專利名稱：：Walker-256細(xì)胞株在創(chuàng)建骨腫瘤痛模型中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及骨腫瘤痛模型的制作，特別是應(yīng)用Walker-256細(xì)胞林創(chuàng)建骨腫瘤痛模型。(二)
背景技術(shù)：
：骨癌痛是癌癥病人最常見的一種疼痛，約三分之一的晚期癌癥病人都會發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。腫瘤引起的疼痛嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。雖然治療骨癌痛有化療、放療、三階梯療法及二磷酸鹽等多種手段，但由于存在療效短暫和藥品不良反應(yīng)等問題，仍有相當(dāng)一部分癌痛得不到理想控制。發(fā)展新療法的關(guān)4定在于對癌痛發(fā)病機(jī)制的正確認(rèn)識，然而由于長期以來缺乏相應(yīng)的動(dòng)物模型，阻礙了對癌痛發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識及抗癌痛藥物的研發(fā)。近幾年來國外相繼有了股骨、肱骨、跟骨和脛骨癌痛動(dòng)物模型成功建立的報(bào)道，為認(rèn)識人類骨癌痛的機(jī)制以及篩選治療性藥物提供了很好的工具。但在國內(nèi)，由于受到造模用細(xì)胞抹來源的限制，癌痛模型復(fù)制仍然成為相關(guān)課題的究的障礙。國外報(bào)道成功建立的骨癌痛模型主要應(yīng)用兩種瘤細(xì)胞抹，即NCTC2472纖維肉瘤細(xì)胞抹和MRMT-1大鼠乳腺癌細(xì)胞抹，然而，這兩種細(xì)胞在國內(nèi)很難獲得，限制了癌痛模型的復(fù)制及相關(guān)課題的研究。因此，如何應(yīng)用國內(nèi)易得的瘤抹建立穩(wěn)定癌痛模型具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和科研價(jià)值。資料顯示，具有較好的骨侵襲能力，但該細(xì)胞林來源于大鼠原發(fā)性乳腺癌組織，至今沒有報(bào)道表明可利用Walker-256癌細(xì)胞林制作骨腫瘤痛模型。(三)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是為解決國內(nèi)骨腫瘤痛模型制作中受到的細(xì)胞抹限制，提供Walker-256細(xì)胞抹在創(chuàng)建骨腫瘤痛模型中在的應(yīng)用。為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是Walker-256細(xì)胞抹在創(chuàng)建骨腫瘤痛沖莫型中的應(yīng)用。Walker-256細(xì)胞抹在創(chuàng)建大鼠骨腫瘤痛模型中的應(yīng)用。所述的Walker-256細(xì)胞林創(chuàng)建骨腫瘤痛模型為將動(dòng)物麻醉后，后肢剪毛，皮膚消毒，將脛骨上段的皮膚切開小口以暴露脛骨，在脛骨上穿刺打孔至骨髓，再注射入2jiL5iiL含4x103~4x106個(gè)W256癌細(xì)胞的生理鹽水細(xì)胞懸液，注射完畢后迅速用骨蠟封住針孔，用無菌生理鹽水沖洗，皮膚縫合，在創(chuàng)口處滴撒抗感染藥，繼續(xù)飼養(yǎng)10~14天即建成骨腫瘤痛模型。所述的動(dòng)物優(yōu)選為大鼠。所述的大鼠優(yōu)選SD或Wistar雌性大鼠，清潔級，體重100~200克。具體的，所述的大鼠經(jīng)質(zhì)量濃度3%的戊巴比妥鈉麻醉后，后肢剪毛，皮膚消毒，在脛骨上段將皮膚切開約lcm小口，小心暴露脛骨，先用5mL或10mL注射器針頭穿刺打孔至骨髓，然后換用5pL或IOjiL微量注射器進(jìn)入骨髓腔，緩慢注入4pL含4x104個(gè)W256癌細(xì)胞的生理鹽水細(xì)胞懸液，注射完畢后迅速用骨蠟封住針孔，無菌生理鹽水沖洗，皮膚縫合，在創(chuàng)口處滴4敎少許慶大霉素注射液，繼續(xù)飼養(yǎng)10~14天即建成骨腫瘤痛才莫型。穿刺打孔時(shí)不可將對側(cè)骨皮質(zhì)穿透，且注射完癌細(xì)胞后應(yīng)迅速用骨蠟封住針孔止血，否則均會導(dǎo)致癌細(xì)胞在骨外生長，易致造模失敗。