNA片段中所含有 的)形成雜交物，而未曱基化竟?fàn)幪结槂?yōu)先與對(duì)應(yīng)的未甲基化序列形成雜交物。 還將所述甲基化特異性探針連接到第一結(jié)合分子上，所述第一結(jié)合分子能夠與 連接到固體載體上的第二結(jié)合分子相結(jié)合。雜交之后，雜交物可以被含有第二 結(jié)合分子的固體載體所俘獲。優(yōu)選地，每一種曱基化特異性探針與其對(duì)應(yīng)的未 曱基化竟?fàn)幪结樀哪柋葹榧s0.02:1至約10:1。
合適的結(jié)合分子的例子包括，但不限于生物素、鏈霉親和素以及它們的組合。
在曱基化特異性雜交和提取富集策略，以及竟?fàn)幮詴趸禺愋噪s交和提 取富集策略兩者中，可以通過(guò)以下步驟來(lái)富集目標(biāo)DNA片段在固體載體上 提取，從該固體載體上釋放所述片段，然后使該體系和剩余DNA片段進(jìn)行另 外的富集循環(huán)。
先前提到的甲基化特異性探針和對(duì)應(yīng)的未曱基化竟?fàn)幪结樋梢允沁m宜特 定應(yīng)用的任意探針。這些纟笨針的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于寡核普酸、肽核酸、
鎖核酸(LNA)以及它們的組合。
如上所述，在某些應(yīng)用中，第一或初始PCR可以是多元的或多重PCR。 在該策略中，使用兩對(duì)或兩對(duì)以上的引物。每一對(duì)引物包括一個(gè)正向引物和反 向引物。每一對(duì)引物用于擴(kuò)增含有一個(gè)或多個(gè)甲基化位點(diǎn)的序列。每一個(gè)引物 優(yōu)選含有靶特異部分和通用尾部。該靶特異部分側(cè)接于(flank)所述目標(biāo)序列， 或相反使其與目標(biāo)序列連接(align)以允許擴(kuò)增該序列。對(duì)于所有的正向和反 向引物，通用尾部的序列優(yōu)選是相同的。優(yōu)選地，該通用尾不能夠與人基因組 序列結(jié)合。并且，優(yōu)選地，正向引物和反向引物的通用尾的序列可以相同或不 同。
此外，在應(yīng)用第二PCR的程序中，優(yōu)選的是，當(dāng)?shù)谝籔CR的正向和反向 引物的通用尾相同時(shí)，第二 PCR使用一個(gè)通用引物。以及，優(yōu)選的是，當(dāng)正 向和反向引物的通用尾不同時(shí)， 一個(gè)通用引物與正向引物的通用尾配對(duì)，另一 個(gè)通用引物與反向引物的通用尾配對(duì)。通常，在使用第二 PCR的程序中，使 含有甲基化位點(diǎn)的富集DNA片段與通用引物接觸，或相反使其暴露于通用引 物中。使通用引物與正向和反向引物的通用尾雜交以擴(kuò)增富集的DNA片段。
本發(fā)明還提供了 一種用于生產(chǎn)足夠純的曱基化DNA片段的方法，該DNA 片段是用于檢測(cè)大量未甲基化DNA背景中多個(gè)DNA CpG位點(diǎn)上的曱基化狀 態(tài)。該方法包括提供含有曱基化DNA和未甲基化DNA的DNA樣品。所述方 法還包括擴(kuò)增含有甲基化位點(diǎn)的DNA序列從而生產(chǎn)擴(kuò)增子。優(yōu)選地，通過(guò)多 重PCR進(jìn)行該擴(kuò)增操作。所述方法還包括從PCR的擴(kuò)增子中富集含有曱基化 CpG位點(diǎn)的甲基化DNA片段。如前所述，該多重PCR使用兩對(duì)或兩對(duì)以上 的PCR引物，其中使每一對(duì)引物與含有一個(gè)或多個(gè)甲基化位點(diǎn)的序列雜交用 于擴(kuò)增該序列。以及，從擴(kuò)增產(chǎn)物即擴(kuò)增子中富集含有曱基化的甲基化DNA 片段，可以通過(guò)甲基化特異性雜交和提取技術(shù)，或者竟?fàn)幮约谆禺愋噪s交 和提取技術(shù)來(lái)進(jìn)行。
所有前述方法都特別針對(duì)來(lái)源于收集自患者的臨床生物試樣的樣品，包 括人腫瘤組織、外周血、糞便、尿、體液、與醫(yī)療過(guò)程相關(guān)的沖洗液以及它 們的組合。疑似生物樣本的樣品或DNA樣品通常含有DNA變異位點(diǎn)，該DNA 變異位點(diǎn)處于一個(gè)或多個(gè)單堿基取代、 一個(gè)或多個(gè)單堿基插入、 一個(gè)或多個(gè)單
堿基缺失、在一個(gè)或多個(gè)CpG位點(diǎn)上的甲基化以及它們的組合的形式。在這 些樣品中野生型DNA與變異DNA的典型摩爾比在約2:1至約100,000:1的范 圍內(nèi)。
如前所述，本發(fā)明還提供了 一種用于除去由多重PCR產(chǎn)生的引物-引物相 互作用產(chǎn)物的方法。 一般地，所述方法包括通過(guò)多重PCR擴(kuò)增靶DNA序列； 接著，通過(guò)序列特異性俘獲除去引物-引物相互作用產(chǎn)物來(lái)純化多重PCR的擴(kuò) 增的靶序列。如將要被評(píng)價(jià)的，所述多重PCR使用兩對(duì)或兩對(duì)以上的PCR引 物，其中每一對(duì)引物適合于擴(kuò)增特定的輩巴序列。
優(yōu)選通過(guò)以下方法進(jìn)行序列特異性俘獲在雜交條件下，使多個(gè)序列特異 性探針接觸或相反使其暴露于多重PCR的產(chǎn)物或擴(kuò)增子中。每一個(gè)序列特異 性探針優(yōu)先與靶序列形成雜交物。還將所述序列特異性探針連接到第一結(jié)合分 子上，所述第一結(jié)合分子能夠與連接到固體載體上的第二結(jié)合分子相結(jié)合。在 雜交之后，所述雜交物可以被含有第二結(jié)合分子的所述固體載體俘獲?？梢灾?復(fù)序列特異性俘獲程序，使得被固體載體所提取的DNA片段從該固體載體中 釋放出來(lái)，接著進(jìn)行另外的序列特異性俘獲循環(huán)。各種結(jié)合分子如前所述，可 以包括生物素、鏈霉親和素以及它們的組合。
許多探針都可以用于序列特異性俘獲法。非限制的實(shí)例包括寡核苷酸、肽 核酸、鎖核酸以及它們的組合。優(yōu)選地，序列特異性探針不與用于多重PCR 的引物的序列相結(jié)合。
本發(fā)明還可以適用于使多級(jí)多重PCR更強(qiáng)大。該方法包括提供含有靶 序列的樣品，接著通過(guò)第 一多重PCR來(lái)擴(kuò)增樣品以形成含有引物-引物相互作 用產(chǎn)物的第一擴(kuò)增樣品。接著，除去至少一部分引物-引物相互作用產(chǎn)物。然 后，可以使用第二多重PCR以形成第二擴(kuò)增樣品。
本發(fā)明還提供了一種用于平衡多個(gè)PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率的方法。所述方法包 括提供含有將要被擴(kuò)增的靶序列的DNA樣品。所述方法涉及接著通過(guò)第一 PCR擴(kuò)增靶DNA序列。接著可以平衡或相反調(diào)節(jié)耙序列的量。以及，接著通 過(guò)第二PCR擴(kuò)增平衡過(guò)的靶DNA序列。在該程序中，第一PCR優(yōu)選是使用 兩對(duì)或兩對(duì)以上PCR引物的多重PCR。每一對(duì)引物包括正向引物和反向引物。 每一對(duì)引物適合于擴(kuò)增目標(biāo)靶序列。每一個(gè)引物包括靶特異性部分和通用尾
部。所述靶特異性部分側(cè)接于所述耙序列以允許擴(kuò)增所述序列，并且對(duì)于所有 的正向和反向引物所述通用尾部的序列相同。優(yōu)選地，所述通用尾不能夠與樣
品中的任何DNA序列相結(jié)合。優(yōu)選地，正向和反向引物的通用尾的序列可以 相同或不同。
優(yōu)選通過(guò)序列特異性俘獲使由第一 PCR擴(kuò)增出的靶序列的量平衡。在雜 交條件下使多個(gè)序列特異性雜交探針與第一 PCR的擴(kuò)增子接觸，其中每一個(gè) 序列特異性探針優(yōu)先與靶序列形成雜交物。還將所述序列特異性探針連接到第 一結(jié)合分子上，所述第一結(jié)合分子能夠與連接到固體載體上的第二結(jié)合分子相 結(jié)合。在雜交之后，使所述雜交物被含有第二結(jié)合分子的所述固體載體俘獲。 優(yōu)選地，優(yōu)化序列特異性探針的摩爾比，使得通過(guò)加入更大量的對(duì)應(yīng)于所述低 效擴(kuò)增序列的序列特異性探針，使低效擴(kuò)增序列能夠被更有效地俘獲，以及通 過(guò)加入較少量的對(duì)應(yīng)于所迷高效擴(kuò)增序列的序列特異性探針，使高效擴(kuò)增序列 在雜交過(guò)程中被較低效地俘獲。
序列特異性探針幾乎可以是任意種探針，例如寡核苷酸、肽核酸、鎖核酸 以及它們的組合。
在上述使用序列特異性俘獲的平tf策略中，第一結(jié)合分子可以是例如生物 素、鏈霉親和素以及它們的組合；第二結(jié)合分子可以選自由鏈霉親和素、生物 素以及它們的組合所組成的組中。
可以重復(fù)進(jìn)行序列特異性俘獲，其中將被固體載體所提取的DNA片段從 該固體載體中釋;^出來(lái)，接著進(jìn)行另外的序列特異性俘獲循環(huán)以得到耙序列量 的最優(yōu)平衡。
本發(fā)明還提供了 一種用于平衡由多級(jí)多重PCR生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率的 方法。該方法包括提供含有第一靶序列和第二靶序列的樣品。接著，該方法涉 及鑒別第一靶序列和第二把序列的相對(duì)擴(kuò)增效率。然后，該方法包括將適合于 以第 一靶序列為靶點(diǎn)的第 一探針和適合于以第二靶序列為靶點(diǎn)的第二探針加 入到樣品中。第一探針與第二探針的摩爾比基于第一和第二輩巴序列的相對(duì)擴(kuò)增 效率。如果第一耙序列具有比第二把序列更高的擴(kuò)增效率，那么增加第一探針 與第二探針的摩爾比。實(shí)施例
本文所包含的以下實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并不是用來(lái)限制本發(fā)明。 實(shí)施例1
本實(shí)施例將說(shuō)明使用竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s交和提取以提高富集的特異性。 在本方法中，對(duì)每一突變位點(diǎn)使用兩個(gè)寡探針，其中一個(gè)寡探針(突變體探針)
與突變體DNA互補(bǔ)，另一個(gè)寡探針(正常竟?fàn)幪结?與野生型DNA互補(bǔ)。 但是，只將突變體探針生物素化，因此只有它們以及被它們所負(fù)載的突變體 DNA可以被俘獲，從而富集突變體DNA。使用兩個(gè)寡探針是基于以下考慮 寡探針的Tm變化可能不是足夠大到能夠區(qū)分被一個(gè)堿基所區(qū)別的兩個(gè)等位 基因，以及加入正常竟?fàn)幪结樋梢蕴岣唠s交的竟?fàn)幮裕瑥亩岣吒患?br>
在本實(shí)施例中，我們檢測(cè)出在K-ras的第12位密碼子的第一堿基上的G —T突變。野生型DNA購(gòu)自普洛麥格(Promega)(麥迪遜(Madison), WI )。 突變體DNA提取自肺癌患者的支氣管肺泡灌洗(BAL)樣品。通過(guò)用野生型 DNA稀釋突變體來(lái)生產(chǎn)含有低豐度的突變體DNA的樣品?；谠紭悠分型?變體DNA的拷貝數(shù)和所加入的野生型DNA的量估算在該生產(chǎn)出的樣品中突 變體DNA的豐度和量。在本實(shí)施例中，使用和研究含有1%的突變體DNA(在 5 ng正常DNA中有0.05 ng突變體DNA )的樣品。
第一 PCR:首先使該DNA樣品進(jìn)行笫一 PCR，其中正向和反向PCR引 物具有T7或T3的尾部，它們的序列分別為5'-GTAATACGACTCACTATAGG AGGCCTGCTGAAAATGACTG-3' ( SEQ ID NO: 1)和5'-AATTAACCCTCAC TAAAGGGTTGGATCATATTCGTCCACAA-3' (SEQ ID NO: 2)。在該P(yáng)CR中 使用以下用量的物質(zhì)正向和反向引物各lOpmol,每一種dNTP各0.2mM， 具有2mMMgCl2的lxPCR緩沖液，0.05 u/^L TaqGold DNA聚合酶，總反應(yīng) 體積為20jiL;在以下條件進(jìn)行該P(yáng)CR:首先在95°C變性DNA 10 min,接著 進(jìn)行38個(gè)以下循環(huán)(95°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒)，最后在72。C保 持5min用于延伸。
竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s交和提取將第一 PCR的產(chǎn)物與突變體和正常竟?fàn)?探針的混合物溫育用于進(jìn)行竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋愿患?。?|liL上面擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物、lxPCR緩沖液、5mM乙二胺四乙酸(EDTA)以及突變體和正常竟?fàn)?br>
探針以總體積為20 [aL的量加入到反應(yīng)管中。突變體和正常竟?fàn)幪结樀男蛄蟹?另,J為5'-生物素-TTGGAGCTTGTGGCGTAG-3' (SEQ ID NO: 3)和 5'醫(yī)TTGGAGCTGGTGGC GTAG -3' (SEQ ID NO: 4)。改變正常竟?fàn)幪结樑c突變 體探針的摩爾比以測(cè)定該比例對(duì)富集的影響。在以下條件進(jìn)行探針與PCR產(chǎn) 物的雜交首先在95。C變性DNA 5 min,接著以0.04。C/秒的速率將溫度緩慢 降低到25。C。在雜交之后，將含5pL鏈霉親和素包被磁珠(戴諾生物技術(shù)， 奧斯陸，挪威(Dynal Biotech, Oslo, Norway ))的20 |iL 2x B&W緩沖液加入 到雜交管中，接著將該雜交管在室溫下溫育45min。用180jliL lx TE緩沖液洗 滌該磁珠3次。其后，接著加入5 lx TE緩沖液以重懸浮該磁珠。將該磁 珠在95。C加熱5 min，接著將上清液轉(zhuǎn)移到清潔管中。
第二PCR:使用約lpL富集DNA作為用于第二PCR擴(kuò)增的模板，該第 二PCR擴(kuò)增分別4吏用T7的5'-GTAATACGACTCACTATAGG- 3' (SEQ ID NO: 5)和T3的5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'(SEQIDNO:6)作為正向和 反向引物。在該P(yáng)CR使用以下用量的物質(zhì)lOpmol的正向和反向引物，每一 種dNTP各0.2 mM， lxPCR緩沖液，2 mM MgCl2, 0.05 u/|iL TaqGold DNA 聚合酶，總反應(yīng)體積為20(iL;在以下條件進(jìn)行該P(yáng)CR:首先在95。C變性DNA 10min，接著進(jìn)行38個(gè)以下循環(huán)(95°C 30秒，58。C30秒，72°C 30秒)，最 后在72。C保持5min用于延伸。
突變分析通過(guò)基于MALDI-TOF的微測(cè)序法來(lái)檢測(cè)富集程度。首先將第 二 PCR的產(chǎn)物用磷酸酶(USB， Cleveland, OH)和DNA外切核酸酶I (exonecularse I) ( USB, Cleveland, OH)在37。C處理30min,接著在80。C處 理10 min。將2.5|iL處理過(guò)的PCR產(chǎn)物與2.5 jxL以下混合物混合ddATP、 ddGTP和ddTTP每一種0.025 mM, 0.1 mM dCTP,含有1.5mM MgClj的2x 熱測(cè)序酶(ThermoSequenase )緩沖液，1 pmol/pL微測(cè)序引物，0.2 u小L熱測(cè) 序酶。在以下條件下進(jìn)行微測(cè)序在94。C預(yù)熱2min，接著進(jìn)行60個(gè)以下循 環(huán)(94°C 20秒，50°C 20秒，72°C 20秒)。微測(cè)序的延伸引物是 5'隱CAAGGCACTCTTGCCTACGCCAC-3' (SEQ ID NO: 7)。將10 NH4OH處 理過(guò)的離子交換珠與該微測(cè)序產(chǎn)物溫育用于脫鹽。通過(guò)將延伸產(chǎn)物與3-HPA 基質(zhì)混合來(lái)制備MALDI樣品。將該樣品干燥，然后通過(guò)MALDI-TOF進(jìn)行分
析。通過(guò)比較對(duì)應(yīng)于突變體和正常等位基因的峰的強(qiáng)度，來(lái)確定富集程度。
圖3顯示了用不同比例的正常竟?fàn)幪结樑c突變體4笨針富集序列的結(jié)果，該
序列含有在k-ras的第12位密碼子的第一個(gè)堿基處的G —T突變。圖3中標(biāo)有 引物、突變體和正常的峰分別對(duì)應(yīng)于引物、突變體序列的延伸產(chǎn)物和正常序列 的延伸產(chǎn)物。對(duì)試驗(yàn)樣品富集一次?？梢钥闯?，在不存在正常竟?fàn)幪结樀那樾?下沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于突變體DNA的峰(圖3A)。但是，在加入2.5或7.5或15 倍更過(guò)量的正常探針之后，出現(xiàn)突變體峰(圖3B至3D),這表明在加入正常 竟?fàn)幪结樦髽O大地提高了富集。 實(shí)施例2
本實(shí)施例說(shuō)明了所用的探針的量對(duì)富集的影響。
在本實(shí)施例中，我們檢測(cè)在K-ras的第12位密碼子的第一堿基上的G—T 突變。野生型DNA購(gòu)自Promega (Madison， WI )。突變體DNA提取自肺癌 患者的BAL樣品。通過(guò)用野生型DNA稀釋突變體來(lái)生產(chǎn)含有低豐度的突變 體DNA的樣品?；谠紭悠分型蛔凅wDNA的拷貝數(shù)和所加入的野生型 DNA的量估算在該生產(chǎn)出的樣品中突變體DNA的豐度和量。在本實(shí)施例中， 使用含有1%的突變體DNA (在5 ng正常DNA中有0.05 ng突變體DNA )的 樣品進(jìn)行研究。
第一PCR:首先使該DNA樣品進(jìn)行第一PCR，其中正向和反向PCR引 物具有T7或T3的尾，正向引物的序列為5'-GTAATACGACTCACTATAGGA GGCCTGCTGAAAATGACTG-3'( SEQ ID NO: 1 )，反向引物的序列為5'-AA TTAACCCTCACTAAAGGGTTGGATCATATTCGTCCACAA-3' (SEQ ID NO: 2)。在該P(yáng)CR使用以下用量的物質(zhì)正向和反向引物各10pmo1,每一種dNTP 各0.2mM，具有2mMMgCl2的lxPCR緩沖液，0.05 u爾L TaqGold DNA聚合 酶，總反應(yīng)體積為20jiL;在以下條件進(jìn)行該P(yáng)CR:首先在95。C變性DNA 10 min,接著進(jìn)行38個(gè)以下循環(huán)(95。C30秒，58°C 30秒，72。C30秒)，最后 在72。C保持5min用于延伸。
竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s交和提取將第一 PCR的產(chǎn)物與突變體和正常竟?fàn)?探針的混合物溫育用于進(jìn)行竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋愿患?。?|iL上面擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物、1 xPCR緩沖液、5 mM EDTA以及突變體和正常竟?fàn)幪结樢钥傮w積為20
pL的量加入到反應(yīng)管中。將正常竟?fàn)幪结樑c突變體探針的摩爾比固定為7.5, 突變體探針的量在0.1至1 pmol的范圍內(nèi)。突變體和正常竟?fàn)幪结樀男蛄蟹謩e 為5'-生物素-TTGGAGCTTGTGGCGTAG曙3'(SEQIDNO: 3)和5'-TTGGAG CTGGTGGCGTAG -3' (SEQ ID NO: 4)。在以下條件進(jìn)行探針與PCR產(chǎn)物的雜 交首先在95。C變性DNA 5 min，接著以0.04。C/秒的速率將溫度緩慢降低到 25°C。在雜交之后，將含5|iL鏈霉親和素包被;茲珠(Dynal Biotech, Oslo, Norway)的20 pL 2x B&W緩沖液加入到雜交管中，接著將該雜交管在室溫下 溫育45 min。用180pL lx TE緩沖液洗滌該磁珠3次。其后，接著加入5 fiL lx TE緩沖液以重懸浮該磁珠。將該磁珠在95。C加熱5 min,接著將上清液轉(zhuǎn)移 到清潔管中。
第二PCR:使用約l(iL富集DNA作為用于第二PCR擴(kuò)增的才莫板，該第 二PCR擴(kuò)增分別使用T7的5'-GTAATACGACTCACTATAGG- 3' (SEQ ID NO: 5)和T3的5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'(SEQIDNO: 6)作為正向和 反向引物。在該P(yáng)CR使用以下用量的物質(zhì)lOpmol的正向和反向引物，每一 種dNTP各0.2 mM， lxPCR緩沖液，2 mM MgCl2, 0.05 u/pL TaqGold DNA 聚合酶，總反應(yīng)體積為20iiL;在以下條件進(jìn)行該P(yáng)CR:首先在95。C變性DNA 10min,接著進(jìn)行38個(gè)以下循環(huán)(95°C 30秒，58°C 30秒，72。C30秒)，最 后在72""C保持5min用于延伸。
突變分析通過(guò)基于MALDI-TOF的微測(cè)序法來(lái)檢測(cè)富集程度。首先將第 二 PCR的產(chǎn)物用磷酸酶和DNA外切核酸酶I在37。C處理30min，接著在80°C 處理10min。將2.5)iL處理過(guò)的PCR產(chǎn)物與2.5 pL以下混合物混合ddATP、 ddGTP和ddTTP每一種0.025 mM， 0.1 mM dCTP,含有1.5mM MgCl2的2x 熱測(cè)序酶緩沖液，1 pmol/iiL微測(cè)序引物，0.2 u/pL熱測(cè)序酶。在以下條件下 進(jìn)行微測(cè)序在94 。C預(yù)熱2 min，接著進(jìn)行60個(gè)以下循環(huán)(94。C 20秒，50°C 20秒，72。C20秒)。微測(cè)序的延伸引物是5'-CAAGGCACTCTTGCCTACG CCA-3' (SEQ ID NO: 7)。將10 NH4OH處理過(guò)的離子交換珠與該微測(cè)序產(chǎn) 物溫育用于脫鹽。通過(guò)將延伸產(chǎn)物與3-HPA基質(zhì)混合來(lái)制備MALDI樣品。將 該樣品干燥，然后通過(guò)MALDI-TOF進(jìn)行分析。通過(guò)比較對(duì)應(yīng)于突變體和正常 等位基因的峰的強(qiáng)度，來(lái)確定富集程度。圖4顯示了使用不同量的突變體4笨針富集序列，該序列含有在k-ras的第 12位密碼子的第一個(gè)石威基處的G—T突變。樣品含有P/。的突變體DNA，并且 富集1次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)突變體探針的量在O.l至lpmol的范圍內(nèi)時(shí)，得到相 似的富集。
實(shí)施例3
本實(shí)施例說(shuō)明了使用多個(gè)雜交和提取的循環(huán)來(lái)提高富集。在本實(shí)施例中， 我們使用含有在APC的第1450位密碼子的第一石威基上的C—T突變的序列。 野生型DNA購(gòu)自Promega (Madison, WI )。突變體DNA提取自結(jié)腸癌細(xì)胞
基于原始樣品中突變體DNA的拷貝數(shù)和所加入的野生型DNA的量估算在該 生產(chǎn)出的樣品中突變體DNA的豐度和量。在本實(shí)施例中，分別對(duì)含有1%、 或0.1%或0.01%的突變體DNA的樣品進(jìn)行研究。
