專利名稱：：香蕉枯萎病菌分子檢測(cè)基因及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種香蕉枯萎病菌分子檢測(cè)基因及其檢測(cè)方法，專用于香蕉枯萎病菌高靈敏度快速分子檢測(cè)，同時(shí)可用于田間香蕉枯萎病的早期診斷和病菌的監(jiān)測(cè)和鑒定，屬于農(nóng)作物病害防治和植物檢疫技術(shù)的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：香蕉枯萎病由尖鐮孢菌古巴?；?尸M^W應(yīng)o^印on^f.sp.o^me)弓l起，是我國(guó)的三類檢疫性病害。1904年在美國(guó)夏威夷首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)該病害，1910年在巴拿馬因該病造成重大損失。目前該病害廣泛分布世界產(chǎn)香蕉國(guó)家(Stover，R.H.1962.FusarialWilt(PanamaDisease)ofBananasandOtherMtsaSpecies.CMI,Kew，Surrey,UK;Koeningetal.尸usa"'wm。Wwi/加f.sp.C由/weconsistsofasmallnumberofdivergentandgloballydistributedclonallineage.Phytopathology,1997，87:915-923)。我國(guó)大陸于1960年在廣西的西貢蕉上首先發(fā)現(xiàn)該病，為我國(guó)進(jìn)口檢疫對(duì)象(高喬婉.香蕉枯萎病.中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書(shū)植物病理學(xué)巻.北京中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996,p.482-483)。該病初侵染源來(lái)自病株及帶菌土壤，病原菌的孢子在土壤中可存活8—10年。該病遠(yuǎn)距離傳播主要通過(guò)種苗、帶菌的土壤和流水。據(jù)報(bào)道該病菌l號(hào)小種和4號(hào)小種對(duì)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。l號(hào)小種只發(fā)現(xiàn)為害粉蕉，在我國(guó)分布較廣；4號(hào)小種能為害香蕉和粉蕉，分布于臺(tái)灣和廣東。香蕉枯萎病是香蕉的一種毀滅性病害，具有很強(qiáng)的傳染性，--旦擴(kuò)散蔓延則難以控制。據(jù)報(bào)道臺(tái)灣香蕉因4號(hào)小種危害，不到10年時(shí)間幾乎摧毀了臺(tái)灣的香蕉產(chǎn)業(yè)(SuHJetal.FusarialwiltofCavendishbananasinTaiwan.PlantDisease,1986,70:814-818)，雖經(jīng)多年研究和治理，至今每年因枯萎病造成香蕉產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失。廣州市番禺地區(qū)、中山市也發(fā)生香蕉枯萎病，據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)病面積5000多畝，該病菌與臺(tái)灣香蕉研究所報(bào)道的是一致，鑒定12個(gè)菌株均屬生理小種4號(hào)，近來(lái)在福建也發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病(林時(shí)遲等。福建省香蕉枯萎病鑒定。福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，29(4):465469)。目前，香蕉枯萎病仍為害我國(guó)香蕉生產(chǎn)，并且有繼續(xù)擴(kuò)展蔓延的態(tài)勢(shì)，香蕉枯萎病對(duì)我國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)已構(gòu)成重大威脅。目前，防治香蕉枯蔞病的方法主要是綜合治理加強(qiáng)檢疫，嚴(yán)防帶病種苗進(jìn)入無(wú)疫區(qū)；推廣種植無(wú)病組培苗；定期檢査蕉園，發(fā)現(xiàn)零星病株應(yīng)及時(shí)清除銷毀，并撒施石灰或尿素處理土壤；種植抗病和耐病的香蕉品種；重病區(qū)則應(yīng)輪作其它作物如水稻、花生、甘蔗等經(jīng)濟(jì)作物。該病害的檢疫檢測(cè)技術(shù)是以往研究中的薄弱環(huán)節(jié)，因此，國(guó)內(nèi)外目前仍無(wú)十分有效的辦法控制香蕉枯萎病擴(kuò)散蔓延為害，同時(shí)，無(wú)病種苗生產(chǎn)基地的建設(shè)對(duì)于無(wú)疫區(qū)農(nóng)作物，尤其是果樹(shù)等多年生作物香蕉枯萎病的防治至關(guān)重要，植物檢疫措施不僅可及時(shí)堵截國(guó)外病原菌的傳入，而且也是確保國(guó)內(nèi)經(jīng)濟(jì)作物安全出口的必要手段。