專利名稱：：分子光電器件及其制造方法分子光電器件及其制造方法發(fā)明領(lǐng)域和發(fā)明背景本發(fā)明涉及光催化單元(photocatalyticunit),更具體地講，本發(fā)明涉及用光催化單元制造的固相支持體。本發(fā)明還涉及包括光催化單元的分子光電器件。納米科學(xué)是一門研究材料中微小粒子的科學(xué)，是現(xiàn)代技術(shù)中最重要的研究尖端領(lǐng)域之一。從基本觀點(diǎn)出發(fā)，這些微小粒子令人矚目，因?yàn)樗鼈兡軌驑?gòu)建具有精確性質(zhì)的材料和結(jié)構(gòu)。由于這種精確控制材料性質(zhì)的能力，從而為科技和商業(yè)開(kāi)發(fā)帶來(lái)了新的機(jī)遇，納米顆粒已經(jīng)應(yīng)用于或有望應(yīng)用于諸如微電子學(xué)和納米電子學(xué)、納米流控學(xué)(nanofluidics)、涂料油漆和生物工程學(xué)等眾多領(lǐng)域。十分明確的是，通過(guò)增加器件元件的組裝密度，微電子技術(shù)、磁記錄器件和化學(xué)傳感器的未來(lái)發(fā)展將得到實(shí)現(xiàn)。傳統(tǒng)上，顯微器件一直用較大的物體制造，但是因?yàn)檫@些產(chǎn)品越來(lái)越小，在微米水平以下，這一工藝變得日漸困難。因此預(yù)期將使用相反的方法，基本上，主要是通過(guò)納米尺度的材料，從分子水平起建造顯孩i器件。目前，所制造的分子電路的清晰度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)常規(guī)圖形化技術(shù)(例如電子束蝕刻)。然而實(shí)際上，具有亞納米精度的分子定位是常規(guī)的，而且對(duì)操作生物復(fù)合體例如光合復(fù)合體是至關(guān)重要的。綠色植物、藍(lán)細(xì)菌和光合細(xì)菌依靠分子電子復(fù)合體這一鑲嵌在其膜內(nèi)的反應(yīng)中心捕獲和利用太陽(yáng)光。在產(chǎn)氧植物和藍(lán)細(xì)菌中，光子捕獲光能并將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能發(fā)生在被稱為類嚢體的特化膜上。類嚢體位于高等植物的葉綠體中，或者由藍(lán)細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜折疊構(gòu)成。類嚢體由垛疊的膜圓盤(稱為基粒)和非垛疊的膜圓盤(稱為基質(zhì))組成。類囊體膜含有兩個(gè)關(guān)鍵的光合組分，光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II,分別命名為psi和psn。光合作用需要psn和psi依次工作，用水作為電子源，用032作為最終電子受體。psi是一種跨膜多亞基蛋白質(zhì)-葉綠素復(fù)合體，它介導(dǎo)矢量的光誘導(dǎo)的電子傳遞。PSI尺度為納米大小，產(chǎn)能約58%，量子效率幾乎等于1[K.Brettel,S/(x:/2/m.i5/0;7/2,jcto1997，322-373]，這使得反應(yīng)中心在分子納米電子學(xué)應(yīng)用中成為有前景的單元。PSI介導(dǎo)光誘導(dǎo)電子從質(zhì)體藍(lán)素或細(xì)胞色素C553傳遞到鐵氧還蛋白上。纟田長(zhǎng)聚球藻(S少"ec/7ocoowe/o"gato力和植物葉綠體中PSI的晶體結(jié)構(gòu)分別解析為2.5A和4.4A[P.Jordan等，Wato廠e2001，4"909-917;A.BenShem等，A^we2003,W<5630-635]。藍(lán)細(xì)菌中，復(fù)合體由12個(gè)多肽組成，其中部分結(jié)合96個(gè)集光葉綠素和22個(gè)P類胡蘿卜素分子。電子傳遞鏈含有P700、Ao、A,、Fx、Fa和Fb,分別表示葉綠素a二聚體、單體葉綠素a、2個(gè)葉綠醌和3個(gè)[4Fe-4S]鐵硫中心。反應(yīng)中心核心復(fù)合體由異二聚體PsaA和PsaB亞基組成，含有原初電子供體P700，該供體進(jìn)行光誘導(dǎo)電荷分離，并通過(guò)順序傳遞體A、A!和Fx傳遞電子。最終受體Fa和FB位于另一個(gè)亞基PsaC上。原初供體P700的氧化還原電位為+0.43V,最終受體FB的氧化還原電位為-0.53V,產(chǎn)生的氧化還原差為-1.0V。電荷分離橫跨約5nm的蛋白質(zhì)高度，表示原初供體(P700)與最終受體(Fb)之間中心至中心的距離。蛋白質(zhì)復(fù)合體的三聚體和單體高為9nm，直徑分別為21nm和15nm。因?yàn)镻SI反應(yīng)中心為色素-蛋白質(zhì)復(fù)合體，負(fù)責(zé)光能向化學(xué)能的光合轉(zhuǎn)化，所以這些反應(yīng)中心可以在各種不同的器件中用作電子元件。這些可能的器件包括但不限于空間成像器件(spatial皿agmgdevice)、太陽(yáng)能電池、光計(jì)算和邏輯門(opticalcomputingandlogicgate)、光電開(kāi)關(guān)、光子A/D轉(zhuǎn)換器和薄膜"柔性"光致電壓結(jié)構(gòu)(thinfilm"flexible"photovoltaicstructure)。然而，為了將這些PSI反應(yīng)中心整合到分子器件中，將PSI反應(yīng)中心固定在基片(substrate)上而不會(huì)變性是必不可少的。在早期的研究工作中，所關(guān)注的是將植物PSI[I.Lee等，丄尸/z，.C/7ew.萬(wàn)2000,2439-2443;R.Das,A^"o2004,41079-1083]和細(xì)菌反應(yīng)中心[C.Nakamura等,jpp/z'ed所0c/2ew/W^y歷她c/2脂/ogy2000,401-408;S.A,Trammell等，說(shuō)騰膨ra&價(jià)oe/erfra"/"2004,791649-1655]與固體表面非共價(jià)連接，以避免自組裝單層膜失活。因此，通過(guò)加入六組氨酸尾標(biāo)，使得經(jīng)遺傳修飾的細(xì)菌反應(yīng)中心[S.A.Trammell等，Wo化腦ra&腸e/e"腦,cs2004,791649-1655〗和植物PSI[Das,2004,41079-1083]與涂敷聚合物的金屬表面非共價(jià)結(jié)合。連接有組氨酸的細(xì)菌反應(yīng)中心顯示，可以在電化學(xué)電池的溶液中產(chǎn)生光電流。有組氨酸尾標(biāo)的PSI則顯示是定向的，但未見(jiàn)報(bào)道能產(chǎn)生光電流或光電位。另外，Das(同上)所教導(dǎo)的有組氨酸尾標(biāo)的PSI,為了與固體表面連接，需要用肽表面活性劑固定。Lee等[,/.尸/,C/^w.B2000]教導(dǎo)用有機(jī)分子涂敷金屬表面，使PSI非共價(jià)地吸附在有機(jī)層上。這種情況下，蛋白質(zhì)呈數(shù)個(gè)方向。Lee等[說(shuō)0M"TO廠5&說(shuō)oe/e"ra"/",1996,375-387]教導(dǎo)鈾沉積在光合月莫表面，表現(xiàn)為與PSI的受體側(cè)形成直接的電接觸，因?yàn)檫@能夠催化氬析出。此外，還顯示可以在分離的PSI反應(yīng)中心上鍍鉑，因?yàn)殄冦K后，遇光可產(chǎn)生氫。然而，這些方法都沒(méi)有教導(dǎo)功能性PSI反應(yīng)中心與固體表面的共價(jià)連接，當(dāng)然也沒(méi)有教導(dǎo)共^介連接的定向方式。未定向的PSI反應(yīng)中心將相互抵消，妨礙PSI固定化器件用于光電器件(例如太陽(yáng)能電池或邏輯門)。因此，普遍認(rèn)為有需要而且將極其有利的是合成能夠以定向方式與固體表面結(jié)合的活性PSI反應(yīng)中心。發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供分離的修飾多肽，該多肽包含光合生物光催化單元的多肽的氨基酸序列，該氨基酸序列能夠介導(dǎo)光催化單元與固體表面的共價(jià)連接，并且在光催化單元連接到固體表面時(shí)仍保持光催化單元的光催化活性。本發(fā)明另一方面提供大量的分離多肽，該多肽包含光合生物光催化單元的多肽的氨基酸序列，該氨基酸序列能夠介導(dǎo)光催化單元與固體表面的共價(jià)連接，并且在光催化單元連接到固體表面時(shí)仍保持光催化單元的光催化活性，還能夠以相對(duì)于固體表面基本相同的方向定向。本發(fā)明又一方面提供分離的修飾光催化單元，該光催化單元包含修飾多肽，該多肽包含光合生物光催化單元的多肽的氨基酸序列，該氨基酸序列能夠介導(dǎo)光催化單元與固體表面的共價(jià)連接，并且在光催化單元連接到固體表面時(shí)仍保持光催化單元的光催化活性。本發(fā)明再一方面提供一種膜制品，該膜制品包含修飾光催化單元，該光催化單元包含修飾多肽，該修飾多肽包含光合生物光催化單元的多肽的氨基酸序列，該氨基酸序列能夠介導(dǎo)光催化單元與固體表面的共價(jià)連接，并且在光催化單元連接到固體表面時(shí)仍保持光催化單元的光催化活性。本發(fā)明還有一方面提供分離的修飾多肽編碼多核苷酸，該修飾多肽包含光合生物光催化單元的多肽的氨基酸序列，該氨基酸序列能夠介導(dǎo)光催化單元與固體表面的共價(jià)連接，并且在光催化單元連接到固體表面時(shí)仍保持光催化單元的光催化活性。本發(fā)明還再有一方面提供一種核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含修飾多肽編碼多核苷酸，該修飾多肽包含光合生物光催化單元的多肽的氨基酸序列，該氨基酸序列能夠介導(dǎo)光催化單元與固體表面的共價(jià)連接，并且在光催化單元連接到固體表面時(shí)仍保持光催化單元的光催化活性。本發(fā)明另再有一方面提供一種細(xì)胞，該細(xì)胞包含分離的修飾多肽編碼多核苷酸，該修飾多肽包含光合生物光催化單元的多肽的氨基酸序列，該氨基酸序列能夠介導(dǎo)光催化單元與固體表面的共價(jià)連接，并且在光催化單元連接到固體表面時(shí)仍保持光催化單元的光催化活性。本發(fā)明又一方面提供一種器件，該器件包括連接有大量的修飾光催化單元的固體表面，該光催化單元包含修飾多肽，該修飾多肽包含光合生物光催化單元的多肽的氨基酸序列，該氨基酸序列能夠介導(dǎo)光催化單元與固體表面的共價(jià)連接，并且在光催化單元連接到固體表面時(shí)仍保持光催化單元的光催化活性。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選的實(shí)施方案中的另一個(gè)特征，光合生物為綠色植物。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，光合生物為藍(lán)細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，光催化單元為PS-1。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，光催化單元為集胞藻(5yec/2oy，toPCC6803光催化單元。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，光催化單元的多肽的氨基酸序列包含至少一個(gè)置換突變。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，置換突變是在光催化單元的膜外環(huán)上。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，多肽的氨基酸序列為PsaB。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，多肽的氨基酸序列為PsaC。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，psaB在至少一個(gè)用以下坐標(biāo)標(biāo)明的位置上包含置換突變D235C、S246C、D479C、S499C、S599C、Y634C。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，psaC在至少一個(gè)用坐標(biāo)W31C標(biāo)明的位置上包含置換突變。