專利名稱：：一種右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法，尤其是一種以外消旋生物素中間體內(nèi)酉旨(tetrahydro-l,3陽(yáng)bis(phenylmethy1)-1H-Furo[3,4-d]imidazole-2,4-dione)水解后得到的外消旋有機(jī)酸(l,3-dibenzyl-5-(hydroxymethyl)-2-oxo-4-Imidazolidinecarboxylicacid)為反應(yīng)底物，在內(nèi)酯合成酶作用下選擇性進(jìn)行合成右旋生物素中間體內(nèi)酯的方法。(二)
背景技術(shù)：
：生物素(Biotin)[CAS:5828525]又名維生素H(VitaminH)或維生素B7和輔酶R(CoenzymeR),是一種重要水溶性B簇維生素。生物素廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、多維制劑及飼料添加劑方面，尤其是配制飼料的關(guān)鍵組分之一。生物素是脂肪酸合成和糖代謝羧化酶的輔酶，是整個(gè)生物界所必需的，在糖質(zhì)新生和氨基酸代謝中也相當(dāng)重要。除了一部分細(xì)菌，酵母和植物能自身合成生物素外，幾乎所有的動(dòng)物和一部分微生物都要從外源獲得生物素。生物素用途廣泛，20-30%用于醫(yī)用原料，50%用于飼料，另外還用作化妝品原料等等。A生物素在世界上的需求量相當(dāng)大，光學(xué)純的右旋生物素中間體內(nèi)酯是生產(chǎn)叢生物素的重要中間體。如圖l,式la/b為外消旋內(nèi)酯1,3-二,基-六氫-lH-呋喃并[3,4-d]咪唑-2,4-二酮，其中右旋內(nèi)酯la是生產(chǎn)d-生物素的重要中間體；式2為內(nèi)酯水解后得到的有機(jī)酸。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(la為右旋體內(nèi)酯，lb左旋體內(nèi)酯，2為內(nèi)酯水解后的有才幾酸)中間體內(nèi)酯的合成目前采用化學(xué)法，但此法工藝復(fù)雜，拆分不完全，造成原料浪費(fèi)，本4交高。經(jīng)拆分后得到右旋體和左旋體的混旋物，該混旋物作為廢棄物處理，造成了原料的極大浪費(fèi)和環(huán)境污染。對(duì)該混旋物進(jìn)行生物酶法拆分，得到光學(xué)純的右旋體，不僅可以大大降低A生物素的生產(chǎn)降低成本，而且環(huán)境友好，具有顯著效果，符合綠色、環(huán)保的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略，具有良好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益，發(fā)展前景廣闊。以前一直采用化學(xué)法拆分，如陳芬兒等采用化學(xué)晶析法拆分得到e.e值為40%左右的混旋體內(nèi)酯，其工藝復(fù)雜，且拆分不完全，造成原料浪費(fèi)，成本較高。但到目前為止，生物素的合成方法有很多，但大部分方法都由于成本過(guò)高，不適宜工業(yè)化。所以若在前幾步就得到光學(xué)活性的中間體，并能在反應(yīng)過(guò)程中保持其構(gòu)型，從而直接得到d(+)-生物素，也就是d-生物素，可大大降低成本。1970年，Roche公司的Gerecke等報(bào)道了原Goldberg-Stembach路線的一個(gè)重要進(jìn)展光學(xué)活性的內(nèi)酯2與硫代乙酸鉀，在DMF中，于150。C下反應(yīng)，能保持構(gòu)型，并以較高收率得到光學(xué)活性的硫代內(nèi)酯3。利用3,可以不經(jīng)拆分直接合成A生物素。于是，光學(xué)活性的內(nèi)酯2的合成就顯得極為重要。右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法有以下幾種已報(bào)道的內(nèi)酯1的合成方法主要有(l)化學(xué)拆分；(2)不對(duì)稱合成(3)生物合成。1、化學(xué)方法拆分，如用光活性醇薄荷醇，或手性胺麻黃堿拆分前體物質(zhì)，再轉(zhuǎn)化得到右旋生物素中間體內(nèi)酯，化學(xué)拆分法的缺點(diǎn)是拆分劑價(jià)格昂貴，分離不完全，還有環(huán)境污染和毒性問(wèn)題；2、物理方法拆分，如用誘導(dǎo)結(jié)晶拆分前體單曱酯，再還原得到右旋生物素中間體內(nèi)酯，條件控制要求高，光學(xué)純度差，收率低。3、生物法拆分，如用豬肝酯酶不對(duì)稱水解前手性二酯得到光學(xué)活性的單酯，再還原得到右旋生物素中間體內(nèi)酯。此方法的缺點(diǎn)是工藝較復(fù)雜，得率低，光學(xué)純度不高。具體生物拆分法(見(jiàn)下式)是利用豬肝酯酶(PLE)不對(duì)稱水解前手性二酯4[和6來(lái)合成內(nèi)酯2的方法。PLE能優(yōu)先水解4的(5)-氨基酸酯部分從而得到手性單酯5，進(jìn)一步用LiBH4還原，就可得到2。在上述報(bào)道中，水解收率為85%，還原收率為64%,產(chǎn)品e.e.值為75%。利用6來(lái)合成內(nèi)酯2的方法是PLE催化二乙酯6得到醇7(收率70%;e.e.值92%),表明前(/)-構(gòu)型的乙氧基已優(yōu)先斷裂了。7經(jīng)Jones氧化，堿水解及內(nèi)酯化作用得到2。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>生物法發(fā)酵生產(chǎn)生物素已取得了一定進(jìn)展，與化工合成生產(chǎn)生物素相比，其優(yōu)勢(shì)日益突出，但以生物技術(shù)方法獲得基因工程菌，價(jià)格仍然昂貴，現(xiàn)在還處于小試研究階段，要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，產(chǎn)量仍然有待于提高，很多技術(shù)問(wèn)題還有待于解決。