香蕉枯萎病是一種毀滅性病害，一旦進(jìn)入無(wú)發(fā)病的地區(qū)則無(wú)法根除，而其抗病育種又極其困難，所以為了防止香蕉枯萎病從疫區(qū)傳入非疫區(qū)，建立一套穩(wěn)定、可靠、簡(jiǎn)便、快速、靈敏的分子檢測(cè)方法對(duì)香蕉苗及種植地區(qū)土壤進(jìn)行檢疫、監(jiān)測(cè)是非常必要的。在以往的有害病菌檢測(cè)方面，我國(guó)科研人員主要采取傳統(tǒng)的植物病原檢測(cè)技術(shù)，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是依據(jù)癥狀、形態(tài)，在培養(yǎng)基上直接分離培養(yǎng)，然后在室內(nèi)通過(guò)形態(tài)學(xué)和生理學(xué)性狀特征鑒定，再結(jié)合致病'性澳!l定(SunEJetal.IdentificationofFwsar/"moxyspo//nf.sp.cw6enserace4fromsoilorhosttissuebyculturalcharacters.Phytopathology.1978,68:1672-1673)，這種檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)，且必須擁有病原菌詳細(xì)的分類資料，鑒定時(shí)還受到其他因子的干擾，如種內(nèi)不同菌株間生物學(xué)性狀變異較大，而且不能直接從植物組織中檢測(cè)出病原菌，滿足不了病害控制中快速、靈敏、穩(wěn)定的檢測(cè)要求。現(xiàn)在部分病原菌免疫血清學(xué)鑒定方法已經(jīng)建立，但是特異性較差，常常受到相似種的千擾，也受到抗血清質(zhì)量的影響，血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性取決于抗血清的質(zhì)量。單克隆抗體的?；蕴珡?qiáng)，主要用于流行學(xué)中檢測(cè)菌系，通常將多種單克隆抗體混合"f吏用，以消除過(guò)度?；膯?wèn)題(Linfield.ArapidserologicaltestfordetectingFusariumoxyspo/x/mf.sp.narc/ssi.inA/arc&sus.AnnateofAppHedB/o/ogy.1993,123,685-93)。目前認(rèn)為在檢觀il應(yīng)用方面，多克隆抗體要優(yōu)于單抗，而多克隆抗體又易與親緣關(guān)系相近的細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，常規(guī)的血清學(xué)方法的應(yīng)用受到了一定的限制。另一種檢測(cè)方法是種內(nèi)特異性寡核苷酸探針檢測(cè)法，盡管一些非放射性探針可取代放射性探針，但是雜交檢測(cè)法耗時(shí)較長(zhǎng)且比較昂貴。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在植物病原菌快速分子檢測(cè)方面進(jìn)行了較為深入的研究，取得了一定的進(jìn)展，尤其是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，在植物病原檢測(cè)中的應(yīng)用日臻完善，專化性引物PCR技術(shù)甚至不需要純培養(yǎng)，可直接從樣品浸提液中對(duì)靶標(biāo)病原物進(jìn)行特異性擴(kuò)增(ZhangZGetal.MoleculardetectionofFusart"Anoxysponvmfsp.n/Vet;mandiWycosp/7ere〃ame/on/'sininfectedplanttissuesandsoil.FEMSMicrobiologyLetters.2005，249:39~47;Henson,JM.andFrenchR.Thepolymerasechainreactionandplantdiseasediagnose.1993，Ann.Rev.Phytopathol.31:81-109.)。植物病原生物的分子檢測(cè)技術(shù)(以PCR技術(shù)為平臺(tái))是當(dāng)前該領(lǐng)域的發(fā)展方向，許多重要病原生物都已經(jīng)建立了分子檢測(cè)技術(shù)，越來(lái)越多的分子檢測(cè)試劑盒已經(jīng)或正在被研制。我國(guó)雖然在植物病原生物分子檢測(cè)技術(shù)方面起步較晚，但目前也研制出了許多用于植物病原生物檢測(cè)的技術(shù)，尤其是一些擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的檢測(cè)方法，并將之投入到商業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用中。但在香蕉枯蔞病菌檢測(cè)方面我國(guó)至今還未見(jiàn)有分子檢測(cè)技術(shù)的系統(tǒng)研究，更沒(méi)有相關(guān)檢測(cè)試劑盒的研制和推廣。