專利名稱：人參液泡膜水孔蛋白基因、其編碼的氨基酸序列和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種人參液泡膜水孔蛋白基因、其編碼的氨基酸序列以及該基因用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自Maurel等1993年(Maurel等，EMBO J.，122241-2247，1993)首次報導了液泡膜內(nèi)在蛋白行使水通道的功能后，許多植物水孔蛋白相繼被發(fā)現(xiàn)。目前，對植物水孔蛋白研究得比較詳盡的是擬南芥和玉米。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了35個水孔蛋白同源基因，在玉米中31個水孔蛋白基因也先后被報道(Chaumont等，Plant Physiol，1251206-1215，2001)。根據(jù)在細胞中的定位，植物水孔蛋白主要分為質(zhì)膜水孔蛋白(PIPs)和液泡膜水孔蛋白(TIPs)。水孔蛋白從結(jié)構(gòu)上共有6個跨膜的α-螺旋，在跨膜區(qū)之間形成了5個環(huán)(A、B、C、D、E)，N端和C端都在膜內(nèi)側(cè)，其中在B環(huán)和E環(huán)各有一個非常保守的NPA(天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸)區(qū)域，兩個NPA區(qū)域折入膜內(nèi)并交叉重疊形成了狹窄的“漏斗”形的水通道(Jung等，J Biol Chem，26914648-14654，1994)。Jauh等利用激光共聚焦技術(shù)發(fā)現(xiàn)擬南芥不同類型的液泡所含的TIP是不同的，如貯藏色素和受環(huán)境響應(yīng)的液泡膜主要存在δ-TIP或δ-TIP和γ-TIP；蛋白貯藏型液泡膜主要存在α-TIP和δ-TIP或α-TIP、δ-TIP和γ-TIP；而含有許多蛋白水解酶的水解型液泡膜上僅單獨存在γ-TIP(Jauh等，Plant Cell，111867-1882，1999)。
細胞生長與水分的跨膜運輸是密切相關(guān)的，現(xiàn)已有一些報道初步證明了水孔蛋白與植物細胞和植株的生長有關(guān)。Ludevid等報道了擬南芥根和胚軸的γ-TIP的表達與其細胞的膨大同步(Ludevid等，Plant physiol，1001633-1639，1992)。后來的研究又表明，擬南芥根和胚軸中的PIP1b(AthH2)基因主要在正在伸長的細胞中表達，這樣的細胞具有較高的水導度有利于細胞與細胞間的水分供應(yīng)(Kaldenhoff等，Plant J，787-95，1995；Maurel，Annu.Rev.Plant.Physiol.Plant Mol.Biol，48399-429，1997)。番茄的果實成熟相關(guān)膜蛋白(TRAMP)被認為是一個功能性的水孔蛋白，轉(zhuǎn)TRAMP反義基因的番茄果實的TRAMP表達量下降了94％，不過轉(zhuǎn)基因番茄并沒有表現(xiàn)與水分相關(guān)表型的明顯差異，但其成熟果實有機酸和糖分的積累卻有所改變。轉(zhuǎn)TRAMP反義基因的番茄果實在成熟過程中，L-馬來酸和檸檬酸顯著提高而D[+]-葡萄糖和D[+]-果糖的含量卻下降，另外，他們的研究還表明，過量表達TRAMP的轉(zhuǎn)基因番茄的果實與對照相比并沒有差異(Chen等，Planta，212799-807，2001)。另外，有報導發(fā)現(xiàn)含羞草(Mimosapudica)的成熟運動細胞在受到外界刺激時細胞膨壓會發(fā)生變化，且含羞草在不成熟的葉枕細胞向成熟的運動器官轉(zhuǎn)變的過程中，γ-TIP的豐度提高了3倍(Fleurat-Lessard等，Plant Physiol，114827-834，1997)。這樣的結(jié)果可能意味著水分跨液泡膜運動在細胞運動中起重要作用?？傊?，由于水孔蛋白家族參與了植物生命活動的各個方面，目前為止人們對其在生命活動中角色的了解仍然是比較膚淺的。隨著研究手段的進步，越來越多的水孔蛋白及它們的生理功能會被人們發(fā)現(xiàn)和認識。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種全新的人參液泡膜水孔蛋白基因(PgTIP)。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種由所述人參液泡膜水孔蛋白基因編碼的蛋白PgTIP。
本發(fā)明的又一個目的在于提供一種所述液泡膜水孔蛋白基因用于轉(zhuǎn)化植物以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的用途。