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決上述方法的不足，通過(guò)篩選微生物酶，提供了一種以外消旋生物素中間體內(nèi)酯水解后得到的外消旋有機(jī)酸為反應(yīng)底物，在內(nèi)酯合成酶作用下選擇性進(jìn)行合成右旋生物素中間體內(nèi)酯的方法為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法，所述方法是以消旋生物素中間體內(nèi)酉旨1(tetrahydro-l，3-bis(phenylmethyl)-lH-Furo[3，4-d]imidazole-2,4-dione)水解得到的外消旋有機(jī)酸2(l,3-dibenzyl-5-(hydroxymethyl)-2-oxo-4-Imidazolidinecarboxylicacid)為反應(yīng)底物，在內(nèi)酯合成酶作用下選一奪性進(jìn)行合成右旋生物素中間體內(nèi)酯，所述內(nèi)酯合成酶來(lái)自下列之一①豬肝酯酶、②胰酶、③米曲霉脂肪酶、④黑曲霉脂肪酶、⑤黃曲霉脂肪酶、青霉脂肪酶、⑦華根霉脂肪酶、⑧酵母脂肪酶；o(,本發(fā)明流程見(jiàn)下式和圖1。其中rac-l為化學(xué)法拆分后的消旋體，在堿性條件下自發(fā)水解得到有機(jī)酸rac-2，經(jīng)酯酶拆分后得到光學(xué)純的右旋體內(nèi)酯d-l和左旋的酸/-2。所述內(nèi)酯合成酶優(yōu)選來(lái)自來(lái)自米曲霉WZ007(As7^/^7/w『Z067)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCCNo:M206105，保藏日期2006年10月8日。所述米曲霉WZ007由篩選得到，通過(guò)發(fā)酵得到菌體，干燥處理得到酶制劑用于酶法拆分生物素中間體內(nèi)酯，一次酯化率為10-50%，光學(xué)純度e,e.值達(dá)到95%以上，精制得到了較高純度的右旋體內(nèi)酯。菌種和誘變從土壤中經(jīng)初篩、復(fù)篩及分離純化，獲得一抹產(chǎn)右旋內(nèi)酯la合成酶的曲霉屬爿^erg/〃woryzaeWZ07,該菌4朱產(chǎn)酶量高，產(chǎn)酶穩(wěn)定，立體選擇性好，在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上搖瓶發(fā)酵的菌絲體作酶源，選擇性酯化有機(jī)酸2得到右旋內(nèi)酯la,經(jīng)提取得到的右旋內(nèi)酯la光學(xué)純度高。以它為出發(fā)菌種，按常規(guī)方法進(jìn)行紫外線、y射線誘變處理。紫外線照射為15W,距離27cm,時(shí)間2-3分鐘;c06o-y-射線處理?xiàng)l件為:在0.5、1.0、2.0KGY照射，致死率才達(dá)到99.2%,正突變率為15%,經(jīng)處理的孢子懸浮液接種到含混旋生物素中間體內(nèi)酯和消旋的對(duì)應(yīng)的酸的基本培養(yǎng)基及完全培養(yǎng)基上，20-40。C培養(yǎng)3-7天，檢出在含混旋生物素中間體內(nèi)酯和消旋的對(duì)應(yīng)的酸的基本培養(yǎng)基上不長(zhǎng)，在完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落。再在生物素中間體內(nèi)酯平板中培養(yǎng)，取透明圏大的進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)其酶酶活力。選育出一突變抹A^e^f〃^o"加eWZ007酶活有明顯提高。誘變分別提高了44.2%和69.8%的酶活,使出發(fā)菌抹的酶活提高了247.4%,其酶活達(dá)到10.1U/g菌體。菌種初步鑒定結(jié)果菌抹『ZW7群體形態(tài)，肉眼觀察在斜面生長(zhǎng)速度較快，在30。C條件下，一般需3-5天，菌落初期呈白色絨毛狀，呈擴(kuò)散狀，表面較干燥，后生出綠色的孢子。菌落在查氏瓊脂上25。C7天直徑45-65mm,10-14天擴(kuò)及全皿；質(zhì)地絲絨狀至厚絮狀，有的生長(zhǎng)較稀疏，具輻射狀溝紋；繼續(xù)培養(yǎng)，呈淺黃褐色，近于淺褐橄欖色。分生孢子結(jié)構(gòu)多或少，顏色初為淺黃綠色至黃綠色.,近于橄欖淺黃色，橄欖黃色或黃桔青色，后呈淡茶褐色，近于淡褐橄欖色或古銅色至淺黃橄欖色；滲出液無(wú)或有，呈稀疏小滴，無(wú)色；菌落反面無(wú)色或呈淡粉紅色至淺褐色。分生孢子頭球形，后呈輻射形，散亂，直徑80250um或更長(zhǎng)，也有少數(shù)呈短柱形者；分生孢子梗生自基質(zhì)或氣生菌絲，孢梗莖5003000um或更長(zhǎng)，直徑820um生于氣生菌絲者較短，壁通常粗糙，也有近于光滑者；頂嚢近球形或燒瓶形，2045um全面或四分之三的表面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層或雙層，甚至同一頂嚢上兩種情況兼有?；?14umx3.55um,偶有多育現(xiàn)象，瓶梗815umx35um分生孢子球形至近球形58.6um，或橢圓形至洋梨形4.89.6umx44.8um，壁近于光滑或粗糙。菌落在查氏麥芽汁瓊脂上25°C7天直徑60—65mm,10—12天質(zhì)地絲絨狀生長(zhǎng)較稀疏，黃綠色，近于黃橄欖色后變褐橄欖色；菌落反面無(wú)色，37。C生長(zhǎng)良好。菌林WZ007初步鑒定為曲霉屬，米曲霉原變種Aperg/〃w0/7zae。所述方法如下將內(nèi)酯合成酶的酶制劑加入反應(yīng)底物外消旋有機(jī)酸2溶于有機(jī)溶劑得到的溶液中，底物終濃度為130%，酶制劑加入量為0.125U/g底物，305(TC下反應(yīng)360小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到所述的右旋生物素中間體內(nèi)酯，U為1個(gè)酶活力單位，所述的1個(gè)酶活力單位是在規(guī)定的條件下測(cè)定的每分鐘催化合成d-內(nèi)酯Ia的1|imol量的內(nèi)酯合成酶的量，所述的規(guī)定條件為取0.1g凍干菌絲體，向菌體中加入混旋體有機(jī)酸2濃度1%的甲苯溶液10ml,40。C條件下，水浴攪拌轉(zhuǎn)速200rpm,反應(yīng)60min后，過(guò)濾除去菌體，取反應(yīng)液曱苯相用高壓液相色譜分析(HPLC)測(cè)定轉(zhuǎn)化得到的d-內(nèi)酯Ia。