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，至少一個(gè)置換突變?yōu)榘腚装彼?。根?jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，該氨基酸序列如SEQIDNO:20、21、22、23、24、25、26、27、28和29中所示。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，固體表面為導(dǎo)電材料。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征過(guò)渡金屬元素。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征素選自銀、金、銅、鉑、鎳和鈀。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征多肽不包含金屬離子。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征多肽為單體形式或三聚體形式。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征還包含順式調(diào)節(jié)元件。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征件為啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征藻(5^wec/2(x;yW"、)纟田月包。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征光催化單元每個(gè)之間的距離介于15-25nm之間。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征光催化單元相對(duì)于固體表面是定向的。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征.導(dǎo)電材料為過(guò)渡金屬元分離的修飾寇分核酸構(gòu)建體順式調(diào)節(jié)元細(xì)胞為集胞大量的修飾大量的修飾該器件用作光電二級(jí)管的元件。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，該器件用作光電晶體管的元件。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，該器件用作邏輯門的元件。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，該器件用作太陽(yáng)能電池的元件。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，該器件用作光耦合器的元件。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，大量的修飾光催化單元與固體表面直接連接。根據(jù)本發(fā)明所述優(yōu)選的實(shí)施方案中的又一個(gè)特征，直接連接為共價(jià)連接。本發(fā)明通過(guò)提供—成功克服了現(xiàn)有已知配置的不足。屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員一般掌握的含義。下面將介紹合適的方法與材料，盡管類似于或等同于本文所述的方法與材料也可以用于本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中。所有的出版物、專利申請(qǐng)書(shū)、專利和其它本文引用的參考文獻(xiàn)都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。萬(wàn)一發(fā)生抵觸，則以本專利說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。另外，所述材料、方法和實(shí)施例僅是示例性的，而不是限制性的。附圖簡(jiǎn)述本文僅通過(guò)實(shí)施例并參考附圖描述本發(fā)明?，F(xiàn)在具體地參考附圖的細(xì)節(jié)，須強(qiáng)調(diào)的是，所顯示的詳細(xì)資料僅僅作為實(shí)例，為了說(shuō)明性地論述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并且提供這些詳細(xì)資料是為了提供所認(rèn)為的對(duì)本發(fā)明的原理和構(gòu)思方面最有用最容易理解的描述。在這方面，并沒(méi)有試圖以比基本理解本發(fā)明所必需的更為詳細(xì)的方式來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，從附圖獲取的說(shuō)明，使得在實(shí)踐中如何使本發(fā)明的所述幾種形式具體化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。附圖中圖1A-E表示PSI的半胱氨酸突變，提供了半胱氨酸突變是在PSI外面的證據(jù)。圖1A-C是在集胞藻PCC6803的戸W中通過(guò)同源重組引入突變時(shí)所用載體的示意圖。將1.8kb的戸W基因片段、卡那霉素^t性I武予基因(kanamycinresistanceconferringgene(KanR))和1.1kb下游側(cè)翼區(qū)(downstreamflankingregion)插入pBluescript載體中構(gòu)建了質(zhì)粒pZBL(圖1B)。為了篩選戸W缺陷型受體細(xì)胞，通過(guò)除去1.3kb的戸cr5下游端并插入氯霉素抗性基因(Cm"構(gòu)建了pBLAB載體(圖1C)?；蚪MDNA的限制位點(diǎn)如圖1A所示。圖ID為在"實(shí)心"處帶有所提出的突變的PSI結(jié)構(gòu)的骨架圖象。箭頭表示光誘導(dǎo)電荷傳遞的方向。PsaB亞基上突變成為半胱氨酸的氨基酸從左到右如下排列D235C、S246C、D479C、S499C、S599C、Y634C。這些坐標(biāo)得自PDB文件JBOl,借助RasMole軟件顯示。圖1E為分離的野生型PSI復(fù)合體(第1泳道)和經(jīng)遺傳修飾的PSI復(fù)合體(笫2-7泳道)外露表面半胱氨酸的免疫印跡照片。圖2A-B是定向PSI反應(yīng)中心在金表面的二維空間陣列圖象。圖象用輕敲模式原子力顯孩i鏡(tapping-modeatomicforcemicroscopy(AFM;面積0.3^112》獲得。圖2A是硅片(siliconslide)上退火的150nm金表面圖象，圖2B是在含有D479C突變多肽(SEQIDNO:20)的PSI單體溶液中溫育的金基片圖象。圖3A-B是金表面定向PSI反應(yīng)中心的二維空間圖和電位圖。Au-Si表面得自突變體D479C(SEQIDNO:20)的同一批PSI反應(yīng)中心三聚體的形貌圖象(圖3A)和電位圖象(圖3B)。PSI的光誘導(dǎo)PSI負(fù)電位見(jiàn)圖3B。用He-Ne激光(632.8nm,5mW/cm2)提供照明，并在圖象中標(biāo)出。圖3B所示電位的負(fù)號(hào)是由于KPFM反饋回路所致，與CPD的實(shí)際符號(hào)相反。圖4A-B是金表面定向PSI反應(yīng)中心的二維空間圖和電位圖。Au-Si表面得自突變體D479C的同一批PSI反應(yīng)中心三聚體的形貌圖象(圖4A)和電位圖象(圖4B)。PSI的光誘導(dǎo)PSI的負(fù)電位見(jiàn)圖4B。示意剖面圖的各光柵的掃描方向自上而下(由光至暗)。用He-Ne激光(632.8nm,5mW/cm2)提供照明。圖4B所示的電位負(fù)號(hào)是由于KPFM反饋回路所致，與CPD的實(shí)際符號(hào)相反。圖5A-B是金表面定向PSI反應(yīng)中心的三維形貌圖象和電位圖象。圖5A表示Au-Si表面PSI反應(yīng)中心單體的電位圖象。打開(kāi)He-Ne激光照明(632.8nm，5mW/cm2(/7力)時(shí)，觀察到PSI的光誘導(dǎo)PSI負(fù)電位。示意剖面圖的各光柵的掃描方向自上而下(由暗至光)。圖5B表示Au-Si基片上PSI三聚體的三維形貌圖。圖6A-B為PSI的光譜測(cè)定。圖6A表示在分離的PSI突變體(SEQIDNO:20)中閃光誘導(dǎo)的P700的瞬時(shí)吸收變化。使激光閃光普照D479C突變PSI復(fù)合體后，在820nm(AA咖)下監(jiān)測(cè)P700的吸收變化。圖6B表示定向PSI復(fù)合體的X射線吸收光譜。自組裝單層膜的PSI取向用掠射X射線焚光全反射測(cè)定法(totalreflectionmeasurementofgrazingx-rayfluorescence》則定。PSI通過(guò)"舉一的半月先氨酸與在硅基片之上鴒-碳多層中鵠之間形成硫鍵連接。各圖是按與X射線束常態(tài)25(--)、45(△)、60(-)和90(O)度的規(guī)定角度，60秒、42秒掃描的平均值。圖7是本發(fā)明不同示例性實(shí)施方案的光電器件的示意圖。圖8是本發(fā)明不同示例性實(shí)施方案的光電二級(jí)管器件的示意圖。圖9是本發(fā)明不同示例性實(shí)施方案的光電晶體管30的示意圖。圖10是本發(fā)明不同示例性實(shí)施方案的光耦合器40的簡(jiǎn)圖。優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及可以與固相支持體共價(jià)連接并保持活性的修飾光催化單元。具體地講，本發(fā)明可以在各種不同的器件中用作電子元件。在詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明至少一個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)該了解本發(fā)明在其應(yīng)用以下說(shuō)明書(shū)或?qū)嵤├兴鲈敿?xì)說(shuō)明時(shí)并無(wú)限制。本發(fā)明可能有其它實(shí)施方案，或者能夠以各種方式實(shí)施或?qū)崿F(xiàn)。同樣，應(yīng)當(dāng)理解本文所用措辭和術(shù)語(yǔ)是為了說(shuō)明目的，不應(yīng)視為限制。光合作用是通過(guò)光反應(yīng)和暗反應(yīng)將電磁能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的生物過(guò)程。在產(chǎn)氧植物和藍(lán)細(xì)菌中，光子捕獲以及光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能發(fā)生在被稱為類嚢體的特化膜上。類嚢體位于高等植物的葉綠體中，或者由藍(lán)細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜折疊構(gòu)成。PSI是一種跨膜多亞基蛋白質(zhì)-葉綠素復(fù)合體，它介導(dǎo)矢量的光誘導(dǎo)電子從質(zhì)體藍(lán)素或細(xì)胞色。553傳遞到鐵氧還蛋白。PSI尺度為納米大小，產(chǎn)能約58%，量子效率高，這使得反應(yīng)中心在分子納米電子學(xué)應(yīng)用中成為有前景的單元。然而，為了將PSI反應(yīng)中心整合到分子器件上，將PSI反應(yīng)中心固定在基片上而不變性是必不可少的。另外，PSI反應(yīng)中心的定向連接是絕對(duì)必要的，這樣誘導(dǎo)的電荷才不會(huì)相互抵消。在本申請(qǐng)發(fā)明人將本發(fā)明4H者實(shí)施時(shí)，發(fā)現(xiàn)了光催化單元的多肽可以進(jìn)行遺傳修飾，使之包含能與固體表面共價(jià)結(jié)合而仍然保持活性的官能團(tuán)。如下面的實(shí)施例部分所述，本發(fā)明的發(fā)明人為了確保形成硫鍵(PSI單元和金屬表面之間)，利用了可公開(kāi)獲取的PSI3D結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，使細(xì)菌膜面向細(xì)胞質(zhì)一側(cè)的膜外環(huán)中PSI的PsaB多肽和PsaC多肽的氨基酸突變成為半胱氨酸。