鑒于以上原因，我們通過(guò)大量分析香蕉枯萎病菌及其它鐮刀菌的指紋圖譜多態(tài)性，針對(duì)香蕉枯萎病菌的特異基因設(shè)計(jì)出了一對(duì)特異性引物，可用于帶香蕉枯萎病菌的植物組織和土壤的高靈敏度快速分子檢測(cè)，對(duì)于確保我國(guó)香蕉無(wú)病種苗生產(chǎn)基地的建設(shè)、安全出口，同時(shí)及時(shí)堵截國(guó)外危險(xiǎn)性帶枯萎病香蕉傳入我國(guó)具有十分重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中香蕉枯萎病菌的生物學(xué)檢測(cè)方法所需周期長(zhǎng)、特異性差，靈敏度低的問(wèn)題，提供一種香蕉枯蔞病菌的特異分子檢測(cè)基因以及結(jié)果可靠、易于操作、靈敏度高的香蕉枯萎病菌的快速檢測(cè)診斷的方法。該方法可以試劑盒的形式直接應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，可用于帶菌的植物組織和土壤的高靈敏度快速分子檢測(cè)，對(duì)于確保我國(guó)香蕉無(wú)病種苗生產(chǎn)基地的建設(shè)、安全出口，同時(shí)及時(shí)堵截國(guó)外危險(xiǎn)性帶枯萎病香蕉傳入我國(guó)具有十分重要的意義。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，(l)本發(fā)明所述的香蕉枯萎病菌的檢測(cè)基因，其特征在于在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)同源序列，為香蕉枯萎病菌的特異基因，序列如下-10203040501TGCCGAGCTGAGTATAAAGACTTTACTGATGTACATATGAATGACTCGTG51GCACGGTACTTGCTGTGGGGGGATCATCCAGGGGATGTATGAGGAGGCTA101GGCTATACATCGCAAGGGTCTTTGMGGGGAGGACGGGGATGAGATTGAA151GGACCTC丌CGAATGGCAAGAGTCTGTTTCC6ATACCTGTGAAGTCGCAG201TTTATACTGAATGTTCAATTAGGCTATTGAGTGGGCTATTGAGCCAGGGC251GCTCCGTCGACATCATCAGCATCTCCGCTGGCTTCCGAAAGTACTCGMG301GMCTAGAGGACGCTGTCACAAGAGCCAAAGCTTCTGGTGTTCTTGTCAT351AGCTGCAGCGTCAAACTGGCAGAACAAAMTACCGTGGCATTCCCAGCTC401GGGA(2)本發(fā)明所述的香蕉枯萎病菌的檢測(cè)基因，又叫高效特異擴(kuò)增序列，其序列特異擴(kuò)增區(qū)域的PCR引物，即分子檢測(cè)引物的序列為FOC-F:5'-ATATGAATGACTCGTGGCACG-3'FOC-R:5'-GCTGGGAATGCGACGGTAT-3'(3)本發(fā)明所述的香蕉枯萎病菌的檢測(cè)方法，包括如下1)從被所述香蕉枯萎病菌感染的香蕉植株組織中或存在香蕉枯萎病菌的土壤樣品中分離DNA;2)以該DNA為模板用上述(2)中所述的一對(duì)引物FOC-F/FOC-R通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出上述(1)所述的香蕉枯萎病菌的特異基因產(chǎn)物；3)然后取適量步驟2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，如果能特異性地?cái)U(kuò)增出364bp產(chǎn)物時(shí)，即可判斷所述的香蕉植株組織或土壤樣品中存在香蕉枯萎病菌；否則所述的香蕉植株組織或土壤樣品中未存在香蕉枯萎病菌。①當(dāng)用于檢測(cè)香蕉植株組織中存在香蕉枯萎病菌時(shí)，采用CTAB法提取香蕉枯萎病菌的DNA，按如下的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件用所設(shè)計(jì)的引物FOC-F/FOC-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系具體可用如下PCR反應(yīng)體系25pl，包括1倍PCR反應(yīng)緩沖液，1.5mMMgCI2，0.2mMdNTPs，1.5UTaqDNA聚合酶，引物FOC-F/FOC-R各50pmol和10ng模板DNA,d.d.H20補(bǔ)足25pl。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min;94。C變性30sec,64。C退火30sec，72。C延伸30sec共30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。然后將8piPCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。②當(dāng)在土壤樣品中存在香蕉枯萎病菌條件下，采用土壤DNA提取法(步驟見(jiàn)具體實(shí)施例3)提取土壤中香蕉枯萎病菌的DNA，按如下的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25pl，包括1倍PCR反應(yīng)緩沖液，1.5mMMgCI2，0.2mMdNTPs,1.5UTaqDNA聚合酶，引物FOC-F/FOC-R各50pmol和10ng模板DNA,d.d.H20補(bǔ)足25pl。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min;94。C變性30sec，64。C退火30sec，72。