凡是能溶解反應(yīng)底物外消旋有機(jī)酸2或產(chǎn)物1的有機(jī)溶劑都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā)明推薦的有機(jī)溶劑為下列之一曱苯、苯、二氯曱烷、四氯曱烷、乙醚、丙酮、乙腈或氯仿。更優(yōu)選曱笨、苯、二氯曱烷、氯仿。本發(fā)明中物質(zhì)百分比濃度均為質(zhì)量體積百分比濃度，某物質(zhì)濃度1%表示每100mL溶液中含有該物質(zhì)lg。所述酶制劑為市售酶制劑或經(jīng)微生物常規(guī)發(fā)酵所得濕菌體干燥得到的酶制劑。所述的內(nèi)酯合成酶的酶制劑按如下方法得到在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上接種斜面種子，3037°C、轉(zhuǎn)速150200r/min培養(yǎng)23天，過(guò)濾得到菌絲體，離心取沉淀冷凍干燥后即酶制劑，所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為葡萄糖2~6%，蛋白胨25%,蔗糖1~6%,尿素0.30.9%，NaCl0.4~0.8%,k2HP040.20.5%,MgSO40.10.3%,,(NH4)2S()40.40.8%，pH自然。本發(fā)明培養(yǎng)基中各物質(zhì)濃度均以終濃度計(jì)，下同。具體的，所述的內(nèi)酯合成酶來(lái)自米曲霉CCTCCNo.M206105,所述的制備方法如下(1)斜面培養(yǎng)取米曲霉CCTCCNo.M206105菌落轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基，30。C培養(yǎng)3天，作為斜面活化種子，所述的斜面培養(yǎng)基組成為NaN030.10.3%，K2HP040.卜0.2%，KC10.30.7%，F(xiàn)eS()40.0010.002%，MgS040.040.06%，蔗糖25%,瓊月旨1.52.0%.PH自然，12rC滅菌20分鐘;(2)產(chǎn)酶培養(yǎng)接種斜面種子，30。C培養(yǎng)48小時(shí)，過(guò)濾得到菌絲體，進(jìn)行干燥得到酶制劑；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為葡萄糖26%,蛋白胨25%,蔗糖16%,尿素0.30.9%,NaC10.40.8%,k2HP040.20.5%,MgSO40.10.3%,,(NH4)2SO40.40.8%,pH自然，121C滅菌20分鐘；(3)取步驟(2)所述的酶制劑加入外消旋有機(jī)酸2含量130%的曱苯溶液中，酶制劑添加量為0.125U/g底物，3050。C下反應(yīng)36()小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液過(guò)濾，濾液減壓蒸餾得到所述右旋生物素中間體內(nèi)酯。優(yōu)選的，所述的內(nèi)酯合成酶來(lái)自米曲霉CCTCCNo.M206105，所述的制備方法如下(1)斜面培養(yǎng)米曲霉CCTCCNo.M206105轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基，3(TC培養(yǎng)3天，作為斜面活化種子，所述的斜面培養(yǎng)基組成為:NaN030.2%,K2HP040.1%,KC10.5%,FeS040.001%,MgS040.05%，蔗糖3%,瓊脂1.5%pH自然，12rC滅菌20分鐘；(2)產(chǎn)酶培養(yǎng)接種斜面種子，3(TC培養(yǎng)48小時(shí)，過(guò)濾得到菌絲體，進(jìn)行干燥得到酶制劑；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為葡萄糖2%,蛋白胨2%,蔗糖l。/。g，尿素0.3%,NaC10.5%，k2HP040.2%,MgS040.1%,,(NH4)2SO40.5%，pH自然;121°C滅菌20分鐘;(3)取步驟(1)所述的酶制劑加入外消旋有機(jī)酸2濃度為2%的曱苯溶液中，酶制劑添加量為0.125U/g底物，40。C條件下，反應(yīng)12h,反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液過(guò)濾，濾液在0.1MPa壓力下減壓蒸餾得到所述右旋生物素中間體內(nèi)酯。內(nèi)酯la/b及其對(duì)應(yīng)的有機(jī)酸2的HPLC測(cè)定條件柱型為shim-pack-CLC-ODS柱；流動(dòng)相為乙腈水-3:2(v/v);流速為1mL/min;4企測(cè)波長(zhǎng)225nm。右旋內(nèi)酯la合成酶酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)搖瓶培養(yǎng)的菌絲體干燥后作為酶源.以外消旋有機(jī)酸2為底物，置于曱苯或丙酮等不同的有機(jī)溶劑中，底物濃度為1~30%,優(yōu)選25%,加酶量為0.125U/g底物，酶反應(yīng)溫度為3050°C,酶轉(zhuǎn)化時(shí)間為3-60小時(shí)，優(yōu)選624小時(shí)。酯化率為1050%,值達(dá)到95%以上。右旋內(nèi)酯la的提取及精制酶轉(zhuǎn)化后過(guò)濾除去菌體，產(chǎn)物內(nèi)酯溶于曱苯，底物酸不溶于曱苯，通過(guò)過(guò)濾分離可以將二者分離，通過(guò)蒸餾除去有機(jī)溶劑得到產(chǎn)物右旋內(nèi)酯la，經(jīng)過(guò)重結(jié)晶即可得到較純的d-內(nèi)酯la產(chǎn)口口o本發(fā)明克服了誘導(dǎo)結(jié)晶法制備右旋內(nèi)酯la收率低，成本高，克服了化學(xué)方法拆分劑或手性誘導(dǎo)物價(jià)格昂貴，成本高，分離困難，有污染和毒性等不足，對(duì)其他生物法拆分的缺點(diǎn)，如收率低，產(chǎn)物光學(xué)純度低等有所改善。本發(fā)明所述右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法的有益效果主要體現(xiàn)在拆分專一性強(qiáng)，拆分率高，大大降低了生產(chǎn)成本，操作簡(jiǎn)單，環(huán)境污染小，適合工業(yè)化生產(chǎn)。(四)圖1為本發(fā)明反應(yīng)過(guò)程流程圖。