在整個(gè)操作過程中應(yīng)注意的問題是，所述的W256癌細(xì)胞的生理鹽水細(xì)胞懸液應(yīng)于冰塊上低溫放置，06。C溫度條件，每次抽取時(shí)要搖勻，在6小時(shí)內(nèi)使用，推薦在23小時(shí)內(nèi)用，否則會影響癌細(xì)胞的活力。所述的Walker-256細(xì)胞抹創(chuàng)建骨腫瘤痛模型在注意在無菌條件下進(jìn)行，熟練輕巧的動(dòng)作也是保證造模成功的重要因素。本發(fā)明所述的應(yīng)用Walker-256癌細(xì)胞抹已成功創(chuàng)建大鼠骨腫瘤痛模型。該腫瘤痛模型的創(chuàng)建，將為腫瘤痛相關(guān)課題的研究，尤其是篩選抗腫瘤痛中藥及其復(fù)方提供一個(gè)有用的工具；并且該細(xì)胞林來源于大鼠原發(fā)性乳腺癌組織，因而應(yīng)用該瘤細(xì)胞建立骨腫瘤痛模型可視為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型，具有重要的科研價(jià)值和應(yīng)用前景。(四)圖1為實(shí)施例1模型組造模第7天的大鼠脛骨X線片；圖2為實(shí)施例l模型組造模第14天的大鼠脛骨X線片；圖3為實(shí)施例1模型組造模第21天的大鼠脛骨X線片；圖4為實(shí)施例1假手術(shù)組的大鼠脛骨X線片；圖5為實(shí)施例1模型組造模第7天的大鼠脛骨切片；圖6為實(shí)施例1模型組造模第14天的大鼠脛骨切片；圖7為實(shí)施例1模型組造模第21天的大鼠脛骨切片；圖8為實(shí)施例1假手術(shù)組的大鼠脛骨切片。(五)具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1:1.材料和方法瘤林Walker-256大鼠腹水癌細(xì)胞抹，由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；動(dòng)物SD雌性大鼠，清潔級，體重140-160克，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；主要儀器XZC-2B型自控溫度熱板儀(山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn))，XZC-A型壓力測痛儀(山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn))，高頻乳腺攝片機(jī)(意大利產(chǎn))；造才莫方法模型組將大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉后，腹部朝上，左側(cè)后肢剪毛，皮膚消毒，在脛骨上段將皮膚切開約lcm小口，小心暴露脛骨，先用5ml注射器針頭穿刺打孔，然后換用5pl微量注射器進(jìn)入骨髓腔，緩慢注入4iaL含4x104個(gè)W256癌細(xì)胞的生理鹽水細(xì)胞懸液，注射完畢后迅速用骨蠟封住針孔，無菌生理鹽水沖洗，皮膚縫合，在創(chuàng)口處滴撒少許慶大霉素注射液以防感染；對照組:將大鼠左側(cè)脛骨上段注入等體積的生理鹽水,其余操作同模型組。2.指標(biāo)測定2.1行為學(xué)分別于手術(shù)前及手術(shù)后第7、12、15、18、21天用大鼠熱板法和足趾加壓法測量熱刺激和機(jī)械刺激痛閾。熱刺激先將熱板儀調(diào)節(jié)溫度至52。C土0.1。C，然后將大鼠放置在熱板上，待出現(xiàn)添后足時(shí)所需要的時(shí)間值(秒)即為該動(dòng)物的痛閾值，每只大鼠測3次，間隔5分鐘以上，取3次均值作為該動(dòng)物的熱刺激痛閾值，篩選基礎(chǔ)痛閾在10秒-30秒的動(dòng)物用于實(shí)驗(yàn)；機(jī)械刺激:將大鼠左后足掌置于壓力測痛儀壓力針下，按動(dòng)電動(dòng)按鈕，使壓力搖桿旋動(dòng)，隨搖桿的旋動(dòng)大鼠足掌壓痛點(diǎn)壓力逐漸增加，以縮足或嘶叫為痛反應(yīng)，出現(xiàn)痛反應(yīng)時(shí)的重量值(x10g)即為該動(dòng)物的機(jī)械刺激痛閾值，每只大鼠測3次，間隔5分鐘以上，取3次均值作為該動(dòng)物的機(jī)械刺激痛閾值。