專利名稱：一種檢測乳品中過氧化物酶(lpo)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可上演食品檢測領(lǐng)域，具體就是一種檢測乳品中過氧化物酶(LP0)的方法 背景技術(shù)牛乳中富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、酶、礦物質(zhì)等對人體生長發(fā)育及代謝 所必需的全部營養(yǎng)成分，也有利于人體消化吸收，因此被稱為最接近完善的食品。隨著現(xiàn)代 生活的提高，人們對牛奶的需求也越來越髙。在飲用牛奶之前，對于牛奶的合理消毒是非常 重要的。乳過氧化物酶是過氧化物酶的一種。LP0作為乳中的內(nèi)源酶之一，存在于牛奶的乳清中。 LPO熱穩(wěn)定性相對較高，在80C熱處理后其酶活力會喪失，如果在乳品沒有合理消毒，就會 使乳過氧化物酶的活性顯著升高。乳過氧化物酶與硫銀酸鹽、過氧化氨構(gòu)成乳過氧化物酶體 系，即LP體系，當(dāng)三種物質(zhì)并存時，SCN—被氧化成具有抗菌活性的OSCN-，進(jìn)而在牛奶中表 現(xiàn)強(qiáng)有力的抑菌作用。利用LPS保鮮牛奶也是迄今為止除了冷卻之外最有效的方法。因此，對 于乳品中乳過氧化物酶的檢測在生產(chǎn)質(zhì)量監(jiān)督及保鮮研究上具有重要的應(yīng)用價值。對乳過氧化物醵的檢測有很多方法，目前多是采用分光光度計(jì)的方法來檢測。如利用苯胺 或鄰苯三酚測過氧化物酶的活力，但是這些方法需要添加試劑較多，操作過程繁瑣，誤差較 大，不易標(biāo)準(zhǔn)化；愈創(chuàng)木酚法很多人采用，但試劑昂貴，不易控制反應(yīng)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種較高靈敏度，誤差小，簡易、快速的檢測乳過氧化物酶的方法。 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種檢測乳品中過氧化物酶(LPO)的方法，包括下列步驟1) 取兩個比色杯，各為對照管和測試管，各加入2.2mL的磷酸鹽緩沖液調(diào)整PH-5-6;2) 各加入0. 5-4mM的ABTS溶液0. 7mL;3) 各管中加入l-30raM的HAO. lmL。顛倒混勻，放置于比色槽中4) 對照管中加入0.2mM的磷酸氫二鉀溶液0.05mL,測試管中加入0. 05mL的樣品；5) 混勻后，在室溫下,立即用分光光度計(jì)在416nm處采用動力學(xué)曲線模式，空白管調(diào)零后， 取前120s進(jìn)行連續(xù)性檢測。輸出打印，每檢測一次就得到一條近似直線的曲線，計(jì)算該 條近似直線的斜率y，由x=256.4y+0.0256計(jì)算酶活力x。上述l)中調(diào)整PH-5.5。上述2)中各加入2mM的ABTS溶液0.7mL。上述3)中各管中加入anM的HAO. lmL。上述碳酸鹽緩沖液代替磷酸鹽緩沖液，相應(yīng)的空白管加入碳酸氨鈉溶液。采用旭TS法試劑成本較低，直接借用分光光度計(jì)可檢測，儀器要求不高，易于實(shí)驗(yàn)操作:
而且與傳統(tǒng)的分光光度計(jì)檢測不同，采用動力學(xué)模式進(jìn)行檢測，根據(jù)斜率的變化可計(jì)算出酶 活力，誤差小，簡便，快速。對該酶的檢測，可指示乳品質(zhì)量是否安全，具有較大的實(shí)際意 義，使用的儀器設(shè)備簡單，操作方便，適用于一般的企事業(yè)單位推廣應(yīng)用。


圖l ABTS掃描曲線；
圖2 PH的影響； 圖3酶濃度的影響； 圖4底物濃度的影響； 圖5 H202的影響； 圖6溫度的影響；
圖7酶濃度動力學(xué)曲線檢測生成的曲線。
具體實(shí)施例方式
檢測乳過氧化物酶的方法以ABTS為底物，在乳過氧化物酶的催化作用下，生成綠色的氧 化型ABTS物質(zhì)，利用比色法在可見光下進(jìn)行連續(xù)性檢測，以吸光度值的變化速率來表征酶活力。
通過對方法本身的研究，找出反應(yīng)產(chǎn)物的最高吸收波長，pH，酶濃度，底物濃度，溫度 等因素對反應(yīng)的影響，確定最佳的反應(yīng)條件。并將此方法應(yīng)用于牛乳等乳制品中乳過氧化物 酶的檢測
一種檢測乳品中過氧化物酶(LPO)的方法，包括下列步驟-