米曲霉WZ007(^^erg/〃wwyzaefFZ007)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCCNo.M206105，保藏日期2006年10月8日。(五)具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不〗又限于此實(shí)施例1:斜面培養(yǎng)基NaNO30.2%,K2HP040.1%,KC10.5%,FeS040.001%,MgS040.05%，蔗糖3%,瓊脂1.5%,pH自然，121°C滅菌20分鐘，滅菌后4妄種米曲霉CCTCCNo.M206105(血pe^,'〃z"'o/jzaeWZ007)，30。C培養(yǎng)3天，作為斜面活化種子。液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖20g，蛋白胨20g，蔗糖IOg,尿素3g,NaC15g,k2HP042g，MgS04lg,，(NH4)2S045g,定容至1L，pH自然，裝液量為500ml三角瓶裝液80ml，121。C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種斜面種子，30。C培養(yǎng)48小時(shí)，過(guò)濾得到菌絲體，進(jìn)行干燥得4克作為酶粉L酶活測(cè)定方法取0.1g干菌絲體，向菌體中加入l。/?；煨w有機(jī)酸2濃度的甲苯溶液10ml，40。C條件下，水浴攪拌轉(zhuǎn)速200rpm,反應(yīng)60min后，過(guò)濾除去菌體，取反應(yīng)液甲苯相用高壓液相色鐠分析(HPLC)測(cè)定轉(zhuǎn)化得到的d-內(nèi)酯Ia，上述條件下，每分鐘催化合成d-內(nèi)酯Ia的lpmol量的內(nèi)酯合成酶的量，記為l個(gè)酶活力單位(1U)。測(cè)得酶粉1的酶活為10.1U/g。實(shí)施例2:O.lgA/e7"g/〃iozjzaeWZ007酶粉1加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的20mL曱苯中，40。C條件下，反應(yīng)12h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率32.6%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在O.lMPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，對(duì)映體過(guò)量值為大約96.2%。實(shí)施例3:O.lgJ^erg/〃^o/jzaeWZ007酶粉1加入含有2。/。外消旋有機(jī)酸2的20mL曱苯中，4(TC條件下，反應(yīng)12h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)液，過(guò)濾除去菌體，加入新的反應(yīng)底物繼續(xù)反應(yīng)，如此反復(fù)，重復(fù)利用5次，得到酶水解結(jié)果見(jiàn)表l。經(jīng)內(nèi)酯化后產(chǎn)品d-生物素中間體內(nèi)酯，經(jīng)0.1Mp減壓濃縮至5mL，常溫下結(jié)晶，得到右旋生物素中間體內(nèi)酯，對(duì)映體過(guò)量值達(dá)96%以上，收率93%,純度達(dá)98%以上。酶粉1使用5次后，酵轉(zhuǎn)化率仍然沒(méi)有明顯下降。表l:反復(fù)分批酶轉(zhuǎn)化結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例4:4姿實(shí)施例2方法，變，對(duì)外消旋有機(jī)酸2進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化。該反應(yīng)的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值見(jiàn)表2。表2結(jié)果表明，在反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值方面上，曱苯作為反應(yīng)溶劑都要優(yōu)于其他溶劑。表2:反復(fù)分批酶轉(zhuǎn)化結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例5:O.lgAperg/〃w。，:aeWZ007酶粉1加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的20mL曱苯中，40。C條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率48.9%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在().lMPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，得出對(duì)映體過(guò)量值為大約94.8%。實(shí)施例6:O.lgApwg/〃wso，weWZ007酶粉1加入含有2。/o外消旋有機(jī)酸2的20mL曱苯中，30。C條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率40.3°/。。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在O.lMPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，得出對(duì)映體過(guò)量值為大約95.4%。實(shí)施例7:0.2g血perg/〃wo/jzaeWZ007酶粉1加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的20mL曱苯中，3(TC條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率48.6%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在O.lMPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，得出對(duì)映體過(guò)量值為大約95.8%。