為了促進(jìn)有效的電連接，在接近P700處選出不同的突變，以保證反應(yīng)中心和金電極之間緊密相鄰(實(shí)施例1)。本發(fā)明的發(fā)明人還指出通過(guò)在大量的光催化單元中用半胱氨酸置換相同的氨基酸，光催化單元與固相支持體的連接將會(huì)是定向的，PSI單元可在固相支持體上形式單層膜(實(shí)施例2)。選擇特定的氨基酸用半胱氨酸殘基置換，可以調(diào)節(jié)光催化單元在固相支持體上的精確取向。按上述方法修飾的PSI單元，能夠在金表面形成定向單層膜，如原子力顯孩t鏡觀測(cè)的一樣，見(jiàn)圖2A-B?？赏ㄟ^(guò)以下試驗(yàn)證實(shí)突變PSI單元與金表面連接后具有功能活性通過(guò)其產(chǎn)生明顯的光誘導(dǎo)電4立的能力，如用開(kāi)爾文4笨4十力顯孩i4竟(Kelvinprobeforcemicroscopy，KPFM)所測(cè)[圖3A-B],以及通過(guò)其傳遞電子的能力，如用單次循環(huán)光i普(singleturnoverspectroscopy)所觀il[圖6A畫B]。Trammel等[說(shuō)o犯moracfe8,oe/e"ramcs2004,/91649匿1655]教導(dǎo)對(duì)包含六組氨酸尾標(biāo)的細(xì)菌反應(yīng)中心的修飾。與本發(fā)明相比截然不同的是，突變后的PSI不能與金屬表面共價(jià)結(jié)合。Das[iVa"o2004，41079-1083]教導(dǎo)對(duì)包含六組氨酸尾標(biāo)的植物反應(yīng)中心的修飾。與本發(fā)明相比截然不同的是，突變后的PSI也不能與金屬表面共價(jià)結(jié)合，為了連接在固體表面，突變后的PSI需要用肽表面活性劑固定。Lee等[J.尸/^.C/2ew.S2000]教導(dǎo)用有機(jī)分子涂敷金屬表面，并使PSI非共價(jià)吸附到有機(jī)層上。與本發(fā)明相比，PSI蛋白呈數(shù)種取向，且同樣無(wú)功能活性。Lee等[S,o化"TOra&5,oe/erframc^1996,375-387]教導(dǎo)將鈾沉積在光合膜表面，因此與PSI的受體側(cè)產(chǎn)生直接電接觸，從中可以催化氫析出。這些研究都未證實(shí)光電流通過(guò)外電路的電勢(shì)能。同Trammel等人和Das—樣，Lee等人也未教導(dǎo)細(xì)菌反應(yīng)中心和PSI分別與固體表面的共價(jià)連接。與Trammell等人和Das相比截然不同的是，本發(fā)明PSI修飾蛋白不需要進(jìn)行修飾以包含金屬離子，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^(guò)引入位于PSI膜外環(huán)的半胱氨酰殘基與金屬表面結(jié)合。因此，本發(fā)明一方面提供分離的修飾多肽，該多肽包含光合生物光催化單元的多肽的氨基酸序列，該氨基酸序列能夠介導(dǎo)光催化單元與固體表面的共價(jià)連接，并且在光催化單元連接到固體表面時(shí)仍保持光催化單元的光催化活性。本文所用術(shù)語(yǔ)"光催化單元(photocatalyticunit)"是指至少一個(gè)多肽和其它小分子(例如葉綠素和色素分子)的復(fù)合體，當(dāng)整合在一起時(shí)，作為功能單元使光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。如上所述，本發(fā)明的光催化單元存在于光合生物(即將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的生物)中。光合生物的實(shí)例包括但不限于綠色植物、藍(lán)細(xì)菌、紅藻、紫色細(xì)菌和綠色細(xì)菌。因此，根據(jù)本發(fā)明這一方面，可以使用的光催化單元的實(shí)例包括生物光催化單元，例如PSI和PSII、細(xì)菌光敏感蛋白、細(xì)菌光敏感蛋白、細(xì)菌視紫紅質(zhì)、光催化微生物、色素(例如原黃素和視紫紅質(zhì))、有機(jī)染料和藻類。優(yōu)選本發(fā)明的光催化單元為光系統(tǒng)I(PSI)。PS1為蛋白質(zhì)-葉綠素復(fù)合體，存在于綠色植物和藍(lán)細(xì)菌中，是類嚢體膜內(nèi)光合機(jī)器的部件，呈橢圓形，尺寸約9xl5納米。PSI復(fù)合體通常包含葉綠素分子，葉綠素分子作為天線發(fā)揮作用，它吸收光子并將光子能量傳遞給P700,這種能量在P700上被捕獲并被利用以啟動(dòng)光化學(xué)反應(yīng)。除P700和天線葉綠素外，PSI復(fù)合體還包含許多電子受體。從P700所釋放的電子通過(guò)中間受體被傳遞到PSI還原端的末端受體上，而且電子是跨類嚢體膜傳遞的。PSI多肽的實(shí)例及其源生物見(jiàn)下表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>本發(fā)明該方面一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PSI來(lái)源于藍(lán)細(xì)菌，更準(zhǔn)確地講，PSI來(lái)源于集胞藻PCC6803。由12個(gè)多肽組成，其中部分多肽結(jié)合了96個(gè)集光葉綠素分子和22個(gè)P類胡蘿卜素分子。電子傳遞鏈含有P700、Ao、ApFx、Fa和Fb,分別表示葉綠素a二聚體、單體葉綠素a、2個(gè)葉綠醌和3個(gè)[4Fe-4S]鐵硫中心。反應(yīng)中心核心復(fù)合體由異二聚體PsaA和PsaB亞基組成，含有原初電子供體P700,該復(fù)合體進(jìn)行光誘導(dǎo)電荷分離，并通過(guò)順序傳遞體Ao、A,和Fx傳遞電子。最終受體Fa和F"立于另一亞基PsaC上。來(lái)源于藍(lán)細(xì)菌的PSI在結(jié)構(gòu)上比來(lái)源于植物和細(xì)菌反應(yīng)中心的PSI更加穩(wěn)定。這是因?yàn)樗械娜~綠素分子和類胡蘿卜素都整合在藍(lán)細(xì)菌的核心亞基復(fù)合體中，而在植物和其它細(xì)菌反應(yīng)中心內(nèi)，天線葉綠素與連接到核心亞基的葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)合。因此，與來(lái)源于其它生物(例如植物和其它細(xì)菌)的PSI不同，來(lái)源于藍(lán)細(xì)菌的PSI在連接到固體表面時(shí)，其固定不需要肽表面活性劑[R.Das等，vV朋o丄e股ra2004，41079-1083]。本文所用術(shù)語(yǔ)"分離的"是指從其合成的天然部位(例如光合生物)至少部分取出的修飾光催化多肽。通常，該光催化多肽未與光催化單元的其它組分(即葉綠素和色素)分開(kāi)，因而光催化單元保持其功能。優(yōu)選多肽基本上不含存在于其體內(nèi)位置的其它物質(zhì)(例如其它細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸等)。如上所述，本發(fā)明這一方面的光催化單元包含修飾多肽。本文所用術(shù)語(yǔ)"多肽"是指可以通過(guò)重組DNA技術(shù)合成的多肽。在本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)部分所用的術(shù)語(yǔ)"氨基酸"應(yīng)理解為包括20種天然存在的氨基酸；常常在體內(nèi)翻譯后經(jīng)修飾的氨基酸，包括例如羥脯氨酸、磷S吏絲氨酸和磷酸蘇氨酸；其它不常用的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羥賴氨酸、異賴氨素、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥(niǎo)氨酸。此外，術(shù)語(yǔ)"氨基酸，，既包括D-氨基酸又包括L-氨基酸。下面的表2和表3列舉了可用于本發(fā)明的天然存在的氨基酸(表2)和不常用的或經(jīng)修飾的氨基酸(表3)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>本文所用術(shù)語(yǔ)"修飾多肽"是指與野生型多肽相比包含修飾的多肽。通常，該修飾為氨基酸修飾。本發(fā)明這一方面包括對(duì)序列進(jìn)行任何的修飾，只要多肽能夠與固體表面共價(jià)連接，并保持光催化活性。修飾的實(shí)例包括缺失、插入、置換及其生物活性多肽片段。插入或缺失通常的范圍約1-5個(gè)氨基酸。根據(jù)所提出的光催化單元的3D結(jié)構(gòu)，選擇修飾位點(diǎn)。有關(guān)光催化單元3D結(jié)構(gòu)的證據(jù)得自X射線晶體學(xué)研究或運(yùn)用蛋白質(zhì)建模軟件。細(xì)長(zhǎng)聚球藻和植物葉綠體PSI的晶體結(jié)構(gòu)已分別解析至2.5A和4.4A[P.Jordan等，淑騰2001,4"909-917;A.BenShem，F(xiàn).Frolow,N.Nelson,淑臟2003，630-635]。所要替換的氨基酸或插入位點(diǎn)通常在光催化單元的外面(例如在膜外環(huán)上)。優(yōu)選需要替換的氨基酸或插入位點(diǎn)在不引起位阻的位置上。還優(yōu)選的是，突變位于光催化單元的P700附近，以確保反應(yīng)中心和固體表面之間緊密相鄰以促進(jìn)有效的電連接。本發(fā)明該方面一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾為置換(即替換)，包含能夠介導(dǎo)與固體表面結(jié)合的官能團(tuán)側(cè)鏈。用于集胞藻PCC6803PsaB上PSI突變的特別優(yōu)選的坐標(biāo)包括單突變D235C、S246C、D479C、S499C、S599C和Y634C或者雙重突變D235C/Y634C和S246C/Y634C。PsaC中，特別優(yōu)選的突變位點(diǎn)為W31C。另外，在光催化單元中可產(chǎn)生三重突變(例如PsaC〃PsaBW31C//D235C/Y634C)。優(yōu)選被置換的野生型氨基酸對(duì)光催化單元的活性不是必需的。為了確定哪些氨基酸在功能上是冗余的，可以通過(guò)將光催化單元的序列與已知的同源蛋白質(zhì)分子的序列相比較，使高同源性區(qū)域所進(jìn)行的氨基酸序列變化的數(shù)目減至最小。在一個(gè)實(shí)施方案中，保守氨基酸置換在一個(gè)或多個(gè)預(yù)計(jì)為非必需氨基酸殘基上進(jìn)行。"保守氨基酸置換"是指其中氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。本領(lǐng)域中已定義了具有相似側(cè)鏈的同族氨基酸殘基。這些同族氨基酸包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有P分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可進(jìn)行非保守氨基酸的置換，因?yàn)橥蛔儍?yōu)選設(shè)計(jì)成能夠使蛋白質(zhì)與金屬定向地共價(jià)連接。通過(guò)選擇可以光自養(yǎng)生長(zhǎng)的突變細(xì)胞，確保PSI細(xì)胞不受損傷。優(yōu)選本文上述坐標(biāo)的氨基酸用能夠與金屬表面結(jié)合的氨基酸(例如含巰基氨基酸例如半胱氨酸",換。在本發(fā)明這一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽序列如SEQIDNO:20、21、22、23、24、25、26、27、28和29所示。優(yōu)選采用重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，因?yàn)楣獯呋瘑卧ǔ０恢挂环N多肽和其它分子(例如色素分子和葉綠素)，它們一起整合成復(fù)合體。另外，這些技術(shù)更適于產(chǎn)生相對(duì)長(zhǎng)的多肽(例如長(zhǎng)20個(gè)氨基酸以上)和大量的多肽。