專利名稱：：一種鑒定和區(qū)分與紫杉烷含量相關的有用紅豆杉的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及21種植物DNA序列，具體涉及八種紅豆杉的DNA分子標記序列。
背景技術：
：紫杉烷是一類二萜化合物，來源其中的紫杉醇是過去10多年內最有效的抗癌藥之一。紫杉醇等紫杉烷化合物廣泛存在于紅豆杉屬植物的莖、葉和樹皮中，目前己從其中已分離得到300余種紫杉烷二萜類化合物C/.7V饑1999,62,1448-1472)。作為獲取紫杉醇藥物的唯一來源，紅豆杉生長緩慢，天然資源有限，人工發(fā)現和培育紅豆杉資源是有效地協調和利用資源的重要保障。不同種類的紅豆杉植物代謝物譜變化很大，鑒別和分類紅豆杉植物在制藥領域有重要應用價值?，F有的分類方法包括1，形態(tài)學鑒定(肉眼的和顯微鏡下的)和2，細胞遺傳學鑒定(染色體計數，核型分析等)。3，化學分類法4,DNA分子標記物分類法,已在GenBank,DDBJ和EMBL等核酸序列數據庫中可查到的有A.DennisCollins等以聚合酶鏈反應(PCR)擴增葉綠體^7丄-F序列，用Xbal和Vspl酶切以鑒別歐洲紅豆杉，東北紅豆杉和加拿大紅豆杉(Jm<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>B丄iJ等用PCR擴增12種紅豆杉(不包括云南紅豆杉)的ITS序列并測序(//anw6Pa/e^/"2001,6,267-274)。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定和區(qū)分與紫杉烷含量相關的有用紅豆杉的方法，該方法通過從八種紅豆杉基因組中分離出的與各有用成分含量和紅豆杉特性相關的DNA分子遺傳學標記，用于紅豆杉品種鑒定，選育和真?zhèn)舞b別，鑒定結果非常準確。具體地，本發(fā)明提供了一種鑒定和區(qū)分與紫杉烷含量相關的有用紅豆杉的方法，采用DNA分子標記物分類法，其特征在于——以待鑒定紅豆杉基因組DNA為模板，用引物分別擴增DNA標記序列，DNA標記序列包括五種葉綠體分子標記和兩種細胞核分子標記；所述的葉綠體分子標記，包括戸M-加/Z^g，加丄,_加丄"氣加加^"g，加5^-加G^，加f、加G,-所述的細胞核分子標記，包括ITS，18SrRNA;^擴增后的DNA標記序列測序，與下述相關序列比對，以鑒定真?zhèn)魏?或相似物種；與南方紅豆杉(ron^w&"/)特性及紫杉烷含量相關的南方紅豆杉特異DNA分子標記序列有gttatgcatgaacgtaatgctcacaacttccctctggatctagctgctgttgaagctaattctatagatggctaattaatcaatccgatggattgttagcgtatttaaatcctggaaaataaaaacagtaccaaacctttttgaaaggcttggtactgttttttccgtctaaacatttattgcaaacagagcataataaatgcttattatgcatccagcaggaattgaacccgcgacttcccaattatgagttgggtgcttttaccattcagccatggatgctagataaagcaaataaagtttatactatttatagataatatatctatatatattatcttatattaggtacccaatctgattctcttattattcgattcatgcctattgctttcaataaataaagcaatacgactcacttgttcgagagttgcaagaaggttatcgatcttgcaaaactttgatgtccggtcagaacttgtcagcttaactgatcaactaatattattagttagtttttagttttttttggggacttaaaaactttcattcttggaagtaatgactgtagacagagactgtctattggtttggggcggacgtagccaagtggtccaaaggcagtggattgtgaatccaccatgcgcgagatagggattcgaaccctcggtacagatagtctgtacaacggattagcaatccaccgctttagtccgctcagccatctctccgagatgggagatatagaatgaatagagctaaaattttgaagctaaagaccacgaaaatacaattgtattgttcattccgttctaaattactcttcgatttctctagcccggecagtatctggccaggctatgatcttccctatatcaggaataattgaataaattattaatacagtgctttacctaatctgaaagctaaaatgcttgttataaaagcagcaaaaagggctatcaaaatttgaccctctgatatcatttctttatttcctctccaataactttttaattcattatttagatagagccctctatctattgatttagatagagecctctatttattgtattattttaataatacaagctgttcaaggctataatctggatgaaatgttgtagattgaaactggatagatcagattaggatgataaaagattataaaaaaaataaaaaaaaaaagaataataatta騰gacttgacccccccctttctctctgccatggaggagccgaatgaaattttcatgttcgtttctgaattagaggcgttaatcgacgccgactataacccctagccttccaagctaacgatgcgggttcgattccctctacttaccgagggttcgaatccctctttctccgttcagtcacttcaaatgaatcctaaaattttttaacctatagaccttttttattctttacgcccaggatttcgtcctggatcgttcgatagaaatccgaagataaatagagaaacaaaaaatataactactgtgtaaacgaacagcttaagagtaagcattatctaatctccaggattcttattagagttacaaaggaatagatcatcaatctttgcatcatataattgatacttcaataccaagcaatattaccattttaaatctagaatggtacgattttggtctccacattatgtgtggagatcaaattaaaaaatatgaatttattaaatattttgaaatttactctttgcttgggattgaagagttgaaatagggactcaactcctagttcaactatectaaacaagtttaggatcgtcagaatcaataaattgattccctactcccctttttttgcaattaaatctaacggatatttcctctatgtcatttgcatcaatatctaatagccccaactctccctatgatgggggttcggaactgactaagacgaattaaaaaggattgagcctgggaggtaggtattttgatctgttggcaaccagaatagaattgctgcttcacaaaataagcagcagaacaaggaaaaattaattctacaaaattaaaatttggttaatgacagcgatccaagatccatcaat:atatggaaatggaataaaagtatggatacaatatttaaatggttttgcatcaagttaattgtttcttttttataaaaagaaatcgatacttcttgctaagattatcgaaagcttacggcagcttgccaagcaaaggctaag3gaaaaaagaacaaaggtataattggcattatatctacagttggatcagaaat3gcat肌gcctcgggcaatttggctaaaaatggattattcsaatgaaaagcggcatcgtctagacatatattgaggttgagtataactggcattttgattctccgatcaataaaaatgatgtaaaagctcaaaagtattttgccaattaatcgaaattatttggcaagattatactttgagttttcgggttggaagggatcatttcttcataaataattttaaccattctgatagagaatgaccaattaatagatattcttgtttctttttccgttccccaaccgaattacttaaattaaagctattaataaatatacaatcgatattccatataagaaatctaataagaataatacaagaataatacaattcagattagaatggaaccttgtttgaatatataaacaagatataggatcttatatgcattcatcatataagaatggggcgtggccaagcggtaaggcaacaggttttggtcctgctattgcgaaggttcgaatcctttcgtcccagatgggacaaatagtaatatttcaaataaattgctgtcaatagtttcactagttcgaatcaaacaaaagtagaaaataaaatacttgcatagaaaatacagaaatagtataataattttcagtctcgattagactggagatgtcgaaagataaagaagtaacagagggtatcccacccttgaactaatatccaccaaatcaatttaaatgaaatttatgagatccgattatctcatgatttcgttcgccaataaggggatatggcgaaatcggtaga與云南紅豆杉特性及紫杉烷含量相關的云南紅豆杉特異DNA分子標記序列有加嚴-加e腦caatgaatcctaaaattttttaacctatagaccttttttattctttacgcccaggatttcgtcctggatcgttcgatagaaatocgaagataaatagagaaacaaaaaatataactactgtgtaaacgaacagcttaagagtaagcattatctaatctccaggattcttattagagttacaaaggaatagatcatcaatctttgcatcatataattgatacttcaataccaagcaatattaccattttaaatctaaaatggtacgattttggtctccacattatgtgtggagatcaaattaaaaaatatgaatttattaaatattttgaaatttactctttgcttgggattgaagagttgaaatagggactcaactcctagttcaactatcctaaacaagtttaggatcgtcagaatcaataaattgattccctactcccctttttttgcaattaaatctaacggatatttcctctatgtcatttgcatcaatatctaatagccccaactctccctatgatgggggttcggaactgactaagacgaattaaaaaggattgagcctgggaggtaggtattttgatctgttggcaaccagaatagaattgctgcttcacaaaataagcagcagaacaaggaaaaattaattctacaaaattaaaatttggttaatgacagcgatccaagatccatcaatatatggaaatggaataaaagtatggatacaatatttaaatggttttgcatcaagttaattgtttcttttttataaaaagaaatcgatacttcttgctaagattatcgaaaacttacggcagcttgccaagcaaaggctaagagaaaaaagaacaaaggtataattggcattatatctacaattggatcagaaatagcataagcctcgggcaatttggctaaaaatggattattcaaatgaaaagcggcatcgtctagacaaatattgaggttgagtataactggcattttgattctccgatcaataaaaatgatgtaaaagctcaaaagtattttgccaattaatcgaaattatttggcaagattatactttgagttttcgggttggaagggatcatttcttcataaataattttaaccattctgatagagaatgaccaattaatagatattcttgtttctttttccgttccccaaccgaattacttaaaataaagctattaataaatatacaatcgatattccatataagaaatctaataagaataatacaagaataatacaattcagattagaatggaaccttgtttgaatatataaacaagatataggatcttatatgcattcatcatataagaatggggcgtggccaageggtaaggcaacaggttttggtcctgctattgcgaaggttcgaatcctttcgtcccagatgggacaaatagtaatatttcaaataaattgctgtcaatagtttcactagttcgaatcaaaca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ctagacaaatattgaggttgagtataactggcattttgattctccgatcaataaaaatgatgtaaaagctcaaaagtattttgccaattaatcgaaattatttggcaagattatactttgagttttcgggttggaagggatcatttcttcataaataattttgaccattctgatagagaatgaccaattaatagatattcttgtttctttttccgttccccaaccgaattacttaaaataaagctattttaaatatacaatcgatattccatataagaaatctaataagaatagtacaagaataatacaattcagattagaatggaaccttgcttgaatatataaaaaagatataggatcttatatgcagcattcatataagaatggggcgtggccaagcggtaaggcaacaggttttggtcctgttattgcgaaggttcgaatcctttcgtcccagatgggacaaatagtaataattaaaataaattgctgtcaatagtttcactagtccgaatcaaacaaaagtggaaaataaaatacttgcatagaaaatacagaaatagtataataattttcagtctcgattagactggagatgtcgaaagataaagaagtaacagagggtatcccacccttgaactggaactaatatccaccaaatcaatttaaatgaaatttatgagatccgattatctcatgatttcgttcgccaataaggggatatggcgaaatcggtaga與歐洲紅豆杉(roxMtomato)特性及紫杉烷含量相關的歐洲紅豆杉特異DNA分子標記序列有ttatgcatgaacgtaatgctcacaacttccctetggatctagctgctgttgaagctaattctatagacggctaattaatcaatccgatggattgttagcgtatttaaatcctggaaaataaaaacagtaccaaacctttttgaaaggcttggtactgttttttacgtctaaacatttattgcaaacagagcataataaatgcttattatgcatccagcaggaattgaacccgcgacttcccaattatgagttgggtgctttgaccattcagccatggatgctagataaagcaaataaagtttatactatttatatataatatatctatatatattatcttatattaggtacccaatctgattctcttattattcgattcatgcctattgctttcaataaataaagcaatacgactcacttgttcgagagttgcaagaaggttatcgatcttgcaaaactttgatgtccggtcagaacttgtcagcttaactgatcaactaatattattagttagtttttagttttttttggggacttagaaactttcattcttggaagtaatgactgtagacagagactgtctattggtttggggcggacgtagccaagtggtccaaaggcagtggattgtgaatccaccatgcgcgagatagggattcgaaccctcggtagtttttaaaactataccggttttcaagaccggagccatcaaccactcggccatctctcccggacgaggccaactggtcctattttactccgacagataataattaattcaattatgatcaatgaaaatccgtagtgcatttgatgcagaatttgaccggatggggatcgaatggtatagtctattgaatctgttgaaagcttttaagatcacaacaatgactattgctttccaatcgtctgtgtttgcattaattgcaatttcatttctcctagtgattggtgtacctgtcgcacttgcctctcctactggttggtcaagtagcaaaaatgtgctattttcaggaatatcattatggattggatcagtctttttagtaggtattctgaattcttttatatcttagatatgttttaagatcttttgggttgaaaccctccctcccctttccgtagggcattaatagttcgcaagggcatttcctaaaaataccaagaaactaaattaaagtgttcttgggagggtttattttattattggcagtattaatcatcatacttataatcataaagtatgtacccacatagaagtggtaatatatagggatatatattatattatccctataacgagtcaaatgcctac加，-加0腦ttaccgagggttcgaatccctctttatccgttcagtcacttcaaatgaatcctaaaattttttaacctatagacctttttattctttacgcccaggatttcgtcctggatcgttcgatagaaatccgaagataaatagagaaacaaaaaatataactactgtgtaaacgaacagcttaagagtaagcattatctaatctccaggattcttattagagttacaaaggaatagatcatcaatctttgcatcatataattgatacttcaataccaagcaatattaccattttaaatctaaaatggtacgattttggtctccacattatgtgtggagatcaaatttaaaaatatgaatttattaaatatttttcttttattgcttgggattgaagagttgaaatagggactcaactcctagttcaactatcctaaacaagtttaggatcgtcagaatcaataaattgattccctactccactttttttgcaattaaatctaacggatatttcctctatgtcatttgcatcaatatctaatagccccaactctccctatgatgggggttcggaactgactaagacgaattaaaaaggattgagcctgggaggtaggtattttgatctgttggcaaccataatagaattgctgcttcacaaaataagaagcagaacaaggaaaaataattctacaaaatgaaaatttggttaatgacagcgatccaagatccatcaatatatgaaaatggaataaaagtatgtaaacaatatttaaattgttttgcatcaagttaattgtttcttttttataaaaagaaatcgatacttcttgctaagattatcgaaaacttacggcagcttgccaagcaaaggctaagagaaaaaagaacaaaggtataattggcattatatctacaattggatcagaaatagcataagcctcgggcaatttggctaaaaatggattattcaaatgaaaagcggcatcgtctagacaaatattgaggttgagtataactggcattttgattctccgatcaatagaaatgatgtaaaagctcaaaagtattttgccaattaategaaattatttggcaagattatactttgagttttcgggttggaagggatcatttcttcataaataattttaaccattctgatagagaatgaccaattaatagatattcttgtttctttttccgttccccaaccgaattacttaaaataaagctattttaaatatacaatcgatattccaatctaataagaataatacaagaataatacaattcagattagaatggaaccttgtttgaatatataaacaagatataggatcttatatgcagcattcatataagaatggggcgtggccaagcggtaaggcaacaggttttggtcctgttattgcgagggttcgaatccctccgtcccagatgggacaaatagtaataattaaaataaattgctgtcaatagtttaactagtccgaatcaaacaaaagtggaaaataaaatacttgcatagaaaatacagaaatagtataataattttcagtotcgattagactggagatgtcgaaagataaagaagtaacagagggtatcccacccttgaactggaactaatatccaccaaataaatttaaatgaaatttatgagatccgattatctcatgatttcgttcgccaataaggggatatggcgaaatcggtaga本發(fā)明鑒定和區(qū)分與紫杉烷含量相關的有用紅豆杉的方法中，用于擴增葉綠體分子標記fmL"^-加F的引物可以是B49317:CGAAATCGGTAGACGCTACG和Tm-f:ATTTGAACTGGTGACACGAG。(文獻1TaberletP,GiellyL,PautouQBouvet丄Universalprimersforamplificationofthreenon-codingregionsofchloroplastDNA.PlantMolBiol.1991;17:1105-9.)本發(fā)明鑒定和區(qū)分與紫杉烷含量相關的有用紅豆杉的方法中，用于擴增葉綠體分子標記戸M-^7//^g的引物可以是psbA3'f:GTTATGCATGAACGTAATGCTC和TmHf:CGCGCATGGTGGATTCACAATCC。(文獻2KressWJ,WurdackKJ,ZimmerEA,WeigtLA，JanzenDH.UseofDNAbarcodestoidentifyfloweringplants.ProcNatlAcadSciUSA.2005;102:8369-74.)本發(fā)明鑒定和區(qū)分與紫杉垸含量相關的有用紅豆杉的方法中，用于擴增葉綠體分子標記加S0^-加0^g的引物可以是TmS:TTACCGAGGGTTCGAATCCCTC和TabB:TCTACCGATTTCGCCATATC。(文獻3ShawJ,LickeyEB,BeckJT,FarmerSB,LiuW,MillerJ,SiripunKC，WinderCT,SchillingEE,SmallRL.ThetortoiseandthehareII:relativeutilityof21noncodingchloroplastDNAsequencesforphylogeneticanalysis.AmJBotany.2005;92:142-66).本發(fā)明鑒定和區(qū)分與紫杉浣含量相關的有用紅豆杉的方法中，用于擴增葉綠體分子標記fm5^《^G0^或fmS^^^i(^『-fm(/^'的引物是加S^u:AGATAGGGATTCGAACCCTCGGT和3'traG^c:GTAGCGGGAATCGAACCCGCATCo(文獻3ShawJ,LickeyEB,BeckJT,FarmerSB,LiuW,MillerJ,SiripunKC,WinderCT,SchillingEE,SmallRL.ThetortoiseandthehareII:relativeutilityof21noncodingchloroplastDNAsequencesforphylogeneticanalysis.AmJBotany.2005;92:142-66).本發(fā)明鑒定和區(qū)分與紫杉烷含量相關的有用紅豆杉的方法中，用于擴增細胞核分子標記18SrRNA的引物是F:TCAAAGATTAAGCCATGCATGTC和R:CAACATCGGCGACGGAAACCA。本發(fā)明鑒定和區(qū)分與紫杉垸含量相關的有用紅豆杉的方法中，用于擴增細胞核分子標記ITS的引物是ITS5a:CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG禾BITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC。本發(fā)明還特別提供了兩種引物用于PCR擴增分子標記，它們分別是一種用于擴增細胞核分子標記18SrRNA的引物，F:TCAAAGATTAAGCCATGCATGTC。一種用于擴增細胞核分子標記18SrRNA的引物，R:CAACATCGGCGACGGAAACCA。本發(fā)明通過對與紫杉烷含量相關的特異DNA分子標記進行擴增和測序，與基因數據庫的同源序列比對，用于紅豆杉種屬鑒定，真?zhèn)舞b別，品種選育，法醫(yī)學分析與資源保護等，為可持續(xù)開發(fā)紅豆杉資源，良好農業(yè)規(guī)范和良好操作規(guī)范提供高通量的可靠技術。具體實施例方式從紅豆杉新鮮葉片，莖，種子和/或烘干葉片中提取基因組DNA。