C延伸30sec共30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。然后將8plPCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。(4)本發(fā)明的香蕉枯萎病菌分子檢測(cè)基因的制備方法，包括1)采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA;2)CTAB法提取各種供試菌株基因組DNA后，應(yīng)用隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD分析篩選，篩選得到一條RAPD隨機(jī)引物，序列為5'-TGCCGAGCTG-3',使用篩選出的隨機(jī)引物5'-TGCCGAGCTG-3'再次對(duì)供試菌株基因DNA進(jìn)行RAPD分析，得到1條香蕉枯萎病菌特異的RAPD片段；3)使用切膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收香蕉枯萎病菌特異的RAPD片段，連接到載體上，通過(guò)適宜溫度熱擊后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，待細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因后，在加有含有氨芐青霉素Amp、異丙基硫代-e-D-半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷的LB平板上篩選陽(yáng)性白斑；4)挑取轉(zhuǎn)化子白斑的陽(yáng)性克隆，采用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用內(nèi)切酶^bo;PI和歷7dn雙酶切檢測(cè)證實(shí)所克隆片段確實(shí)為香蕉枯萎病菌特異性的DNA片段；5)進(jìn)行DNA的測(cè)序，得到香蕉枯萎病菌特異基因序列。本發(fā)明的香蕉枯蔞病菌分子檢測(cè)基因的制備方法具體如下本發(fā)明的關(guān)鍵性技術(shù)是香蕉枯萎病菌的高效特異擴(kuò)增的序列(檢測(cè)基因)及其序列特異擴(kuò)增區(qū)域(sequencecharacterizedamplifiedregion,SCAR)的PCR引物。為了發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病菌的特異基因和設(shè)計(jì)這些SCAR引物，本發(fā)明以我國(guó)3省(福建、廣東和海南，此3省為我國(guó)香蕉枯萎病分布區(qū))14株香蕉枯萎病菌和多種尖孢鐮刀菌不同專化型、多種不同的鐮刀菌種以及香蕉植株上常見(jiàn)的幾種病原真菌為供試材料(具體菌株見(jiàn)表1),采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA，具體方法如下取50mg冷凍干燥后的菌絲粉于1.5ml離心管中，所述的菌絲粉選自表l中的任一種菌株制成的菌絲粉，加入90(Vl2WCTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取液(提取液的配方為2%CTAB;100mmol/LTris-HC1(三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽)，PH8.0;20mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸二鈉)，pH8.0;1.4mol/LNaCl)和90^110%SDS(十二烷基苯磺酸鈉)后混勻，于556(TC水浴1.5h，每10min振蕩混勻-次，水浴1.5h后離心(12，000rpm)15min,取上清液加入與上清液等體積的酚/氯仿/異戊醇(酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1)，離心(12，000rpm)5min，取上清液(水相),加入與上清液等體積的氯仿抽提一次(12,000rpm)離心5min，吸上清(350W)，加0.1體積(35W)的3mol/LNaAC溶液和2體積(700W)的冰無(wú)水乙醇，-20。C下沉淀30min后12，OOOrpm離心5min,輕輕地倒去上清液，加入700W冰70%乙醇進(jìn)行洗滌(稍離心，傾掉上清)，在超凈工作臺(tái)上自然晾干無(wú)酒精味后用1XTE(10ramol/LTris-HCL，0.lmmol/LEDTA,pH8.0)溶液進(jìn)行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度并稀釋至50ng/u1待用。經(jīng)上述方法提取表1中各種供試菌株基因組DNA后，應(yīng)用隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD分析篩選，篩選得到一條RAPD隨機(jī)引物(序列為5'-TGCCGAGCTG-3')，使用篩選出的隨機(jī)引物5'-TGCCGAGCTG-3'再次對(duì)供試菌株基因DNA進(jìn)行RAPD分析，得到1條香蕉枯萎病菌特異的RAPD片段，使用UNIQ-10柱式切膠回收試劑盒(上海Sangori公司出品)從瓊脂糖凝膠中回收香蕉枯萎病菌特異的RAPD片段(具體切膠回收方法參照UNIQ-IO柱式切膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū))，連接到pMD18-Tvector載體(日本KAKARA公司，具體連接方法參照pMD18-Tvector載體說(shuō)明書(shū))上，通過(guò)42。