實(shí)施例8:0.2gAperg/〃woo^eWZ007酶粉1加入含有5%外消旋有機(jī)酸2的20mL曱苯中，3(TC條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率37.2%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有才/U容劑經(jīng)過(guò)在0.1MPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，得出對(duì)映體過(guò)量值為大約93.8%。實(shí)施例9:0.2gAperg/〃wswj加eWZ007酶粉1加入含有5%外消旋有機(jī)酸2的20mL曱苯中，40。C條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率40.6%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在O.lMPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，得出對(duì)映體過(guò)量值為大約92.9%。實(shí)施例10:5g按實(shí)施例1方法制得的J^e^/〃Mo,yz"eWZ007酶粉1-1(酶活10.5U/g,測(cè)定方法同實(shí)施例2)加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的1L曱笨中，4(TC條件下，反應(yīng)12h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率36.6%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在0.1MPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，對(duì)映體過(guò)量值為大約93.8%。實(shí)施例11:5g按實(shí)施例1方法制得的A/erg/〃M。0^aeWZ007酶粉1-2(酶活9.8U/g,測(cè)定方法同實(shí)施例2)加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的1L甲苯中，4(TC條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率40.2°/。。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在O.lMPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，得出對(duì)映體過(guò)量值為大約94.8%。實(shí)施例12:20g4姿實(shí)施例1方法制4尋的/^/erg/〃woryzaeWZ007酶4分1-3(酶活10.7U/g,測(cè)定方法同實(shí)施例2)加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的1L甲笨中，30'C條件下，反應(yīng)12h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率39.4%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在0.1MPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，得出對(duì)映體過(guò)量值為大約95.7%。實(shí)施例13:40g按實(shí)施例1方法制得的^perg/〃ws0,yzaeWZ007酶粉1-4(酶活11.2U/g,測(cè)定方法同實(shí)施例2)加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的1L曱笨中，30。C條件下，反應(yīng)12h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率44.3%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在0.1MPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，得出對(duì)映體過(guò)量值為大約98.1%。實(shí)施例14:40g按實(shí)施例1方法制得的A/^^〃M。o;z"eWZ007酶粉1-5(酶活10.3U/g,測(cè)定方法同實(shí)施例2)加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的1L曱苯中，4(TC條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率46.3%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在0.1MPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，得出對(duì)映體過(guò)量值為大約97.1%。實(shí)施例15:40g按實(shí)施例1方法制得的爿w^g/〃M07zaeWZ007酶粉1-6(酶活10.1U/g,測(cè)定方法同實(shí)施例2)加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的1L二氯曱烷中，4(TC條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率50.3%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有澤幾溶劑經(jīng)過(guò)在O.lMPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，得出對(duì)映體過(guò)量值為大約91.2%。實(shí)施例16:40g按實(shí)施例1方法制得的A;^^7/mo;^zaeWZ007酶粉〗-7(酶活10.4U/g,測(cè)定方法同實(shí)施例2)加入含有5%外消旋有機(jī)酸2的1L曱笨中，3(TC條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率41.2%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在O.lMPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，得出對(duì)映體過(guò)量值為大約95.5%。