2.2放射學(xué)于造模后第7、14天分別隨機(jī)抽取每組大鼠2~4只，第21天收集全部剩余大鼠雙側(cè)后肢，進(jìn)行X線攝片，評估腫瘤誘發(fā)的骨破壞程度。放射學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)如下0分正常的骨結(jié)構(gòu)，無任何骨質(zhì)破壞的征象；1分在脛骨近骺端注射部位附近，見小的放射性的骨質(zhì)缺損病灶(數(shù)量少于3個(gè))；2分髓質(zhì)骨缺損放射性病灶增多(大于3個(gè))；3分髓質(zhì)骨缺失，同時(shí)皮質(zhì)骨受侵；4分單面的骨皮質(zhì)完全缺損；5分雙面的骨皮質(zhì)缺失，移位性骨折。23組織學(xué)將X線攝片后的大鼠后肢進(jìn)行修剪，留下脛骨及少許軟組織，先用4%中性甲酪液固定1周，再在含10%曱酸的多聚甲醛固定液中脫鈣1周，石蠟切片，HE染色，鏡下觀察腫瘤生長和骨結(jié)構(gòu)的破壞情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0軟件進(jìn)行方差分析，以PO.05為差異標(biāo)準(zhǔn)。3.結(jié)果3.1行為學(xué)熱刺激(見表l):與造模前的基礎(chǔ)痛閾相比，模型組第12天開始，大鼠出現(xiàn)熱刺激痛閾明顯下降(PO.Ol)，以后逐漸降低，其中術(shù)后第18天和第21天痛閾與第12天比較均有差異顯著(P<0.05)。而假手術(shù)組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)痛閾與術(shù)前基礎(chǔ)痛閾比較均無差異。提示，造模大鼠從第12天已出現(xiàn)熱痛覺過敏，且呈漸進(jìn)性加強(qiáng)趨勢。表1:兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)熱刺激痛閾的變化(5±s)(單位秒)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>機(jī)械刺激(見表2):與造模前的基礎(chǔ)痛閾相比，模型組第12天開始，大鼠出現(xiàn)機(jī)械刺激痛閾明顯下降(PO.01),并隨時(shí)間推移逐漸降低，其中術(shù)后第21天痛閾較第12天進(jìn)一步降低(P<0.05)。而假手術(shù)組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)痛閾與術(shù)前基礎(chǔ)痛閾比較均無差異。提示，造模大鼠從第12天已出現(xiàn)機(jī)械性痛覺過敏，且呈漸進(jìn)性加強(qiáng)趨勢。表2:兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)機(jī)械刺激痛閾的變化(^土s)(單位10g<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與基礎(chǔ)痛閾比較"表示PO.Ol,與第12天比較1表示P〈0.053.2放射學(xué)大鼠脛骨X線片顯示，模型組大鼠左側(cè)脛骨隨造模時(shí)間的推移逐漸出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)破壞，且骨破壞的程度與造模時(shí)間成正相關(guān)。造模第7天的X線片僅見注射部位松質(zhì)骨有小的放射性缺損病灶(見圖1,評分為1,范圍0~2);第14天，X線示+〉質(zhì)骨放射性病灶增多，同時(shí)骨皮質(zhì)有明顯缺損病灶(見圖2，評分為3，范圍24);到第21天，骨破壞進(jìn)一步加重,骨皮質(zhì)完全缺失，病灶范圍擴(kuò)大，部分脛骨已出現(xiàn)病理性骨折(見圖3，評分為4，范圍3~5)。而假手術(shù)組脛骨X線片未顯示明顯的骨質(zhì)破壞(見圖4,評分為0)。3.3組織學(xué):造;f莫第7天的脛骨切片顯示，骨髓腔內(nèi)及骨小梁間見大量活躍的腫瘤細(xì)胞生長，骨小梁破壞較輕，骨皮質(zhì)仍完整(見圖5);造模第14天，骨髓腔內(nèi)充滿了腫瘤細(xì)胞，大部分呈活躍狀態(tài)，骨小梁破壞加重，骨皮質(zhì)受侵，變薄，局部可見新生編織骨形成(見圖6);造模第21天，骨髓腔完全被腫瘤細(xì)胞所填充，中央大部分腫瘤細(xì)胞已退變壞死，而在骨髓腔的邊緣部分，腫瘤細(xì)胞多呈活躍狀態(tài)，腫瘤向外生長，骨小梁和骨皮質(zhì)均完全被破壞(見圖7)。