專利名稱：一種檢測牛cvm有害基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛脊椎畸形綜合癥(CVM)有害基因的分子檢測方法。
背景技術(shù)：
2001年丹麥Agerholm等[1]發(fā)現(xiàn)了荷斯坦牛群中存在一個隱性遺傳缺陷基因，純合時可以造成妊娠早期流產(chǎn)、死胎或犢牛出生后很快死亡，患畜最顯著的特征為脊椎彎曲畸形、兩前腿筋腱縮短、頸短、心臟畸形等綜合癥狀，故稱為“脊椎畸形綜合癥”(ComplexVertebral Malformation簡稱CVM)，是由常染色體上SLC35A3基因的單堿基突變(G→T)引起的，呈隱性遺傳[1，2]。
CVM遺傳缺陷的發(fā)現(xiàn)立刻引起了各國奶牛育種協(xié)會和育種工作者的重視，在美國[3]、英國[4]和日本[5]等國家相繼報道了在荷斯坦牛群中存在CVM有害基因。隨后美國、加拿大和歐洲一些國家大量的基因檢測和系譜分析發(fā)現(xiàn)，該隱性遺傳突變基因可以追溯到一頭美國非常著名的公?！癈arlin-M Ivanhoe Bell”家系，這頭公牛可能是該遺傳缺陷基因的共同祖先，該公牛在全世界廣泛使用。美國2004年TPI前100名的優(yōu)秀種公牛中，CVM攜帶者約占17％，一頭優(yōu)秀種公牛一生可以生產(chǎn)幾十萬劑甚至上百萬劑冷凍精液，由于冷凍精液和人工授精技術(shù)的普及和廣泛應(yīng)用，優(yōu)秀種公牛遺傳影響是顯而易見的?？梢姡伤固古Ｈ褐邪l(fā)現(xiàn)的CVM遺傳缺陷帶來的是世界性的問題，這導(dǎo)致近年來奶牛育種工作者在重視優(yōu)秀種公牛生產(chǎn)性能表現(xiàn)的同時，更加重視優(yōu)秀種公牛是否攜帶隱性有害基因。
通過基因檢測和分子選育技術(shù)，可以在分子水平上解決奶牛的遺傳改良問題，一方面通過基因檢測技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)種公?；蚍N子母牛攜帶隱性有害基因的情況，并加以選擇剔除，避免通過人工授精技術(shù)傳播遺傳缺陷基因的風(fēng)險；另一方面通過遺傳標記基因或候選基因可以對數(shù)量性狀基因(QTL)進行定位分析，實現(xiàn)對后備種公牛的早期選擇，可以縮短奶牛世代間隔，加快遺傳改良速度。歐美等奶業(yè)發(fā)達國家已經(jīng)在小公牛的選育和淘汰中使用分子選育技術(shù)。據(jù)有關(guān)專家預(yù)測，隨著奶牛和其他主要家畜品種質(zhì)量和數(shù)量性狀基因圖譜完成及分子選育技術(shù)的滲入，整個育種體系將發(fā)生革命性改變。
近幾年，在美國、加拿大、日本等國家都相應(yīng)建立了種公牛遺傳缺陷基因的分子檢測方法和育種方案，并在種公牛系譜上進行明確標注隱性有害基因的攜帶情況，合理的指導(dǎo)種公牛的選種選配，有效的降低了隱性有害基因CVM的不良影響。目前，國外CVM有害基因的分子檢測方法主要有AS-PCR(allele-specific polymerase chainreaction)方法和PCR-PIRA(polymerase chain reaction-primer introducedrestriction analysis)方法[6]，AS-PCR方法對DNA聚合酶具有很高要求而且必須嚴格控制反應(yīng)條件才能達到一定的準確性；而PCR-PIRA法雖然比AS-PCR法有所改進，但PCR-PIRA法要求建立陽性對照才能保證準確性，而且不適合規(guī)?；瘷z測，成本較高。所以，建立一種準確、快速、經(jīng)濟的檢測CVM有害基因的分子方法是非常必要的。
在我國種公牛選育中，尚未開展CVM隱性有害基因的檢測和分子選育技術(shù)，對種公牛和奶牛群體中CVM有害基因的攜帶情況尚不清楚。積極利用分子遺傳學(xué)和分子生物技術(shù)手段建立起種公牛隱性有害基因的檢測方法和分子選育技術(shù)，縮小與奶業(yè)發(fā)達國家的差距，對自行培育我國優(yōu)秀后備種公牛，完善種公牛繁育體系是十分重要的。本發(fā)明將介紹一種全新的檢測CVM有害基因的快捷、準確的方法-SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism，單鏈構(gòu)象多態(tài)性)方法。