實(shí)施例17:40g按實(shí)施例1方法制得的y^/e巧7'〃worj,zoeWZ007酶粉1-8(酶活10.5U/g,測(cè)定方法同實(shí)施例2)加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的1L曱苯中，4(TC條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率46.3%。轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)液，過(guò)濾除去菌體，經(jīng)0.1Mp減壓濃縮至50mL,常溫下結(jié)晶，得到右旋生物素中間體內(nèi)酯，對(duì)映體過(guò)量值達(dá)95%以上，收率92.8%,純度達(dá)96%以上。實(shí)施例18:60g按實(shí)施例1方法制得的/^/erg/〃wsoo^^WZ007酶粉1-9(酶活10.0U/g，測(cè)定方法同實(shí)施例2)加入含有5%外消旋有機(jī)酸2的1L曱苯中，3(TC條件下，反應(yīng)]2h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率40.8%。轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)液，過(guò)濾除去菌體，經(jīng)0.1Mp減壓濃縮至50mL，常溫下結(jié)晶，得到右旋生物素中間體內(nèi)酯，對(duì)映體過(guò)量值達(dá)96%以上，收率93%,純度達(dá)99%以上。實(shí)施例19:按照實(shí)施例2所述方法進(jìn)行對(duì)下述所用皺褶假絲酵母脂肪酶(SIGMA公司，脂肪酶水解活力700,000-150,000U/g)進(jìn)行酶活測(cè)定，測(cè)得鈹褶假絲酵母脂肪酶的酶活為1.2U/g。O.lg皺褶假絲酵母脂肪酶(SIGMA公司，脂肪酶水解活力700,000-150,000U/g)加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的20mL曱苯中，40"C條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率13.2%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在0.1MPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，對(duì)映體過(guò)量值為大約86%。實(shí)施例20:按照實(shí)施例2所述方法對(duì)下述所用胰酶(杭州三葉生物化工廠，脂肪酶水解活力3,000U/g)進(jìn)行酶活測(cè)定，測(cè)得胰酶的酶活為0.8U/g。O.lg胰酶(杭州三葉生物化工廠，脂肪酶水解活力3,000U/g)加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的20mL曱笨中，4(TC條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率11.4%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在0.1MPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，對(duì)映體過(guò)量值為大約63%。實(shí)施例21:按照實(shí)施例2所述方法對(duì)下述所用青霉脂肪酶(深圳市綠樣吏康生物工程有限公司，脂肪酶水解活力5,000~50,000U/g)進(jìn)行酶活測(cè)定，測(cè)得青霉脂肪酶的酶活為6U/g。O.lg青霉脂肪酶(深圳市綠微康生物工程有限公司，脂肪酶水解活力5,000~50,000U/g)加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的20mL甲笨中，40。C條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率20.1%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在O.lMPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，對(duì)映體過(guò)量值為大約84%。實(shí)施例22:按照實(shí)施例2所述方法對(duì)下述所用黑曲霉脂肪酶(深圳市綠微康生物工程有限/〉司，脂肪酶水解活力5,000~50,000U/g)進(jìn)行酶活測(cè)定，測(cè)得黑曲霉脂肪酶的酶活為7U/g。O.lg黑曲霉脂肪酶(深圳市綠微康生物工程有限公司，脂肪酶水解活力5,000~50,000U/g)加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的20mL曱苯中，4(TC條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率18.2%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在0.1MPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，對(duì)映體過(guò)量值為大約80%。實(shí)施例23:按照實(shí)施例2所述方法對(duì)下述所用米曲霉脂肪酶進(jìn)行酶活測(cè)定，測(cè)得米曲霉脂肪酶(上海寶豐生化有限公司，脂肪酶水解活力>20,000U/g)的酶活為5.5U/g。O.lg米曲霉脂肪酶加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的20mL曱苯中，40。C條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率19.6%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在0.1MPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光^f義測(cè)定，對(duì)映體過(guò)量值為大約78%。