而假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠脛骨切片顯示，骨髓腔內(nèi)見各種正常的骨髓細(xì)胞，未見其他骨結(jié)構(gòu)的改變(見圖8)。實(shí)施例2:1.材津牛和方法瘤抹Walker-256大鼠腹水癌細(xì)胞抹，由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；動(dòng)物SD雌性大鼠，清潔級，體重150-180克，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；主要儀器XZC-2B型自控溫度熱板儀(山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn))，XZC-A型壓力測痛儀(山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn))，高頻乳腺攝片機(jī)(意大利產(chǎn))；造模方法模型組將大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉后，腹部朝上，左側(cè)后肢剪毛，皮膚消毒，在脛骨上段將皮膚切開約lcm小口，小心暴露脛骨，先用5ml注射器針頭穿刺打孔，然后換用5^d微量注射器進(jìn)入骨髓腔，緩慢注入4ML含4x103個(gè)W256癌細(xì)胞的生理鹽水細(xì)胞懸液，注射完畢后迅速用骨蠟封住針孔，無菌生理鹽水沖洗，皮膚縫合，在創(chuàng)口處滴撒少許慶大霉素注射液以防感染；對照組將大鼠左側(cè)脛骨上段注入等體積的生理鹽水，其余操作同模型組。2.指標(biāo)測定2.1行為學(xué)分別于手術(shù)前及手術(shù)后第7、12、15、18、21天用大鼠熱板法和足趾加壓法測量熱刺激和機(jī)械刺激痛閾。熱刺激先將熱板儀調(diào)節(jié)溫度至52。C士0.rC，然后將大鼠放置在熱板上，待出現(xiàn)添后足時(shí)所需要的時(shí)間值(秒)即為該動(dòng)物的痛閾值，每只大鼠領(lǐng)寸3次，間隔5分鐘以上，取3次均值作為該動(dòng)物的熱刺激痛閾值，篩選基礎(chǔ)痛閾在10秒-30秒的動(dòng)物用于實(shí)驗(yàn)；機(jī)械刺激:將大鼠左后足掌置于壓力測痛儀壓力針下，按動(dòng)電動(dòng)按鈕，使壓力搖桿旋動(dòng)，隨搖桿的旋動(dòng)大鼠足掌壓痛點(diǎn)壓力逐漸增加，以縮足或嘶叫為痛反應(yīng)，出現(xiàn)痛反應(yīng)時(shí)的重量值(x10g)即為該動(dòng)物的機(jī)械刺激痛閾值，每只大鼠測3次，間隔5分鐘以上，取3次均值作為該動(dòng)物的機(jī)械刺激痛閾值。2.2放射學(xué)于造模后第14天隨機(jī)抽取每組大鼠2只，第21天收集全部剩余大鼠雙側(cè)后肢，進(jìn)行X線攝片，評估腫瘤誘發(fā)的骨破壞程度。放射學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)如下0分正常的骨結(jié)構(gòu)，無任何骨質(zhì)破壞的征象；1分在脛骨近骺端注射部位附近，見小的放射性的骨質(zhì)缺損病灶(數(shù)量少于3個(gè))；2分髓質(zhì)骨缺損放射性病灶增多(大于3個(gè))；3分髓質(zhì)骨缺失，同時(shí)皮質(zhì)骨受侵；4分單面的骨皮質(zhì)完全缺損；5分雙面的骨皮質(zhì)缺失，移位性骨折。2.3組織學(xué)將X線攝片后的大鼠后肢進(jìn)行修剪，留下脛骨及少許軟組織，先用4%中性甲酪液固定1周,再在含10%甲酸的多聚甲醛固定液中脫4丐1周,石蠟切片，HE染色，鏡下觀察腫瘤生長和骨結(jié)構(gòu)的破壞情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0軟件進(jìn)行方差分析，以P<0.05為差異標(biāo)準(zhǔn)。3.