專(zhuān)利名稱(chēng)：一種植物超氧化物歧化酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶的制備方法，尤其涉及一種植物超氧化物岐化酶的制備方法，屬 于生物化學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域。
,狄術(shù)
超氧化物岐化酶(superoxide， dismutase，簡(jiǎn)稱(chēng)SOD)是一種金屬酶，能夠
催化超氧陰離子自由基發(fā)生岐化反應(yīng)，消除超氧陰離芋自由基所引起的生物大分子過(guò)氧 化等細(xì)胞損傷，具有消炎祛病，保健美容的功效。目前SOD已廣泛被應(yīng)用于醫(yī)藥、保 健品、食品和日化等許多行業(yè)中。
現(xiàn)有的SOD制備主要以三種原料為主，第一，以動(dòng)物體組織或血為來(lái)源，第二， 以微生物為原料來(lái)源，第三，以植物為原料來(lái)源。 一般以動(dòng)物體組織或血為原料制備的 SOD存在著價(jià)格較貴，體內(nèi)半衰期短的缺點(diǎn)，再者，現(xiàn)在瘋牛病及禽流感的大范圍出現(xiàn)， 原料的質(zhì)量及安全性受到置疑，微生物主要利用其發(fā)酵來(lái)生物合成，由于微生物易受環(huán) 境因素的影響，所得SOD其回收率及活性得不到保證，由于這方面國(guó)內(nèi)研究時(shí)間較短， 未建立其相對(duì)應(yīng)完善統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，難以監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量。在《成都航空職業(yè)技術(shù)學(xué)院 學(xué)報(bào)》的2005年3月第1期中由金紹黑發(fā)表了《植物超氧化物岐化酶的提取、修飾制 備工藝劑其應(yīng)用研究》的文章，該文章公開(kāi)了熱變性沉淀法及鹽析和金屬鰲合親和層析 法來(lái)制備和提純超氧化物岐化酶，上述這些方法對(duì)原料中的病毒及有害細(xì)菌沒(méi)有有效的 措施加以抑制，制得SOD活性不高，且工藝中設(shè)備投入成本大，不適合大規(guī)模工業(yè)化 生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種衛(wèi)生、適合規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的植物超氧化物 岐化酶的制備方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為 一種植物超氧化物岐化酶的制備方 法，其特征在于包括如下步驟
(1) 將洗凈的豆粕、龍葵、白英、筋骨草、蛇莓分別粉碎、打漿；
(2) 合并步驟(1)中的打漿后的產(chǎn)物，添加重量3 4倍于合并后產(chǎn)物、質(zhì)量百分比為 0.5 2%的堿離子液，厭氧發(fā)酵1 12個(gè)月；
(3) 發(fā)酵完后，添加飽和緩沖液，直至pH值為7 8，厭氧靜置4 6小時(shí)；
(4) 添加氧化劑和萃取劑到發(fā)酵容器中，脫水沉淀，過(guò)濾，取濾液，添加脫水氧化 劑，在一10 0。C下，厭氧真空冷凍1 4小時(shí)，上述氧化劑添加的量為步驟(3)中溶液體 積的1 100%，上述萃取劑添加的量為步驟(3)中溶液體積的15 80%，上述脫水氧化 劑添加的量為步驟(3)中溶液體積的15 80%;
(5) 沉淀得到粗品酶，采用80 400目濾布抽濾，接著離心分離，取沉淀物，于一 30 0'C真空冷凍干燥8 72小時(shí)；
(6) 將重量40 60倍于步驟(5)中產(chǎn)物、質(zhì)量百分比為10 15%的還原糖培養(yǎng)基添 加到上述產(chǎn)物，再添加重量0.2 0.3倍于還原糖培養(yǎng)基、質(zhì)量百分比為1.5 3%的掩蔽 劑，在78 9(TC條件下溫浴，溫浴產(chǎn)物溫度至65 75。C，取出；