實(shí)施例24:由解脂假絲酵母B017(陜西省微生物研究所，編號(hào)B017)液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖40g，酵母膏3g，(NH4)2HP0413g，KH2P047g，MgS04.7H2()0.8g,NaClO.lg,定容至1L，pH自然。裝液量為500ml三角瓶裝液80ml.'12rC滅菌20分鐘，滅菌后冷卻接種斜面種子，3(TC培養(yǎng)24小時(shí)，過(guò)濾得到菌絲體，進(jìn)行干燥作為酶粉2。按照實(shí)施例2所述方法對(duì)酶粉2進(jìn)行酶活測(cè)定，測(cè)得酶粉3的酶活為0.5U/g。取該菌粉20.1g加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的20mL曱苯中，40。C條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率9.6%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在0.1MPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，對(duì)映體過(guò)量值為大約82%。實(shí)施例23:按照實(shí)施例2所述方法對(duì)下述所用豬肝酯酶(上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，脂肪酶水解活力〉3000U/g)進(jìn)行酶活測(cè)定，測(cè)得豬肝酯酶的酶活為1.4U/g。O.lg豬肝酯酶(上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，脂肪酶水解活力>3000U/g)加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的20mL甲苯中，40。C條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率15.2%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在O.lMPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，對(duì)映體過(guò)量值為大約65%。實(shí)施例26:按照實(shí)施例2所述方法對(duì)下述所用米根霉脂肪酶(上海寶豐生化有限公司，脂肪酶水解活力>2,000,000U/g)進(jìn)行酶活測(cè)定，測(cè)得華4艮霉脂肪酶的酶活為4.8U/g。O.lg米根霉脂肪酶(上海寶豐生化有限公司，脂肪水解活力》2,000,000U/g)加入含有2%外消旋有機(jī)酸2的20mL曱笨中，40。C條件下，反應(yīng)24h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率35.2%。反應(yīng)結(jié)束過(guò)濾后有機(jī)溶劑經(jīng)過(guò)在O.lMPa壓力下減壓蒸餾得到產(chǎn)物內(nèi)酯。產(chǎn)物內(nèi)酯的光學(xué)純度通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)定，對(duì)映體過(guò)量值為大約87%。權(quán)利要求1.一種右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法，其特征在于所述方法是以消旋生物素中間體內(nèi)酯1(tetrahydro-1，3-bis(phenylmethyl)-1H-Furo[3，4-d]imidazole-2，4-dione)水解得到的外消旋有機(jī)酸2(1，3-dibenzyl-5-(hydroxymethyl)-2-oxo-4-Imidazolidinecarboxylicacid)為反應(yīng)底物，在內(nèi)酯合成酶作用下選擇性進(jìn)行合成右旋生物素中間體內(nèi)酯，所述內(nèi)酯合成酶來(lái)自下列之一①豬肝酯酶、②胰酶、③米曲霉脂肪酶、④黑曲霉脂肪酶、⑤黃曲霉脂肪酶、⑥青霉脂肪酶、⑦華根霉脂肪酶、⑧酵母脂肪酶；id="icf0001"file="A2006101548320002C1.gif"wi="106"he="41"top="111"left="53"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2.如權(quán)利要求1所述的右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法，其特征在于所述內(nèi)酯合成酶來(lái)自米曲霉WZ007(A;wg/〃z"o,，aeWZW7)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCCNo.M206105。3.如權(quán)利要求1或2所述的右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法，其特征在于所述方法如下將內(nèi)酯合成酶的酶制劑加入反應(yīng)底物外消旋有機(jī)酸2溶于有機(jī)溶劑得到的溶液中，底物終濃度為130%,酶制劑加入量為0.125U/g底物，3050。C下反應(yīng)360小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到所述的右旋生物素中間體內(nèi)酯，U為1個(gè)酶活力單位，所述的1個(gè)酶活力單位是在規(guī)定的條件下測(cè)定的每分鐘催化合成d-內(nèi)酯Ia的1jamol量的內(nèi)酯合成酶的量，所述的規(guī)定的條件為取0.1g干菌絲體，向菌體中加入混旋體有機(jī)酸2濃度為1%的甲苯溶液10ml,4(TC條件下，水浴攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，反應(yīng)60min后，過(guò)濾除去菌體，取反應(yīng)液曱笨相用高壓液相色傳分析測(cè)定轉(zhuǎn)化得到的d-內(nèi)酯Ia。