1) 取兩個比色杯，各為對照管和測試管，各加入2.2mL的磷酸鹽緩沖液調(diào)整PH-5.5;
2) 各加入2raM的ABTS溶液0. 7mL;
3) 各管中加入5mM的H2020. lraL。顛倒混勻，放置于比色槽中；
4) 對照管中加入0.2mM的磷酸氣二鉀溶液0.05mL，測試管中加入0.05mL的樣品；
5) 混勻后，在室溫下，立即用分光光度計(jì)在416nm處采用動力學(xué)曲線模式，空白管調(diào)零后， 取前120s進(jìn)行連續(xù)性檢測。輸出打印，每檢測一次就得到一條近似直線的曲線，計(jì)算該 條近似直線的斜率y,由x-256.4y+0.0256計(jì)算酶活力x。
上述碳酸鹽緩沖液代替磷酸鹽緩沖液，相應(yīng)的空白管加入碳酸氨鈉溶液，當(dāng)然也可以用其它 相同功效的試劑代替。
檢測牛乳中乳過氧化物酶的活性的建立試驗(yàn)報告 --.實(shí)驗(yàn)材料 1.試劑度制 磷酸鹽緩沖液
稱取3.40g磷酸二氫鉀，用去離子水定容至250raL。既是0. lmM的磷酸二氫鉀溶液。
稱取4. 35g磷酸氫二鉀，用去離子水定容至250mL。既是0. lmM的磷酸氣二鉀溶液。 二者混合，即為0. lmM磷酸鹽緩沖液。使用之前，分別用磷酸或氫氧化鉀調(diào)至所需pH值。
0. 2.M的磷酸氫二鉀溶液稱取一定量的磷酸氫二鉀，用去離子水稀釋溶解。41C保存 lmM ABTS: 稱取0. 0274g的ABTS (sigma)，用去離子水稀釋溶解。新鮮配制。 過氧化氫溶液取原濃度的過氧化氫，用去離子水按照一定的比例配制所需要的濃度。新鮮
配置，避光保存。
標(biāo)準(zhǔn)品酶液標(biāo)準(zhǔn)酶液購置子于sigma公司，用去離子水稀釋至所需濃度。(-20TC保存)。
2. 實(shí)驗(yàn)儀器UV—2800型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器廠。
3. 樣品的處理購置的新鮮牛乳(保證牛乳新鮮，無異物，無沉淀，無異味)，用超純水進(jìn)行
1: 25倍稀釋，4TC冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 二. 標(biāo)準(zhǔn)曲錢的繪制
1. 取兩個比色杯，各為對照管和測試管，各加入2. 2mL的磷酸鹽緩沖液
2. 各加入O. 7mL的ABTS溶液
3. 各管中加入0.1niL的H202。顛倒混勻，放置于比色槽中。
4. 對照管中加入0.05mL的0. 2mM的磷酸氫二鉀溶液，測試管中加入0. 05mL的標(biāo)準(zhǔn)品酶液
混勻后室溫下,立即用分光光度計(jì)在416nm處連續(xù)性檢測(采用動力學(xué)曲線模式)
5. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
三. 樣品的測定
1. 取兩個比色杯，各為對照管和測試管，各加入2.2mL的磷酸鹽緩沖液
2. 各加入0. 7mL的ABTS溶液
3. 各管中加入0. lmL的HA。顛倒混勻，放置于比色槽中。
4. 對照管中加入0.05mL的0. 2mM的磷酸教二鉀溶液，測試管中加入0. 05mL的樣品
5. 混勻后，在室溫下,立即用分光光度計(jì)在416nm處采用動力學(xué)曲線模式，取前120s進(jìn)行連 續(xù)性檢測。輸出打印，每檢測一次就得到一條近似直線的曲線，根據(jù)斜率的多少可以計(jì)算 酶活力。
6. 酶活力定義1個酵活力單位就是在25C、 pH-5.5時，每分鐘氧化ABTS所需乳過氧化物
酶的吸光度值變化率 酶活力計(jì)算公式
<formula>formula see original document page 5</formula>
注厶A416nm/s測試管每秒鐘測試管酶的吸光度變化 AA416nm/s空白管每秒鐘空白管酶的吸光度變化 60 :換算為每分鐘
3.05 :總體積(mL)
df :稀釋因子 29.3 :在416咖處氧化型ABTS的毫摩消光系數(shù) 0.05 :所用的酶體積(mL)
四.結(jié)果如下 1掃描曲線
由圖l可知所顯示的是倒立的拋物線形式，從360nm到416nm之間，吸光度值逐漸增 加；而416nm到472nm之間，吸光度值逐漸減小；從472nm到600nm之間，吸光度值增加平 緩?？傊?，在416nm處有最大吸收峰。所以，ABTS方法采用的最大吸收波長為416nm。 2 pH的影響