C熱擊90Sec，轉(zhuǎn)化到￡co7iDH5a(大腸桿菌)的感受態(tài)細(xì)胞中(感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于日本TAKARA公司)，待細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Amp+)后，在加有Amp/IPTG/X-gal(Amp:氨芐青霉素；IPTG:異丙基硫代-e-D-半乳糖苷；X-Gal:5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)的LB(LB培養(yǎng)基的配方酵母膏5.0g;蛋白胨10.0g;氯化鈉10.0g;蒸餾水1000ml;瓊脂20.0g;pH7.0)平板上篩選陽(yáng)性白班，挑取轉(zhuǎn)化子白斑的陽(yáng)性克隆，采用H卜l-3質(zhì)粒抽提試劑盒(上海Sangori公司出品)提取質(zhì)粒DNA,用內(nèi)切酶^幼I和歷'/7flffl雙酶切檢測(cè)證實(shí)所克隆片段確實(shí)為香蕉枯蔞病菌特異性的DNA片段，并委托TaKaRa公司進(jìn)行DNA的測(cè)序，得到香蕉枯萎病菌特異基因序列。在香蕉枯萎病菌特異DNA片段序列的基礎(chǔ)上應(yīng)用Primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)SCAR引物，經(jīng)對(duì)供試菌株和福建、海南、廣東等3個(gè)中國(guó)發(fā)生香蕉枯萎病地區(qū)50株香蕉枯萎病菌的特異性進(jìn)行PCR驗(yàn)證(具體的反應(yīng)體系是PCR反應(yīng)體系25pl，包括1倍PCR反應(yīng)緩沖液，1.5mMMgCI2，0.2mMdNTPs,1.5UTaqDNA聚合酶，引物FOC-F/FOC-R各50pmol和10ng模板DNA，d.d.H20補(bǔ)足25pl。PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3min;94。C變性30sec，64。C退火30sec,72。C延伸30sec共30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min),最后確定了1對(duì)高效擴(kuò)增的序列特異擴(kuò)增區(qū)域SCAR引物，此序列特異擴(kuò)增區(qū)域引物在香蕉枯萎病菌上特異性地?cái)U(kuò)增出364bp的產(chǎn)物。這說(shuō)明該引物可被用于生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)病植物組織和土樣中香蕉枯萎病菌快速可靠的檢測(cè)和鑒定。表1供試菌株Table1Testedstrains<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>13尖孢鐮刀菌古巴?；?Race4)Fusfl"Mmoj^worwm/印.cw^e/we香蕉廣東14尖孢鐮刀菌古巴?；?Racel)粉蕉廣東15尖孢鐮刀菌學(xué)薺專化型孛薺福建16尖孢鐮刀菌番薯?；透适砀＝?7尖孢鐮刀菌蠶豆?；虵Msa/"/w;nojqy5/orwm/s/./h6ae蠶豆福建18尖孢鐮刀菌豌豆專化型豌豆福建19尖孢鐮刀菌菜豆?；筒硕垢＝?0尖孢鐮刀菌西瓜?；臀鞴细＝?1尖孢鐮刀菌黃瓜?；忘S瓜福建22尖孢鐮刀菌萎蔫專化型棉花江蘇23木賊鐮刀菌棉花江蘇24雪腐鐮刀菌燕麥江蘇25接骨木鐮刀菌藍(lán)色變種sa/wZ)Mc/;iw/wvar.coerw/e訓(xùn)香石竹福建26茄類鐮刀菌玉米CGMCC27串珠鐮刀菌水稻福建28黃色鐮刀菌高梁CGMCC29小麥赤霉菌(未谷鐮刀菌)小麥CGMCC30尖孢鐮刀菌大豆福建31磚紅鐮刀菌桑樹(shù)CGMCC32鏈狀鐮刀菌棉花CGMCC33厚垣鐮刀菌土壤CGMCC34香蕉生球腔菌(香蕉葉斑病)Afyccw/^flew/Axwus/ca/a丄L.Mulder香蕉福建35斐濟(jì)球腔菌(香蕉葉斑病)Afycos//were//.為/e柳s.Morelet香蕉福建36芭蕉球腔菌(香蕉葉斑病)芭蕉福建37香蕉大莖點(diǎn)菌(香蕉黑星病)香蕉福建38芭蕉炭疽菌(香蕉炭疽病)香蕉福建注序號(hào)1-14為香蕉枯萎病病原菌；CGMCC為中國(guó)普通徼生物菌種保藏中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter)。