(7) 在10 20分鐘內(nèi)，冷卻至16 20。C，采用400 600目濾布抽濾；
(8) 取濾液，添加脫水氧化劑，厭氧靜置2 4小時(shí)，抽濾、離心分離，得到產(chǎn)物， 于一30 (TC真空機(jī)冷凍干燥24 72小時(shí)，再經(jīng)常溫真空器干燥24 72小時(shí)，即得超 氧化物岐化酶，上述脫水氧化劑添加的量為步驟(7)中抽濾后溶液體積的15 80%，
其中步驟(l)中各原料之間的質(zhì)量比為1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100。 進(jìn)一步提高所得酶的質(zhì)量及活性，所述步驟(l)中的原料還包括白花蛇舌草和半枝
蓮，且各物質(zhì)之間的質(zhì)量比為1 跳1 跳1 跳1 跳1 跳1 100: l
100。
進(jìn)一步提高所得酶的質(zhì)量及活性，所述步驟(l)中的原料還包括鴨跖草、萚草和魚(yú) 腥草，且各物質(zhì)之間的質(zhì)量比為1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1~100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100。
所述步驟(2)中的堿離子液采用氫氧化鈉溶液、氯化鉀溶液或氯化鈉溶液，步驟(3) 中的緩沖液采用檸檬酸、檸檬酸鈉、醋酸、醋酸鈉、磷酸二氫鉀或氯化鈉溶液，步驟(4) 中的氧化劑采用100%乙醇、質(zhì)量百分比為1 20%的氫氧化鈉溶液、質(zhì)量百分比為10~ 40%的雙氧水、質(zhì)量百分比為5 38%的鹽酸或質(zhì)量百分比為10 98%的硫酸，萃取劑 采用丙酮、二氯甲垸或三氯甲烷，步驟(4)中的脫水氧化劑采用乙醇、三氯甲烷、丙酮、 二氯甲烷或硫酸鈉溶液，步驟(6)中的還原糖培養(yǎng)基采用麥芽糖培養(yǎng)基或葡聚糖培養(yǎng)基， 步驟(6)中的掩蔽劑采用EDTA溶液、聚乙二醇或上述兩種的混合物，步驟(8)中的脫水 氧化劑采用100%乙醇、質(zhì)量百分比為1 20%的氫氧化鈉溶液、質(zhì)量百分比為10 40 %的雙氧水、質(zhì)量百分比為5 38%的鹽酸或質(zhì)量百分比為10 98%的硫酸。
為進(jìn)一步減少厭氧發(fā)酵時(shí)間和提高厭氧發(fā)酵效果，所述步驟(2)中厭氧發(fā)酵前添加 質(zhì)量百分比為20 100%的步驟(4)中過(guò)濾后的沉淀物。
作誘導(dǎo)激活劑使用，所述的步驟(6)中在溫浴之前添加步驟(6)中抽濾后的上層物質(zhì)， 且該上層物質(zhì)抽濾后添加前經(jīng)過(guò)一20~ — IO'C冷凍干燥，該上層物質(zhì)添加的量為步驟(I)
中產(chǎn)物合并后混合物質(zhì)量的10 50%。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于將具有解毒消腫抗癌功效的龍葵、白英、筋 骨草、蛇莓等廉價(jià)中草藥與含有大量金屬離子的豆粕配合，各取所長(zhǎng)，相互協(xié)同，經(jīng)過(guò)
厭氧發(fā)酵，制得衛(wèi)生無(wú)污染具有抑制病菌酶活性很高的SOD，直接可以服用或外涂，并
且具有良好的消炎效果，而且可根據(jù)具體的病癥，適當(dāng)?shù)靥砑悠渲幸环N或多種原料，針
對(duì)性地能提高療效；重復(fù)利用，反復(fù)發(fā)酵，同時(shí)誘導(dǎo)激活可大大提高產(chǎn)品質(zhì)量和縮短制 備時(shí)間；依照本發(fā)明制得的SOD，可以在常溫下保存，適合長(zhǎng)途運(yùn)輸，減少了保存和運(yùn) 輸費(fèi)用，本發(fā)明所用的各原料成本低廉，設(shè)備投入少，操作過(guò)程簡(jiǎn)單安全，工作人員易 學(xué)易會(huì)；由于工藝過(guò)程中產(chǎn)生吸附和抑制病菌的氣體，所以如果大規(guī)模生產(chǎn)本產(chǎn)品，可 改善當(dāng)?shù)氐目諝猸h(huán)境。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例工藝流程圖