通過采用抑制差減雜交法(SSH)篩選激素依賴型和非依賴型兩類人參細胞中的差異表達基因，本申請的發(fā)明人篩選到了一種在不含植物激素培養(yǎng)基上生長的人參細胞中表達很強，而在含有植物激素的培養(yǎng)基上生長的人參細胞中不表達的差異表達基因，并在人參cDNA庫中克隆了它的全長cDNA。經(jīng)過測序表明，該基因具有SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)cDNA序列。該編碼區(qū)cDNA的長度為753bp，編碼的蛋白含有250個氨基酸。
對本發(fā)明的PgTIP基因的編碼區(qū)序列的進一步的研究證明，該基因所編碼的氨基酸序列具有水孔蛋白的功能，并且主要定位于液泡膜上，因而是一種液泡膜水孔蛋白基因。
本發(fā)明的人參液泡膜水孔蛋白基因所編碼的蛋白PgTIP具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
通過將本發(fā)明的人參液泡膜水孔蛋白基因轉(zhuǎn)入擬南芥中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥相比，其種子的大小和重量都產(chǎn)生了明顯的增加；進一步的研究發(fā)現(xiàn)，過表達PgTIP基因的擬南芥種子中脂肪酸的含量是野生型種子的1.85倍。因此，本發(fā)明的人參液泡膜水孔蛋白基因PgTIP適合用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，并且具有非常重要的意義。
雖然現(xiàn)有技術(shù)的文獻中有對于其他植物的液泡膜水孔蛋白基因的報道，但是它們的核苷酸序列與本發(fā)明的人參液泡膜水孔蛋白基因是有差異的，因此，本發(fā)明的人參液泡膜水孔蛋白基因(PgTIP)是本申請的發(fā)明人首次獨立克隆到的一種全新的液泡膜水孔蛋白基因。而且發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)有PgTIP的轉(zhuǎn)基因擬南芥，其種子的體積和重量都明顯增加，并且主要體現(xiàn)在脂肪酸總量的顯著增加，這也是沒有報道過的。


圖1為人參細胞系特異表達基因PgTIP的Northern分析結(jié)果示意圖，其中A為激素自養(yǎng)型人參細胞，B為激素依賴型人參細胞。
圖2為本發(fā)明的PgTIP的編碼區(qū)cDNA序列與煙草液泡膜水孔蛋白基因NtAQP1、水稻液泡膜水孔蛋白基因OsTIP、玉米液泡膜水孔蛋白基因ZmTIP、擬南芥液泡膜水孔蛋白基因AtTIP的同源性比較的示意圖。
圖3A為本發(fā)明的PgTIP與NtAQP1、OsTIP、ZmTIP、AtTIP的蛋白質(zhì)序列同源性比較的示意圖；圖3B顯示了PgTIP與NtAQP1、OsTIP、ZmTIP和AtTIP蛋白質(zhì)進化關(guān)系的分析。
圖4顯示了本發(fā)明的PgTIP在爪蟾卵母細胞中表達后引起卵母細胞水導度增加，其中水孔蛋白AQP2為陽性對照，H2O為陰性對照。
圖5顯示了本發(fā)明的PgTIP與綠色熒光蛋白(GFP)融合后在洋蔥表皮細胞中表達后作質(zhì)壁分離的示意圖，其中A～CpCAMBIA-mGFP對照；D～FpCAMBIA-PgTIP-mGFP融合質(zhì)粒。
圖6顯示了以轉(zhuǎn)PgTIP基因擬南芥的葉片為材料提取DNA作為PCR反應(yīng)的模板進行PCR反應(yīng)，并以PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果示意圖，其中A分子量Marker；B質(zhì)粒陽性對照；C轉(zhuǎn)PgTIP株系2(L2)；D轉(zhuǎn)PgTIP株系8(L8)；E轉(zhuǎn)PgTIP株系20(L20)；F野生型對照。
圖7A顯示了轉(zhuǎn)PgTIP基因擬南芥株系2與野生型擬南芥種子大小的比較；其中1～3為野生型擬南芥小苗，4～6為轉(zhuǎn)PgTIP株系2的小苗。
圖7B顯示了轉(zhuǎn)PgTIP基因擬南芥與野生型擬南芥種子萌發(fā)一周后根的長度比較。
圖8顯示了PgTIP基因擬南芥與野生型擬南芥種子大小的比較；L22號轉(zhuǎn)PgTIP基因株系的擬南芥種子；Wt野生型擬南芥種子。
具體實施例方式
通常情況下，植物外植體在植物激素的作用下誘發(fā)出愈傷組織細胞，這些愈傷組織細胞可以繼續(xù)在含有植物激素的培養(yǎng)基上繼代生長。而如果從培養(yǎng)基中去除外源植物激素，對很多種植物來說，細胞會出現(xiàn)停止生長的現(xiàn)象。