用TakaraPCR儀擴增各分子標記，擴增條件如下psbA-tmH，18SrRNA和ITS,94。C5分鐘，40次循環(huán)94。C30秒，52。C50秒，72。Cl分48秒，最后72°C7分鐘；trnSGGA-trnTUGU-traLUAA，^7丄""內含子和fmS^'4-加C/^'，94。C5分鐘，40次循環(huán)94。C30秒，50。Cl分鐘，72。C2分鐘，最后72°C7分鐘。PCR反應液經優(yōu)化后的成分為模板DNA1微升(約50ng),10xPCR緩沖液5微升，2.5mMdNTP4微升，IO,正向和反向引物各3微升，TakaraExTaq0.4微升,IOmg/ml牛血清白蛋白0.5微升,25mMMgCl22微升,滅菌蒸餾水31.1微升,總體積50微升。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)照相。實施例1~8:DNA序列標記用于紅豆杉真?zhèn)舞b別與物種鑒定實施例1:從東北紅豆杉新鮮葉片，莖，種子和/或烘干葉片中提取基因組DNA。用TakaraPCR儀擴增各分子標記，PCR產物純化后轉入克隆載體pMD19T，測序。加,氣^wi^^-mF和ITS序列結果與NCBIGenBank中已知序列相同，證實樣品為東北紅豆杉。其余四個標記測序結果進一步證實(表1)。實施例2:從云南紅豆杉新鮮葉片，莖，種子和/或烘干葉片中提取基因組DNA。用TakaraPCR儀擴增各分子標記，PCR產物純化后轉入克隆載體pMD19T,測序。^iZ^^-fmF序列結果與NCBIGenBank中已知序列相同，證實樣品為云南紅豆杉。其余五個標記測序結果進一步證實。實施例3:從中華紅豆杉新鮮葉片，莖，種子和/或烘干葉片中提取基因組DNA。用TakaraPCR儀擴增各分子標記，PCR產物純化后轉入克隆載體pMD19T,測序。加/^^-加/Z^-加F，18SrRNA和ITS序列結果與NCBIGenBank中已知序列相同，證實樣品為中華紅豆杉。其余三個標記測序結果進一步證實。實施例4:從南方紅豆杉新鮮葉片，莖，種子和/或烘干葉片中提取基因組DNA。用TakaraPCR儀擴增各分子標記，PCR產物純化后轉入克隆載體pMD19T,測序。加Z^^-加廣氣加F，18SrRNA和ITS序列結果與NCBIGenBank中已知序列相同，證實樣品為南方紅豆杉。其余三個標記測序結果迸一步證實。實施例5:從曼地亞紅豆杉新鮮葉片，莖，種子和/或烘干葉片中提取基因組DNA。用TakaraPCR儀擴增各分子標記，PCR產物純化后轉入克隆載體pMD19T,測序。18SrRNA和ITS序列結果與NCBIGenBank中已知序列相同，證實樣品為曼地亞紅豆杉。其余三個標記測序結果進一步證實。實施例6:從歐洲紅豆杉新鮮葉片，莖，種子和/或烘千葉片中提取基因組DNA。用TakaraPCR儀擴增各分子標記，PCR產物純化后轉入克隆載體？^0191;測序。,/2^^4-^丄1144-fmF和ITS序列結果與NCBIGenBank中己知序列相同，證實樣品為歐洲紅豆杉。其余四個標記測序結果進一步證實。實施例7:從Hunnewell紅豆杉新鮮葉片，莖，種子和/或烘干葉片中提取基因組DNA。用TakaraPCR儀擴增各分子標記，PCR產物純化后轉入克隆載體pMD19T,測序。ITS序列結果與NCBIGenBank中已知序列相同，證實樣品為Hunnewell紅豆杉。其余五個標記測序結果迸一步證實。實施例8:從加拿大紅豆杉新鮮葉片，莖，種子和/或烘千葉片中提取基因組DNA。用TakaraPCR儀擴增各分子標記，PCR產物純化后轉入克隆載體pMD19T，測序。fm/^W-frnL"4^-和ITS序列結果與NCBIGenBank中已知序列相同，證實樣品為加拿大紅豆杉。其余四個標記測序結果進一步證實。表1.新發(fā)現紅豆杉分子標記的GenBank登錄號及紅豆杉枝葉來源<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>歐洲紅豆杉(r00003811586-1978英國牛津大學園匈牙利Ka植物園EF017303AY013744EF017309EFO17307AF259294EF0173U)Humiewel紅豆杉WC001加拿大滑EF0H302EF0HM4EF0H306AF259288鐵盧"a)大學加拿大紅豆杉1960-2000加拿大蒙特利爾植物園EF017304AF506837EF017308EF017305AF259296EF0173U二尖杉FCH001湖北房縣DQ哪578EF017315無DQ888581無(誤為香榧)紅豆杉FC001湖北神農架(小葉品種)無無無無-￡無用上述方法對表1中的東北紅豆杉，云南紅豆杉AFOOl，中華紅豆杉，南方紅豆杉LSOOl，曼地亞紅豆杉DICPOOl迸行測序鑒定證實其身份。各分子標記有無及大小見表2。表2.七類分子標記在紅豆杉及相關物種中的分布及大小(bp)的G歐旭的『"縦譜/1東北紅豆杉83082i1724669NA1691云南紅豆杉6488341719698NA11551679中華紅豆杉6488231711698NA賜1674南方紅豆杉6488341726699NA"551692薆地亞紅豆杉833NA1724729NAU55i668歐洲紅豆杉6478361716729加拿大紅豆杉8298341606729Hun加weH紅豆杉9298981724669三尖杉415830NA739NA,PCR陰性實施例11~13:偽品和未知樣品的鑒定實施例11一份來自湖北房縣的"香榧"樣品，經^72Z/^/W/W2分子標記測序，與GenBank中已知序列比對，發(fā)現其與已知序列僅84%相同。