分別在pH為4. 5、 5. 5、 6. 5、 7. 5的情況下，限定LPO選用1.85U/mL、 ABTS為lmM、 HA為 lOmM等其他形象因素不變，對其探討，在416nm檢測結(jié)果如下可知當(dāng)pH-5.5時，酶活 力增加較快，也既是酶的最佳pH。所以，最佳pH為5.5。
說明在pH-5.5時，酶所解離的基團(tuán)與底物結(jié)合時具有最大的催化活性；在此種緩沖液、底物 的影響下，PH的改變對酶的催化作用影響很大。 3酶濃度的影響
分別取0.4625u/mL、 0.925u/mL、 1. 85u/mL的LPO標(biāo)樣，限定其它影響因素不變，在416nm 處檢測，結(jié)果如下
由圖3可知酶濃度依次增大時，其增長率也逐漸增大；當(dāng)酶濃度《0.4625u/mL，酶活力 增長很小；當(dāng)酶濃度^1.85u/mL，酶活力急劇增長，而且在本實(shí)驗(yàn)多用的有限時間內(nèi)，吸光 度值基本都大于l。所以，選用最佳酶濃度介于三者之間。 4底物濃度的影響
分別取0.5mM、 1 raM、 2 mM、 3 mM、 4 mM的ABTS，限定其它因素不變，在416nm處檢測
如下
由圖4可知底物濃度逐漸增加時，酶增加率也逐漸增長，當(dāng)達(dá)到2mM時，隨著底物濃度的
增加，酶增加率逐漸的降低。所以，底物濃度ABTS取2mM時，酶活力增長最快。所以，選用
2nM的ABTS.
5 HA濃度的影響
分別取10mM、 20mM、 30mM、 50mM H202 ，限定其它因素不變，在416nrn處連續(xù)性檢測，結(jié) 果如下
由上圖5可知HA濃度逐漸增加時，酶增長率也在逐漸增加，當(dāng)達(dá)到5mM時，再隨著HA 濃度的增加其酶增長率呈下降趨勢。所以，選用酶活力增加最快時的濃度，應(yīng)為5 mM。 6溫度的影響
分別設(shè)定3個溫度0t:、室溫(251C)、 37t:，來探討溫度對該酶的影響，如下
由圖6可知在所選定的溫度下，隨著溫度的升高，酶活力增長率也逐漸升高。結(jié)合本實(shí) 驗(yàn)的目的，室溫下能夠很好的控制，所以，選定室溫下進(jìn)行檢測。 7酶活力與酶增長率之間的關(guān)系
分別取0.23125u、 0.4625u、 0.925u、 1.85u的酶標(biāo)準(zhǔn)液，在416nm利用動力學(xué)曲線檢測， 前120s所成生的曲線是
本實(shí)驗(yàn)選定這四種不同的酶濃度如圖7,發(fā)現(xiàn)酶單位與酶增長率成很好的線性關(guān)系，相關(guān) 系數(shù)達(dá)到了99%。說明當(dāng)酶濃度小于0.23125u時，吸光度值都基本小于了 0.1;而當(dāng)酶濃 度大于1.85u時，吸光度值部分大于了 3，超過了動力學(xué)曲線所描述的范圍。因此，選用這
四種不同的酶濃度。 8準(zhǔn)確度
分別對0.23125u、 0.4625u、 0.925u、 1.85u的酶標(biāo)準(zhǔn)液所檢測的實(shí)測值與理論值比較，求 得誤差百分率。誤差％= I實(shí)測值一理論值I +理論值。
酶濃度 實(shí)測值 理論值l實(shí)測值一理 誤差％
_論值I_
0.23125 0.226432 0.23125 0.00482 2.0挑
0.4625 0.485212 0.4625 0.022712 4.91%
0.925 0.862599 0.925 0.0624 6.75%
1.851.940848 1.850.090848 4.91%
由圖表可知所測得誤差在允許范圍內(nèi)，達(dá)到了實(shí)際應(yīng)用的要求。 9批內(nèi)變異系數(shù)
用同一批次的試劑溶液、同一實(shí)驗(yàn)條件，對同樣的樣品重復(fù)測定10次，讀取酶增長率。
求其變異系數(shù)。
標(biāo)
號
123456789
平
標(biāo) 變
10 準(zhǔn)異
均
^ 偏系 值
差數(shù)
酵0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0,0 0.0
0.0
增075 072 077 081 075 070 081 078 074 071 0.0 4.8
003
長 075 6%