發(fā)明人通過對人參細胞進行長時間的不依賴外源植物激素的適應(yīng)性培養(yǎng)，獲得了在不含植物激素的培養(yǎng)基上逐漸恢復了生長能力的細胞系。為了認識這個人參細胞系在不含植物激素的培養(yǎng)基上恢復生長能力的原因，發(fā)明人進而開展克隆在這個細胞系中特異表達的基因，也就是相對于在含有植物激素的培養(yǎng)基上生長的人參細胞而言，是特有表達的基因。利用抑制差減雜交法(SSH)來篩選激素依賴型和非依賴型兩類細胞中的特異表達基因，并對其中一個在不含植物激素培養(yǎng)基上生長的人參細胞中表達很強，而在含有植物激素的培養(yǎng)基上生長的人參細胞中不表達的差異表達基因進行了系統(tǒng)研究，在人參cDNA庫中克隆了它的全長cDNA。經(jīng)過同源性比較發(fā)現(xiàn)，該基因與多種植物液泡膜水孔蛋白基因具有較高的同源性，是一種全新的人參液泡膜水孔蛋白基因。
在一個具體的實施例中，通過利用DNAStar軟件將該基因的序列與其它植物的液泡膜水孔蛋白基因的序列進行同源性比較發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的人參液泡膜水孔蛋白基因(PgTIP)與煙草NtAQP1的同源性為74.5％，與擬南芥AtTIP的同源性為71.6％，與水稻OsTIP的同源性為71.7％，與玉米ZmTIP的同源性為65.7％。進而對其序列的分析結(jié)果也顯示了它具有液泡膜水孔蛋白結(jié)構(gòu)的特征性序列。
在另一個具體的實施例中，發(fā)明人進一步以克隆的人參液泡膜水孔蛋白基因(PgTIP)用國際上公認的“爪蟾卵母細胞中體外表達法”進行功能鑒定，證明了其編碼的蛋白PgTIP具有水孔蛋白的功能。PgTIP與GFP(綠色熒光蛋白)融合后在洋蔥表皮中瞬時表達進行細胞內(nèi)定位分析表明，PgTIP主要定位于液泡膜上。
在另一個實施例中，將本發(fā)明的人參液泡膜水孔蛋白基因(PgTIP)轉(zhuǎn)入擬南芥中，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥相比，其種子的大小和重量都產(chǎn)生了明顯的增加。
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。
實施例1、激素自養(yǎng)型人參愈傷組織細胞的獲得人參(Panax Ginseng C.A.Meyer)愈傷組織細胞培養(yǎng)在0.8％瓊脂固化的67V培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中添加2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)1.5mg/l，NAA(α-萘乙酸)0.1mg/l，IAA(3-吲哚乙酸)1.0mg/l，KT(激動素)0.25mg/l(Veliky和Martin，Can.J.Microbiol.，16223-226，1970；朱蔚華等，藥學學報，14541-547，1979；李新蘭和朱蔚華，中藥材，16(6)3-4，1993)。培養(yǎng)條件為25℃，暗培養(yǎng)；每28天按1g的接種量轉(zhuǎn)接傳代。將添加了上述四種外源植物激素培養(yǎng)的人參細胞轉(zhuǎn)接至去激素的培養(yǎng)基上，挑選能夠在其上生長存活的細胞進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與依賴外源激素的細胞系相同，通過不斷篩選獲得激素自養(yǎng)型人參愈傷組織細胞系。
實施例2、激素自養(yǎng)型人參細胞系特異表達的液泡膜水孔蛋白cDNA序列的獲得分別取激素依賴型和自養(yǎng)型人參細胞，以LiCl沉淀法提取兩類細胞的總RNA(王關(guān)林和方宏筠，植物基因工程原理與技術(shù)，1998)，并按照Qiagen polyA+RNAPurification Kit說明書進行mRNA的分離純化。通過抑制差減雜交法(SSH)篩選兩類細胞中的特異表達基因，得到正向差減雜交cDNA和反向差減cDNA的PCR擴增產(chǎn)物，具體操作依ClontechPCR-SelectTMcDNA Subtractive Kit說明書進行。
對通過SSH獲得的正向差減和反向差減cDNA群體的PCR擴增產(chǎn)物以常規(guī)T/A克隆法構(gòu)建差減cDNA文庫。以雜交的方法對差減文庫進行差示篩選，具體操作如下分別取正向差減雜交cDNA和反向差減雜交cDNA的PCR擴增產(chǎn)物40μl(含400～1600ng cDNA)，以PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海華舜生物公司)回收后用Rsa I、Sma I和Eae I酶切消化去除cDNA分子兩端的接頭，PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物作為差示篩選備用探針。探針標記采用隨機引物DNA標記系統(tǒng)(Takana，Japan)。