SSCP方法基本原理PCR擴增靶DNA，然后將特異的PCR擴增產(chǎn)物變性，而后快速復(fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子，單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻力大小不同。因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開。
PCR-SSCP技術(shù)[7，8]是檢測DNA突變最為直觀而精確的實驗技術(shù)手段之一，該方法對長度在100-300bp之間的DNA片段突變檢測的靈敏度可達100％，結(jié)合序列分析，可做到對大批量樣品的目的DNA片段的“全掃描”分析，不僅成本低，而且自動化程度較高，因此，在進行基因診斷和多態(tài)分析，包括單核苷酸多態(tài)(SNP)的檢測中，PCR-SSCP技術(shù)不失為一種準確、快速、簡便、經(jīng)濟的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種牛脊椎畸形綜合癥(CVM)有害基因的分子檢測方法。
本發(fā)明依據(jù)GenBank上牛SLC35A3基因序列(NOAY160683)設(shè)計檢測CVM有害基因的特異性PCR引物，PCR產(chǎn)物的長度均在150-300bp左右，適合采用SSCP檢測，通過對PCR引物的篩選和優(yōu)化，找到了適合SSCP檢測的特異性引物，從而創(chuàng)建了一套檢測CVM有害基因的快速、準確的方法，準確率可達99％以上。
本發(fā)明設(shè)計、篩選得到的引物如序列表SEQ ID NO1和2所示，通過該引物，對牛的總DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物序列如序列表SEQ ID NO.3所示，對擴增產(chǎn)物進行SSCP分析。牛脊椎畸形綜合癥(CVM)攜帶者與正常牛相比，由于G→T的突變，使得擴增產(chǎn)物中存在4條單鏈，而正常牛只有2條單鏈(見圖3)。將篩選出不同的基因型進行測序，確定自序列表中SEQ ID NO.3的5’端第73位堿基是G還是N，進一步驗證SSCP的可靠性。實驗結(jié)果表明準確率可達99％以上。
在本發(fā)明中，所述的SEQ ID NO.3中的第73位堿基為N是指測序的結(jié)果，表明的是未檢出的堿基，實際上在樣品中該位點存在兩種情況即G和T，測序結(jié)果顯示為N。本發(fā)明亦以N來表示在該位點的堿基。
本發(fā)明還進一步優(yōu)化了PCR擴增條件，優(yōu)化的擴增條件是94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，進行35個循環(huán)；72℃延伸7min。
需要說明的是，本發(fā)明不是一種疾病的檢測方法。對于牛脊椎畸形綜合癥，也即是SEQ ID NO.3的第73位堿基為T的純合時，會造成妊娠早期流產(chǎn)、死胎或犢牛出生后很快死亡，患畜最顯著的特征為脊椎彎曲畸形、兩前腿筋腱縮短、頸短、心臟畸形等綜合癥狀，這些是顯著癥狀，不需要特別的檢測。而本發(fā)明的對象是表征正常的牛，通過檢測牛CVM有害基因，從而排除CVM的攜帶者，排除牛育種中的隱患。
本發(fā)明建立了一種通過PCR-SSCP分析檢測牛CVM有害基因攜帶者的方法。本發(fā)明的方法簡單、快速、準確，并且通過本發(fā)明的方法可以進一步開發(fā)檢測試劑盒。本發(fā)明為奶牛CVM有害基因的分型和篩選提供了新的方法和思路，為我國奶牛的分子選育提供了可靠的理論依據(jù)。


圖1是PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖，泳道1的退火溫度為65℃，泳道12溫度為45℃，泳道1～12溫度遞減，M為100bp ladder Mark；圖2是PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖，泳道1～6為PCR產(chǎn)物，M為100bp分子量標準，退火溫度為57℃；圖3是PCR-SSCP分析檢測圖，其中AA型為正常牛，AB型為CVM隱性攜帶者；圖4是PCR產(chǎn)物的測序峰圖，箭頭所示之處是SEQ ID NO.3的第73位堿基，上面為AA型，下面為BB型。