重組3支術(shù)記載于Bitter等，0987)MethodsinEnzymol.153:516-544,Studier等，(1990)MethodsinEnzymol.185:60-89，Bnsson等，(1984)Nature310:511-514,Takamatsu等，(1987)EMBOJ.6:307-311,Co腿i等,(1984)EMBOJ.3:1671-1680和Brogli等,(1984)Science224:838-843,Gurley等，(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565和Weissbach&Weissbach,1988,MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,NY,第VIII節(jié)，第421-463頁(yè)。本發(fā)明的多肽用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)修飾，例如定點(diǎn)誘變(寡核苷酸介導(dǎo)的誘變)和PCR介導(dǎo)的誘變。因此，可以使編碼光催化單元多肽的多核苷酸發(fā)生突變。誘變之后，光催化單元可以在合適的細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)。寡核苷酸介導(dǎo)的誘變是一門本領(lǐng)域公知的技術(shù)，參見(jiàn)Adelman等，DNA,2:183(1983)。簡(jiǎn)單地講，通過(guò)使編碼所需突變的寡核苷酸與多核苷酸模板雜交，來(lái)改變編碼光催化單元多肽的多核苦酸(例如尸^^基因)，其中該模板是單鏈形式的質(zhì)粒，含有未改變或天然光催化單元多肽的多核苷酸序列。雜交之后，使用DNA聚合酶(例如DNA聚合酶I的Klenow片段)來(lái)合成模板第二條完整的互補(bǔ)鏈，因此摻入寡核苷酸引物，這將編碼所選擇的光催化單元多核普酸中的變化，因而產(chǎn)生異源雙鏈體分子。然后，使該異源雙鏈體分子轉(zhuǎn)化到合適的宿主細(xì)胞中，通常為原核生物例如大腸桿菌(E.coli)JM101。細(xì)胞生長(zhǎng)后，將細(xì)胞接種到瓊脂糖平板上，進(jìn)行篩選以鑒定出含有突變DNA的細(xì)菌菌落。然后取出突變區(qū)，置入用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的適當(dāng)載體上，一般來(lái)講，該類型的表達(dá)載體通常用于轉(zhuǎn)化合適的宿主。一般而言，使用長(zhǎng)度至少為25個(gè)核苷酸的寡核苷酸。最佳的寡核苦酸含12-15個(gè)與編碼突變的核苷酸^t板任一端完全互補(bǔ)的核苷酸。這就確保了寡核香酸充分地與單鏈多核苷酸模板分子雜交。寡核苷酸可容易地用本領(lǐng)域已知"R術(shù)進(jìn)行合成(例如參見(jiàn)Crea等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75..5765(1978))。多核苷酸模板僅可由以下載體產(chǎn)生源自噬菌體M13載體的載體(市售的M13mpl8和M13mpl9載體適用)，或者含有單鏈喧菌體復(fù)制起點(diǎn)的載體(例如參見(jiàn)Viera等，Meth.Enzymol.,153:3(1987))。因此，需要突變的多核苷酸必須插入這些載體的一個(gè)當(dāng)中以產(chǎn)生單鏈模板。單鏈模板的產(chǎn)生記載于Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第4.21-4.41節(jié)(ColdSpringHarborLaboratoryPress,N.Y.1989)。還可用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生不止一個(gè)氨基酸被置換的突變體。本文下面的實(shí)施例1將介紹根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，采用定點(diǎn)誘變使PSI突變的一個(gè)示例性方法。PCR誘變和盒式誘變也是適于對(duì)光催化單元多肽進(jìn)行修飾的技術(shù)--參見(jiàn)Sambrook和Russell(2001,MolecularCloning,ALaboratoryApproach,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)和Ausubel等,(2002,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY))。光催化單元的任何宿主。因此，宿主必須能夠?qū)⑸亍⑷~綠素分子等摻入到這個(gè)單元中。合適宿主的實(shí)例包括但不限于綠色植物細(xì)胞培養(yǎng)物、綠色植物和光合細(xì)菌。在本發(fā)明這一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主為集胞藻細(xì)菌(5^"ec/2oc，'tobacteria)。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，通過(guò)將突變DNA插入宿主基因組進(jìn)行克隆。這尤其適用于當(dāng)宿主細(xì)胞為光合細(xì)菌時(shí)。該方法受到包含在載體中的與光合基因組DNA中存在的序列互補(bǔ)的DNA序列的影響。用這一載體轉(zhuǎn)染光合細(xì)菌，導(dǎo)致與基因組的同源重組及光催化多肽DNA的插入。下面的實(shí)施例1描述了利用突變戸aS基因通過(guò)同源重組轉(zhuǎn)化集胞藻PCC6803的示例性方法。重要的是，野生型集胞藻細(xì)胞用克隆有突變戸fl5基因的質(zhì)粒pZBL轉(zhuǎn)化，其中野生型集胞藻細(xì)胞在BG-11平板中光激活異養(yǎng)生長(zhǎng)(LAHG:避光生長(zhǎng)，只是按光子通量密度40微摩爾1112/秒，每24小時(shí)光照10分鐘)，BG-11平板補(bǔ)充了5mM葡萄糖、lOmMTES-KOH、pH8(N-三[羥甲基]-甲基-2-氨基乙烷磺酸鹽)和硫代硫酸鹽(3g/L)。同源重組的方案見(jiàn)圖1A。細(xì)胞用所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，然后用S-20mg/ml卡那霉素篩選并分離出少許子代。在卡那霉素壓力下進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的篩選和分離?；蛘?，可以將編碼本發(fā)明修飾多肽的多核苷酸與核酸表達(dá)載體連接在一起，該載體包含處于順式調(diào)節(jié)序列(例如啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄控制之下的多核苷酸序列，該調(diào)節(jié)序列適于在宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明多肽的組成型、組織特異性或誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄。"分離的多核苷酸"，是指分離的并按以下形式提供的單鏈或雙鏈核酸序列RNA序列、互補(bǔ)多核苷酸序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/復(fù)合多核香酸序列(例如上述序列的組合)。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)可以使用的多核苷酸序列的實(shí)例如SEQIDNO:30、31、32、33、34、35、36、37和38中所示。本文所用術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)多核香酸序列"是指用反轉(zhuǎn)錄酶或任何其它依賴于RNA的DNA聚合酶，由信使RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的序列。該序列隨后可用依賴于DNA的DNA聚合酶在體內(nèi)或體外擴(kuò)增。本文所用術(shù)語(yǔ)"基因組多核苷酸序列"是指從染色體獲得(分離)的序列，因此表示染色體的連續(xù)部分(contiguousportion)。本文所用術(shù)語(yǔ)"復(fù)合多4J:苷酸序歹'J(compositepolynucleotidesequence)"是指一種至少部分是互補(bǔ)的和至少部分是基因組的序列。復(fù)合序列可以包括一些需要編石馬本發(fā)明多肽的外顯子序列，以及一些間插在外顯子序列中的內(nèi)含子序列。內(nèi)含子序列可以是任何來(lái)源，包括其它基因，通常可包括保守剪接信號(hào)序列。這些內(nèi)含子序列還可包括順式作用表達(dá)調(diào)節(jié)元件。如上所述，可以將本發(fā)明的多核苷酸序列插入表達(dá)載體(即核酸構(gòu)建體)中，使重組多肽能夠表達(dá)。本發(fā)明的表達(dá)載體包括使這種載體適于在原核生物、真核生物或者優(yōu)選兩者中復(fù)制和整合的其它序列(例如穿梭載體)。典型的克隆載體含有轉(zhuǎn)錄起始序列和翻譯起始序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子)及轉(zhuǎn)錄終止子和翻譯終止子(例如聚腺香酸化信號(hào))。細(xì)菌系統(tǒng)中，可根據(jù)所要表達(dá)的多肽的用途，便利地篩選出多種表達(dá)載體。例如，如果需要大量的多肽，則可能需要指導(dǎo)表達(dá)高水平蛋白質(zhì)產(chǎn)物的載體，該載體可能與指導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入細(xì)菌周質(zhì)或培養(yǎng)基中的疏水信號(hào)序列融合，使得蛋白質(zhì)產(chǎn)物易于純化?？赡苓€需要某些用特異性切割位點(diǎn)改造的融合蛋白，該切割位點(diǎn)有助于多肽的回收。適宜這種操作的載體包括但不限于大腸桿菌表達(dá)載體的pET系[Studier等，MethodsinEnzymol.185:60-89(1990)〗。在使用植物表達(dá)載體的情況下，多肽編碼序列的表達(dá)可以由多種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。例如，可以使用病毒啟動(dòng)子，例如CaMV的35SRNA啟動(dòng)子和19SRNA啟動(dòng)子[Bnsson等，Nature310:511-514(1984)]，或者可以使用TMV的外殼蛋白啟動(dòng)子[Takamatsu等，EMBO丄6:307-311(1987)]?；蛘?，可以使用植物啟動(dòng)子，例如RUBISCO的小亞基[Coruzzi等，EMBOJ.3:〗671-1680(]984)和Brogli等,Science224:838-843(1984)]或熱激啟動(dòng)子，例如大豆hspl7.5-E或hspl7.3-B[Gurley等，Mol.Cell.Biol.6:559-565(986)]。可以用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯^:注射、電穿孔和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，將這些構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞。參見(jiàn)例如Weissbach&Weissbach[MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress，NY,第VIII節(jié)，第421-463頁(yè)(1988)]。應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體除了含有插入編碼序列(編碼多肽)轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件外，還可包括經(jīng)工程改造使已表達(dá)多肽的穩(wěn)定性、生產(chǎn)、純化、產(chǎn)量或活性最優(yōu)化的序列。表達(dá)和克隆載體應(yīng)當(dāng)含有選擇基因，亦稱選擇標(biāo)記。這是一種編碼用載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞存活或生長(zhǎng)所必需的蛋白質(zhì)的基因。