在第一輪差示篩選中，將正向和反向差減文庫所有克隆的插入片段的PCR產(chǎn)物10倍稀釋后用Biomek2000HDRT自動點樣裝置(Beckman)點印于尼龍膜上，變性后80℃烘干，保存在干燥器中備用(注將兩組PCR產(chǎn)物分別點在同一張膜的左右兩個半邊，制備兩套重復拷貝膜)。取約300ng正向或反向差減cDNA群體標記探針，分別用來雜交同一張點有兩組PCR產(chǎn)物的膜。
在第二輪差示篩選中，取正向cDNA文庫中第一輪篩選為陽性的克隆，分別抽提質(zhì)粒，操作依分子克隆實驗指南進行(Sambrook等，1998)，百倍稀釋后點印于尼龍膜上，用300ng正向或反向差減cDNA群體標記探針，分別用來雜交同一張點有正向庫質(zhì)粒的兩套重復膜。雜交、洗膜條件參見文獻(Sambrook等，1998，分子克隆實驗指南)。
對通過SSH獲得并經(jīng)差示篩選驗證為陽性的cDNA克隆進行Northern雜交分析以進一步確定差異表達基因取抽提的去激素和添加激素培養(yǎng)人參細胞總RNA各30μg，甲醛凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。隨機挑取10個在差示篩選中表現(xiàn)陽性的cDNA，用放射性同位素標記探針進行Northern雜交，具體操作按文獻(Sambrook等，1998，分子克隆實驗指南)進行。Northern分析的結(jié)果如圖1所示，其中A為激素自養(yǎng)型人參細胞，B為激素依賴型人參細胞。由圖1的結(jié)果可見，通過上述步驟篩選得到的基因在轉(zhuǎn)錄水平上是激素自養(yǎng)型人參細胞系中特異表達的。
對Northern雜交顯示為陽性的cDNA采用自動測序法測序，測序結(jié)果表明上述篩選得到的基因的編碼區(qū)序列如SEQ ID NO1所示，該編碼區(qū)cDNA的長度為753bp，編碼的蛋白含有250個氨基酸，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
用BLAST軟件搜索，將SEQ ID NO1所示的本發(fā)明的基因的編碼區(qū)cDNA序列及其編碼的SEQ ID NO2所示的氨基酸序列與GenBank中的序列進行同源性比較，比較結(jié)果如圖2和圖3所示。
圖2顯示了本發(fā)明的基因的編碼區(qū)cDNA序列與GenBank中同源序列的比較結(jié)果，該結(jié)果顯示本發(fā)明的基因與煙草NtAQP1的同源性為74.5％，與擬南芥AtTIP的同源性為71.6％，與水稻OsTIP的同源性為71.7％，與玉米ZmTIP的同源性為65.7％。
圖3A(利用DNAStar軟件進行分析)顯示了本發(fā)明的基因的編碼區(qū)cDNA序列所編碼的蛋白與NtAQP1、OsTIP、ZmTIP、AtTIP的蛋白質(zhì)序列同源性比較結(jié)果，該結(jié)果顯示本發(fā)明的基因編碼的蛋白具有水孔蛋白的特征性NPA區(qū)域，圖中A～F標明了6個跨膜區(qū)。
圖3B為本發(fā)明的蛋白與NtAQP1、OsTIP、ZmTIP和AtTIP蛋白質(zhì)進化關(guān)系的分析。由圖3B的結(jié)果可見PgTIP在遺傳進化上與NtAQP1、OsTIP、ZmTIP和AtTIP的距離由近及遠依次為NtAQP1、OsTIP、AtTIP、ZmTIP。
以上的結(jié)果表明，本發(fā)明所篩選得到的基因為一種新的人參水孔蛋白基因。
實施例3、PgTIP在爪蟾卵母細胞中體外表達進行功能鑒定在PgTIP cDNA兩端引入BglII酶切位點后將上述本發(fā)明的基因的編碼區(qū)cDNA用BglII酶切，連接到以相同酶切回收的爪蟾卵母細胞表達載體pXBG-evl(Li L等，Plant Sci.154(1)43-51，2000)。用In Vitro Transcription Kit(Boehringer Mannheim)進行體外轉(zhuǎn)錄得到PgTIP的mRNA，具體操作見產(chǎn)品說明書，以DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水溶解稀釋至1μgmRNA/μl用于微注射。
爪蟾用碎冰冷凍失去知覺后，在下腹部開一約1cm的小口，用鑷子取出足量的卵母細胞置于含2mg/ml膠原酶(Collagenase 1A，Sigma)的Bath溶液(含88mmol/L NaCl，1mmol/L KCl，0.82mmol/L MgSO4，0.41mmol/L CaCl2，0.33mmol/L Ca(NO3)2，2.4mmol/LNaHCO3，10mmol/L HEPES，pH7.4，200mOsm/kg水，氨卞青霉素10μgml，鏈霉素10μg/ml)中，20℃下酶解約2～4h以去除卵母細胞外的濾泡膜，然后用Bath溶液清洗3～4次后用于微注射。