本發(fā)明有益效果本發(fā)明方法適用于土樣和植物組織中香蕉枯萎病菌的快速可靠的檢測(cè)和鑒定(具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2)，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和植物檢疫領(lǐng)域中香蕉枯萎病的防治和檢疫措施的有效實(shí)施具有重要的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和積極效果1)結(jié)果可靠本發(fā)明方法已經(jīng)對(duì)源于中國(guó)發(fā)生香蕉枯萎病的福建、海南、廣東等地的香蕉枯萎病菌和帶香蕉枯萎病菌的土樣、植物組織進(jìn)行了測(cè)試驗(yàn)證，因此結(jié)果可靠性具有充分的保證；2)實(shí)用性好本發(fā)明所設(shè)計(jì)出的一對(duì)特異性引物，可用于帶香蕉枯萎病菌的植物組織和土壤的高靈敏度快速分子檢測(cè)，同時(shí)也可用于我國(guó)香蕉無(wú)病種苗生產(chǎn)基地的建設(shè)、安全出口，還可用于海關(guān)檢疫口岸對(duì)香蕉枯蔞病菌的檢測(cè)，及時(shí)堵截國(guó)外危險(xiǎn)性帶枯萎病菌香蕉傳入我國(guó)；3)操作簡(jiǎn)便快速應(yīng)用本發(fā)明方法，對(duì)帶香蕉枯萎病菌的土樣和植物組織進(jìn)行病菌DNA提取、PCR擴(kuò)增和常規(guī)的瓊脂糖電泳后即可判定結(jié)果，無(wú)需對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切。一般整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在12小時(shí)內(nèi)完成；4)檢測(cè)靈敏度高應(yīng)用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的SCAR引物的擴(kuò)增靈敏度達(dá)到10fg，因此本方法的實(shí)用性強(qiáng)，可滿足對(duì)帶菌土壤和發(fā)病植物組織中存在的香蕉枯萎病菌進(jìn)行快速可靠的檢測(cè)和鑒定的需要。表2驗(yàn)證引物對(duì)香蕉枯萎病菌特異性所用菌株、樣本及PCR檢測(cè)結(jié)果Tab,e2SpecificityofprimersindetectingF附ar/"max^s/wfiim/印.cn辦e"wfrom_differentstrainsandsamplesbyPCR_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注序號(hào)1-14為香蕉枯萎病病原菌；CGMCC為中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter);+表示能特異性地?cái)U(kuò)增出序列為364bp的DNA片段-表示未能特異性地?cái)U(kuò)增出序列為364bp的DNA片段；S表示具有特異性；NS表示無(wú)特異性。圖1為本發(fā)明所要檢測(cè)的香蕉枯萎病菌的特異PCR擴(kuò)增圖。圖中M為100bpladder分子量marker，1泳道為陰性對(duì)照，2-10泳道為尖鐮孢古巴?；?香蕉枯萎病菌)，11泳道為尖鐮孢黃瓜?；?，12泳道為尖鐮孢茄?；停?3泳道為豌豆腐皮鐮孢，14泳道為稻瘟病菌，15泳道為致病疫霉菌。圖2為本發(fā)明香蕉枯萎病菌的靈敏性檢測(cè)及巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。圖中M為100bpladder分子量marker，1泳道為1pg，2泳道為500ng,3泳道為100ng，4泳道為10ng，5泳道為1ng，6泳道為100pg，7泳道為10pg，8泳道為1pg，9泳道為100fg,10泳道為10fg，11泳道為陰性對(duì)照。圖3為本發(fā)明香蕉發(fā)病組織和帶菌土壤的檢測(cè)結(jié)果圖。圖中M為100bpladder分子量marker,1泳道為陽(yáng)性對(duì)照，2泳道為陰性對(duì)照，3泳道為發(fā)病的香蕉組織，4泳道為發(fā)病土壤，5泳道為健康香蕉組織，6泳道為健康香蕉組織用真核通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增。具體實(shí)施方式-本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容包括香蕉枯萎病菌的特異檢測(cè)基因和特異檢測(cè)引物，所設(shè)計(jì)的引物及其序列為FOC-F:5'-ATATGAATGACTCGTGGCACG-3'，F(xiàn)OC-R:5'-GCTGGGAATGCGACGGTAT-3'。利用該引物可從香蕉枯萎菌株上特異擴(kuò)增出364bp的產(chǎn)物。實(shí)施例l香蕉枯萎病菌的特異引物FOC-F/FOC-R的PCR擴(kuò)增。香蕉枯萎病菌檢測(cè)基因的檢測(cè)試劑盒，包括以下成分其特異引物及其序列為FOC畫F:5'-ATATGAATGACTCGTGGCACG-3FOC-R:5'-GCTGGGAATGCGACGGTAT-3其試劑盒PCR反應(yīng)體系25|jl，包括1倍PCR反應(yīng)緩沖液，1.5mMMgCI2，0.2mMdNTPs,1.5UTaqDNA聚合酶，引物FOC-F/FOC-R各50pmol和10ng模板DNA，d.d.H20補(bǔ)足25pl。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min;94。C變性30sec，64。