4.如權(quán)利要求3所述的右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為下列之一曱苯、苯、乙醚、丙酮、乙腈或氯仿。5.如權(quán)利要求3所述的右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法，其特征在于所述酶制劑為市售酶制劑或經(jīng)微生物常規(guī)發(fā)酵所得濕菌體干燥得到的酶制劑。6.如權(quán)利要求5所述的右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法，其特征在于所述的內(nèi)酯合成酶的酶制劑按如下方法得到在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上接種斜面種子，3037°C、轉(zhuǎn)速150200r/min培養(yǎng)23天，過(guò)濾得到菌絲體，離心^^沉淀干燥后即酶制劑，所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為葡萄糖26%,蛋白胨25%,蔗糖b6%,尿素0.30.9%,NaCl0.40.8%,k2HPO40.20.5%,MgSO40.10.3%，，(NH4)2S040.40.8%,pH自然。7.如權(quán)利要求2所述的右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法，其特征在于所述的內(nèi)酯合成酶來(lái)自米曲霉CCTCCNo.M206105,所述的制備方法io下(1)斜面培養(yǎng)取米曲霉CCTCCNo.M206105菌落轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基，30。C培養(yǎng)3天，作為斜面活化種子，所述的斜面培養(yǎng)基組成為NaN030.卜0.3%,K2HP040.10.2%,KC10.30.7%，F(xiàn)eS040.0010.002%,MgS040.040.06%,蔗糖25%,瓊脂1.52.0%，pH自然,121。C滅菌20分鐘；(2)產(chǎn)酶培養(yǎng)接種斜面種子，30。C培養(yǎng)48小時(shí)，過(guò)濾得到菌絲體，進(jìn)行干燥得到酶制劑；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為葡萄糖26%,蛋白胨25%，蔗4唐16%,/艮素0.30.9%,NaCl0.40.8%，k2HP040.20.5%,MgS040.10.3%,,(NH4)2SO40.40.8%,pH自然，12rC滅菌20分鐘;(3)取步驟(2)所述的酶制劑加入外消旋有機(jī)酸2濃度為130%的曱笨溶液中,酶制劑添加量為(U25U/g底物，3050°C下反應(yīng)360小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液過(guò)濾，濾液減壓蒸餾得到所述右旋生物素中間體內(nèi)酯。8.如權(quán)利要求2所述的右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法，其特征在于所述的內(nèi)酯合成酶來(lái)自米曲霉CCTCCNo.M206105，所述的制備方法3。下(1)斜面培養(yǎng)米曲霉CCTCCNo.M206105轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基，30。C培養(yǎng)3天，作為斜面活化種子，所述的斜面培養(yǎng)基組成為NaNO30.2%，K2HP040.1%,KC10.5%,FeS040.001%，MgS040.05%,蔗糖3%，瓊脂1.5。/。pH自然，121。C滅菌20分鐘;(2)產(chǎn)酶培養(yǎng)接種斜面種子，3(TC培養(yǎng)48小時(shí)，過(guò)濾得到菌絲體，進(jìn)行干燥得到酶制劑；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為終濃度(g/ml):葡萄糖2%,蛋白胨2%，蔗糖l。/。g,尿素0.3%,NaC10.5%,k2HPO40.2%,MgS040.1%,,(NH4)2SO40.5%,pH自然；121。C滅菌20分鐘；(3)取步驟(2)所述的酶制劑加入外消旋有機(jī)酸2濃度為2%的甲苯溶液中，酶制劑添加量為0.125U/g底物，40。C條件下，反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液過(guò)濾，濾液在0.1.MPa壓力下減壓蒸餾得到所述右旋生物素中間體內(nèi)酯。全文摘要本發(fā)明提供了一種右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法，所述方法是以消旋生物素中間體內(nèi)酯1(tetrahydro-1，3-bis(phenylmethyl)-1H-Furo[3，4-d]imidazole-2，4-dione)水解得到的外消旋有機(jī)酸2(1，3-dibenzyl-5-(hydroxymethyl)-2-oxo-4-Imidazolidinecarboxylicacid)為反應(yīng)底物，在內(nèi)酯合成酶作用下選擇性進(jìn)行合成右旋生物素中間體內(nèi)酯，所述內(nèi)酯合成酶來(lái)自下列之一①豬肝酯酶、②胰酶、③米曲霉脂肪酶、④黑曲霉脂肪酶、⑤黃曲霉脂肪酶、⑥青霉脂肪酶、⑦華根霉脂肪酶、⑧酵母脂肪酶。本發(fā)明所述右旋生物素中間體內(nèi)酯的制備方法的有益效果主要體現(xiàn)在拆分專一性強(qiáng)，拆分率高，大大降低了生產(chǎn)成本，操作簡(jiǎn)單，環(huán)境污染小，適合工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號(hào)C12P17/18GK101186938SQ20061015483公開(kāi)日2008年5月28日申請(qǐng)日期2006年11月17日優(yōu)先權(quán)日2006年11月17日發(fā)明者勍朱,釗汪,沈寅初,沈雪亮,章銀軍,鄭建永,鄢洪德申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)