按照顯微注射儀(WPI，USA)的操作步驟，用毛細管針頭取3μl待注射的mRNA注射入卵母細胞中，每個細胞的注射劑量相同(每個細胞40ng/40nl)，每組注射至少50個卵母細胞。隨后將卵母細胞置于20℃下保溫，約48～72h后轉(zhuǎn)入1/5的Bath溶液中，立即于攝影顯微鏡下拍照，每10sec攝一次，每組測定100sec。同樣實驗重復至少三次。攝影照片用LabWork軟件(Ultra-Violet Products Ltd.，UV P，Inc.)處理以獲得卵母細胞的體積大小。以照片拍攝時間與卵母細胞體積作曲線圖，根據(jù)曲線公式獲得卵母細胞的初始膨脹率[d(V/V0)/dt]并將數(shù)據(jù)代入下列公式計算細胞的水導度(Pf)Pf＝V0[d(V/V0)/dt]/[S×Vw×(OSMin-OSMout)]V0初始細胞體積；S初始細胞表面積；Vw水分子的偏摩爾體積(18cm3/mol)；V細胞膨脹后的體積；OSMin細胞內(nèi)滲透勢(200mOsm/kg水)；OSMout細胞外滲透勢(40mOsm/kg水)。
結(jié)果如圖4所示，可見本發(fā)明的水孔蛋白基因在爪蟾卵母細胞中表達后引起卵母細胞透水性增強，水導度比陽性對照水孔蛋白AQP2增加了約1.35倍(H2O為陰性對照)，證明了本發(fā)明的基因所編碼的蛋白確實具有水孔蛋白的功能。
實施例4、PgTIP與GFP融合后在洋蔥表皮中瞬時表達進行細胞內(nèi)定位分析綠色熒光蛋白(GFP)基因從發(fā)光水母成功分離后，是近年來新興的一種報告分子。該蛋白具有熒光強度高、不需要底物(或輔助因子)、無種屬特異性、相對分子量小、易與其它蛋白融合、對細胞無傷害、易于檢測、可在活細胞實時觀察等特點。因GFP分子量相對較小，僅有27KD左右，它能與多種不同的蛋白質(zhì)N端或C端融合而保持其天然蛋白的特性，因此是一種直觀性很強的遺傳標記物，通過與某單一序列的融合，可特異地進行線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器的定位，目前已經(jīng)在現(xiàn)代生物學的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。構(gòu)建含編碼PgTIP-GFP融合蛋白序列的pCAMBIA-PgTIP-mGFP融合質(zhì)粒載體(Kai P. Hfig等，Planta 217(6)858-67，2003)。DNA的金粉包埋按照Biolistic PDS-1000/HeParticle Delivery System的方法(安千里等，植物學報43，6558-564，2001)，具體如下取金粉懸液50μl(60g/l)，依次加入5μl質(zhì)粒DNA(1μg/μl)，50μl 2.5M CaCl2和20μl 0.1M亞精胺；振蕩3分鐘，10000rpm離心10～20秒，棄上清；加250μl無水乙醇，振蕩重懸，10000rpm離心10～20秒，棄上清；用60μl無水乙醇定容；取10μl點于微粒載膜中央，使其平鋪，晾至完全干燥。
采用PDS-1000/He基因槍(Bio-Rad)進行轟擊，樣品室真空度26Pa，壓力1300psi，洋蔥(約1cm×1cm的小塊)放在0.8％瓊脂固化的MS培養(yǎng)基上，至可裂膜距離為6cm，轉(zhuǎn)化后繼續(xù)培養(yǎng)16-24h，制片，于ZEISS激光共聚焦熒光顯微鏡(LSM 510META，Germany)下觀察細胞中的綠色熒光。結(jié)果如圖5所示，其中A～C為pCAMBIA-mGFP對照；D～F為pCAMBIA-PgTIP-mGFP融合質(zhì)粒轟擊洋蔥表皮細胞并做質(zhì)壁分離后在激光共聚焦顯微鏡下觀察到的結(jié)果，由圖5可以看到本發(fā)明的水孔蛋白基因主要定位于液泡膜上，證明本發(fā)明篩選得到的基因為人參液泡膜水孔蛋白基因PgTIP。
實施例5、將PgTIP基因轉(zhuǎn)入擬南芥后對PgTIP生理功能的初步研究在PgTIP cDNA的翻譯起始密碼前和終止密碼后分別引入HindIII和XbaI酶切位點，而后將本發(fā)明的基因PgTIP的編碼區(qū)cDNA用HindIII和Xba I酶切，連接到以相同酶切后回收的pHB質(zhì)粒載體(中科院上海植物生理生態(tài)研究所楊洪全研究員構(gòu)建，具體方法如下將PCR擴增的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II片段插入質(zhì)粒pCAMBIA3301(CAMBIA，Australia)的NcoI和BstEII酶切位點之間，取代其上的β-葡萄糖醛酸酶cDNA片段。然后將兩個CaMV 35S啟動子及多克隆位點(MCS)和多聚腺嘌呤(polyA)插入pCAMBIA3301的EcoRI和HindIII酶切位點構(gòu)建成pHB質(zhì)粒載體)，構(gòu)建成pgTIP基因的重組表達質(zhì)粒。
