專利名稱：一種甲烷氧化菌的保藏方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物的保藏方法，特別是涉及一種可以有效防止雜菌污染的甲烷氧化菌的保藏方法。
背景技術(shù)：
甲烷氧化菌是自然界中一類非常特殊的微生物，它以甲烷為唯一的碳源及能源。雖然某些甲烷氧化菌也可以同時利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能利用多碳化合物。研究表明甲烷氧化菌可以廣泛地應(yīng)用于以甲烷為原料的化工產(chǎn)品(天然氣或沼氣等)的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中，也可以應(yīng)用于環(huán)境中有機污染物的治理，甚至可以用來有效地預(yù)防煤礦中的瓦斯氣體爆炸。目前，該菌種沒有特殊的保存方法，一般只是像其它微生物一樣加入甘油后于-70℃冷凍保存。因為甘油在后續(xù)的操作中被很難完全除去，而甲烷氧化菌的生長速度又遠遠慢于其它雜菌，因此，雜菌就利用其中的甘油作為碳源大量生長，引起雜菌污染。另一種保藏方法是將甲烷氧化菌菌種保存于含有甲烷的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)起來后再接種到另一平板上，如此不停。該方法雖然可以避免雜菌污染且能使甲烷氧化保持較高的活性，但費時費力，實施起來很不方便。
因此迫切需要一種簡便，且可以有效防止雜菌污染的甲烷氧化菌的保藏方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單，且可以有效防止雜菌污染的甲烷氧化菌的保藏方法。
本發(fā)明所提供的甲烷氧化菌的保藏方法，是收集甲烷氧化菌菌體，將其與經(jīng)滅菌的石蠟油混勻后，在-4℃～-90℃下保存。
在上述保藏方法中，所述甲烷氧化菌與石蠟油混合物的OD600值為0.3-1.5。
所述石蠟油的滅菌條件可為在121℃下加熱15-25分鐘。
可用于保存甲烷氧化菌的容器是多種多樣的，任何經(jīng)滅菌且耐低溫的容器均可，如容積為200微升～500毫升的塑料容器，優(yōu)選為500微升～1.5毫升的塑料離心管。
上述保藏方法對經(jīng)液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的甲烷氧化菌同時適用。
需要使用時，只需將保藏的菌體連同石蠟油一同倒入培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可，因為石蠟油除可用于甲烷氧化菌的菌種保藏外，還具有促進該菌生長的作用。
本發(fā)明提供了一種甲烷氧化菌的保藏方法。該方法是用石蠟油代替甘油進行菌種保藏的方法。由于石蠟油不能被大多數(shù)雜菌作為碳源利用，因此該方法可以大大地降低雜菌的污染機會；此外，使用時只需將菌體及石蠟油的混合物直接添加入培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)即可，方便、快速。本發(fā)明將在甲烷氧化菌的保藏及其工業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所有百分比濃度均為質(zhì)量百分比濃度，所有培養(yǎng)基中的溶劑均為去離子水。
NMS培養(yǎng)基配方每升培養(yǎng)基中含有NaNO30.85克，KH2PO40.53克，Na2HPO42.17克，K2SO40.17克，MgSO4·7H2O 0.037克，CaCl2·2H2O 0.007克，微量元素貯存液2mL，lmmol/L H2SO40.5毫升，F(xiàn)eSO4·7H2O 11.2毫克，CuSO4·5H2O 2.5毫克(固體培養(yǎng)基再添加1.5％的瓊脂)，pH 7.0。
微量元素貯存液的配方為每升溶液中含有ZnSO4·7H2O 0.2042克，MnSO4·4H2O0.223g，H3BO30.062g，Na2MoO4·2H2O 0.048g，CoCl2·6H2O 0.048g，KI 0.083g。
實施例1、甲烷氧化菌的液體培養(yǎng)一、甲烷氧化菌單菌落的獲得用滅菌的接種環(huán)挑取甲烷氧化菌保存液(Methylosinus trichosporium)OB3b(Sullivan JP et al.Methanotrophs，Methylosinus trichosporium OB3b，sMMO，and their application to bioremediation，Crit.Rev.Microbiol.，1998，4(24)335-373；Takeguchi M et al.，Properties of the membranes containing theparticulate methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b，Biometals，1998，11229-234)，用劃線的方法將其接種于NMS平板固體培養(yǎng)基表面，每天用注射器通過0.2μ的過濾器向培養(yǎng)皿中加入5-10毫升的甲烷氣體，在30℃下培養(yǎng)四周后，平板上有明顯的菌落產(chǎn)生。
二、甲烷氧化菌的液體培養(yǎng)1)取50毫升的培養(yǎng)瓶，裝入NMS液體培養(yǎng)基10毫升，在121℃下滅菌20分鐘；2)挑取一個步驟一在平板上長出的甲烷氧化菌單菌落，將其接種到NMS液體培養(yǎng)基中，每天用注射器通過0.2μ的過濾器加入5-20毫升的甲烷氣體，在30℃、150rpm下振蕩培養(yǎng)四周，培養(yǎng)基的OD600值約為0.1-1.0后，即可用于保存。
實施例2、甲烷氧化菌在石蠟油中的保存將實施例1培養(yǎng)的甲烷氧化菌菌液1.5毫升倒入經(jīng)滅菌的1.5毫升離心管中，8000rpm離心10分鐘后，棄去上清，在超凈臺中或用無菌操作的方法將收集的菌體加入經(jīng)滅菌(121℃下加熱20分鐘)的500微升石蠟油中，在旋渦振蕩器上振蕩，使菌體在石蠟油中分散均勻，然后放入-20℃冰箱中保存。
實施例3、石蠟油保藏的甲烷氧化菌的使用取50毫升培養(yǎng)瓶，裝入NMS液體培養(yǎng)基10毫升，在121℃下滅菌20分鐘后，從冰箱中取一管用石蠟油保存90天的甲烷氧化菌，在超凈臺中將解凍的菌液全部倒入到NMS液體培養(yǎng)基中，每天用注射器通過0.2μ的過濾器加入5-20毫升的甲烷氣體，在30℃、150rpm下振蕩培養(yǎng)三天后，培養(yǎng)基呈現(xiàn)混濁狀，其OD600值約為0.1-0.3，甲烷氧化菌培養(yǎng)成功，表明用本發(fā)明方法對甲烷氧化菌進行保藏，可使菌體長期維持較高的生物活性。
權(quán)利要求
1.一種甲烷氧化菌的保藏方法，是收集甲烷氧化菌菌體，將其與經(jīng)滅菌的石蠟油混勻后，在-4℃～-90℃下保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保藏方法，其特征在于所述甲烷氧化菌與石蠟油混合物的OD600值為0.3-1.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的保藏方法，其特征在于所述石蠟油的滅菌條件為在121℃下加熱15-25分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甲烷氧化菌的保藏方法。該方法是收集甲烷氧化菌菌體，將其與經(jīng)滅菌的石蠟油混勻后，在－4℃～－90℃下保存。由于石蠟油不能被大多數(shù)雜菌作為碳源利用，因此該方法可以大大地降低雜菌的污染機會；此外，使用時只需將菌體及石蠟油的混合物直接添加入培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)即可。本發(fā)明將在甲烷氧化菌的保藏及其工業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N1/26GK1844368SQ200610074530
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月27日
發(fā)明者緱仲軒, 邢新會, 趙洪新, 吳昊, 韓冰, 江皓, 王磊 申請人:清華大學