結(jié)果3.1行為學(xué)熱刺激(見表3:與造模前的基礎(chǔ)痛閾相比，模型組第12天開始，大鼠出現(xiàn)熱刺激痛閾明顯下降(P<0.01)，以后逐漸降低，其中術(shù)后第18天和第21天痛閾與第12天比較均有差異顯著(P<0.05)。而假手術(shù)組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)痛閾與術(shù)前基礎(chǔ)痛閾比較均無差異。提示，造模大鼠從第12天已出現(xiàn)熱痛覺過^:，且呈漸進(jìn)性加強(qiáng)趨勢。表3:兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)熱刺激痛閾的變化(5土s)(單位秒)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>與基礎(chǔ)痛閾比較**表示P<0.01機(jī)械刺激(見表4):與造模前的基礎(chǔ)痛閾相比，模型組第12天開始，大鼠出現(xiàn)機(jī)械刺激痛閾明顯下降(P<0.01),并隨時(shí)間推移逐漸降低，其中術(shù)后第21天痛閾較第12天進(jìn)一步降低(P<0.05)。而假手術(shù)組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)痛閾與術(shù)前基礎(chǔ)痛閾比較均無差異。提示，造模大鼠從第12天已出現(xiàn)機(jī)械性痛覺過敏，且呈漸進(jìn)性加強(qiáng)趨勢。表4:兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)機(jī)械刺激痛閾的變化(5士s)(單位10g)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>與基礎(chǔ)痛閾比4交**表示P<0.013.2放射學(xué)大鼠脛骨X線片顯示，模型組大鼠左側(cè)脛骨隨造模時(shí)間的推移出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)破壞。造模第14天的X線片可見注射部位松質(zhì)骨有小的放射性缺損病灶(評分為1,范圍02);第21天，X線示杠、質(zhì)骨放射性病灶明顯增多，同時(shí)骨皮質(zhì)有明顯缺損病灶(評分為3,范圍2~4)。而假手術(shù)組脛骨X線片未顯示明顯的骨質(zhì)破壞(評分為0)。3.3組織學(xué)造模第14天的脛骨切片顯示，骨髓腔內(nèi)及骨小梁間見活躍的腫瘤細(xì)胞生長，骨小梁破壞較輕，骨皮質(zhì)完整；第21天，骨髓腔內(nèi)充滿了腫瘤細(xì)胞，骨小梁破壞加重，骨皮質(zhì)受侵，變薄，局部可見新生編織骨形成。實(shí)施例3:1.材料和方法瘤抹Walker-256大鼠腹水癌細(xì)胞抹，由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；動(dòng)物SD雌性大鼠，清潔級，體重150-180克，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；主要儀器XZC-2B型自控溫度熱板儀(山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn))，XZC-A型壓力測痛儀(山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn))，高頻乳腺攝片機(jī)(意大利產(chǎn))；造模方法模型組將大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉后，腹部朝上，左側(cè)后肢剪毛，皮膚消毒，在脛骨上段將皮膚切開約lcm小口，小心暴露脛骨，先用5ml注射器針頭穿刺打孔，然后換用5Kil微量注射器進(jìn)入骨髓腔，緩慢注入4HL含4x106個(gè)W256癌細(xì)胞的生理鹽水細(xì)胞懸液，注射完畢后迅速用骨蠟封住針孔，無菌生理鹽水沖洗，皮膚縫合，在創(chuàng)口處滴撒少許慶大霉素注射液以防感染；對照組:將大鼠左側(cè)脛骨上段注入等體積的生理鹽水,其余操作同模型組。2.指標(biāo)測定2.1行為學(xué)分別于手術(shù)前及手術(shù)后第7、10、12、15天用大鼠熱板法和足趾加壓法測量熱刺激和機(jī)械刺激痛閾。