野生型擬南芥種子播種在蛭石∶草炭土∶珍珠巖(7∶2∶1)的混合土壤中，光照16h/d，溫度23℃日/18℃夜條件下生長，并按照Clough和Bent(Clough和Bent，Plant J.，16735-743，1998)的方法進行根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)PgTIP基因的擬南芥種子在含有50mg/l潮霉素的MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，Physiol Plant 15473-497，1962)上萌發(fā)，篩選具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)基因小苗，轉(zhuǎn)入土壤與野生型擬南芥在相同條件下培養(yǎng)。以轉(zhuǎn)基因植株的葉片為材料提取DNA作為PCR反應(yīng)的模板進行分子檢測(王關(guān)林和方宏筠，植物基因工程原理與技術(shù)，1998)，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖6所示，其中A分子量Marker；B質(zhì)粒陽性對照；C轉(zhuǎn)PgTIP株系2(L2)；D轉(zhuǎn)PgTIP株系8(L8)；E轉(zhuǎn)PgTIP株系20(L20)；F野生型對照。PCR反應(yīng)為陽性的株系L2、L8和L20為陽性轉(zhuǎn)PgTIP擬南芥株系。
以2、8、20三個株系為例分別對轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥種子的體積和重量進行比較，結(jié)果如圖8和以下表1所示，可見轉(zhuǎn)PgTIP后種子的體積和重量都明顯增加(是野生型對照的1.5-2倍)。將種子萌發(fā)于含MS培養(yǎng)基的垂直平板上，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)PgTIP基因的擬南芥小苗根的長度明顯比野生型擬南芥小苗長，見于圖7A和7B。
表1、轉(zhuǎn)PgTIP株系2，8，20的種子大小、重量與野生型種子的比較

為了進一步分析轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的變化，比較了野生型和過表達PgTIP擬南芥2號株系(L2)成熟的干種子內(nèi)脂肪酸和糖類的含量，種子內(nèi)脂肪酸和糖類的提取分析參照Fiehn等(Nature Biotechnol，2000，181157-1161)的方法，具體操作簡述如下分別稱取0.33g野生型和L2轉(zhuǎn)PgTIP擬南芥的成熟干種子，于液氮中研磨成粉，迅速移入2ml離心管中，加入1.4ml甲醇，終止酶活；加入50μl核糖醇儲存液(0.2mg核糖醇/1ml水)和50μl十九酸甲酯儲存液(2mg十九酸甲酯/1ml氯仿)；加入50μl水，混勻，測pH(約5-6)；70℃振蕩15min；14,000g離心3min；上清移入6ml玻璃瓶，沉淀加入1ml氯仿，37℃振蕩5min，14,000g離心3min，合并上清；加入1.4ml純水和1ml氯仿，振蕩混勻，4,000rpm離心15min。
取脂相100μl，加1ml甲醇/硫酸(97∶3)，100℃甲酯化反應(yīng)4h；加入4ml水，振蕩，4,000rpm離心，棄去水相；加無水硫酸鈉干燥過夜；用氮吹儀濃縮至約80μl；加10μl吡啶和10μl MSTFA，37℃放置30min后取2μl進GC/MS(6890N GC System/5973MSSelective Detector)檢測。
取極性相500μl于1.5ml離心管中，在LNG-T98冷凍濃縮離心干燥器中干燥過夜；在干燥碎片中加25μl甲氧胺酸鹽(20mg/ml吡啶)，搖晃共培90min；加40μl MSTFA，37℃放置30min后轉(zhuǎn)入25℃放置2h；取2μl進GC/MS檢測。
測定結(jié)果顯示，L2株系的種子中多糖含量在轉(zhuǎn)基因后沒有明顯變化，但脂肪酸含量卻達到了野生型擬南芥種子的1.85倍(表2)。
表2、野生型和過表達PgTIP擬南芥種子中脂肪酸總量和組成成分的比較