這一基因的存在確保了除去載體的任何宿主細(xì)胞并不會(huì)比轉(zhuǎn)化宿主在生長(zhǎng)或繁殖上獲得優(yōu)勢(shì)。典型的選擇基因編碼具有以下功能的蛋白質(zhì)(a)賦予抗生素或其它毒素(例如氨千青霉素、新霉素、氨曱蝶呤或四環(huán)素)抗性，(b)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷型缺乏的養(yǎng)分，或(c)供給不能從復(fù)合培養(yǎng)基得到的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物。方法一般參見(jiàn)Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSprmgsHarborLaboratory,NewYork(1989，1992);A體bel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,Md.(1989);Chang等，SomaticGeneTherapy,CRCPress,AnnArbor,Mich.(1995);Vega等，GeneTargeting,CRCPress,AnnArborMich.(1995),Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses,Butterworths,BostonMass.(1988)和Gilboa等[Biotechniques4(6):504-512,1986],包括例如穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔和用重組病毒載體感染。另外，有關(guān)正負(fù)雙向篩選方法參見(jiàn)美國(guó)專利第5,464,764號(hào)和第5,487,992號(hào)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在有效條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使其以高水平表達(dá)重組多肽。有效培養(yǎng)條件包括但不限于允許蛋白質(zhì)產(chǎn)生的有效培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器、溫度、pH和氧氣等條件。有效培養(yǎng)基是指任何用于培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生本發(fā)明重組多肽的培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基通常包括具有可同化碳源、氮源和磷酸鹽源及適當(dāng)?shù)柠}、無(wú)機(jī)物、金屬和其它營(yíng)養(yǎng)物(例如維生素)的水溶液。本發(fā)明的細(xì)胞可以在常規(guī)的發(fā)酵生物反應(yīng)器、搖瓶、試管、微量滴定板和培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。可以在溫度、pH和氧含量適于重組細(xì)胞的條件下進(jìn)^f于培養(yǎng)。這些培養(yǎng)條件為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所掌握。細(xì)胞在合適條件下培養(yǎng)之后，優(yōu)選從培養(yǎng)細(xì)胞中分離出光催化單元。本文以下實(shí)施例部分的實(shí)施例2描述了從光合生物提取光催化單元的示例性方法。本發(fā)明還包括采用任何其它純化和分離方法，只要光催化單元保持功能。所分離的光催化單元可為多聚體(例如三聚體)或單個(gè)單體。光催化單元可以是完全分離的或是部分膜制品。膜提取物的制備方法是本領(lǐng)域公知的。例如，Qoronfleh等[JBiomedBiotechnol.2003;2003(4):249-255]教導(dǎo)了通過(guò)分配相分離選擇性富集膜蛋白的方法。用于制備膜提取物的各種試劑盒也是市售的，例如ProteoPrepTM膜提取試劑盒(Sigma-Aldrich公司)。因此，本發(fā)明另一方面提供分離的修飾光催化單元，該催化單元包含本發(fā)明的修飾多肽。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，術(shù)語(yǔ)"分離(的)"是指光催化單元至少部分取自其天然合成部位(例如光合生物)。優(yōu)選光催化單元基本上不含存在于其體內(nèi)位置的物質(zhì)(例如其它細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸等)?？砂幢疚南率龇椒?，在分離出光催化單無(wú)之后，對(duì)其活性進(jìn)行測(cè)試。在分離出本發(fā)明的修飾光催化單元之后，可以通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵(靜電)將其與固體表面相連接。本文所用術(shù)語(yǔ)"共價(jià)鍵"是指2個(gè)原子通過(guò)共用2個(gè)電子(其中每個(gè)原子貢獻(xiàn)1個(gè)電子)進(jìn)行連接。優(yōu)選光催化單元直接與固體表面鍵合(即既不包含任何連接分子，也不用涂敷金屬離子)。對(duì)固體表面的選擇取決于光催化單元的修飾。因此，如果修飾包含如下述的半胱氨酸置換，則固體表面優(yōu)選為導(dǎo)電材料，例如過(guò)渡金屬元素。根據(jù)本發(fā)明這一方面，可以使用的過(guò)渡金屬元素的實(shí)例包括但不限于銀、金、銅、鉑、鎳、鋁和鈀。本發(fā)明實(shí)施方案的修飾光催化單元可以通過(guò)使置換殘基與固體基片的親水表面直接反應(yīng)，與固體表面共價(jià)連接。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，置換殘基為半胱氨酸，可通過(guò)將修飾光催化單元與金表面或其它金屬表面一起保溫長(zhǎng)達(dá)足以形成硫鍵的時(shí)間進(jìn)行連接。還可包括其它連接方法。本文以下實(shí)施例部分的實(shí)施例2描述了半胱氨酸置換的光催化單元的示例性共價(jià)連接方法。根據(jù)本發(fā)明這一方面，修飾光催化單元在連接到固體表面之后仍保持光催化活性。本文所用術(shù)語(yǔ)"光催化活性"是指光能向化學(xué)能的轉(zhuǎn)化。優(yōu)選修飾光催化單元保持野生型光催化單元在其體內(nèi)環(huán)境活性的至少20%,更優(yōu)選至少30%，更優(yōu)選至少40%,更優(yōu)選至少50%,更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少90%，例如約100%。本發(fā)明還包括其活性高于野生型光催化單元在其體內(nèi)環(huán)境的活性的本發(fā)明光催化單元。為了使本發(fā)明的修飾光催化單元在連接到固相支持體上后仍具有光催化活性，光催化單元必需以定向方式連接，這樣它們彼此間的電荷才不會(huì)被中和。如實(shí)施例3所述，本發(fā)明的修飾多肽能夠使光催化單元結(jié)合到固相支持體上，從而產(chǎn)生光誘導(dǎo)的正電位。該誘導(dǎo)電位是負(fù)電荷從PSI的金一側(cè)位移的結(jié)果。本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為在大量的光催化單元中用半胱氨酸置換相同的氨基酸，光催化單元與固相支持體的連接將會(huì)是定向的，并且可在固相支持體上形成單層膜。選擇特定的氨基酸用半胱氨酸殘基置換，可以調(diào)節(jié)光催化單元在固相支持體上的精確取向。電壓性質(zhì)。光電壓性質(zhì)可以用例如開(kāi)爾文探針力顯微鏡(KPFM)進(jìn)行測(cè)定。如圖3A和圖3B的KPFM圖象所示，本發(fā)明的光催化單元顯示清晰的光誘導(dǎo)電位。具體地講，在形貌跟蹤時(shí)，產(chǎn)生的光誘導(dǎo)正電位為+0.498±0.02V，其中觀察到屬于PSI復(fù)合體的峰值。當(dāng)關(guān)掉照明時(shí)仍觀察到電位變化(圖4A-B)，還證實(shí)了光誘導(dǎo)電位的可逆性。還可通過(guò)分析光催化復(fù)合體中的電子轉(zhuǎn)遞，測(cè)定光催化活性。子傳遞。如圖6A-B所示，與野生型重組及與突變體重組之間的電荷率的差異表明，本發(fā)明教導(dǎo)的半胱氨酸置換沒(méi)有改變光誘導(dǎo)電子傳遞作用的方式?，F(xiàn)參照?qǐng)D7，圖7是本發(fā)明不同示例性實(shí)施方案的光電器件10的示意圖。器件10包括固相支持體12、大量分離的光催化單元14和支持體12的表面13,其中單元14與表面13相連接。分離的光催化單元14優(yōu)選經(jīng)修飾以促進(jìn)單元14與表面13的共價(jià)連接，同時(shí)保持光催化活性，更多詳情同上。作為光催化單元14的組成部分，光電器件10促進(jìn)光誘導(dǎo)的電子傳遞。在光ll激發(fā)下，在數(shù)百皮秒到幾微秒的一段時(shí)間內(nèi)(視光催化單元的類型而異)，電子從供體位點(diǎn)16，經(jīng)過(guò)多個(gè)中間步驟傳遞到受體位點(diǎn)18。誘導(dǎo)電子傳遞的光頻率取決于獲得單元14的光合生物。例如，如果使用綠色植物或綠色細(xì)菌的光催化單元，器件10對(duì)波長(zhǎng)約500nm至約550nm的綠色光l文感，如果使用藍(lán)細(xì)菌的光催化單元，器件10對(duì)波長(zhǎng)約450nm至約500nm的藍(lán)色光敏感，如果使用紅藻的光催化單元，器件10對(duì)波長(zhǎng)約6S0nm至約700nrn的紅色光敏感，如果使用紫色細(xì)菌的光催化單元，則器件10對(duì)波長(zhǎng)約700nm至約750nm的紫色光敏感。領(lǐng)域，包括但不限于空間成像器件、太陽(yáng)能電池、光學(xué)計(jì)算和邏輯門、光電開(kāi)關(guān)、二極管、光子A/D轉(zhuǎn)換器和薄膜"柔性"光致電壓結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)參照?qǐng)D8,圖8是本發(fā)明不同示例性實(shí)施方案的光電二級(jí)管器件20的示意圖。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，為了清楚表示起見(jiàn)，圖7中出現(xiàn)的幾個(gè)元件在圖8中被省略。光電二級(jí)管器件20包括光電器件10以及兩個(gè)電接觸22和24，其中兩個(gè)電接觸22和24分別與供體4立點(diǎn)16和受體4立點(diǎn)18^f呆^爭(zhēng)電通^[言(electricalcommunication)?？梢耘c供體位點(diǎn)16建立電通信，例如將導(dǎo)電材料連接到支持體12或表面13上。通過(guò)在本發(fā)明修飾多肽(例如PSIPsaC亞基中的WWC)與沉積的金屬電極上表面之間形成硫鍵，使受體位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合。受體側(cè)鍍鉑的光催化單元與頂部電極((topelectrode)通過(guò)蒸發(fā)薄的金屬電極而沉積可以使金屬間發(fā)生電連通(electricalconnection)。在光催化單層膜上沉積的導(dǎo)電聚合物或鍍鉬的光催化單層膜可用作頂部電極。光電二級(jí)管的符號(hào)圖見(jiàn)圖8(下小圖)。使用時(shí)，用光照射光催化單元，因此激發(fā)高量子效率的有效的電荷分離，通常超過(guò)95%。接觸件22和24分接通過(guò)電荷分離引起的電流。根據(jù)施加在接觸件22和24之間的電壓，光電二級(jí)管器件20可以用作光致電壓器件，或者用作反向偏壓光電二級(jí)管。具體地講，不存在外部電壓時(shí)，當(dāng)用光照射時(shí)，光電二級(jí)管器件20用作產(chǎn)生電流的光致電壓器件。該器件可以用作例如太陽(yáng)能電池中的元件。當(dāng)在接觸件22和24之間施加反向偏壓時(shí)，只要光電二級(jí)管器件20不被光激發(fā)光催化單元的光照射，則光電二級(jí)管器件20對(duì)從接觸件24流向接觸件22的電流就保持高的阻抗。