熱刺激先將熱板儀調(diào)節(jié)溫度至52。C士0.rC,然后將大鼠放置在熱板上，待出現(xiàn)添后足時(shí)所需要的時(shí)間值(秒)即為該動(dòng)物的痛閾值，每只大鼠觀'J3次，間隔5分鐘以上，取3次均值作為該動(dòng)物的熱刺激痛閾值，篩選基礎(chǔ)痛閾在10秒-30秒的動(dòng)物用于實(shí)驗(yàn)；機(jī)械刺激:將大鼠左后足掌置于壓力測痛儀壓力針下，按動(dòng)電動(dòng)按鈕，使壓力搖桿旋動(dòng)，隨搖桿的旋動(dòng)大鼠足掌壓痛點(diǎn)壓力逐漸增加，以縮足或嘶叫為痛反應(yīng)，出現(xiàn)痛反應(yīng)時(shí)的重量值(xiog)即為該動(dòng)物的機(jī)械刺激痛閾值，每只大鼠測3次，間隔5分鐘以上，取3次均值作為該動(dòng)物的機(jī)械刺激痛閾值。2.2放射學(xué)于造模后第10天隨機(jī)抽取每組大鼠2只，第15天收集全部剩余大鼠雙側(cè)后肢，進(jìn)行X線攝片，評估腫瘤誘發(fā)的骨破壞程度。放射學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)如下0分正常的骨結(jié)構(gòu)，無任何骨質(zhì)破壞的征象；1分在脛骨近骺端注射部位附近，見小的放射性的骨質(zhì)缺損病灶(數(shù)量少于3個(gè))；2分髓質(zhì)骨缺損放射性病灶增多(大于3個(gè))；3分髓質(zhì)骨缺失，同時(shí)皮質(zhì)骨受侵；4分單面的骨皮質(zhì)完全缺損；5分雙面的骨皮質(zhì)缺失，移位性骨折。2.3組織學(xué)將X線攝片后的大鼠后肢進(jìn)行修剪,留下脛骨及少許軟組織，先用4%中性曱醛液固定1周,再在含10%曱酸的多聚曱醛固定液中脫鈣1周，石蠟切片，HE染色,鏡下觀察腫瘤生長和骨結(jié)構(gòu)的破壞情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0軟件進(jìn)行方差分析，以PO.05為差異標(biāo)準(zhǔn)。3.結(jié)果3.1行為學(xué)熱刺激(見表5):與造模前的基礎(chǔ)痛閾相比，模型組第IO天開始，大鼠出現(xiàn)熱刺激痛閾明顯下降(P<0.01),并逐漸降低，其中術(shù)后第15天與第IO天比較有顯著差異(P<0.05)。而假手術(shù)組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)痛閾與術(shù)前基礎(chǔ)痛閾比較均無差異。提示，造模大鼠從第IO天已出現(xiàn)熱痛覺過敏，且呈漸進(jìn)性加強(qiáng)趨勢。表5:兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)熱刺激痛閾的變化(^土s)(單位秒)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>與基礎(chǔ)痛閾比較"表示PO.Ol，與第10天比較A表示P0.05機(jī)械刺激(見表6):與造模前的基礎(chǔ)痛闊相比，模型組第IO天開始,大鼠出現(xiàn)機(jī)械刺激痛閾明顯下降(PO.01),并隨時(shí)間推移逐漸降低，其中術(shù)后第15天痛閾較第IO天進(jìn)一步降低(P<0.05)。而假手術(shù)組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)痛閾與術(shù)前基礎(chǔ)痛閾比較均無差異。提示，造模大鼠從第10天已出現(xiàn)機(jī)械性痛覺過^t，且呈漸進(jìn)性加強(qiáng)趨勢。表6:兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)機(jī)械刺激痛閾的變化(；土s)(單位10g)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>與基礎(chǔ)痛閾比較"表示PO.01;與第10天比較A表示P0.053.2放射學(xué)大鼠脛骨X線片顯示，模型組大鼠左側(cè)脛骨隨造模時(shí)間的推移出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)破壞。