以上結(jié)果表明，利用本發(fā)明的人參液泡膜水孔蛋白基因生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物與野生型相比具有非常明顯的優(yōu)勢，種子中的脂肪酸含量得到大幅提高，因此用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物具有非常重要的應(yīng)用前景。
雖然以上僅以擬南芥為例驗證了本發(fā)明的人參液泡膜水孔蛋白基因的功能及其用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的效果，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通常本技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)手段將其轉(zhuǎn)入其它植物，例如大豆、油菜、煙草、水稻和玉米等，同樣可以獲得類似的效果。這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的，因此同樣應(yīng)當屬于本發(fā)明的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>人參液泡膜水孔蛋白基因、其編碼的氨基酸序列和應(yīng)用<130>061226N<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>753<212>cDNA<213>Panax ginseng<220>
<221>exon<222>(1)..(753)<400>1atg ccg att cac gaa att gcc gtc ggt agg tac gag gag ttc cgc cac48Met Pro Ile His Glu Ile Ala Val Gly Arg Tyr Glu Glu Phe Arg His1 5 10 15ccg ggt gcc ctt aag gcc gcg gcg gca gag ttc ttc agt acc ctc att96Pro Gly Ala Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Phe Phe Ser Thr Leu Ile20 25 30ttt gtt ttt gcc ggc caa ggc tca ggc ttg gca ttt agc aag ctc act144Phe Val Phe Ala Gly Gln Gly Ser Gly Leu Ala Phe Ser Lys Leu Thr35 40 45gac ggc ggt gcc act act ccg tct ggc ctt gtc tcc gct gcg ttg gcc192Asp Gly Gly Ala Thr Thr Pro Ser Gly Leu Val Ser Ala Ala Leu Ala50 55 60
cac gca ttc ggg ttg ttt gtg gca gtc tct gtc gga gcc aac atc tcc240His Ala Phe Gly Leu Phe Val Ala Val Ser Val Gly Ala Asn Ile Ser65 70 75 80ggc ggc cat gtt aac cct gcc gtt aca ttc ggc gcc ttt atc ggt ggt288Gly Gly His Val Asn Pro Ala Val Thr Phe Gly Ala Phe Ile Gly Gly85 90 95aac ctt aca ctg atc agg gga att ttg tac att att gct cag ttg ctt336Asn Leu Thr Leu Ile Arg Gly Ile Leu Tyr Ile Ile Ala Gln Leu Leu100 105 110ggc tca act gtt gct tgc ctt ctc ctt agt ttc gca act ggt gga tcg384Gly Ser Thr Val Ala Cys Leu Leu Leu Ser Phe Ala Thr Gly Gly Ser115 120 125cca att tcg gca ttc gct ttg tcc gga gta tcg gtg tgg agc gcc ttt432Pro Ile Ser Ala Phe Ala Leu Ser Gly Val Ser Val Trp Ser Ala Phe130 135 140gtg ttc gag att gtc atg acc ttt ggg ctg gtt tac acc gtt tac gca480Val Phe Glu Ile Val Met Thr Phe Gly Leu Val Tyr Thr Val Tyr Ala145 150155 160acc gcc atc gac cca