C退火30sec,72°C延伸30sec共30個(gè)循環(huán)；72i:延伸10min。檢測(cè)的特異性除了來(lái)自我國(guó)枯萎病發(fā)生地海南、廣東和福建等省份的香蕉枯萎菌株可特異地?cái)U(kuò)增出364bp的產(chǎn)物外，檢測(cè)了Fusan'wmoxyspomm的非古巴?；?、其它鐮刀菌Fusan'wT7spp及其它的真菌和細(xì)菌等菌株，均未能擴(kuò)增出任何產(chǎn)物。檢測(cè)的靈敏性:用不同濃度的香蕉枯萎病菌DNA進(jìn)行靈敏性檢測(cè),最低的檢測(cè)率為10fg的純DNA。靈敏性檢測(cè)巢式PCR，其特征在于引物及其序列為.-FOC-NF:5'-GATGAGATTGAAGGACCTCTTCG-3'FOC-NR:5'-TCTAGTTCCTTGGAGTAGTTTCGG-3'其試劑盒PCR反應(yīng)體系25pl，包括1倍PCR反應(yīng)緩沖液，1.5mMMgCI2，0.2mMdNTPs,1.5UTaqDNA聚合酶，引物FOC-F/FOC-R各50pmol和10ng模板DNA，d.d.H20補(bǔ)足25iJl。PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3min;94。C變性30sec，64。C退火30sec,72'C延伸30sec共30個(gè)循環(huán)；72r延伸10min。實(shí)施例2發(fā)病植物組織中香蕉枯萎病菌的檢測(cè)。分別取香蕉枯萎病的發(fā)病組織和人工接種發(fā)病的香蕉組織采用CTAB法提取DNA，取1MIDNA按上述試劑盒實(shí)施的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其試劑盒PCR反應(yīng)體系25yl，包括1倍PCR反應(yīng)緩沖液，1.5mMMgCI2，0.2mMdNTPs，1.5UTaqDNA聚合酶，弓l物FOC-F/FOC-R各50pmol和10ng模板DNA，d.d.H20補(bǔ)足25|jl。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min;94。C變性30sec,64t:退火30sec,72。C延伸30sec共30個(gè)循環(huán)；72""C延伸10min。電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖3，見(jiàn)到一條清晰的分子量為364bp的特異條帶，因而判斷香蕉枯萎病的發(fā)病組織和人工接種發(fā)病的香蕉組織均感染香蕉枯萎病菌。實(shí)施例3發(fā)病土壤樣品中香蕉枯萎病菌的檢測(cè)。1)從發(fā)病土壤樣品中提取DNA:取過(guò)篩的土壤冷凍抽干24-48h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，將研磨后的土壤細(xì)粉分裝至1.5ml離心管中，每管加入500^10.4%脫脂奶粉溶液，渦旋混勻。12000rpm離心15min。取上清加入等體積蛋白酶K緩沖液，加終濃度為10jig/ml蛋白酶K,55。C水浴1-3h。水浴結(jié)束后，加入1/2體積的7.5MNH4AC溶液，上下顛倒混勻。12000rpm離心15min。吸上清加2倍體積無(wú)水乙醇-20'C沉淀(沉淀時(shí)間1.5h)。沉淀結(jié)束后，12000rpm離心15min。用70%乙醇洗滌沉淀后傾去，室溫晾干。每份樣品所提DNA用10plTE(或無(wú)菌超純水)溶解，-2(TC保存?zhèn)溆谩?)香蕉枯萎病菌的PCR檢測(cè)取1ylDNA按試劑盒實(shí)施的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其試劑盒PCR反應(yīng)體系25pl，包括1倍PCR反應(yīng)緩沖液，1.5mMMgCI2，0.2mMdNTPs,1.5UTaqDNA聚合酶，引物FOC-F/FOC-R各50pmol和10ng模板DNA,d.d.H20補(bǔ)足25pl。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min;94。C變性30sec，64。C退火30sec,72。C延伸30sec共30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖3，見(jiàn)到一條清晰的分子量為364bp的特異條帶，判斷發(fā)病土壤樣品侵染香蕉枯萎病菌。實(shí)施例4本發(fā)明對(duì)無(wú)感染香蕉枯萎病菌的香蕉植物組織和土壤樣品進(jìn)行同實(shí)施例2和3的實(shí)驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)分子量為364bp的特異性擴(kuò)增條帶。從以上結(jié)果可知，對(duì)所供試的香蕉植株組織或土壤樣品進(jìn)行總DNA提取，使用香蕉枯萎病菌的DNA序列特異擴(kuò)增區(qū)域的SCAR引物FOC-F/FOC-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果能特異性地?cái)U(kuò)增出364bp的產(chǎn)物，即可判斷香蕉植株組織感染了香蕉枯蔞病菌或土壤中存在了香蕉枯萎病菌。