第一 PCR的正向和反向引物具有T7或T3的尾，它們的序列分別為 5'隱GTAATACGACTCACTATAGGCTTCCAGATAGCCCTGGACA-3' (SEQ ID NO: 8)和 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGGCAGCATTTACTGCAGCT TG-3' (SEQ ID NO: 9)。微測(cè)序延伸引物是5'- CCTCAAACAGCTCAAACCAA G-3' (SEQ ID NO: 10)。突變體探針和正常竟?fàn)幪结樂謩e是5'-生物素-TCA AACCAAGTGAGAAGTA (SEQ ID NO: 11)和5'- TCAAACCAAGCGAGAA GTA-3'(SEQ ID NO: 12)。
第一PCR:在該P(yáng)CR使用以下用量的物質(zhì)正向和反向引物各10pmol, 每一種dNTP各0.2 mM, 1 xPCR緩沖液，2 mM MgCl2， 0.05 u/|iL TaqGold DNA 聚合酶，總反應(yīng)體積為20;iL;在以下條件進(jìn)行該P(yáng)CR:首先在95。C變性DNA 10min,接著進(jìn)行38個(gè)以下循環(huán)(95°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒)，最 后在72。C保持5min用于延伸。
富集將第一 PCR的產(chǎn)物與突變體和正常竟?fàn)幪结樀幕旌衔餃赜糜谶M(jìn) 行竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s交和提取。將總體積為20(aL的、含有以下物質(zhì)的液體 加入到試管中2pL上面擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物、lxPCR緩沖液、5mMEDTA以及 0.01pmol/pL突變體探針和0.075pmol/(iL正常竟?fàn)幪结?。正常竟?fàn)幪结樑c突變 體探針的摩爾比為7.5。在以下條件進(jìn)行探針與PCR產(chǎn)物的雜交首先在95。C
變性DNA 5 min,接著以0.04。C/秒的速率將溫度緩慢P條低到25°C。在雜交之 后，將含5fiL鏈霉親和素包被磁珠(Dynal Biotech, Oslo, Norway )的20 [iL 2x B&W緩沖液加入到雜交管中，接著將該雜交管在室溫下溫育45 min。用180pL lxTE緩沖液洗滌該磁珠3次。其后，接著加入5 (iL lxTE緩沖液以重懸浮該 磁珠。將該磁珠在95。C加熱5 min，接著將上清液轉(zhuǎn)移到清潔管中。
第二PCR:使用約lpL富集DNA作為用于第二PCR擴(kuò)增的模板，該第 二 PCR擴(kuò)增分別使用T7的5'-GTAATACGACTCACTATAGG- 3' (SEQ ID NO: 5)和T3的5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'(SEQIDNO:6)作為正向和 反向引物。在該P(yáng)CR使用以下用量的物質(zhì)lOpmol的正向和反向引物，每一 種dNTP各0.2 mM， lxPCR緩沖液，2 mM MgCl2， 0.05 u/pL TaqGold DNA 聚合酶，總反應(yīng)體積為20jiL;在以下條件進(jìn)行該P(yáng)CR:首先在95。C變性DNA 10min,接著進(jìn)行38個(gè)以下循環(huán)(95。C30秒，58。C30秒，72。C30秒)，最 后在72TM呆持5min用于延伸。
突變分析通過(guò)基于MALDI-TOF的微測(cè)序法來(lái)檢測(cè)富集程度。首先將第 二 PCR的產(chǎn)物用磷酸酶和DNA外切核酸酶I在37。C處理30min,接著在80°C 處理10min。將2.5jiL處理過(guò)的PCR產(chǎn)物與2.5iiL以下混合物混合ddATP、 ddGTP和ddTTP每一種0.025 mM, 0.1 mM dCTP，含有1.5mM MgCl2的2x 熱測(cè)序酶緩沖液，1 pmol4iL微測(cè)序引物，0.2u^iL熱測(cè)序酶。在以下條件下 進(jìn)行微測(cè)序在94。C預(yù)熱2min，接著進(jìn)行60個(gè)以下循環(huán)(94°C 20秒，50°C 20秒，72。C20秒)。將10laLNH40H處理過(guò)的離子交換^K與該^:測(cè)序產(chǎn)物溫 育用于脫鹽。通過(guò)將延伸產(chǎn)物與3-HPA基質(zhì)混合來(lái)制備MALDI樣品。將該樣 品干燥，然后通過(guò)MALDI-TOF進(jìn)行分析。通過(guò)比較對(duì)應(yīng)于突變體和正常等位 基因的峰的強(qiáng)度，來(lái)確定富集程度。
圖5顯示了使用 一個(gè)(5A )、兩個(gè)(5B )和三個(gè)(5C )富集循環(huán)富集序列， 該序列含有在APC的第1450位密碼子的第一個(gè)堿基處的C—T突變，其中該 樣品分別含有1% (5A)、 0.1% (5B)和0.01% (5C)突變體DNA。清楚地， 在圖5C中突變體DNA的峰與野生型DNA的峰相當(dāng)，這表明用三個(gè)富集循環(huán) 成功富集了該序列約10,000倍。
實(shí)施例4
本實(shí)施例說(shuō)明了 DNA的大小對(duì)富集的影響。在本實(shí)施例中，我們研究了 三種不同大小的序列，它們都含有在APC的第1450位密碼子的第一堿基上的 C—T突變。分別地，第一序列的長(zhǎng)度為158bp長(zhǎng)，第二序列的長(zhǎng)度為439bp 長(zhǎng)，第三序列的長(zhǎng)度為829bp長(zhǎng)。野生型DNA購(gòu)自Promega (Madison, WI )。 突變體DNA提取自結(jié)腸癌細(xì)胞系。通過(guò)用野生型DNA稀釋突變體來(lái)生產(chǎn)含 有低含量的突變體DNA的樣品?；谠紭悠分型蛔凅wDNA的拷貝數(shù)和所 加入的野生型DNA的量估算在該生產(chǎn)出的樣品中突變體DNA的豐度和量。 在本實(shí)施例中，對(duì)含有P/。的突變體DNA的樣品進(jìn)行研究并且只富集一次。
我們?cè)O(shè)計(jì)三對(duì)引物來(lái)產(chǎn)生這些三種大小的PCR產(chǎn)物。所有的正向引物具 有T7尾的5'-GTAATACGACTCACTATAGG- 3' (SEQ ID NO: 5),所有的反 向引物具有T3尾的5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'(SEQ ID NO: 6)。 三對(duì)正向和反向引物的序列是
正向引物(158bp) : 5'-GTAATACGACTCACTATAGGCTTCCAGATAG CCCTGGACA-3' (SEQ ID NO: 8);
反向引物(158bp): 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGGCAGCATTTACTG CAGCTTG-3' (SEQ ID NO: 9);
正向引物(439bp): 5'-GTAATACGACTCACTATAGGCTTCCAGATAGC CCTGGACA-3' (SEQ ID NO: 13);
反向引物(439bp) : 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGCATCTGAATCA TCTAATAGGTCC-3' (SEQ ID NO: 14);
正向引物(829bp): 5'-GTAATACGACTCACTATAGGACACAGGAAGCA GATTCTGC-3' (SEQ ID NO: 15);
反向引物(829bp): 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGCATCTGAATCAT CTAATAGGTCC-3' (SEQ ID NO: 16)。
微測(cè)序延伸引物是5'畫CCTCAAACAGCTCAAACCAAG-3' (SEQ ID NO: 10).突變體探針和正常竟?fàn)幪结樂謩e是5'-生物素-TCAAACCAAGTGAGA AGTA-3' (SEQ ID NO: 11)和5'- TCAAACCAAGCGAGAAGTA -3' (SEQ ID NO: 12)。
第一PCR:在該P(yáng)CR使用以下用量的物質(zhì)正向和反向引物各10 pmol,每一種dNTP各0.2 mM， 1 xpCR緩沖液，2 mM MgCl2, 0.05 u L TaqGold DNA 聚合酶，總反應(yīng)體積為20pL;在以下條件進(jìn)行該P(yáng)CR:首先在95。C變性DNA 10min,接著進(jìn)行38個(gè)以下循環(huán)(95°C 30秒，58。C30秒，72。C30秒)，最 后在72。C保持5min用于延伸。
富集將第一 PCR的產(chǎn)物與突變體和正常竟?fàn)巀l罙針的混合物溫育用于進(jìn) 行竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s交和揭A又。將2pL上面擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物、lxPCR緩沖
探針以總體積為20 |iL的量加入到反應(yīng)管中。正常竟?fàn)幪结樑c突變體探針的摩 爾比為7.5。在以下條件進(jìn)行探針與PCR產(chǎn)物的雜交首先在95T:變性DNA5 min,接著以0.04。C/秒的速率將溫度緩慢降低到25°C。在雜交之后，將含5(iL 鏈霉親和素包被磁珠(Dynal Biotech, Oslo, Norway )的20 2x B&W緩沖液 加入到雜交管中，接著將該雜交管在室溫下溫育45min。用180jiL1xTE緩沖 液洗滌該磁珠3次。其后，接著加入5 (xL lx TE緩沖液以重懸浮該磁珠。將 該it珠在95。C加熱5 min，接著將上清液轉(zhuǎn)移到清潔管中。
第二PCR:使用約I(liL富集DNA作為用于第二PCR擴(kuò)增的模板，該第 二 PCR擴(kuò)增分別使用T7的5'-GTAATACGACTCACTATAGG- 3' (SEQ ID NO: 5)和T3的5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'(SEQIDNO: 6)作為正向和 反向引物。在該P(yáng)CR使用以下用量的物質(zhì)lOpmol的正向和反向引物，每一 種dNTP各0.2 mM, lxPCR緩沖液，2 mM MgCl2, 0.05 u/|uL TaqGold DNA 聚合酶，總反應(yīng)體積為20pL;在以下條件進(jìn)行該P(yáng)CR:首先在95。C變性DNA 10min,接著進(jìn)行38個(gè)以下循環(huán)(95°C 30秒，58。C30秒，72°C 30秒)，最 后在72。C保持5min用于延伸。
突變分析通過(guò)基于MALDI-TOF的微測(cè)序法來(lái)檢測(cè)富集程度。首先將第 二 PCR的產(chǎn)物用磷酸酶和DNA外切核酸酶I在37。C處理30min，接著在80°C 處理10 min。將2.5|iL處理過(guò)的PCR產(chǎn)物與2.5 以下混合物混合ddATP、 ddGTP和ddTTP每一種0.025 mM, 0.1 mM dCTP， 2x熱測(cè)序酶緩沖液，1.5mM MgCl2， lpmoi41L微測(cè)序引物，0.2u年L熱測(cè)序酶。在以下條件下進(jìn)行微測(cè)序 在94 。C預(yù)熱2 min，接著進(jìn)行60個(gè)以下循環(huán)(94°C 20秒，50°C 20秒，72°C 20 秒)。將10 |iL NH4OH處理過(guò)的離子交換珠與該微測(cè)序產(chǎn)物溫育用于脫鹽。
通過(guò)將延伸產(chǎn)物與3-HPA基質(zhì)混合來(lái)制備MALDI樣品。將該樣品干燥，然后 通過(guò)MALDI-TOF進(jìn)行分析。通過(guò)比較對(duì)應(yīng)于突變體和正常等位基因的峰的強(qiáng) 度，來(lái)確定富集程度。