在適當(dāng)波長(zhǎng)的光照射下，阻抗顯著減小。這種器件可在例如光檢測(cè)器中用作元件。如果不施加偏壓時(shí)，光電器件10還可以用作太陽(yáng)能電池。照射光催化單元后，電荷分離態(tài)導(dǎo)致供體位點(diǎn)16和受體位點(diǎn)18之間產(chǎn)生內(nèi)部電壓。內(nèi)部電壓可以通過(guò)供體位點(diǎn)16和受體位點(diǎn)18的電接觸分接。如果電路外部是關(guān)閉的，電流則通過(guò)重復(fù)的光驅(qū)動(dòng)電荷分離保持在太陽(yáng)能電池內(nèi)。器件10中所產(chǎn)生的極化電荷分離態(tài)還可用于分子晶體管。具體地講，器件10可用作光充電電容，它作為柵4及，在與電容連接的溝道中改變電荷傳遞體的密度?，F(xiàn)參照?qǐng)D9，圖9是本發(fā)明不同示例性實(shí)施方案的光電晶體管30的示意圖。光電晶體管30包括源極32、漏極34、溝道36和光應(yīng)答柵極38。柵極38優(yōu)選包括光電器件10。溝道36優(yōu)選具有半導(dǎo)體性能，因此電荷傳遞體的密度可以改變。無(wú)光時(shí)，溝道36不含任何自由電荷傳遞體，且基本上是絕緣體。暴露于光下時(shí)，器件10的光催化單元形成極化電荷分離態(tài)，由此所生成的電場(chǎng)從源極32和漏極34中吸引電子(或更通俗地說(shuō)是電荷傳遞體)，使得溝道36變得導(dǎo)電。因此，光電晶體管30用作放大器或開(kāi)關(guān)器件，由光控制電流從源極32和漏極34流出。電極可由任何導(dǎo)電材料(例如但不限于金)制成。極間空間決定了溝道長(zhǎng)度。電極可以沉積在半導(dǎo)體表面以形成源-溝道-漏結(jié)構(gòu)。柵極可以用更多詳情如上的本發(fā)明實(shí)施方案中分離的光催化單元形成。光電晶體管的符號(hào)圖見(jiàn)圖9的右上小圖。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該了解是，當(dāng)柵極38維持?jǐn)嗦窌r(shí)，光電晶體管30可工作，因?yàn)殚T控是通過(guò)光子撞擊電極38誘導(dǎo)的。光電晶體管30可以用作邏輯元件，因此光電晶體管可被入射光轉(zhuǎn)換至"開(kāi)"的狀態(tài)。另外，可能是由于具有空間位置的入射光束的漏電流強(qiáng)烈變化，因此光電晶體管30可用作具有大型圖案形成的圖象傳感器的主要構(gòu)件(backbone)?？梢越M裝成數(shù)種光電晶體管，各自在更多詳情如上的不同波長(zhǎng)下工作，使圖象傳感器對(duì)彩色圖象具敏感性?？梢岳镁哂懈喔牧冀Y(jié)構(gòu)的電荷貯存能力，用于存儲(chǔ)器相關(guān)應(yīng)用中，這些改良為常規(guī)半導(dǎo)體領(lǐng)域技術(shù)人員所知。光電二級(jí)管20和/或光電晶體管30可以集成在許多電子電^各中。具體地講，這些器件可以用作結(jié)構(gòu)單元，它們可以在表面結(jié)構(gòu)上組裝成復(fù)合電子纟且合4牛(compositeelectronicassembly)。例戈口，兩個(gè)以上的光電二級(jí)管或光電晶體管可以在表面結(jié)構(gòu)上組裝成邏輯門、一組邏輯門或^t處理器?，F(xiàn)參照?qǐng)D10，圖10是本發(fā)明不同示例性實(shí)施方案的光耦合器40的簡(jiǎn)圖。光耦合器40尤其用于從一個(gè)元件傳遞信號(hào)到其它元件而無(wú)需在元件之間設(shè)置直接電接觸，例如由于電壓水平不匹配。例如，光耦合器40可以用于在以低電壓水平操作的微處理器和以高電壓水平操作的門控交換器件之間建立接觸自由通信。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的光耦合器40包括光發(fā)射器42和光接收器44。發(fā)射器42可以是任何光源，例如但不限于發(fā)光二極管(LED)。接收器44優(yōu)選包括光電器件10，并且可以是例如光電二級(jí)管(例如光電二級(jí)管20)或光電晶體管(例如光電晶體管30)?？梢赃x擇發(fā)射器42,使得所發(fā)射的輻射因此有足夠的能量引起器件10的供體位點(diǎn)16與受體位點(diǎn)18之間的電荷分離。發(fā)射器42和接收器44^f果持光通信但卻是電去耦的。例如，發(fā)射器42和接收器44可被使光通過(guò)但卻阻止任何電流流過(guò)的透明屏障46分隔。發(fā)射器42和接收器44優(yōu)選彼此相對(duì)，使得從發(fā)射器42發(fā)射的輻射射到接收器44上。受電信號(hào)觸發(fā)，發(fā)射器42發(fā)射光48，光穿過(guò)屏障46，射到接收器44上。進(jìn)而，接收器44產(chǎn)生電信號(hào)，該信號(hào)可以通過(guò)更多詳情如上的合適的電接觸分接。因此，光耦合器40成功地將施加于其輸入端(發(fā)射器42)的電信號(hào)傳輸至其輸出端(接收器44)，輸入端與輸出端之間沒(méi)有任何電接觸。在本發(fā)明不同的示例性實(shí)施方案中，上述電子器件(包括但不限于光電器件、太陽(yáng)能電池、光電二級(jí)管、光電晶體管、邏輯門和光耦合器)的尺寸為亞毫米范圍。優(yōu)選電子器件的尺寸為約O.lnm至約100pm,更優(yōu)選約O.lnm至約l]iim。本文所用術(shù)語(yǔ)"約，，是指±10%。本發(fā)明的其它目的、優(yōu)勢(shì)和新的特征對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在檢驗(yàn)以下實(shí)施例時(shí)是顯而易見(jiàn)的，這些實(shí)施例不是限制性的。另外，本文上述的本發(fā)明每個(gè)不同的實(shí)施方案和方面，以及所附權(quán)利要求書(shū)部分所要求保護(hù)的范圍都可以在下述實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。實(shí)施例下面參考以下實(shí)施例并結(jié)合上述描述，以非限制性方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。一般地講，本文所用術(shù)語(yǔ)和本發(fā)明所采用的實(shí)驗(yàn)方法包括分子、生物化學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有詳細(xì)介紹。參見(jiàn)侈'J長(zhǎng)口"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook等，(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology，，第I-III巻，Ausubel，R.M.主編，(1994);Ausubel等，"CurrentProtocolsinMolecularBiology";JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988);Watson等,"RecombinantDNA",ScientificAmericanBooks,NewYork;Birren等(主纟扁)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries",第卜4巻，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);美國(guó)專利4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192，659和5,272,057中所乂/^開(kāi)的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook",第I-III巻，Cellis,丄E.主編(1994);"CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechnique"Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版；"CurrentProtocolsinImmunology"第I-III巻，Coligan丄E.主編(1994);Stites等(主編)，"BasicandClinicalImmunology"(第八版)，Appleton&Lange,No酒lk,CT(1994);Mishell和Shiigi(主編)，"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,的記載，參見(jiàn)例如美國(guó)專利3，791,932、3,839，153、3,850,752、3，850,578、3,853，987、3,867,517、3,879,262、3,901，654、3,935,074、3,984,533、3，996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521;"OligonucleotideSynthesis"Gait，M.J.主編(1984);"NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.和HiggmsS.丄主編(1985);"TranscriptionandTranslation"Hames，B.D.和HiggmsS.J.主編(1984);"AnimalCellCulture"Freshney，R.L主編(1986);"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986);"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal，B.，(1984)和"MethodsmEnzymology"第1-317巻,AcademicPress;"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990);Marshak等，"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996);所有這些文獻(xiàn)的內(nèi)容都通過(guò)引用全部結(jié)合到本文。還提供貫穿本文的其它一般參考文獻(xiàn)。我們認(rèn)為文獻(xiàn)方法是本領(lǐng)域眾所周知的，僅為了方便讀者而在此提供，所有所包括的資料都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。實(shí)施例1集胞藻PCC6803psaB突變體的合成從藍(lán)細(xì)菌集胞藻PCC6803中篩選完整的PSI反應(yīng)中心，以確定遺傳修飾是否可以有助于將反應(yīng)中心連接到固相支持體上。該P(yáng)SI結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的主要原因是因?yàn)樗腥~綠素分子和類胡蘿卜素都整合到核心亞基復(fù)合體中，而在植物和其它細(xì)菌的反應(yīng)中心內(nèi)，天線葉綠素與連接到核心亞基的葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)合?；趯?duì)PSI原子結(jié)構(gòu)的了解，選擇氨基酸使之修飾成為半胱氨酸，從而使PSI與金表面共價(jià)連接。因此，為了確保形成硫鍵，使面向細(xì)菌膜細(xì)胞質(zhì)一側(cè)膜外環(huán)(當(dāng)放置在固體表面時(shí)不會(huì)形成立體障礙)上的氨基酸，突變成半胱氨酸。為了促進(jìn)有效的電連接，在P700附近篩選出不同的突變，確保反應(yīng)中心和金電極緊密相鄰。方法與材料集胞藻PCC6803的psaB通過(guò)同源重組引入突變通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)戸W基因的定點(diǎn)誘變。將1.8kb戸aB基因片段和1.1kb下游側(cè)翼區(qū)插入pBluesc叩tIIKS栽體中(參見(jiàn)圖1A-C的方案)。