aag aag gga gaa ctg ggc ata att gca ccc att528Thr Ala Ile Asp Pro Lys Lys Gly Glu Leu Gly Ile Ile Ala Pro Ile165 170 175gca att ggg ttg att gtg gga gct aac att ctt gct ggt ggt gcc ttc576Ala Ile Gly Leu Ile Val Gly Ala Asn Ile Leu Ala Gly Gly Ala Phe180 185 190acc ggg gca tca atg aac cca gct gtt tca ttt ggc cca gct ttg gtc624Thr Gly Ala Ser Met Asn Pro Ala Val Ser Phe Gly Pro Ala Leu Val
195 200 205agc tgg gac tgg acc aac cac tgg gtg tac tgg gcc ggc cct att gtt672Ser Trp Asp Trp Thr Asn His Trp Val Tyr Trp Ala Gly Pro Ile Val210 215 220ggt ggt ggg gtt gct gca gtt gtc tac gag ctc atc ttc atc agc agc720Gly Gly Gly Val Ala Ala Val Val Tyr Glu Leu Ile Phe Ile Ser Ser225 230 235 240agt cac gag cca ttg cct gtc gct gat tac tag753Ser His Glu Pro Leu Pro Val Ala Asp Tyr245 250<210>2<211>250<212>PRT<213>Panax ginseng<220>
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權(quán)利要求
1.一種人參液泡膜水孔蛋白基因，其特征在于，該基因編碼具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的人參液泡膜水孔蛋白基因，其特征在于，該基因具有SEQ IDNO1所示的編碼區(qū)cDNA序列。
3.一種人參液泡膜水孔蛋白，其特征在于，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1或2所述的人參液泡膜水孔蛋白基因用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，用于提高植物種子中的脂肪酸含量。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物是通過將人參液泡膜水孔蛋白基因的編碼區(qū)cDNA序列與適當?shù)妮d體構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化植物而實現(xiàn)。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述人參液泡膜水孔蛋白基因的編碼區(qū)cDNA序列如SEQ ID NO1所示。
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述載體為pHB質(zhì)粒。
9.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化植物的方法為根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化。
10.如權(quán)利要求4～9中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物包括但不限于擬南芥、大豆、油菜、煙草、水稻和玉米。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人參液泡膜水孔蛋白基因、其編碼的氨基酸序列以及該基因用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。該基因編碼的蛋白具有水孔蛋白的功能，并且主要定位于液泡膜上。將該基因轉(zhuǎn)入植物后得到的轉(zhuǎn)基因植物的種子明顯大于野生型植物的種子，種子中的脂肪酸含量也有很大的提高。
文檔編號C12N15/82GK1891828SQ200610087620
公開日2007年1月10日 申請日期2006年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日
發(fā)明者蔡偉明, 藺五玲 申請人:中國科學院上海生命科學研究院