67
J_
由上圖可知批內(nèi)變異系數(shù)為4.86%,在允許范圍內(nèi)。 IO批間變異系數(shù)
同一樣品溶液，采用同一實(shí)驗(yàn)條件下，但是在不同的工作日對其檢測，如下所示:
標(biāo)
號
10 平均
酶 增 長 率
0.0048 0.004 0.0046 0.0043 0.0043 0.0044 0.0042 0.0041 0.0041 0.0044 0.004
現(xiàn)對其試驗(yàn)步驟總結(jié)如下
試驗(yàn)步驟(在探索出的最佳條件下檢測)
1. 取兩個比色杯，各為對照管和測試管，各加入0.1mM、 pH-5.5的磷酸鹽緩沖液2.2mL
2. 各加入的2mM的ABTS溶液0. 7mL
:!.各管中加入5mM的HA溶液0.1inL。顛倒混勻，放置于比色槽中。
4. 對照管中加入0. 2raM的磷酸氫二鉀溶液0. 05mL，測試管中加入0. 05mL的樣品
5. 混勻后，在室溫下,立即用分光光度計(jì)在416nm處采用動力學(xué)曲線模式，取前120s進(jìn)行 連續(xù)性檢測。輸出打印，每檢測一次就得到一條近似直線的曲線，根據(jù)斜率的多少可以 計(jì)算酶活力。
當(dāng)在限定的時間內(nèi)對樣品檢測時，對照管可以重復(fù)利用，僅做測試管。測試管可以一個批 次內(nèi)做很多管，這樣可以縮短試驗(yàn)過程；但不能太多，因?yàn)殚L時間內(nèi)過氧化氨會見光分 解。試驗(yàn)過程因人而異。
權(quán)利要求
1. 一種檢測乳品中過氧化物酶(LPO)的方法，包括下列步驟1)取兩個比色杯，各為對照管和測試管，各加入2.2mL的磷酸鹽緩沖液調(diào)整PH＝5-6；2)各加入0.5-4mM的ABTS溶液0.7mL；3)各管中加入1-30mM的H2O20.1mL。顛倒混勻，放置于比色槽中；4)對照管中加入0.2mM的磷酸氫二鉀溶液0.05mL，測試管中加入0.05mL的樣品；5)混勻后，在室溫下，立即用分光光度計(jì)在416nm處采用動力學(xué)曲線模式，空白管調(diào)零后，取前120s進(jìn)行連續(xù)性檢測。輸出打印，每檢測一次就得到一條近似直線的曲線，計(jì)算該條近似直線的斜率y，由x＝256.4y+0.0256 計(jì)算酶活力x。
2、 如權(quán)利要求1所述的檢測乳品中過氧化物酶(LPO)的方法，其特征在于1)中調(diào)整PH =5.5。
3、 如權(quán)利要求2所述的檢測乳品中過氧化物酶(LPO)的方法，其特征在于2)中各加入 2mM的ABTS溶液0. 7mL。
4、 如權(quán)利要求3所述的檢測乳品中過氧化物酶(LPO)的方法，其特征在于3)中各管中加 入5mM的HAO. lmL。
5、 如權(quán)利要求1所述的檢測乳品中過氧化物酶(LPO)的方法，其特征在于碳酸鹽緩沖液 代替磷酸鹽緩沖液，相應(yīng)的空白管加入碳酸氫鈉溶液。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種較高靈敏度，誤差小，簡易、快速的檢測乳過氧化物酶的方法。一種檢測乳品中過氧化物酶(LPO)的方法，包括下列步驟1)取兩個比色杯，各為對照管和測試管，各加入2.2ml的磷酸鹽緩沖液調(diào)整pH＝5-6；2)各加入0.5-4mm的ABTS溶液0.7ml；3)各管中加入1-30mm的H₂O₂0.1ml。顛倒混勻，放置于比色槽中；4)對照管中加入0.2mm的磷酸氫二鉀溶液0.05ml，測試管中加入0.05ml的樣品；5)混勻后，在室溫下，立即用分光光度計(jì)在416nm處采用動力學(xué)曲線模式，空白管調(diào)零后，取前120s進(jìn)行連續(xù)性檢測。輸出打印，每檢測一次就得到一條近似直線的曲線，計(jì)算該條近似直線的斜率y，由x＝256.4y+0.0256計(jì)算酶活力x。采用ABTS法試劑成本較低適用于推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/28GK101210264SQ200610128488
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者楊國宇, 韓立強(qiáng) 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)