圖6分別顯示了富集158bp (圖6A)、 439bp (圖6B )和829bp (圖6C ) 的PCR產(chǎn)物，所有的PCR產(chǎn)物含有在APC的第1450位密碼子的第一個(gè)》成基 處的相同的C—T突變。所有樣品含有1。/。的突變體DNA,并且僅被富集一次。 該結(jié)果清楚地顯示，至少在158至829bp的區(qū)域內(nèi)，富集程度不會(huì)隨DNA大 小而顯著變化，這表明該富集程序能夠?qū)Σ煌笮〉母鞣NPCR產(chǎn)物良好地起 作用。
實(shí)施例5
本實(shí)施例說(shuō)明了同時(shí)富集多個(gè)靶序列。我們通過(guò)在相同的條件下富集6 個(gè)不同的突變體序列來(lái)說(shuō)明這個(gè)問題，其中四個(gè)是p53突變(第190、 248、 267和274位密碼子)，第五個(gè)是k-ras突變(第12位密碼子)，第六個(gè)是APC 突變(第1450位密碼子)。含有k-ras和p53突變的突變體DNA提取自肺癌 患者的BAL樣品，含有APC突變的突變體DNA提取自結(jié)腸癌細(xì)胞系。測(cè)定 突變體DNA的量。通過(guò)用野生型DNA (Promega， Madison, Wl)稀釋突變體 DNA來(lái)生產(chǎn)含有低含量的突變體DNA的樣品。基于原始樣品中突變體DNA 的拷貝數(shù)和所加入的野生型DNA的量估算在該生產(chǎn)出的樣品中突變體DNA 的豐度和量。在本實(shí)施例中，對(duì)含有1%或0.1%或0.01。/。的突變體DNA的樣 品進(jìn)行研究。
在本研究中，我們使用多重PCR來(lái)擴(kuò)增覆蓋這6個(gè)位點(diǎn)的5個(gè)序列(請(qǐng) 注意， 一個(gè)序列具有在第267和274位密碼子上的兩個(gè)p53突變位點(diǎn))。第一 PCR采用5對(duì)引物，每一個(gè)引物具有靶特異部分和通用尾部。靶特異部分?jǐn)U 增靶序列，而尾部導(dǎo)入用于第二PCR的序列。使用T7序列作為正向引物的尾 部，使用T3序列作為反向引物的尾部。這些引物的序列是
K畫ras的正向引物5'-GTAATACGACTCACTATAGGAGGCCTGCTGAA AATGACTG-3' (SEQ ID NO: 1 );
K-ras的反向引物5'- AATTAACCCTCACTAAAGGGTTGGATCATATT CGTCCACAA-3' (SEQ ID NO: 2);APC的正向引物5'-GTAATACGACTCACTATAGGCTTCCAGATAGCC CTGGACA-3' (SEQ ID NO: 8);
APC的反向引物5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGGCAGCATTTACT GCAGCTTG-3' (SEQ ID NO: 9);
p53 (第190位密碼子)的正向引物5'-GTAATACGACTCACTATAGGC AGTTGCAAACCAGACCTCA-3' (SEQ ID NO: 17);
p53 (第190位密碼子)的反向引物5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG CAGATAGCGATGGTGA GCAG-3' (SEQ ID NO: 18);
p53 (第248位密碼子)的正向引物5'-GTAATACGACTCACTATAGGG GGTCAGAGGCAAGCA GAG-3' (SEQ ID NO: 19);
p53(第248位密碼子)的反向引物5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGTG GCTCTGACTGTACC ACCA國(guó)3' (SEQ ID NO: 20);
p53 (第267和274位密碼子)的正向引物5'- GTAATACGACTCAC TATAGGTCTTGCGGAGATTCTCTTCC畫3' (SEQ ID NO: 21 );
p53 (第267和274位密碼子)的反向引物5'- AATTAACCCTCACT AAAGGGGACAAGGGTG GTTGGGAGTA-3' (SEQ ID NO: 22);
第一PCR:在該P(yáng)CR使用以下用量的物質(zhì)正向和反向引物各10pmol, 每一種dNTP各0.2 mM， 1 xPCR緩沖液，2 mM MgCl2， 0.05 u L TaqGold DNA 聚合酶，總反應(yīng)體積為20pL;在以下條件進(jìn)行該P(yáng)CR:首先在95°C變性DNA 10 min,接著進(jìn)行38個(gè)以下循環(huán)(95。C30秒，58。C30秒，72。C30秒)，最后 在72。C保持5min用于延伸。
富集將第一 PCR的產(chǎn)物與突變體和正常竟?fàn)幪结樀幕旌衔餃赜糜谶M(jìn) 行竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s交和提取。在本實(shí)施例中，使用6對(duì)探針來(lái)富集PCR 產(chǎn)物，其中每一個(gè)纟采針以一個(gè)突變位點(diǎn)為靶點(diǎn)。將2pL上面擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物、 lxPCR緩沖液、5 mM EDTA,以及0.01pmoI/(iL的每一種突變體和 0.075pmol/)jL每一種正常竟?fàn)幪结槪钥傮w積為20 的量加入到反應(yīng)管中。 正常竟?fàn)幪结樑c其對(duì)應(yīng)的突變體探針的摩爾比為7.5。在以下條件進(jìn)行探針與 PCR產(chǎn)物的雜交首先在95。C變性DNA5min，接著以0.04。C/秒的速率將溫 度緩慢降低到25。C。在雜交之后，將含5pL鏈霉親和素包^皮-磁珠(Dynal Biotech,
Oslo, Norway)的20 2x B&W緩沖液加入到雜交管中，接著將該雜交管在 室溫下溫育45min。用180(iL lx TE緩沖液洗滌該^茲珠3次。其后，接著加入 5 i止lx TE緩沖液以重懸浮該磁珠。將該磁珠在95。C加熱5 min,接著將上清 液轉(zhuǎn)移到清潔管中。所用的6對(duì)突變體和正常竟?fàn)幪结樀男蛄惺?br>
K-ras的突變體探針5'-生物素-TTGGAGCTTGTGGCGTAG -3' (SEQ ID NO: 3);
K-ras的正常竟?fàn)幪结?'- TTGGAGCTGGTGGCGTAG -3' (SEQ ID NO:
4);
APC的突變體探針5'-生物素-TCAAACCAAGTGAGAAGTA -3' (SEQ IDNO: 11);
APC的正常竟?fàn)幪结?'- TCAAACCAAGCGAGAAGTA -3' (SEQ ID NO:
12);
p53 (第190位密碼子)的突變體探針5'-生物素-CTGAGGAAGGGCC AGA-3'(SEQIDNO:23);
p53 (第190位密碼子)的正常竟?fàn)幪结?'-CTGAGGAGGGGCCAGA-3' (SEQ ID NO: 24);
p53 (第248位密碼子)的突變體探針5'-生物素-GGCCTCCAGT TCATGC-3' (SEQ ID NO: 25);
(第248位密碼子)的正常竟?fàn)幪结?'-GGCCTCCGGTTCATGC-3'(SEQ ID NO: 26);
p53 (第267位密碼子)的突變體探針5'-生物素-CTGTTCGGTCCCA GTA-3' (SEQ ID NO: 27);
p53 (第267位密碼子)的正常竟?fàn)幪结?'-CTGTTCCGTCCCAGTA-3' (SEQ IDNO: 28);
p53 (第274位密碼子)的突變體探針5'-生物素-GCACAAAAACGCA CCTC-3,(SEQ ID NO: 29);
p53(第274位密碼子)的正常竟?fàn)幪结?'-GCACAAACACGCACCTC-3' (SEQ ID NO: 30);
第二PCR:使用約lpL富集DNA作為用于第二PCR擴(kuò)增的模板，該第
二 PCR擴(kuò)增分別^f吏用T7的5'-GTAATACGACTCACTATAGG- 3' (SEQ ID NO: 5)和T3的5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'(SEQIDNO:6)作為正向和 反向引物。在該P(yáng)CR使用以下用量的物質(zhì)lOpmol的正向和反向引物，每一 種dNTP各0.2 mM， lxPCR緩沖液，2 mM MgCl2, 0.05 u/pL TaqGold DNA 聚合酶，總反應(yīng)體積為20(iL;在以下條件進(jìn)行該P(yáng)CR:首先在95。C變性DNA 10 min,接著進(jìn)行38個(gè)以下循環(huán)(95°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒)，最 后在72t:保持5min用于延伸。
突變分析通過(guò)基于MALDI-TOF的微測(cè)序法來(lái)檢測(cè)富集程度。首先將第 二 PCR的產(chǎn)物用磷酸酶和DNA外切核酸酶I在37。C處理30min,接著在80°C 處理10min。將2.5|iL處理過(guò)的PCR產(chǎn)物與2.5 jiL以下混合物混合ddATP、 ddGTP和ddTTP每一種0.025 mM, 0.1 mM dCTP，含L5mM MgCl2的2x熱 測(cè)序酶緩沖液，1 pmol/pL微測(cè)序引物，0.2 u/)iL熱測(cè)序酶。在以下條件下進(jìn) 行微測(cè)序在94 。C預(yù)熱2 min,接著進(jìn)行60個(gè)以下循環(huán)(94°C 20秒，50°C 20 秒，72。C20秒)。將10pLNH4OH處理過(guò)的離子交換珠與該微測(cè)序產(chǎn)物溫育 用于脫鹽。通過(guò)將延伸產(chǎn)物與3-HPA基質(zhì)混合來(lái)制備MALDI樣品。將該樣品 干燥，然后通過(guò)MALDI-TOF進(jìn)行分析。通過(guò)比較對(duì)應(yīng)于突變體和正常等位基 因的峰的強(qiáng)度，來(lái)確定富集程度。在本實(shí)施例中，我們使用6個(gè)微測(cè)序引物， 其中每一種引物以6個(gè)突變位點(diǎn)中的一個(gè)為靶點(diǎn)。所述微測(cè)序延伸引物的序列 是
k-ms的微測(cè)序延伸引物5'- CAAGGCACTCTTGCCTACGCCA-3' (SEQ ID NO: 7);
APC的微測(cè)序延伸引物5'-CCTCAAACAGCTCAAACCAAG-3'(SEQID NO: 10);
p53 (第190位密碼子)的微測(cè)序延伸引物5'- TGCTCTTAGGTCTGGC CC-3'(SEQIDNO:31 );
p53 (第248位密碼子)的微測(cè)序延伸引物5'- TGCATGGGCGGCATG AAC-3'(SEQIDNO:32);
p53 (第267位密碼子)的微測(cè)序延伸引物5'- CGCACCTCAAAGCTG TTC-3'(SEQ ID NO: 33);
p53 (第274位密碼子)的微測(cè)序延伸引物5'- TCCCAGGACAGGCAC AAA-3' (SEQ ID NO: 34);
圖7顯示了檢測(cè)6個(gè)樣品中突變的結(jié)果，每一個(gè)樣品具有0.1%的突變體 DNA,并且被富集兩次。可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于每一個(gè)樣品都檢測(cè)出正確的突變， 并且沒有檢測(cè)出假陽(yáng)性。使用3個(gè)雜交循環(huán)也可以從含有0.01。/。的突變體DNA 的樣品中檢測(cè)出正確的突變(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
實(shí)施例6
本實(shí)施例是說(shuō)明曱基化特異性富集。通過(guò)富集ER基因的曱基化序列來(lái)研 究曱基化特異性富集。采用以下方法來(lái)制備陽(yáng)性對(duì)照曱基化DNA:通過(guò)使用 建議的程序用Sssl甲基化敏紐英倫生物技術(shù)有限公司(NewEnglandBiolabs), MA )處理正常DNA，將每一個(gè)CpG位點(diǎn)上的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)闀趸奏ぁ?通過(guò)將曱基化DNA摻入正常DNA來(lái)制備含有曱基化和未曱基化DNA的樣 品，其中基于原始樣品中甲基化DNA的拷貝數(shù)和所加入的未曱基化DNA的 量來(lái)估算甲基化DNA的豐度和量。對(duì)含有0.1%和0.01%的曱基化DNA的樣 品進(jìn)行研究，在每一個(gè)樣品中使用20拷貝的曱基化DNA。