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
實(shí)施例，參考圖1 ，本實(shí)施例中植物超氧化物岐化酶的制備方法，包括如下步驟-
(1) 將洗凈的100克豆粕、50克龍葵、50克白英、50克筋骨草、50克蛇莓白、50 克花蛇舌草、50克半枝蓮、50克鴨跖草、50克萚草和50克魚(yú)腥草分別粉碎、打漿；
(2) 合并步驟(1)中的打漿后的產(chǎn)物，添加重量3.5倍(一般控制在3 4倍)于合并后 產(chǎn)物、質(zhì)量百分比為1.5%(—般控制在0.5 2%)的堿離子液，本實(shí)施例采用氯化鈉溶液 作為堿離子液，厭氧發(fā)酵2個(gè)月,如果原料是干的，可以適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間,一般厭氧發(fā) 酵時(shí)間范圍控制在1 12月；
(3) 發(fā)酵完后，添加飽和緩沖液，本實(shí)施例采用檸檬酸溶液，直至pH為7左右，厭 氧靜置5小時(shí)(一般控制在4 6小時(shí))；
(4) 添加氧化劑和萃取劑到發(fā)酵容器中，脫水沉淀，虹吸上層清夜，過(guò)濾，取濾液， 合并清液和濾液，添加脫水氧化劑，于一5X:(—般控制在一10 (TC)厭氧真空冷凍2小 時(shí)(一般控制在1 4小時(shí)),上述氧化劑添加的量為步驟(3)中溶液體積的50%(—般控制在 1~100%)，本實(shí)施例采用質(zhì)量百分比為15% (—般控制在1 20%倍)的氫氧化鈉溶液， 萃取劑添加的量為步驟(3)中溶液體積的50%(—般控制在15 80%)，本實(shí)施例采用丙 酮，上述脫水氧化劑添加的量為步驟(3)中溶液體積的50%(—般控制在15 80%)，本 實(shí)施例采用乙醇；
(5) 沉淀得到粗品酶，采用300目(一般控制在80 400目)濾布抽濾，接著用3000 轉(zhuǎn)/分鐘，甩水機(jī)工作4分鐘，取沉淀物，于一1(TC(一般控制在一30 (TC)冷凍真空干 燥32小時(shí)(一般控制在8 72小時(shí))；
(6) 重量50倍(一般控制在40 60倍)于步驟(5)中產(chǎn)物、質(zhì)量百分比為12%(— 般控制在10 15%)的還原糖培養(yǎng)基添加到上述產(chǎn)物，再添加重量0.25倍(一般控制在 0.2 0.3倍)于還原糖培養(yǎng)基、質(zhì)量百分比為2%(—般控制在1.5 3%)的掩蔽劑(溫度 達(dá)到45。C時(shí)添加)，本實(shí)施例釆用EDTA溶液，在80。C (一般控制在78 90'C)條件下 溫浴，溫浴產(chǎn)物至溫度7(TC(—般控制在65 75°C)，取出；
(7) 在18分鐘內(nèi)(一般控制在16 20分鐘)，冷卻至18。C(一般控制在16 20°C)， 采用500目(一般控制在400 600目)濾布抽濾；
(8) 取濾液，添加脫水氧化劑到步驟(7)得到的濾液中，靜置3小時(shí)(一般控制在2 4小時(shí))，500目(一般控制在400 600目)濾布抽濾，用3000轉(zhuǎn)/分鐘，甩水機(jī)工作4分 鐘，取沉淀物，一2(TC冷凍真空機(jī)24小時(shí)(一般控制在24 72小時(shí))后，再經(jīng)常溫真空器 干燥48小時(shí)(一般控制在24 72小時(shí))，即得優(yōu)質(zhì)超氧化物岐化酶50克，上述脫水氧化 劑添加的量為步驟(7)中抽濾后溶液體積的50%(—般控制在15 80%)，本實(shí)施例采用 乙醇。
其中，本可根據(jù)具體的病癥，適當(dāng)?shù)靥砑悠渲幸环N或多種原料， 一般質(zhì)量比控制在 1 100。廉價(jià)的豆粕也可以用大豆或黃豆替代，其作用是一樣的。