具體實施例方式
本發(fā)明將在下面的實施例中進一步描述，其中，分子生物學(xué)的常規(guī)操作采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法和技術(shù)進行。實施例中的牛DNA樣品來自北京市種公牛站的荷斯坦種公牛，基因組DNA可以從牛的血液(例如，新鮮或冷凍的)、精液(例如，新鮮或冷凍的)、組織樣品(如耳組織等)或含有毛囊的牛毛樣品中提取、分離和純化。
實施例1 引物的設(shè)計以及擴增條件的優(yōu)化依據(jù)GenBank上牛SLC35A3基因序列(NOAY160683)，用Oligo6.0設(shè)計檢測CVM有害基因的特異性PCR引物，PCR產(chǎn)物的長度均在150-300bp左右，適合采用SSCP檢測，通過對PCR引物的設(shè)計、篩選和優(yōu)化，最終確定以下引物序列CVMF(上游)5-TGGCCCTCAGATTCTCAAGAG-3’CVMR(下游)5-CCAAGTTGAATGTTTCTTATC-3’PCR引物優(yōu)化條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55±10℃退火30s，72℃延伸30s，進行35個循環(huán)；72℃延伸7min。PCR條件優(yōu)化的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果如附圖1所示，根據(jù)PCR條件優(yōu)化的檢測結(jié)果，確定該引物的退火溫度為57℃。
反應(yīng)體系為引物為25pmol，模板DNA 50ng，Taq酶0.5U，dNTP濃度為100umol/L，總反應(yīng)體系為25ul，PCR產(chǎn)物長度為173bp。
用上述引物和反應(yīng)體系，對牛總DNA進行PCR擴增，取3ulPCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖電泳檢測，PCR擴增結(jié)果如附圖2所示，擴增條帶單一，濃度較高，可用于SSCP檢測。
實施例2 12％非變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳
1.清洗玻璃板，烘干，0.8％瓊脂糖封閉玻璃板和膠條間的縫隙；2.配制30ml12％的丙稀酰胺膠工作液(30％丙烯酰胺12.0ml，50％甘油3ml，10×TBE 3ml，10％過硫酸銨200μl，TEMED12μl，純水12ml)，混合后迅速灌膠；3.當(dāng)澆灌至離玻璃板上沿0.1cm時停止灌膠，插入梳子，室溫聚合半小時左右，多余的丙烯酰胺4℃下保存。并隨時觀察凝膠聚合情況，補加丙烯酰胺；4.凝膠聚合后，向電泳槽中加入1×TBE，用注射器沖洗加樣孔；5.預(yù)電泳20min，同時準備上樣；6.取1.5μl PCR產(chǎn)物置于PCR管中，加6μl變性Buffer，98℃變性10min迅速置于冰上，冰浴5min，點樣；7.120V，電泳14-16h。
實施例3 CVM的PCR-SSCP分析利用種公牛的DNA樣品、實施例1中選定的特異性PCR引物CVMF/CVMR進行PCR擴增，該擴增片段包含引起CVM的G→T堿基突變，取1.5μl PCR產(chǎn)物置于PCR管中，加6μl變性Buffer，98℃變性10min，立即置于冰上直至電泳，采用實施例2中的方法制作12％的acr∶bis為29∶1的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，120V，14-16h，凝膠電泳結(jié)束后，采用Bassam等(1991)的銀染方法染色[9]，發(fā)現(xiàn)存在2種不同基因型AA型和AB型，基因分型結(jié)果如附圖3所示。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，AA型的SLC35A3基因第4外顯子(exon4)(與SEQ ID NO.3序列相同)的第73位堿基為G，該基因型屬正常個體，用“TV”表示；而AB型的第4外顯子(exon4)第73位堿基為N，該基因型的個體是CVM攜帶者，用“CV”表示。對54頭種公牛的DNA樣品進行了SSCP分析，結(jié)果表明，AA基因型47頭，AB基因型7頭，也就是說，在所檢測的54頭種公牛中，有7頭是CVM攜帶者。