亞硫酸氫鹽處理我們使用標(biāo)準(zhǔn)的亞硫酸氬鹽處理方法來(lái)處理樣品DNA。 首先將1昭鮭魚精子DNA加入到DNA樣品中作為載體，接著在NaOH存在 的情形下在42。C變性DNA 20 min。 將新制的亞石克酸氛鹽溶液力口入到變性的 DNA樣品中，接著在黑暗條件下在55。C溫育混合溶液。其后，對(duì)處理后的樣 品進(jìn)行脫硫、中和和純化。將處理后的DNA儲(chǔ)存在-20。C。
第一PCR:在亞硫酸氬鹽處理之后，使每一個(gè)樣品進(jìn)行第一PCR。該P(yáng)CR 的引物具有靶特異性部分和T7 (正向)或T3 (反向)的通用尾。該靶特異性 部分?jǐn)U增ER的曱基化序列，而該尾部導(dǎo)入用于第二 PCR的序列。正向和反 向引物的序列分別是5'- GTAATACGACTCACTATAGGGGTGTATTTGG ATAGTAGTAAGTTTGT畫3' (SEQ ID NO: 35)和5'-AATTAACCCTCACTAAA GGGCTATTAAATAAAAAAAAACCCCCCAAACC畫3' (SEQ ID NO: 36)。在該 PCR使用以下用量的物質(zhì):正向和反向引物各10 pmol,每一種dNTP各0.2 mM， lxPCR緩沖液，2mMMgCl2， 0.05 u/pL TaqGoldDNA聚合酶，總反應(yīng) 體積為20)iL;在以下條件進(jìn)行該P(yáng)CR:首先在95。C變性DNA 10 min,接著 進(jìn)行38個(gè)以下循環(huán)(95°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒)，最后在72。C保 持5min用于延伸。
富集將第一PCR的產(chǎn)物與甲基化和未甲基化竟?fàn)幪结樀幕旌衔餃赜?于進(jìn)行竟?fàn)幮詴趸禺愋噪s交和提取。將2pL上面擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物、lxPCR 緩沖液、5 mM EDTA，以及0.01pmol/pL甲基化探針和0.075pmol/VL未曱基 化竟?fàn)幪结?，以總體積為20pL的量加入到反應(yīng)管中。所用的未曱基化竟?fàn)幪?針與曱基化探針的摩爾比為7.5。在以下條件進(jìn)行探針與PCR產(chǎn)物的雜交首 先在95。C變性DNA 5 min，接著以0.04。C/秒的速率將溫度緩慢降低到25°C。 在雜交之后，將含5jxL鏈霉親和素包被磁珠(Dynal Biotech, Oslo, Norway )的 20 pL 2x B&W緩沖液加入到雜交管中，接著將該雜交管在室溫下溫育45 min。 用180piL lx TE緩沖液洗滌該磁珠3次。其后，接著加入5 lx TE緩沖液以 重懸浮該磁珠。將該;茲珠在95。C加熱5min，接著將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中。 甲基化探針和未甲基化竟?fàn)幪结樀男蛄蟹謩e是5'-生物素-ACGAGTTTAAC GTCGCGG-3' (SEQ ID NO: 37)和5'-ATGAGTTTAATGTTGTGG- 3' (SEQ ID NO: 38)。
第二 PCR:使用約l|iL富集的DNA作為用于第二 PCR擴(kuò)增的模板，該 第二PCR擴(kuò)增分別使用T7的5'-GTAATACGACTCACTATAGG- 3' (SEQ ID NO: 5)和T3的5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG國(guó)3'(SEQ ID NO: 6)作為正 向和反向引物。在該P(yáng)CR使用以下用量的物質(zhì)lOpmol的正向和反向引物， 每一種dNTP各0.2 mM， 1 xPCR緩沖液，2 mM MgCl2, 0.05 u/pL TaqGold DNA 聚合酶，總反應(yīng)體積為20jiL;在以下條件進(jìn)行該P(yáng)CR:首先在95。C變性DNA 10min，接著進(jìn)行38個(gè)以下循環(huán)(95°C 30秒，58。C30秒，72°C 30秒)，最 后在72"C保持5min用于延伸。
甲基化分析通過(guò)基于MALDI-TOF的微測(cè)序法來(lái)檢測(cè)富集程度。首先將 第二 PCR的產(chǎn)物用磷酸酶和DNA外切核酸酶I在37。C處理30min，接著在 80。C處理10 min。將2.5|止處理過(guò)的PCR產(chǎn)物與2.5 以下混合物混合 ddATP、 ddGTP和ddTTP每一種0.025 mM, O.lmMdCTP,含1.5mMMgCl2 的2x熱測(cè)序酶緩沖液，1 pmol/pL微測(cè)序引物，0.2u/jiL熱測(cè)序酶。在以下條 件下進(jìn)行微測(cè)序在94。C預(yù)熱2min,接著進(jìn)行60個(gè)以下循環(huán)(94°C 20秒，
50°C 20秒，72°C 30秒)。微測(cè)序延伸引物是5'- CCCTCRAAATAATT ATACAC-3' (SEQ ID NO: 39)。將10 NH4OH處理過(guò)的離子交換珠與該微測(cè) 序產(chǎn)物溫育用于脫鹽。通過(guò)將延伸產(chǎn)物與3-HPA基質(zhì)混合來(lái)制備MALDI樣品。 將該樣品干燥，然后通過(guò)MALDI-TOF進(jìn)行分析。通過(guò)比較對(duì)應(yīng)于突變體和正 常等位基因的峰的強(qiáng)度，來(lái)確定富集程度。
圖IO顯示了本研究的結(jié)果，其中標(biāo)有P、 M和UM的峰分別對(duì)應(yīng)于引物、 甲基化等位基因的延伸產(chǎn)物和未曱基化等位基因的延伸產(chǎn)物。圖10a和圖10b 分別顯示了不使用和使用曱基化特異性富集來(lái)檢測(cè)1,000倍過(guò)量未曱基化 DNA中ER的曱基化序列的結(jié)果。不使用曱基化特異性富集沒有檢測(cè)出曱基 化DNA (圖10a)，而使用曱基化特異性富集清楚地檢測(cè)出甲基化DNA (圖 10b)，這表明了通過(guò)甲基化特異性雜交富集曱基化DNA的效率。圖10c顯示 了成功4企出0.0P/o的曱基化ER的結(jié)果，這表明MMPA可以檢測(cè)出0.01°/。的甲 基化DNA。請(qǐng)注意，MMPA的特異性是極好的，如通過(guò)使用相同的程序分析 只含有未曱基化DNA(圖10d)的樣品所證實(shí)的，其中沒有觀察到對(duì)應(yīng)于甲 基化DNA的峰。
實(shí)施例7
本實(shí)施例是說(shuō)明使用序列特異性提取策略來(lái)平衡不同PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率。 在本實(shí)施例中，通過(guò)第一輪PCR來(lái)擴(kuò)增BRAF、 K-ras、 p53和APC的10個(gè) 序列，該第一輪PCR使用IO對(duì)引物，每一對(duì)引物具有靶特異性部分和通用尾 部。該靶特異性部分?jǐn)U增耙序列，而該尾部導(dǎo)入用于第二 PCR的序列。分別 使用T7和T3序列作為正向和反向引物的尾部。使用50ng人基因組DNA作 為模板。在該P(yáng)CR使用以下用量的物質(zhì)正向和反向引物各2.5 pmol，每一 種dNTP各0.2mM, lxPCR緩沖液，2mMMgCl2， 0.05 u/pL TaqGold DNA 聚合酶，總反應(yīng)體積為20pL;在以下條件進(jìn)行該P(yáng)CR:首先在95。C變性DNA 10min,接著進(jìn)行38個(gè)以下循環(huán)(95°C 60秒，58°C 60秒，72。C60秒)，最 后在72"C保持5min用于延伸。這IO對(duì)引物的序列是
BRAF的正向引物5'畫GTAATACGACTCACTATAGGTGCTTGCTCTG ATAGGAAAATGA畫3' (SEQ ID NO: 40);
BRAF的反向引物5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGCCACAAAATGGATCCAGA CAAC畫3' (SEQ ID NO: 41);
p53 (第190位密碼子)的正向引物5'-GTAATACGACTCACTATAG GCAGTTGCAAACCAGACCTCA-3' (SEQIDNO: 17);
p53(第190位密碼子)的反向引物5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGCA GATAGCGATGGTGA GCAG-3' (SEQ ID NO: 18);
p53 (第248位密碼子)的正向引物5'-GTAATACGACTCACTATAGGGG GTCAGAGGCAAGCAGAG-3' (SEQ ID NO: 19);
p53(第248位密碼子)的反向引物5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGTG GCTCTGACTGTACCACCA-3' (SEQ ID NO: 20);
p53(第267和274位密碼子)的正向引物5'-GTAATACGACTCACTAT AGGTCTTGCGGAGATTCTCTTCC-3' (SEQ ID NO: 21 );
p53 (第267和274位密碼子)的反向引物5'- AATTAACCCTCACTA AAGGGGACAAGGGTGGTTGGGAGTA-3' (SEQ ID NO: 22);
K-ras的正向引物5'-GTAATACGACTCACTATAGGAGGCCTGCTGA AAATGACTG畫3' (SEQ ID NO: 1);
K-ras的反向引物5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGTTGGATCATA TTCGTCCACAA-3' (SEQ ID NO: 2);
APC (第876位密碼子)的正向引物5'-TAATACGACTCACTATAGGTCT AGGCAACTACCATCAG-3' (SEQ ID NO: 42);
APC (第876位密碼子)的反向引物5'-AATTAACCCTCACTAAAGG GGAGGTATGAATGGC TGACAC-3' (SEQ ID NO: 43);
APC (第1114位密碼子)的正向引物5'- GTAATACGACTCACTA TAGGCCAACCACATTTTGGACAGC-3' (SEQ ID NO: 44);
APC (第1114位密碼子)的反向引物5'-AATTAACCCTCACTA AAGGGTCTTCTTGACACAAA GACTGGC-3' (SEQ ID NO: 45);
APC (第1306位密碼子)的正向引物5'- GTAATACGACTCACT ATAGGACACAGGAAGCAGATTCTGC-3' (SEQ ID NO: 46);
APC (第1306位密碼子)的反向引物5'-AATTAACCCTCACTAA AGGGCTATCAAGTGAACT GACAGAAG-3' (SEQ ID NO: 47); APC(第1450位密碼子)的正向引物5'-GTAATACGACTCACTATAGGC TTCCAGATAGCCCTGGACA畫3' (SEQ ID NO: 8);
APC (第1450位密碼子)的反向引物5'-AATTAACCCTCACTAAA GGGGCAGCATTTACTGCAGCTTG-3' (SEQ ID NO: 9);
APC (第1554位密碼子)的正向引物5'-GTAATACGACTCACTA TAGGGGGAATGAAACAGAATCAGAGC隱3' (SEQ ID NO: 48);
APC (第1554位密碼子)的反向引物5'-AATTAACCCTCACTAAAGG GCATCTGAATCATCT AATAGGTCC-3' (SEQ ID NO 49).