按先前文獻(xiàn)所述方法[Zeng等，說(shuō)oc/,/".說(shuō)o//7"./kto2002,/"(5254-264],從pUC4K上切下1.27kb卡那霉素抗性賦予基因(KanR),將其插入側(cè)翼起始的&'oW位點(diǎn)，構(gòu)建載體pZBL。采用重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[Ho等，1989,7751-59],構(gòu)建含有突變的1400bp延伸片段，分別在限制位點(diǎn)S—/-//戸/和5>^/-Sac/,通過(guò)片段交換構(gòu)建載體pZBL-D479C、pZL-S499C、pZBL-S599C、pZBL-Y634C、pZBL-D235C和pZBL-S246C。用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的引物見(jiàn)下表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>另外，用上述同一技術(shù)，再將W31C的單突變插入PsaC,將2個(gè)雙重突變(D235C/Y634C和S246C/Y634C)插入PsaB。為了篩選psaB缺陷型受體細(xì)胞，從戸a萬(wàn)下游端切下1.3kb(從pZBL的至五co剛，在這些位點(diǎn)上插入1.3kb氯霉素抗性U武予基因(Cm",構(gòu)建pBLAB載體(圖1C)。野生型集胞藻細(xì)胞用pPLAB轉(zhuǎn)化，使轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)在"光適應(yīng)異養(yǎng)(lightadaptedheterotrophic)"條件下[Zeng等，說(shuō)oc/z,w.說(shuō)'o/7/7;^.」cto2002,755(5254-264]，以表達(dá)D479C突變多肽(SEQIDNO:20)、S499C突變多肽(SEQIDNO:21)、S599C突變多肽(SEQIDNO:22)、Y634C突變多肽(SEQIDNO:23)、D235C突變多肽(SEQIDNO:24)、S246C突變多肽(SEQIDNO:25)和W31C突變多肽(SEQIDNO:26)。類嚢體膜和PSI復(fù)合體的分離將集胞藻細(xì)胞在弗氏壓碎器于500p.s.i.下破碎，用差速離心分離出類嚢體。PSI用去污劑正十二烷基(3-D-麥芽糖苷增溶，在DEAE-纖維素柱中用蔗糖梯度純化[Nechushtai,R.,Muster,P.,Binder,A.,Liveanu，V.和Nelson,N.(1983)t/&480,1179-1183]。按先前文獻(xiàn)所述方法[Laemmli,U.K.(1970)淑訓(xùn)227，680-685;Tmdall,K.R.t和Kunkel,T.A.(1988)說(shuō)oc/2，勿27，6008-6013]，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡法對(duì)亞基組成進(jìn)行分析。按先前文獻(xiàn)所述方法[Lowry,O.H.,Rosenbrough,N.L.,Farr,A.L.和Randall,R.J.(1951)丄說(shuō)o/.C/置193，265-275]，在1%SDS中增溶后，對(duì)膜內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)已公開(kāi)的方法[Arnon,D.I.(1949)尸/aWP/ywo/.24,1-15],測(cè)定葉綠素濃度及P700化學(xué)氧化和光氧化。詳細(xì)的分離方法和分析概述參見(jiàn)Gong等,Jowma/o/歷o/og7ca/C7^附^少2003，27§1W41-19150。上述分析證實(shí)，分離產(chǎn)物就是純化的PSI蛋白質(zhì)葉綠素復(fù)合體。PSI中外露表面的半胱氨酸用與巰基特異性反應(yīng)的生物素-馬來(lái)酰亞胺探測(cè)。使生物素標(biāo)記的PSI復(fù)合體解離，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。對(duì)于免疫印跡測(cè)定，按先前文獻(xiàn)所述方法[Sun等，A/eAoA'/5""z戸6)/(3gy,AcademicPress,1998,第124-139頁(yè)],將蛋白質(zhì)樣品從凝膠轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，使之與過(guò)氧化物酶綴合的抗生物素反應(yīng)，然后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯現(xiàn)。結(jié)果如圖IE所示，所有純化的修飾PSI單元都包含外露表面的半胱氨酸。雖然未修飾的蛋白包含9個(gè)游離半胱氨酸，但是當(dāng)用表面活性試劑生物素-馬來(lái)酰亞胺測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們都沒(méi)有暴露在外面。實(shí)施例2定向單層膜的制造方法與材料制造通過(guò)突變PSI的半胱氨酸與新鮮潔凈的親水金表面直接反應(yīng)形成Au-硫鍵，來(lái)制備定向單層膜。通過(guò)在玻片或硅片上蒸發(fā)5nmCr和150nm金，制成平坦的金表面。使這些表面于35(TC下真空熱處理1小時(shí)。含有l(wèi)mg/lmlPSI的葉綠素緩沖溶液層鋪在金屬表面之上，然后溫育。使突變PSI或天然PSI于室溫下溫育2小時(shí)后，未連接的蛋白質(zhì)用蒸餾水徹底洗滌幾次。表面用超純氮干燥后，用原子力顯微鏡(AFM)觀測(cè)。原子力顯微鏡(AFM):用商用AFM(配有Extender電子模塊(ElectronicsModule)的Nanoscope*IliaMultyModeTM，VeecoInstruments)進(jìn)行AU測(cè)定。懸臂共振頻率為300kHz,用輕敲模式進(jìn)行形貌測(cè)定。結(jié)果PSI突變體在退火之后在金表面自組裝，在溫育2小時(shí)后與金表面保持共價(jià)連接。在金表面以類似方式溫育的天然PSI被沖洗掉。圖2B表示通過(guò)掃描玻片上0.3jam2面積的金表面所獲得的原子力顯微鏡圖象，PSI半胱氨酸突變體D479C的單體通過(guò)硫鍵與玻片連接在一起。圖2B清楚顯示出直徑15-21nm，高9nm的顆粒的單層膜。這正是預(yù)期的PSI尺寸，正如晶體學(xué)所獲得的一樣。在發(fā)光的顆粒狀表面觀察到這些顆粒。圖2A表示經(jīng)退火未處理的棵金表面的掃描圖，經(jīng)退火的金顆粒直徑150nm,高5nm。實(shí)施例3PSI突變體制#面的光電壓性質(zhì)通過(guò)開(kāi)爾文探針力顯微鏡(KPFM)測(cè)定單層膜中半胱氨酸突變體D4WC的單個(gè)PSI三聚體復(fù)合體和單體復(fù)合體的光電壓。材料與方法KPFM裝置基于商用AFM(改良的NanoScopeIliaMultiMode，Veeco，USA)，以輕敲模式操作。用所謂的"抬高模式(/,/r測(cè)定靜電力。基本上，測(cè)量形貌以后，使針尖從樣品表面縮回到固定高度。由壓力引發(fā)的針尖擺動(dòng)便停止，在之前用輕敲模式測(cè)量形貌所用的相同頻率下，向懸臂施加AC偏流。通過(guò)使在第一共振頻率下測(cè)定靜電力的鎖相放大器的輸出信號(hào)歸零，用常規(guī)方式測(cè)定CPD[Vatel等，Jowma/o/v4/7//zWP/y^cs1995，772358-2362]。用連續(xù)掃描記錄AFM形貌和相應(yīng)的KPFM電位，掃描速率1Hz;樣品面積分兩段進(jìn)行512線掃描以形成二維圖象。對(duì)于第一段掃描打開(kāi)氦-氖激光(^632.8nm，5mW/cm2)，對(duì)于第二段則關(guān)掉激光。結(jié)果如圖3A和圖3B所示，KPFM圖象證實(shí)突變PSI復(fù)合體明顯的光誘導(dǎo)電位。在形貌跟蹤時(shí)，產(chǎn)生的光誘導(dǎo)正電位為+0.498士0.02V(參見(jiàn)下表l),其中觀測(cè)到屬于PSI復(fù)合體的峰值(圖3A和圖3B)。這些結(jié)果清楚表明，所有結(jié)合到金表面的突變PSI復(fù)合體都具有功能活性，并且都朝著相同的方向。誘導(dǎo)電位是負(fù)電荷從PSI的金一側(cè)位移的結(jié)果，見(jiàn)圖1D。照明下，所測(cè)接觸電位差(CPD)的變化與簡(jiǎn)單計(jì)算的電位變化(Zl0)十分吻合，該電位由誘導(dǎo)偶極層產(chǎn)生，偶極層高度A與曲面法線成^角，可用下列公式表示z^=A^/cos其中7V為偶極層的面積密度，？為元電荷，s為偶極層的介電常數(shù)。對(duì)于三聚體，如果W為2.2x1011cm-2,^N5nm,e=2，6=90。,我們得出^^=0.41伏特。因?yàn)樵搶优紭O的角度未知，而且還因?yàn)榕紭O層不是一個(gè)大的實(shí)體，故介電常數(shù)具有不確定的性質(zhì)，所以可部分解答預(yù)期的+1V與計(jì)算所得出的0.41V之間的偏差。此外，由于反應(yīng)中心彼此相對(duì)較遠(yuǎn)，照明下所測(cè)得的CPD比實(shí)際CPD小很多。由于長(zhǎng)距離"l爭(zhēng)電力，在針尖頂下表面的點(diǎn)所測(cè)得的CPD是針尖附近表面電位的加權(quán)平均值。過(guò)去曾用不同算法計(jì)算針尖靜電求平均值的影響[Y.Rosenwaks等，尸/"zc"/i^wewS2004,70085320-085327]。根據(jù)這些計(jì)算結(jié)果，估計(jì)CPD(照明下)更精確的值約比該測(cè)量值大2倍。在位于琉基乙醇涂敷的金上的植物PSI中，測(cè)得相似的光誘導(dǎo)電位[I.Lee等，,尸/2,C/^w.S2000,/似2439-2443]。在這些實(shí)驗(yàn)中，用松散結(jié)合在單層膜上的巰基乙醇使PSI與金隔離，僅70%的復(fù)合體呈相同方向。在照明期間，金表面功函數(shù)也增加約+0.125V。部分電荷傳遞到位于PSI與金屬界面的光氧化P700附近，預(yù)期將導(dǎo)致更多的負(fù)基片。金和PSI之間的電荷傳遞是有效電子耦合的指標(biāo)。然而，當(dāng)照射未處理的金表面時(shí)，CPD的變化非常小。還可以觀察到暗中PSI復(fù)合體的正電位(CPD為+0.2V)比金基片的略高(圖3B)。這一電位可能是由AFM反饋激光使PSI激發(fā)而產(chǎn)生，該反饋激光沒(méi)有完全被用在KPFM裝置中的懸臂所掩蔽。這種本底激發(fā)可能引起對(duì)PSI中光CPD減去暗CPD變化的低估。關(guān)掉照明時(shí)觀察到電位的變化，證實(shí)了光誘導(dǎo)電位的可逆性質(zhì)。結(jié)果見(jiàn)下表5。數(shù)值表示在光下或在暗中測(cè)得的24個(gè)獨(dú)立的PSI復(fù)合體的平均電位。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>測(cè)量或者在光下開(kāi)始，然后關(guān)掉光源(光至暗)，或者在暗中開(kāi)始，然后打開(kāi)光源(暗至光)。表5所示，單層膜中經(jīng)照射的PSI半胱氨酸突變體的三聚體產(chǎn)生的CPD為+1.220±0.02V,當(dāng)關(guān)掉光源則降至+0.870±0.003V(見(jiàn)圖4B)。當(dāng)關(guān)掉光源時(shí)，基片電位沒(méi)有變化。在實(shí)驗(yàn)中施加偏流電位時(shí)，電荷不能從PSI附近快速遷移到balk金基片上。因此，與光源打開(kāi)時(shí)的差異相比，光CPD減去暗CPD(SPV)在關(guān)掉光源時(shí)較小(表5)。多個(gè)PSI復(fù)合體的平均光電位減去暗電位之差為+0.358士0.014V。當(dāng)金表面暴露時(shí)，接觸電位中沒(méi)有變化。在同一樣品中或在貯藏超過(guò)一個(gè)月的樣品中，光電位可以重復(fù)再生多次。半胱氨酸突變體D479C的PSI單體易形成自組裝的定向單層膜。單層膜中，單體之間(圖2B)和三聚體(圖5B)之間的平均距離分別為15nm和25nm。然而小單體比三聚體充滿在單層膜中的密度更高，可以通過(guò)配有高清晰度懸臂針尖的AFM測(cè)定加以判斷(圖2B)。