實施例4 PCR擴增產(chǎn)物的純化及序列測定用玻璃奶洗脫法回收CVM的PCR擴增產(chǎn)物，使用ABI PRISM377DNA測序儀直接進行正反向測序，進一步驗證實施例2中基因分型結(jié)果。測序結(jié)果表明，實施例2中的基因分型結(jié)果是正確的，而且準確率達99％以上，說明建立的檢測CVM有害基因的方法是可行的。PCR擴增產(chǎn)物通過測序獲得的CVM有害基因序列如SEQ ID NO.3所示，SLC35A3基因第4外顯子G73T錯義突變即為引起CVM的堿基突變。不同基因型的測序結(jié)果如附圖4所示。
利用上述建立的分子檢測方法，對種公牛站的54頭種公牛進行了CVM隱性有害基因攜帶情況的檢測，檢測結(jié)果表明，有7頭種公牛為CVM隱性有害基因攜帶者，攜帶率為13％。
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序列表<110>北京奶牛中心<120>一種檢測牛CVM有害基因的方法<130>
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<221>misc_feature<222>(73)..(73)<223>″n″表示″g″或″t″<400>3tggccctcag attctcaaga gcttaattct aaggaacttt cagctggctc acaatttgta 60ggtctcatgg canttctcac agcatgtttt tccagtggct ttgctggggt ttactttgag120aaaatcttaa aagaaaccaa acaatcagtg tggataagaa acattcaact tgg 17權(quán)利要求
1.一種特異性擴增引物，其具有SEQ ID NO.1和2所示的序列。
2.一種檢測牛CVM有害基因的方法，其特征在于使用權(quán)利要求1所述的引物，對牛DNA樣品進行PCR-SSCP分析，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果判斷樣品的基因型。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中PCR的反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，進行35個循環(huán)；72℃延伸7min。
4.含有權(quán)利要求1所述引物的檢測試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測牛脊椎畸形綜合癥(CVM)攜帶者的方法。該方法首先設(shè)計合成如序列表SEQ ID NO.1和2所示的引物，然后通過該引物對牛的DNA樣品進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，退火溫度為57℃，得到如序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。然后對PCR產(chǎn)物進行單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果判斷牛是否攜帶CVM有害基因。本發(fā)明的方法簡單、快速、準確，并且通過本發(fā)明的方法可以進一步開發(fā)檢測試劑盒。本發(fā)明為奶牛CVM有害基因的分型和篩選提供了新的方法和思路，為我國奶牛的分子選育提供了可靠的理論依據(jù)。
文檔編號C12P19/34GK1958810SQ20061015031
公開日2007年5月9日 申請日期2006年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月26日
發(fā)明者張勝利, 韓廣文, 李艷華, 薛建華, 趙鵬, 黃毅, 孫鳳俊, 張曉霞, 曹福存, 劉振君 申請人:北京奶牛中心