戸/^-fm/^"G測序結果與GenBank中已知序列比對，與三尖杉僅有三堿基差異。其它四種分子標記測序結果證實該樣品為三尖杉。實施例12一份來自湖北神農架的"小葉"紅豆杉樣品，經加S^-加G^分子標記測序,與曼地亞紅豆杉相應序列比對，發(fā)現二者相同。其它五種分子標記測序結果證實該樣品為曼地亞紅豆杉。實施例132—份來自加拿大滑鐵盧大學的紅豆杉樣品，經六個分子標記測序,與已知紅豆杉相應序列比對，發(fā)現其為/n/""ew//紅豆杉。NA11551692NA11551692NA1155169216551130NA權利要求1、一種鑒定和區(qū)分與紫杉烷含量相關的有用紅豆杉的方法，采用DNA分子標記物分類法，其特征在于——以待鑒定紅豆杉基因組DNA為模板，用引物分別擴增DNA標記序列，DNA標記序列包括五種葉綠體分子標記和兩種細胞核分子標記；所述的葉綠體分子標記，包括psbA-trnHGUG，trnLUAA-trnLUAA-trnFGAA，trnSGCU-trnQUUG，trnSUGA-trnGGCC，trnSGCU-trnGUUC-trnGUUC；所述的細胞核分子標記，包括ITS，18SrRNA；——將擴增后的DNA標記序列測序，與下述已知的相關序列比對，以鑒定真?zhèn)魏?或相似物種；與南方紅豆杉(Taxusmairei)特性及紫杉烷含量相關的南方紅豆杉特異DNA分子標記序列有1psbA-trnHGUGgttatgcatgaacgtaatgctcacaacttccctctggatctagctgctgttgaagctaattctatagatggctaattaatcaatccgatggattgttagcgtatttaaatcctggaaaataaaaacagtaccaaacctttttgaaaggcttggtactgttttttccgtctaaacatttattgcaaacagagcataataaatgcttattatgcatccagcaggaattgaacccgcgacttcccaattatgagttgggtgcttttaccattcagccatggatgctagataaagcaaataaagtttatactatttatagataatatatctatatatattatcttatattaggtacccaatctgattctcttattattcgattcatgcctattgctttcaataaataaagcaatacgactcacttgttcgagagttgcaagaaggttatcgatcttgcaaactttgatgtccggtcagaacttgtcagcttaactgatcaactaatattattagttagtttttagttttttttggggacttaaaaactttcattcttggaagtaatgactgtagacagagactgtctattggtttggggcggacgtagccaagtggtccaaaggcagtggattgtgaatccaccatgcgcg2trnSUGA-trnGGCCagatagggattcgaaccctcggtacagatagtctgtacaacggattagcaatccaccgctttagtccgctcagccatctctccgagatgggagatatagaatgaatagagctaaaattttgaagctaaagaccacgaaaatacaattgtattgttcattccgttctaaattactcttcgatttctctagcccggccagtatctggccaggctatgatcttccctatatcaggaataattgaataaattattaatacagtgctttacctaatctgaaagctaaaatgcttgttataaaagcagcaaaaagggctatcaaaatttgaccctctgatatcatttctttatttcctctccaataactttttaattcattatttagatagagccctctatctattgatttagatagagccctctatttattgtattattttaataatacaagctgttcaaggctataatctggatgaaatgttgtagattgaaactggatagatcagattaggatgataaaagattataaaaaaaataaaaaaaaaaagaataataattatttttgacttgacccccccctttctctctgccatggaggagccgaatgaaattttcatgttcgtttctgaattagaggcgttaatcgacgccgactataacccctagccttccaagctaacgatgcgggttcgattccctctac3trnSGCU-trnQUUGttaccgagggttcgaatccctctttctccgttcagtcacttcaaatgaatc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