序列表<110>福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所〈120>香蕉枯蔞病菌分子檢測(cè)基因及其檢測(cè)方法〈130>DM<160>1<170>Patentlnversion3.1<210>1〈211〉404<212>DNA<213>香蕉枯萎病(Fltffl"'鵬0，/>0/*謂f早)<400>1tgccgagctgagtataaagactttactgatgtacatatgaatgactcgtggcacggtact60tgctgtgcggggatcatccaggggatgtatgaggaggctaggcteitacstcgcaagggtc120tttgaacgggaccacgcggatgagattgaaggacctcttcgaatggcaagagtctgtttc180cgatacctgtgaagtcgcagtttata(:tgaatgttcaattaggctattcactgggctatt240gagccaccgcgctccgtcgacatcatcagcatctccgctggcttccgaaactactccaag300gaactagacgacgctgtcacaagagc(:aaagcttctggtgttcttgtcatagctgcagcg360tcaaactggcagaacaaaaataccgt(:gcattcccagctcggca40權(quán)利要求1.一種香蕉枯萎病菌分子檢測(cè)基因，其特征在于具有如下所述的基因序列的香蕉枯萎病菌的特異檢測(cè)基因。1020304050|||||1TGCCGAGCTGAGTATAAAGACTTTACTGATGTACATATGAATGACTCGTG51GCACGGTACTTGCTGTGCGGGGATCATCCAGGGGATGTATGAGGAGGCTA101GGCTATACATCGCAAGGGTCTTTGAACGGGACCACGCGGATGAGATTGAA151GGACCTCTTCGAATGGCAAGAGTCTGTTTCCGATACCTGTGAAGTCGCAG201TTTATACTGAATGTTCAATTAGGCTATTCACTGGGCTATTGAGCCACCGC251GCTCCGTCGACATCATCAGCATCTCCGCTGGCTTCCGAAACTACTCCAAG301GAACTAGACGACGCTGTCACAAGAGCCAAAGCTTCTGGTGTTCTTGTCAT351AGCTGCAGCGTCAAACTGGCAGAACAAAAATACCGTCGCATTCCCAGCTC401GGCA2、一種香蕉枯萎病菌的檢測(cè)基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列為<sequence>seeoriginaldocumentpage2</sequence>3、一種香蕉枯萎病菌分子檢測(cè)基因的檢測(cè)方法，包括1)從被所述的香蕉枯萎病菌、被香蕉枯萎病菌感染的香蕉組織和存在香蕉枯萎病菌的土壤中提取DNA;2)以該DNA為模板用一對(duì)引物FOC-F/FOC-R通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出香蕉枯萎病菌的特異基因產(chǎn)物；3)然后取適量步驟2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，如果能特異性地?cái)U(kuò)增出364bp的產(chǎn)物，即可判斷所述的香蕉植株組織或土壤樣品中存在了香蕉枯萎病菌。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的香蕉枯萎病菌的檢測(cè)基因的PCR引物，其特征在于其靈敏性檢測(cè)巢式PCR的引物及其序列為<sequence>seeoriginaldocumentpage2</sequence>全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種香蕉枯萎病菌分子檢測(cè)基因及其檢測(cè)方法，專用于香蕉枯萎病高靈敏度快速分子檢測(cè)。檢測(cè)基因?yàn)橄憬犊菸【禺惖?04bp序列，在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)未發(fā)現(xiàn)同源序列。設(shè)計(jì)了一對(duì)引物FOC-F/FOC-R，其在香蕉枯萎病菌純DNA、帶菌的發(fā)病組織及土壤上特異性地?cái)U(kuò)增出364bp的特異擴(kuò)增產(chǎn)物。所發(fā)明的檢測(cè)基因及引物可被用于生產(chǎn)實(shí)踐中香蕉發(fā)病組織和土壤中香蕉枯萎病菌的快速、靈敏、特異的檢測(cè)，同時(shí)可用于田間香蕉枯萎病的早期診斷和病菌的監(jiān)測(cè)和鑒定。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101205558SQ20061013536公開(kāi)日2008年6月25日申請(qǐng)日期2006年12月22日優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日發(fā)明者蘭成忠,新呂,李本金,翁啟勇,健趙,邱榮洲,陳慶河申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所