步驟(2)中的堿離子液還可以采用氯化鉀或氯化鈉；步驟(3)中的緩沖液還可以采用 檸檬酸鈉、醋酸、醋酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉或氯化鈉溶液；步驟(4)中的氧化劑 還可以采用質(zhì)量百分比為10 40%的雙氧水、質(zhì)量百分比為5 38%鹽酸或質(zhì)量百分比 為10 98%硫酸等，萃取劑還可以采用二氯甲烷或三氯甲烷；步驟(4)中的脫水氧化劑 還可以采用丙酮、三氯甲烷、二氯甲垸或硫酸鈉溶液等；步驟(6)中的還原糖培養(yǎng)基可以 采用麥芽糖培養(yǎng)基或葡聚糖培養(yǎng)基，本實(shí)施例中采用麥芽糖培養(yǎng)基；步驟(6)中的掩蔽劑 還可以采用聚乙二醇或EDTA與乙二醇的混合物。
步驟(2)中厭氧發(fā)酵前可添加質(zhì)量百分比為20 100%的步驟(4)中過(guò)濾后的沉淀， 本實(shí)施例里添加50%的步驟(4)中過(guò)濾后的沉淀物(為上次發(fā)酵后的產(chǎn)物)，重復(fù)利用、 反復(fù)發(fā)酵。
作誘導(dǎo)激活劑使用，步驟(6)中在溫浴之前添加步驟(7)中抽濾后的上層物質(zhì)，添加 的量為步驟(l)中產(chǎn)物合并后混合物質(zhì)量的30%(—般控制在10 50%)且該上層物質(zhì)抽 濾后添加前經(jīng)過(guò)一2(TC冷凍干燥。
為進(jìn)一步節(jié)約輔助原料及提高發(fā)酵效果，步驟(5)和步驟(8)中抽濾回收的溶液分離 提取試劑后剩下的母液可添加到步驟2中的堿離子液中循環(huán)使用，
本實(shí)施例制得的SOD于2002年7月22日，經(jīng)上海市農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所檢驗(yàn)， 測(cè)得酶活性為3456U/mg，常溫下保存至2006年3月10日，再次測(cè)同一樣品，測(cè)得酶 活性為2589U/mg，存活力為75%，本工藝所用主要設(shè)備，如下721電子可見(jiàn)分光光 度機(jī)、冷柜、50升塑料桶(作為厭氧發(fā)酵罐)、真空抽濾裝置、蒸餾器、LG-5或LG-2
真空冷凍干燥機(jī)(由上海市離心機(jī)械研究所生產(chǎn))、離心機(jī)、甩水機(jī)和冷卻制冷設(shè)備。
根據(jù)本發(fā)明工藝制得的SOD具有良好的消炎作用，口服劑量為每次500/mg,每
12小時(shí)口服一次，可做成粉劑、水劑和膠囊，均可應(yīng)用與各種癬癥、便秘、多發(fā)性關(guān)節(jié) 炎、風(fēng)濕心肌痛、化膿性潰瘍、神經(jīng)腫痛和急、慢性腸胃炎，已經(jīng)有多個(gè)病例證明本發(fā) 明制得的SOD具有良好的消炎作用。
本實(shí)施例中的原料也可以采用以下五種制備豆粕、龍葵、白英、筋骨草和蛇莓， 其制得的SOD也具有良好的消炎作用，其他與實(shí)施例1相同。
本實(shí)施例中的原料也可以采用以下八種制備豆粕、龍葵、白英、筋骨草、蛇莓、 鴨跖草、萚草和魚(yú)腥草，其制得的SOD也具有良好的消炎作用，其他與實(shí)施例l相同。
權(quán)利要求
1、一種植物超氧化物岐化酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)將洗凈的豆粕、龍葵、白英、筋骨草、蛇莓分別粉碎、打漿；(2)合并步驟(1)中的打漿后的產(chǎn)物，添加重量3～4倍于合并后產(chǎn)物、質(zhì)量百分比為0.5～2％的堿離子液，厭氧發(fā)酵1～12個(gè)月；(3)發(fā)酵完后，添加飽和緩沖液，直至pH值為7～8，厭氧靜置4～6小時(shí)；(4)添加氧化劑和萃取劑到發(fā)酵容器中，脫水沉淀，過(guò)濾，取濾液，添加脫水氧化劑，在-10～0℃下，厭氧真空冷凍1～4小時(shí)，上述氧化劑添加的量為步驟(3)中溶液體積的1～100％，上述萃取劑添加的量為步驟(3)中溶液體積的15～80％，上述脫水氧化劑添加的量為步驟(