序列特異性提取將第一PCR的產(chǎn)物與IO種序列特異性探針混合用于提 取，其中每一種序列特異性探針與一種擴(kuò)增序列雜交并提取該序列。將2^L 上面擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物、lxPCR緩沖液、5mMEDTA,以及O.Olpmol/pL每一 種序列特異性探針，以總體積為20i!L的量加入到反應(yīng)管中。在以下條件進(jìn)行 探針與PCR產(chǎn)物的雜交首先在95。C變性DNA 5 min，接著以0.04。C/秒的速 率將溫度緩慢降低到25°C 。在雜交之后，將含5pL鏈霉親和素包被磁珠(Dynal Biotech, Oslo, Norway )的20 2x B&W緩沖液加入到雜交管中，接著將該雜 交管在室溫下溫育45min。用180pL lx TE緩沖液洗滌該磁珠3次。其后，接 著加入5 |LiL lx TE緩沖液以重懸浮該磁珠。將該磁珠在95。C加熱5 min,接著 將上清液轉(zhuǎn)移到清潔管中。這些序列特異性探針的序列是
K-ras: 5'-生物素-TTGGAGCTGGTGGCGTAG-3' (SEQ ID NO: 50);
p53 (第190位密碼子)5'-生物素-ATCTTATCCGAGTGGAAGG-3' (SEQ ID NO: 51);
p53 (第248位密碼子)5'-生物素-CCTGCATGGGCGGCATGA-3' (SEQ ID NO: 52);
p53 (第267位密碼子)5'-生物素-CTCTCCCAGGACAGGCAC-3'(SEQ ID NO: 53);
APC (第876位密碼子)5'-生物素-CTTCAAAGCGAGGTTTGC-3' (SEQ ID NO: 54);
APC(第1114位密碼子)5'-生物素-GAAACAAATCGAGTGGGT-3'(SEQ ID NO: 55);
APC (第1306位密碼子)5'-生物素-CAGTGTCACAGCACCCTA -3' (SEQ ID NO: 56);
APC (第1450位密碼子)5'-生物素-CCACCACCTCCTCAAACAG-3' (SEQ ID NO: 57);
APC (第1554位密碼子)5'-生物素-GAGGCAGAAAAAACTATTGA國(guó)3' (SEQ ID NO: 58);
BRAF: 5'隱生物素-CGAGATTTCACTGTAGCT匿3' (SEQ ID NO: 59);
第二PCR:使用0.5pL的第一輪PCR產(chǎn)物或約l(aL富集DNA作為用于 第二 PCR擴(kuò)增的模板，該第二 PCR擴(kuò)增分別使用T7的5'-D4-GTAAT ACGACTCACTATAGG-3' (SEQ ID NO: 60)和T3的5'-AATTAACCCTCAC TAAAGGG-3' (SEQ ID NO: 6)作為正向和反向引物。在該P(yáng)CR使用以下用量 的物質(zhì)lOpmol的正向和反向引物，每一種dNTP各0.2mM, lxPCR緩沖液， 2mMMgCl2, 0.05 u/pLTaqGoldDNA聚合酶，總反應(yīng)體積為20faL;在以下 條件進(jìn)行該P(yáng)CR:首先在95。C變性DNA 10 min,接著進(jìn)行38個(gè)以下循環(huán)(95°C 30秒，58。C30秒，72。C30秒)，最后在72。C保持5min用于延伸。該T7引 物具有熒光標(biāo)記，允許用DNA測(cè)序儀進(jìn)行最終PCR產(chǎn)物的片段分析。
圖11顯示本研究的結(jié)果，其中標(biāo)有1、 2...10的峰分別對(duì)應(yīng)于所擴(kuò)增的 10個(gè)序列。圖lla是在兩輪PCR之間沒有使用探針提取步驟所擴(kuò)增的PCR產(chǎn) 物的片段分析譜圖。清楚地，PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率變化很大，幾個(gè)序列甚至是檢 測(cè)不出的。圖llb顯示了在兩輪PCR之間增加探針提取步驟以及優(yōu)化10個(gè)探 針的摩爾比之后的結(jié)果，其中每一種PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率是相似的，這顯示了使 用探針提取程序來(lái)平衡多重PCR的產(chǎn)物產(chǎn)率的效果。值得注意的是，該探針 提取可以成為改進(jìn)多重PCR的一般方法。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式已經(jīng)描述了示例性實(shí)施方式。明顯地，通過(guò)閱讀和理 解上述詳細(xì)說(shuō)明，可以產(chǎn)生其他的修飾和改變?？梢岳斫獾氖牵纠詫?shí)施方 式應(yīng)該理解為包括所有的這些修飾和改進(jìn)，只要它們出現(xiàn)在后附權(quán)利要求或其 等同方式的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)量大量野生型DNA背景中多個(gè)突變標(biāo)記的狀態(tài)的方法，所述方法包括提供含有突變體DNA和野生型DNA的樣品，所述突變體DNA包含突變；通過(guò)第一PCR擴(kuò)增樣品以生產(chǎn)含有突變位點(diǎn)的DNA片段；通過(guò)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)突變體特異性富集循環(huán)富集含有突變的突變體DNA片段，從而形成富集體系；通過(guò)第二PCR擴(kuò)增該富集體系以生產(chǎn)足夠量的突變體DNA用于檢測(cè)；以及，測(cè)量靶突變位點(diǎn)的狀態(tài)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述突變位點(diǎn)包括一個(gè)或多個(gè)單 堿基的(i)取代、(ii)插入、(iii)缺失和(iv)它們的組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述樣品來(lái)源于收集自患者的臨 床生物樣品，所述生物樣品選自由人腫瘤組織、外周血、糞便、尿、體液、與 醫(yī)療過(guò)程相關(guān)的沖洗液以及它們的組合所組成的組中。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，在所述DNA樣品中所述野生型 DNA與突變體DNA的摩爾比為約2:1至約100,000:1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一PCR是使用兩對(duì)或兩對(duì) 以上PCR引物的多重PCR,其中每一對(duì)引物包括正向引物和反向引物，其中 每一對(duì)引物適合于擴(kuò)增含有一個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn)的序列，并且其中每一個(gè)引物 包括輩巴特異性部分和通用尾部，其中所述靶特異性部分側(cè)接于所述序列以允許的，其中所述通用尾部不能夠與人基因組序列相結(jié)合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述突變體特異性富集循環(huán)選自 由以下所組成的組中(i)減少野生型DNA， (ii)選擇性俘獲突變體DNA， 以及(iii) (i)和(ii)的組合。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述從多重PCR的擴(kuò)增子中富集 含有突變的突變體DNA片段通過(guò)以下(i)和(ii)的至少之一進(jìn)行(i)突 變特異性雜交和提取，以及(ii)竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s交和提取。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，富集含有突變的突變體DNA片 段是通過(guò)突變特異性雜交和提取進(jìn)行的，其中在雜交條件下使多個(gè)突變體特異 性探針與第一 PCR的DNA片段接觸，其中每一個(gè)突變體特異性探針優(yōu)先與突 變體序列形成雜交物，其中還將所述突變體特異性探針連接到第一結(jié)合分子 上，所述第一結(jié)合分子能夠與連接到固體載體上的第二結(jié)合分子相結(jié)合；以及, 其中在雜交之后，使所述雜交物被含有第二結(jié)合分子的所述固體載體俘獲。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所進(jìn)行的突變體特異性富集循環(huán) 的循環(huán)數(shù)范圍為1至5個(gè)循環(huán)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為l個(gè)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為2個(gè)或2個(gè)以上。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，重復(fù)所述突變特異性雜交和提 取，其中將被所述固體載體提取的DNA片段從固體載體中釋放出來(lái)，然后進(jìn) 行另外的突變特異性富集和提取的循環(huán)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述突變體特異性探針選自由寡 核苷酸、肽核酸、鎖核酸以及它們的組合所組成的組中。
14. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述第一結(jié)合分子選自由生物素、 鏈霉親和素以及它們的組合所組成的組中，所述第二結(jié)合分子選自由鏈霉親和 素、生物素以及它們的組合所組成的組中。
15. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，富集含有突變位點(diǎn)的DNA片段 是通過(guò)竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s交和提取進(jìn)行的，其中在雜交條件下使多個(gè)突變體 特異性探針和正常竟?fàn)幪结樑c第一 PCR的DNA片段接觸，其中每一個(gè)突變體 特異性探針優(yōu)先與突變體序列形成雜交物，而其對(duì)應(yīng)的正常竟?fàn)幪结槂?yōu)先與對(duì) 應(yīng)的野生型序列形成雜交物，其中還將所述突變體特異性探針連接到第一結(jié)合 分子上，所述第一結(jié)合分子能夠與連接到固體載體上的第二結(jié)合分子相結(jié)合； 以及，在雜交之后，使所述雜交物被含有第二結(jié)合分子的所述固體載體俘獲。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所進(jìn)行的竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s 交和提取的循環(huán)的循環(huán)數(shù)范圍為1至5個(gè)循環(huán)。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為l個(gè)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為2個(gè)或2個(gè)以上。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，重復(fù)所述竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s 交和提取，其中將被所述固體載體提取的DNA片段從固體載體中釋放出來(lái)， 然后進(jìn)行另外的竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋愿患吞崛〉难h(huán)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求15所迷的方法，其中，所述突變體特異性探針和正常 竟?fàn)幪结樁歼x自由寡核苷酸、肽核酸、鎖核酸以及它們的組合所組成的組中。
21. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，每一種突變體特異性探針與其 對(duì)應(yīng)的正常竟?fàn)幪结樀哪柋葹榧s0.02:1至約10:1。
22. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述第一結(jié)合分子選自由生物 素、鏈霉親和素以及它們的組合所組成的組中，所述第二結(jié)合分子選自由鏈霉 親和素、生物素以及它們的組合所組成的組中。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一PCR使用兩對(duì)或兩對(duì) 以上的PCR引物，每一對(duì)引物包括正向引物和反向引物，每一對(duì)引物包括通 用尾；第二 PCR是通過(guò)使含有突變的富集DNA片段與通用引物接觸來(lái)進(jìn)行的，DNA片段。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，當(dāng)?shù)谝籔CR的正向和反向引物 的通用尾相同時(shí)，第二PCR使用一個(gè)通用引物；當(dāng)?shù)谝籔CR的正向和反向引 物的通用尾不同時(shí)，第二PCR使用兩個(gè)通用引物，其中一個(gè)通用引物與第一 PCR的正向引物的通用尾配對(duì)，而另 一個(gè)通用引物與第——一 PCR的反向引物的 通用尾配只十。
25. —種用于生產(chǎn)足夠純的突變體DNA片段的方法，所述突變體DNA 片段是用于測(cè)定大量野生型DNA背景中多個(gè)DNA突變位點(diǎn)的突變狀態(tài)，所 述方法包括提供含有突變體DNA和野生型DNA的DNA樣品；通過(guò)多重 PCR擴(kuò)增包含突變位點(diǎn)的DNA序列，從而生產(chǎn)擴(kuò)增子；以及，從PCR的擴(kuò) 增子中富集具有突變的突變體DNA片段。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述DNA突變選自由一個(gè)或 多個(gè)單堿基(i)取代、(ii)插入、(m)缺失和(iv)它們的組合所組成的組 中。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述DNA樣品來(lái)源于收集自 患者的臨床生物樣品，所述生物樣品選自由人腫瘤組織、外周血、糞便、尿、 體液、與醫(yī)療過(guò)程相關(guān)的沖洗液以及它們的組合所組成的組中。
28. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，在所述DNA樣品中野生型DNA 與突變體DNA的摩爾比為約2:1至約100,000:1。
29. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述多重PCR使用兩對(duì)或兩對(duì) 以上的PCR引物，其中每一對(duì)引物與含有一個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn)的序列雜交用 于擴(kuò)增所述序列。
30. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，富集突變體DNA片段是通過(guò) 選自由以下所組成的組中的操作進(jìn)行的(i)減少野生型DNA, (ii)選擇性 俘獲突變體DNA，以及(m) (i)和(ii)的組合。
31. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述從多重PCR的擴(kuò)增子中富 集含有突變的突變體DNA片段通過(guò)以下(i)和(ii)的至少之一進(jìn)行(i) 突變特異性雜交和提取，以及(ii)竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s交和提取。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，富集是通過(guò)突變特異性雜交和 提取進(jìn)行的，這是通過(guò)以下過(guò)程進(jìn)行的在雜交條件下使多個(gè)突變體特異性探 針與多重PCR的擴(kuò)增子接觸，其中突變體特異性探針優(yōu)先與突變體序列形成 雜交物，其中還將所述突變特異性雜交探針連接到第一結(jié)合分子上，所述第一 結(jié)合分子能夠與連接到固體載體上的第二結(jié)合分子相結(jié)合；以及,在雜交之后， 使所述雜交物被含有第二結(jié)合分子的所述固體載體俘獲。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，所進(jìn)行的突變體特異性富集循 環(huán)的循環(huán)數(shù)范圍為1至5個(gè)循環(huán)。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為l個(gè)。
35. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為2個(gè)或2個(gè)以上。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中，重復(fù)所述突變特異性雜交和提 取，其中將被所述固體載體提取的DNA片段從固體載體中釋放出來(lái)，然后進(jìn) 行另外的突變特異性富集和提取的循環(huán)。
37. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述突變體特異性探針選自由 寡核苦酸、肽核酸、鎖核酸以及它們的組合所組成的組中。
38. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述第一結(jié)合分子選自由生物 素、鏈霉親和素以及它們的組合所組成的組中，所述第二結(jié)合分子選自由鏈霉 親和素、生物素以及它們的組合所組成的組中。
39. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，富集是通過(guò)竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋?雜交和提取進(jìn)行的，這是通過(guò)以下過(guò)程進(jìn)行的在雜交條件下使多個(gè)突變體特 異性探針和正常竟?fàn)幪结樑c多重PCR的擴(kuò)增子接觸，其中每一個(gè)突變體特異 性探針優(yōu)先與突變體序列形成雜交物，而其對(duì)應(yīng)的正常竟?fàn)幪结槂?yōu)先與對(duì)應(yīng)的 野生型序列形成雜交物，其中還將所述突變體特異性纟冢針連接到第一結(jié)合分子 上，所述第一結(jié)合分子能夠與連接到固體載體上的第二結(jié)合分子相結(jié)合；以及， 在雜交之后，使所述雜交物被含有第二結(jié)合分子的所述固體載體俘獲。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，所進(jìn)行的竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s 交和^是:取的循環(huán)的循環(huán)數(shù)范圍為1至5個(gè)循環(huán)。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為l個(gè)。
42. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為2個(gè)或2個(gè)以上。
43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中，重復(fù)所述竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋噪s 交和提取，其中將被所述固體載體提取的DNA片段從固體載體中釋放出來(lái)， 然后進(jìn)行另外的竟?fàn)幮酝蛔兲禺愋愿患吞崛〉难h(huán)。
44. 4艮據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述突變體特異性探針和正常 竟?fàn)幪结樁歼x自由寡核苷酸、肽核酸、鎖核酸以及它們的組合所組成的組中。
45. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，每一種突變體特異性探針與其 對(duì)應(yīng)的正常竟?fàn)幪结樀哪柋葹榧s0.02:1至約10:1。
46. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述第一結(jié)合分子選自由生物 素、鏈霉親和素以及它們的組合所組成的組中，所述第二結(jié)合分子選自由鏈霉 親和素、生物素以及它們的組合所組成的組中。
47. —種用于測(cè)量大量未甲基化DNA背景中大量CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài) 的方法，所述方法包括提供含有甲基化DNA和未曱基化DNA的樣品； 處理所述樣品以將未曱基化DNA中的胞嘧啶基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏せ鶊F(tuán)； 用引物通過(guò)第一 PCR擴(kuò)增該處理過(guò)的樣品，從而獲得所有的尿嘧啶基團(tuán) 都被轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏せ鶊F(tuán)的DNA片段；通過(guò)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)曱基化特異性富集循環(huán)富集甲基化DNA，從而形成 富集體系；通過(guò)第二 PCR擴(kuò)增所述富集體系以生產(chǎn)足夠量的曱基化DNA用于檢測(cè)；以及測(cè)量CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。
48. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述樣品來(lái)源于收集自患者的 臨床生物樣品，所述生物樣品選自由人腫瘤組織、外周血、糞便、尿、體液、 與醫(yī)療過(guò)程相關(guān)的沖洗液以及它們的組合所組成的組中。
49. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中，在所述樣品中未曱基化DNA 與甲基化DNA的摩爾比為約2:1至約100,000:1。
50. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述CpG位點(diǎn)在一個(gè)或多個(gè)基 因上。
51. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述處理是通過(guò)使用亞硫酸氫 鹽反應(yīng)進(jìn)行的。
52. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述第一PCR是使用兩對(duì)或兩 對(duì)以上PCR引物的多重PCR，其中每一對(duì)引物包括正向引物和反向引物，其 中每一對(duì)引物適合于擴(kuò)增含有一個(gè)或多個(gè)CpG位點(diǎn)的序列，并且其中每一個(gè) 弓1物包括靶特異性部分和通用尾部，其中所述靶特異性部分側(cè)接于所述序列以 允許擴(kuò)增所述序列，并且對(duì)于所有的正向和反向引物所述通用尾部的序列相
53. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述曱基化特異性富集循環(huán)選 自由以下所組成的組中(i)減少未甲基化DNA， (ii)選擇性俘獲曱基化 DNA,以及(iii) (i)和(ii)的組合。
54. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述從多重PCR的擴(kuò)增子中富 集含有在CpG位點(diǎn)上的曱基化胞嘧啶的曱基化DNA片段是通過(guò)以下(i)和(ii)的至少之一進(jìn)行的(i)曱基化特異性雜交和提取，和(ii)竟?fàn)幮酝蛔?特異性雜交和提取。
55. 根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中，富集是通過(guò)曱基化特異性雜交 和提取進(jìn)行的，其中在雜交條件下使多個(gè)曱基化特異性探針與第一 PCR的 DNA片段接觸，其中每一個(gè)曱基化特異性探針優(yōu)先與曱基化序列形成雜交物， 其中還將所述曱基化特異性纟笨針連接到第一結(jié)合分子上，所述第一結(jié)合分子能 夠與連接到固體載體上的第二結(jié)合分子相結(jié)合；以及，在雜交之后，使所述雜 交物被含有第二結(jié)合分子的所述固體載體俘獲。
56. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中，所進(jìn)行的曱基化特異性雜交和 提取的循環(huán)的循環(huán)數(shù)范圍為1至5個(gè)循環(huán)。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為l個(gè)。
58. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為2個(gè)或2個(gè)以上。
59. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中，重復(fù)所述曱基化特異性雜交和 提取，其中將被所述固體載體俘獲的DNA片段從固體載體中釋放出來(lái)，然后 進(jìn)行另外的曱基化特異性雜交和提取的循環(huán)。
60. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中，所述曱基化特異性探針選自由 寡核苦酸、肽核酸、鎖核酸以及它們的組合所組成的組中。
61. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中，所述第一結(jié)合分子選自由生物 素、鏈霉親和素以及它們的組合所組成的組中，所述第二結(jié)合分子選自由鏈霹 親和素、生物素以及它們的組合所組成的組中。
62. 根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中，富集甲基化DNA片段是通過(guò) 竟?fàn)幮詴趸禺愋噪s交和提取進(jìn)行的，其中在雜交條件下使多個(gè)曱基化特異 性探針和未甲基化竟?fàn)幪结樑c第一 PCR的DNA片段接觸，其中所述曱基化特 異性探針優(yōu)先與甲基化序列形成雜交物，而對(duì)應(yīng)的未曱基化竟?fàn)幪结槂?yōu)先與對(duì) 應(yīng)的未甲基化DNA片段形成雜交物，其中還將所述甲基化特異性探針連接到 第一結(jié)合分子上，所述第一結(jié)合分子能夠與連接到固體載體上的第二結(jié)合分子 相結(jié)合；以及，在雜交之后，使所述雜交物被含有第二結(jié)合分子的所述固體載 體俘獲。
63. 根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中，所進(jìn)行的竟?fàn)幮约谆禺愋?雜交和提取的循環(huán)的循環(huán)數(shù)范圍為1至5個(gè)循環(huán)。
64. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為l個(gè)。
65. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為2個(gè)或2個(gè)以上。
66. 根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中，重復(fù)所述竟?fàn)幮詴趸禺愋?雜交和提取，其中將被所述固體載體俘獲的DNA片段從固體載體中釋放出來(lái)， 然后進(jìn)行另外的竟?fàn)幮詴趸禺愋噪s交和提取的循環(huán)。
67. 根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中，所述曱基化特異性探針選自由 寡核苷酸、肽核酸、鎖核酸以及它們的組合所組成的組中。
68. 根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中，所述第一結(jié)合分子選自由生物 素、鏈霉親和素以及它們的組合所組成的組中，所述第二結(jié)合分子選自由鏈霉 親和素、生物素以及它們的組合所組成的組中。
69. 根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中，曱基化特異性探針與相應(yīng)的未 甲基化竟?fàn)幪结樀哪柋葹榧s0.02:1至約10:1。
70. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述第一PCR使用兩對(duì)或兩對(duì) 以上引物，每一對(duì)引物包括正向引物和反向引物，每一對(duì)引物包括通用尾；第 二 PCR是通過(guò)使富集的曱基化DNA片段與通用引物接觸來(lái)進(jìn)行的，其中所述 通用引物與正向和反向引物的通用尾雜交以擴(kuò)增所有富集的DNA片段。
71. 根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中，當(dāng)?shù)谝籔CR的正向和反向引物 的通用尾相同時(shí)，第二PCR使用一個(gè)通用引物；當(dāng)?shù)谝籔CR的正向和反向引 物的通用尾不同時(shí)，第二 PCR使用兩個(gè)通用引物，其中一個(gè)通用引物與第一 PCR的正向引物的通用尾配對(duì)，而另 一個(gè)通用引物與第一 PCR的反向引物的 通用尾配對(duì)。
72. —種用于生產(chǎn)足夠純的曱基化DNA片段的方法，所述曱基化DNA 片段是用于測(cè)定大量未曱基化DNA背景中多個(gè)DNA CpG位點(diǎn)的曱基化狀態(tài)， 所述方法包括提供含有曱基化DNA和未曱基化DNA的DNA樣品；使DNA 樣品進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理；通過(guò)多重PCR擴(kuò)增含有曱基化CpG位點(diǎn)的DNA 序列，從而生產(chǎn)擴(kuò)增子；以及，從PCR的擴(kuò)增子中富集含有曱基化CpG位點(diǎn) 的甲基化DNA片段。