造模第IO天的X線片可見松質(zhì)骨明顯放射性病灶，同時(shí)骨皮質(zhì)有輕微缺損病灶(評分為2,范圍13)。造模第15天的X線片顯示松質(zhì)骨破壞嚴(yán)重，骨皮質(zhì)有缺損病灶明顯擴(kuò)大(評分為3，范圍2~4)。而假手術(shù)組脛骨X線片未顯示明顯的骨質(zhì)破壞(評分為0)。3.3組織學(xué)造模第IO天的脛骨切片顯示，骨髓腔內(nèi)及骨小梁間見大量活躍的腫瘤細(xì)胞生長，骨小梁明顯破壞，骨皮質(zhì)較完整；第15天，骨髓腔內(nèi)充滿了腫瘤細(xì)胞，骨小梁破壞嚴(yán)重，骨皮質(zhì)大范圍受侵，變薄，局部可見新生編織骨形成。權(quán)利要求1.Walker-256細(xì)胞株在創(chuàng)建骨腫瘤痛模型中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于Walker-256細(xì)胞抹在建立大鼠骨腫瘤痛模型中的應(yīng)用。3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的Walker-256細(xì)胞抹創(chuàng)建骨腫瘤痛模型為將動(dòng)物麻醉后，后肢剪毛，皮膚消毒，將脛骨上段的皮膚切開小口以暴露脛骨，在脛骨上穿刺打孔至骨髓，再注射入2nL5luL含4xloS4x1(^個(gè)W256癌細(xì)胞的生理鹽水細(xì)胞懸液,注射完畢后迅速用骨蠟封住針孔，用無菌生理鹽水沖洗，皮膚縫合，在創(chuàng)口處滴撒抗感染藥，繼續(xù)飼養(yǎng)1014天即建成骨癌痛模型。4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的動(dòng)物為大鼠。5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的大鼠為SD或Wistar雌性大鼠，清潔級，體重100200克。6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉后，后肢剪毛，皮膚消毒，在脛骨上段將皮膚切開約lcm小口，小心暴露脛骨，先用5ml或10mL注射器針頭穿刺打孔至骨髓，然后換用5jil或10pl微量注射器進(jìn)入骨髓腔，緩慢注入4jiL含4x104個(gè)W256癌細(xì)胞的生理鹽水細(xì)胞懸液，注射完畢后迅速用骨蠟封住針孔，無菌生理鹽水沖洗，皮膚縫合，在創(chuàng)口處滴撒慶大霉素注射液，繼續(xù)銅養(yǎng)10~14天即建成骨腫瘤痛模型。7.如權(quán)利要求3~6之一所述的應(yīng)用，其特征在于所述的W256癌細(xì)胞的生理鹽水細(xì)胞懸液使用前搖勻，并在6小時(shí)內(nèi)使用。8.如權(quán)利要求3-6之一所述的應(yīng)用，其特征在于所述的Walker-256細(xì)胞抹創(chuàng)建骨腫瘤痛模型在無菌條件下進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明提供了Walker-256細(xì)胞株在創(chuàng)建骨腫瘤痛模型中的應(yīng)用，尤其是在創(chuàng)建大鼠骨腫瘤痛模型中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的應(yīng)用Walker-256癌細(xì)胞株已成功創(chuàng)建大鼠骨腫瘤痛模型。該腫瘤痛模型的建立，將為腫瘤痛相關(guān)課題的研究，尤其是篩選抗腫瘤痛中藥及其復(fù)方提供一個(gè)有用的工具；并且該細(xì)胞株來源于大鼠原發(fā)性乳腺癌組織，因而應(yīng)用該瘤細(xì)胞創(chuàng)建骨腫瘤痛模型可視為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型，具有重要的科研價(jià)值和應(yīng)用前景。文檔編號C12N5/06GK101191123SQ20061015495公開日2008年6月4日申請日期2006年12月1日優(yōu)先權(quán)日2006年12月1日發(fā)明者嚴(yán)繼貴,俞麗霞,王澤時(shí)申請人:浙江中醫(yī)藥大學(xué)