然而，形貌或CPD測(cè)量的靈壽文度都不足于鑒別單個(gè)單體。因此，用KPFM測(cè)量在暗中的PSI單體單層膜所獲得的CPD稱為連續(xù)集(contmuum)(圖5A)。用同一裝置測(cè)定形貌時(shí)，觀察到類似的圖象(未顯示)。然而，用光照明后，CPD增加。在暗中和光下，根據(jù)單層膜上多個(gè)位置的CPD平均測(cè)量值，得出光誘導(dǎo)的CPD為+0.356土0.001V(表5)。經(jīng)照射的單層膜在關(guān)掉光源測(cè)量變化時(shí)，觀測(cè)到較小的光誘導(dǎo)CPD為+0.311士0鹿。實(shí)施例4本發(fā)明其它半胱氨酸突變體的自組裝定向PSI的自組裝還從其它3個(gè)突變體中獲得，其中位于暴露在膜外環(huán)上的氨基酸S499C、S599C、Y634C被修飾成為半胱氨酸(見(jiàn)圖1D)。這些突變體的PSI單體和三聚體均形成單層膜，所產(chǎn)生的光誘導(dǎo)CPD的值，與用突變體D479C制備的單層膜所測(cè)得的值相似。因此，PSI的功能性定向單層膜取決于與位于復(fù)合體膜外環(huán)的半胱氨酸形成硫鍵，而不局限在特定的位置。實(shí)施例5PSI電荷復(fù)合(c/f"/^e動(dòng)力學(xué)分#斤為了表征突變對(duì)PSI復(fù)合體中電子傳遞的作用，用單次循環(huán)光譜測(cè)定閃光誘導(dǎo)的吸收變化。材料與方法光譜測(cè)定用前述改良的閃光光解裝置[Gong等，Jbwm"/o/所o/op.ca/C/7ewz'對(duì)o;2003,19141-19150],于700nm和820nm下測(cè)定類囊體和PSI中P700的光氧化。樣品含有25mMTns(pH8)、10mM抗壞血酸鈉、10pM吩。秦硫酸曱酯和60卩ig葉綠素/mlPSI復(fù)合體。吸收變化瞬態(tài)用裝配多指數(shù)衰減的Marquardt最小二乘法算法程序分析(KaleidaGraph3.5,得自SynergySoftware,Reading,PA)。結(jié)果P700的光誘導(dǎo)氧化引起700nm的吸收減小或820nm的吸收增力口。從突變體D479C中分離的PSI蛋白中，閃光誘導(dǎo)的瞬時(shí)AA820(和AA700nm未顯示)衰減顯示與野生型相似的結(jié)果，逆反應(yīng)半衰期為4.5毫秒，這可歸因于電子傳遞介質(zhì)吩嗪硫酸曱酯使P700+還原(圖6A)。對(duì)于S499C和S599C的PSI復(fù)合體也獲得相似結(jié)果。結(jié)果表明，在突變PSI中電子轉(zhuǎn)交給FA/FB。如果在轉(zhuǎn)交給FA/FB時(shí)有干擾，則P700+還原可能是位于FA/FB之前傳遞體減少的結(jié)果，復(fù)合率可能比4.5毫秒更快。實(shí)際上，突變體5990及收衰減被分解成4.5毫秒(85%)和0.5毫秒(15%)的兩個(gè)組分，表明僅有部分電子傳遞到Fx,這導(dǎo)致P700+和Fx-之間的電荷復(fù)合[K.Brettel,S,'0c/2/w.說(shuō)0/^".jcto1997,322-373]。野生型和突變體P700+和Fx-之間相似的電荷復(fù)合率表明，定點(diǎn)誘變不會(huì)改變光誘導(dǎo)電子傳遞作用的模式。這些結(jié)果與突變體能夠在連續(xù)光下自養(yǎng)生長(zhǎng)這一事實(shí)是相符的。實(shí)施例6通過(guò)X射線熒光測(cè)定方向材料與方法X射線吸收測(cè)定從B10CAT機(jī)構(gòu)(AdvancedPhotonSource,ArgonneNationalLaboratories,Argonne,IL)的波動(dòng)機(jī)光束扇區(qū)(beamlineSector)18ID-D中獲得X射線吸收和焚光。通過(guò)雙Si(III)晶單色儀供給光束，用諧波抑制鏡獲得諧波抑制。聚焦光束的尺寸為100pmxl50拜,10-4DE/E帶寬的流量為1014光子/秒。通過(guò)充滿N2氣的離子室，來(lái)監(jiān)測(cè)入射X射線束強(qiáng)度/0，通過(guò)多層陣列檢測(cè)器監(jiān)測(cè)X射線熒光。Fe〖邊在X射線能7000eV和7900eV之間進(jìn)行掃描。為了使輻射損傷減至最小，在100K下，對(duì)PSI樣品的各角度掃描60秒。結(jié)果用掠射X射線熒光全反射測(cè)定自組裝單層膜中PSI的方向。PSI通過(guò)唯一的半胱氨酸與硅基片上鴒-碳多層上的鎢形成硫鍵連接。各圖是按與X射線束常態(tài)的25、45、60和90度的規(guī)定角度，60秒、42秒掃描的平均值。如圖6B所示，X射線焚光A邊隨相對(duì)于極化X射線束角度的變化而變化。如果PSI和鐵-硫簇以硅基片平面為基準(zhǔn)取向，這種變化則是預(yù)料當(dāng)中的。3個(gè)[4Fe-4S]鐵-硫簇各自形成變形立方，位于中心并沿PSI假C2對(duì)稱軸的兩側(cè)[P.Jordan等，M7to"2001,4//909-917]。因此，預(yù)期極化X射線束吸收衰減的變化是使光束偏振的PSI假對(duì)稱軸角度的函數(shù)。實(shí)際上，早已通過(guò)電子順磁共振在部分定向的類嚢體膜中測(cè)定了鐵-硫簇的方向[R.C.Prince,說(shuō)'0c/2/m/caW5,'—戸c"cto卩朋4J腸e群Wcs1980,592323-337]。結(jié)論本項(xiàng)工作首次證明，從藍(lán)細(xì)菌中篩選完整的反應(yīng)中心PSI,加上基于晶體結(jié)構(gòu)的合理的突變?cè)O(shè)計(jì)，能夠在導(dǎo)電金屬表面制造定向單層膜。通過(guò)與經(jīng)突變誘導(dǎo)的唯一的半胱氨酸形成硫鍵，使蛋白質(zhì)復(fù)合體直接結(jié)合在金屬電極上，確保了穩(wěn)定、定向、具功能和有效的電子連接。單層膜中的干膜蛋白保持其產(chǎn)生約+1V光電位的能力。光電二級(jí)管的性質(zhì)、納米尺度、量子產(chǎn)額高和幾乎60%的能量轉(zhuǎn)化效率使反應(yīng)中心成為分子電子學(xué)和生物工程學(xué)應(yīng)用中十分引人注目的納米技術(shù)器件。應(yīng)當(dāng)了解的是，為了清楚起見(jiàn)在不同的實(shí)施方案內(nèi)容中加以描述的本發(fā)明的某些特征，同樣也可合并起來(lái)在一個(gè)實(shí)施方案中提供。相反，為簡(jiǎn)明起見(jiàn)在一個(gè)實(shí)施方案內(nèi)容中加以描述的本發(fā)明的各種盡管本發(fā)明結(jié)合其具體的實(shí)施方案加以描述，但是明顯的是許多替換、修改和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，本發(fā)明包括所有落入所附權(quán)利要求書(shū)精神和大范圍內(nèi)的這些替換、修改和變化。本說(shuō)明書(shū)所提及的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)都通過(guò)引用全部結(jié)合到本說(shuō)明書(shū)中，其程度與每個(gè)獨(dú)立出版物、專利、專利申請(qǐng)具體而單獨(dú)指明通過(guò)引用結(jié)合到本文中一樣。另外，在本申請(qǐng)任何參考文獻(xiàn)的引用或標(biāo)識(shí)都不得解釋為承認(rèn)這樣的參考文獻(xiàn)都可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)荻得。權(quán)利要求1.一種分離的修飾多肽，該多肽包含光合生物光催化單元的多肽的氨基酸序列，所述氨基酸序列能夠介導(dǎo)所述光催化單元與固體表面的共價(jià)連接，并且在連接到所述固體表面時(shí)仍保持所述光催化單元的光催化活性。2.權(quán)利要求1的分離的修飾多肽，其中所述光合生物為綠色植物。3.權(quán)利要求1的分離的修飾多肽，其中所述光合生物為藍(lán)細(xì)菌。4.權(quán)利要求1的分離的修飾多肽，其中所述光催化單元為PS-I。5.權(quán)利要求3的分離的修飾多肽，其中所述光催化單元為集胞藻PCC6803光催化單元。6.權(quán)利要求1的分離的修飾多肽，其中所述光催化單元中所述多肽的所述氨基酸序列包含至少一個(gè)置換突變。7.權(quán)利要求6的分離的修飾多肽，其中所述置換突變?cè)谒龉獯呋瘑卧哪ね猸h(huán)上。8.權(quán)利要求1的分離的修飾多肽，其中所述多肽的所述氨基酸序列為psaB。9.權(quán)利要求1的分離的》爹飾多肽，其中所述多肽的所述氨基酸序列為psaC。10.權(quán)利要求8的分離的修飾多肽，其中所述PsaB在至少一個(gè)用以下坐標(biāo)標(biāo)明的位置上包含置換突變D235C、S246C、D479C、S499C、S599C、Y634C。11.權(quán)利要求8分離的修飾多肽，其中所述PsaC在至少一個(gè)用坐標(biāo)W31C標(biāo)明的位置上包含置換突變。12.權(quán)利要求6的分離的修飾多肽，其中所述至少一個(gè)置換突變?yōu)榘腚装彼帷?3.權(quán)利要求6的分離的修飾多肽，其中所述氨基酸序列如SEQIDNO:20、21、22、23、24、25、26、27、28和29中所示。14.權(quán)利要求l的分離的〗'f飾多肽，其中所述固體表面為導(dǎo)電材料。15.權(quán)利要求14的分離的修飾多肽，其中所述導(dǎo)電材料為過(guò)渡金屬元素。16.權(quán)利要求15的分離的修飾多肽，其中所述過(guò)渡金屬元素選自銀、金、銅、鉬、鎳和鈀。17.權(quán)利要求1的分離的修飾多肽，所述多肽不包含金屬離子。18.權(quán)利要求4的分離的修飾多肽，所述多肽為單體形式或三聚體形式。19.大量的權(quán)利要求1的分離的多肽，所述多肽能夠以相對(duì)于所述固體表面基本相同的方向定向。20.—種分離的修飾光催化單元，其包含權(quán)利要求1的修飾多肽。21.—種膜制品，其包含權(quán)利要求20的修飾光催化單元。22.—種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1的修飾多肽。23.—種核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求22的多核苷酸。24.權(quán)利要求23的核酸構(gòu)建體，其還包含順式調(diào)節(jié)元件。25.權(quán)利要求24的核酸構(gòu)建體，其中所述順式調(diào)節(jié)元件為啟動(dòng)子。26.—種細(xì)胞，其包含權(quán)利要求22的分離的多核苷酸。27.權(quán)利要求24的細(xì)胞，所述細(xì)胞是集胞藻細(xì)胞。28.—種器件，其包括連接有大量的權(quán)利要求20的修飾光催化單元的固體表面。29.權(quán)利要求24的器件，其中所述大量的修飾光催化單元每個(gè)之間的距離介于15-25nm之間。30.權(quán)利要求28的器件，其中所述大量的修飾光催化單元相對(duì)于所述固體表面是定向的。31.權(quán)利要求28的器件，用作光電二級(jí)管的元件。32.權(quán)利要求28的器件，用作光電晶體管的元件。33.權(quán)利要求28的器件，用作邏輯門的元件。34.權(quán)利要求28的器件，用作太陽(yáng)能電池的元件。35.權(quán)利要求28的器件，用作光耦合器的元件。36.權(quán)利要求28的器件，其中所述大量的修飾光催化單元與所述固體表面直接連接。37.權(quán)利要求36的器件，其中所述直接連接為共價(jià)連接。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了分離的修飾多肽，該多肽包含編碼光合生物光催化單元的氨基酸序列，該光催化單元能夠與固體表面共價(jià)連接，并且在連接到固體表面之后仍具有光催化活性。文檔編號(hào)C12N15/29GK101163793SQ200680013433公開(kāi)日2008年4月16日申請(qǐng)日期2006年2月22日優(yōu)先權(quán)日2005年2月22日發(fā)明者C·卡梅利,I·卡梅利,L·弗羅洛夫申請(qǐng)人:特拉維夫大學(xué)拉莫特有限公司