73. 根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中，所述DNA樣品來(lái)源于收集自 患者的臨床生物樣品，所述生物樣品選自由人腫瘤組織、外周血、糞便、尿、 體液、與醫(yī)療過(guò)程相關(guān)的沖洗液以及它們的組合所組成的組中。
74. 根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中，在所述DNA樣品中未曱基化 DNA與曱基化DNA的摩爾比為約2:1至約100,000:1。
75. 根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中，所述CpG位點(diǎn)在一個(gè)或多個(gè)基 因上。
76. 根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中，所述亞硫酸氫鹽處理將CpG位 點(diǎn)上的未甲基化胞嘧咬轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚴纫?，而CpG位點(diǎn)上的曱基化胞嘧啶保持不 變。
77. 根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其中，所述多重PCR使用兩對(duì)或兩對(duì) 以上的PCR引物，其中使每一對(duì)引物與含有 一個(gè)或多個(gè)CpG位點(diǎn)的序列雜交 用于擴(kuò)增所述序列。
78. 根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中，多重PCR將尿嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵?嘧啶。
79. 根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中，所述從多重PCR的擴(kuò)增子中富 集含有曱基化CpG位點(diǎn)的曱基化DNA片段是通過(guò)以下(i)和(ii)的至少之 一進(jìn)行的(i)甲基化特異性雜交和提取，以及(ii)竟?fàn)幮约谆禺愋噪s 交和提取。
80. 根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其中，富集是通過(guò)曱基化特異性雜交 和提取進(jìn)行的，其中在雜交條件下使多個(gè)曱基化特異性探針與第一 PCR的 DNA片段接觸，其中每一個(gè)曱基化特異性探針優(yōu)先與甲基化序列形成雜交物， 其中還將所述曱基化特異性探針連接到第一結(jié)合分子上，所述第一結(jié)合分子能 夠與連接到固體載體上的第二結(jié)合分子相結(jié)合；以及，在雜交之后，使所述雜 交物被含有第二結(jié)合分子的所述固體載體俘獲。
81. 根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中，所進(jìn)行的竟?fàn)幮詴趸禺愋?雜交和提取的循環(huán)的循環(huán)數(shù)范圍為1至5個(gè)循環(huán)。
82. 根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為l個(gè)。
83. 根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為2個(gè)或2個(gè)以上。
84. 根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法，其中，重復(fù)所述曱基化特異性雜交和 提取，其中將被所述固體載體俘獲的DNA片段從固體載體中釋放出來(lái)，然后 進(jìn)行另外的甲基化特異性雜交和提取的循環(huán)。
85. 根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中，所述曱基化特異性探針選自由 寡核苷酸、肽核酸、鎖核酸以及它們的組合所組成的組中。
86. 根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中，所述第一結(jié)合分子選自由生物 素、鏈霉親和素以及它們的組合所組成的組中，所述第二結(jié)合分子選自由鏈霉 親和素、生物素以及它們的組合所組成的組中。
87. 根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其中，富集曱基化DNA片段是通過(guò) 竟?fàn)幮詴趸禺愋噪s交和提取進(jìn)行的，其中在雜交條件下使多個(gè)甲基化特異 性探針和未甲基化竟?fàn)幪结樑c第一 PCR的DNA片段接觸，其中甲基化特異性 探針優(yōu)先與曱基化序列形成雜交物，而對(duì)應(yīng)的未曱基化竟?fàn)幪结槂?yōu)先與對(duì)應(yīng)的 未甲基化DNA片段形成雜交物，其中還將所述甲基化特異性探針連接到第一 結(jié)合分子上，所述第一結(jié)合分子能夠與連接到固體載體上的第二結(jié)合分子相結(jié) 合；以及，在雜交之后，使所述雜交物被含有第二結(jié)合分子的所述固體載體俘 獲。
88. 根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中，所進(jìn)行的竟?fàn)幮詴趸禺愋?雜交和提取的循環(huán)的循環(huán)數(shù)范圍為1至5個(gè)循環(huán)。
89. 根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為l個(gè)。
90. 根據(jù)權(quán)利要求88所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為2個(gè)或2個(gè)以上。
91. 根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法，其中，重復(fù)所述竟?fàn)幮约谆禺愋?雜交和提取，其中將被所述固體載體俘獲的DNA片段從固體載體中釋放出來(lái)， 然后進(jìn)行另外的竟?fàn)幮约谆禺愋噪s交和提取的循環(huán)。
92. 根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中，所述曱基化特異性探針選自由 寡核香酸、肽核酸、鎖核酸以及它們的組合所組成的組中。
93. 根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中，所述第一結(jié)合分子選自由生物 素、鏈霉親和素以及它們的組合所組成的組中，所述第二結(jié)合分子選自由鏈霉 親和素、生物素以及它們的組合所組成的組中。
94. 根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中，曱基化特異性探針與對(duì)應(yīng)的未 曱基化竟?fàn)幪结樀哪柋葹榧s0.02:1至約10:1。
95. —種用于除去由多重PCR產(chǎn)生的引物-引物相互作用產(chǎn)物的方法，所 述方法包括通過(guò)多重PCR擴(kuò)增靶DNA序列；以及，通過(guò)序列特異性俘獲除 去引物-引物相互作用產(chǎn)物來(lái)純化多重PCR的擴(kuò)增把序列。
96. 根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其中，所述多重PCR使用兩對(duì)或兩對(duì) 以上的PCR引物，其中每一對(duì)引物適合于擴(kuò)增一個(gè)耙序列。
97. 根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其中，所述序列特異性俘獲是通過(guò)在雜交條件下使多個(gè)序列特異性探針與多重PCR的擴(kuò)增子接觸來(lái)進(jìn)行的，其中所述序列特異性探針優(yōu)先與靶序列形成雜交物，其中還將所述序列特異性探針連接到第一結(jié)合分子上，所述第一結(jié)合分子能夠與連接到固體載體上的第二結(jié)合分子相結(jié)合；以及，在雜交之后，使所述雜交物被含有第二結(jié)合分子的所述 固體載體俘獲。
98. 根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中，所進(jìn)行的序列特異性俘獲循環(huán) 的循環(huán)數(shù)范圍為1至5個(gè)循環(huán)。
99. 根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為l個(gè)。
100. 根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法，其中，所述循環(huán)數(shù)為2個(gè)或2個(gè)以上。
101. 根據(jù)權(quán)利要求100所述的方法，其中，重復(fù)所述序列特異性俘獲， 其中將被所述固體載體提取的DNA片段從固體載體中釋放出來(lái)，然后進(jìn)行另 外的序列特異性俘獲循環(huán)。
102. 根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中，所述序列特異性探針選自由寡 核苷酸、肽核酸、鎖核酸以及它們的組合所組成的組中，并且其中所述序列特 異性探針不與多重PCR的引物序列相結(jié)合。
103. 根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中，所述第一結(jié)合分子選自由生物 素、鏈霉親和素以及它們的組合所組成的組中，所述第二結(jié)合分子選自由鏈霉 親和素、生物素以及它們的組合所組成的組中。
104. —種用于使多級(jí)多重PCR更強(qiáng)大的方法，所述方法包括 提供含有耙序列的樣品；通過(guò)第一多重PCR擴(kuò)增所述樣品來(lái)形成含有引物-引物相互作用產(chǎn)物的第 一擴(kuò)增樣品；除去至少一部分引物-引物相互作用產(chǎn)物；以及，在除去引物-引物相互作用產(chǎn)物之后，通過(guò)第二多重PCR形成第二擴(kuò)增樣
105. 根據(jù)權(quán)利要求104所述的方法，其中，所述第一多重PCR使用具有 輩巴特異性部分和通用尾部的PCR引物。
106. —種用于平衡多個(gè)PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率的方法，其包括提供含有將要 被擴(kuò)增的靶序列的DNA樣品；通過(guò)第一 PCR擴(kuò)增靶DNA序列；平衡被第一 PCR擴(kuò)增出的靶序列的量；以及，通過(guò)第二PCR擴(kuò)增該平衡的靶DNA序歹'J。
107. 根據(jù)權(quán)利要求106所述的方法，其中，所述第一PCR是使用兩對(duì)或 兩對(duì)以上PCR引物的多重PCR,其中每一對(duì)引物包括正向引物和反向引物， 其中每一對(duì)？ 1物適合于擴(kuò)增輩巴序列，并且其中每一個(gè)《I物包括靶特異性部分和 通用尾部，其中所述靶特異性部分側(cè)接于所述靶序列以允許擴(kuò)增所述序列并且 對(duì)于所有的正向和反向引物所述通用尾部的序列相同，其中所述通用尾不能夠 與樣品中的任何DNA序列相結(jié)合。
108. 根據(jù)權(quán)利要求106所述的方法，其中，通過(guò)序列特異性俘獲使被第 一 PCR擴(kuò)增出的靶序列的量平衡，其中在雜交條件下使多個(gè)序列特異性雜交 探針與第一 PCR的擴(kuò)增子接觸，其中所述序列特異性探針優(yōu)先與靶序列形成 雜交物，其中還將所述序列特異性探針連接到第一結(jié)合分子上，所述第一結(jié)合 分子能夠與連接到固體載體上的第二結(jié)合分子相結(jié)合；以及在雜交之后，使所述雜交物被含有第二結(jié)合分子的所述固體載體俘獲；以及，調(diào)整序列特異性摞:針的摩爾比，使得通過(guò)加入較大量的對(duì)應(yīng)于所述低效擴(kuò)增序列的序列特異性探 針，使所述低效擴(kuò)增序列能夠被更有效地俘荻，以及通過(guò)加入較少量的對(duì)應(yīng)于 所述高效擴(kuò)增序列的序列特異性探針，使所述高效擴(kuò)增序列在雜交過(guò)程中#皮較 低效地俘獲。
109. 根據(jù)權(quán)利要求108所述的方法，其中，所述序列特異性探針選自由寡核香酸、肽核酸、鎖核酸以及它們的組合所組成的組中。
110. 根據(jù)權(quán)利要求108所述的方法，其中，所述第一結(jié)合分子選自由生 物素、鏈霉親和素以及它們的組合所組成的組中，所述第二結(jié)合分子選自由鏈 霉親和素、生物素以及它們的組合所組成的組中。
111. 根據(jù)權(quán)利要求108所述的方法，其中，重復(fù)所述序列特異性俘獲， 其中將被所述固體載體提取的DNA片段從固體載體中釋放出來(lái)，然后進(jìn)行另 外的序列特異性俘獲循環(huán)以獲得所需要的靶序列的平衡量。
112. 根據(jù)權(quán)利要求106所述的方法，其中，所述第一PCR使用兩對(duì)或兩 對(duì)以上的引物，每一對(duì)引物包括正向引物和反向引物，每一對(duì)引物包括通用尾; 第二PCR是通過(guò)使平衡的靶序列與通用引物接觸來(lái)進(jìn)行的，其中使所述通用 引物與正向和反向引物的通用尾雜交以擴(kuò)增所有的靶序列。
113. 根據(jù)權(quán)利要求112所述的方法，其中，當(dāng)?shù)谝籔CR的正向和反向引 物的通用尾相同時(shí)，第二PCR使用一個(gè)通用引物；當(dāng)?shù)谝籔CR的正向和反向 引物的通用尾不同時(shí)，第二 PCR使用兩個(gè)通用引物，其中一個(gè)通用引物與第 一PCR的正向引物的通用尾配對(duì)，而另一個(gè)通用引物與第一PCR的反向引物 的通用尾配對(duì)。
114. 一種用于平tf由多級(jí)多重PCR生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率的方法，所 述方法包括提供含有第 一耙序列和第二靶序列的樣品；鑒別第 一靶序列和第二靶序列的相對(duì)擴(kuò)增效率；將適合于以第 一靶序列為靶點(diǎn)的第 一探針和適合于以第二靶序列為靶點(diǎn) 的第二探針加入到所述樣品中，其中第 一探針與第二探針的摩爾比基于第 一和 第二耙序列的相對(duì)擴(kuò)增效率。
115. 根據(jù)權(quán)利要求114所述的方法，其中，第一靶序列具有比第二靶序 列低的擴(kuò)增效率，因此增加第一4笨針與第二探針的摩爾比。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于同時(shí)測(cè)量大量DNA突變標(biāo)記的狀態(tài)的方法。此外，本發(fā)明還描述了用于在單個(gè)分析中同時(shí)測(cè)定一組基因的多個(gè)位點(diǎn)上的甲基化狀態(tài)的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101370945SQ200680042545
公開日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2006年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者郭保川 申請(qǐng)人:克利夫蘭州立大學(xué)