3)中溶液體積的15～80％；(5)沉淀得到粗品酶，采用80～400目濾布抽濾，接著離心分離，取沉淀物，于-30～0℃真空冷凍干燥8～72小時(shí)；(6)將重量40～60倍于步驟(5)中產(chǎn)物、質(zhì)量百分比為10～15％的還原糖培養(yǎng)基添加到上述產(chǎn)物，再添加重量0.2～0.3倍于還原糖培養(yǎng)基、質(zhì)量百分比為1.5～3％的掩蔽劑，在78～90℃條件下溫浴，溫浴產(chǎn)物溫度至65～75℃，取出；(7)在10～20分鐘內(nèi)，冷卻至16～20℃，采用400～600目濾布抽濾；(8)取濾液，添加脫水氧化劑，厭氧靜置2～4小時(shí)，抽濾、離心分離，得到產(chǎn)物，于-30～0℃真空機(jī)冷凍干燥24～72小時(shí)，再經(jīng)常溫真空器干燥24～72小時(shí)，即得超氧化物岐化酶，上述脫水氧化劑添加的量為步驟(7)中抽濾后溶液體積的15～80％，其中步驟(1)中各原料之間的質(zhì)量比為1～100∶1～100∶1～100∶1～100∶1～100。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物超氧化物岐化酶的制備方法，其特征在于所述步驟 (l)中的原料還包括白花蛇舌草和半枝蓮，且各物質(zhì)之間的質(zhì)量比為1 100: 1 100: l 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物超氧化物岐化酶的制備方法，其特征在于所述步驟(l)中的原料還包括鴨跖草、萚草和魚(yú)腥草，且各物質(zhì)之間的質(zhì)量比為1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100: 1 100。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的植物超氧化物岐化酶的制備方法，其特征在于 所述步驟(2)中的堿離子液采用氫氧化鈉溶液、氯化鉀溶液或氯化鈉溶液，步驟(3)中的 緩沖液采用檸檬酸、檸檬酸鈉、醋酸、醋酸鈉、磷酸二氫鉀或氯化鈉溶液，步驟(4)中的 氧化劑采用100%乙醇、質(zhì)量百分比為1 20%的氫氧化鈉溶液、質(zhì)量百分比為10 40 %的雙氧水、質(zhì)量百分比為5 38%的鹽酸或質(zhì)量百分比為10 98%的硫酸，萃取劑采 用丙酮、二氯甲烷或三氯甲垸，步驟(4)中的脫水氧化劑采用乙醇、三氯甲垸、丙酮、二 氯甲烷或硫酸鈉溶液，步驟(6)中的還原糖培養(yǎng)基采用麥芽糖培養(yǎng)基或葡聚糖培養(yǎng)基，步 驟(6)中的掩蔽劑采用EDTA溶液、聚乙二醇或上述兩種的混合物，步驟(8)中的脫水氧 化劑采用100%乙醇、質(zhì)量百分比為1 20%的氫氧化鈉溶液、質(zhì)量百分比為10 40% 的雙氧水、質(zhì)量百分比為5 38%的鹽酸或質(zhì)量百分比為10 98%的硫酸。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的植物超氧化物岐化酶的制備方法，其特征在于 所述步驟(2)中厭氧發(fā)酵前添加質(zhì)量百分比為20 100%的步驟(4)中過(guò)濾后的沉淀物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的植物超氧化物岐化酶的制備方法，其特征在于 所述的步驟(6)中在溫浴之前添加步驟(6)中抽濾后的上層物質(zhì)，且該上層物質(zhì)抽濾后添 加前經(jīng)過(guò)一20^^ — 10。C冷凍干燥，該上層物質(zhì)添加的量為步驟(l)中產(chǎn)物合并后混合物質(zhì) 量的10 50%。
全文摘要
一種植物超氧化物岐化酶的制備方法，包括如下步驟將各原料分別粉碎、打漿；合并上述打漿后的產(chǎn)物，加堿離子液，厭氧發(fā)酵；添加飽和緩沖液；將氧化劑和萃取劑加入到發(fā)酵容器中，脫水沉淀，過(guò)濾，取濾液，厭氧真空冷凍；添加脫水氧化劑，沉淀得到粗品酶，抽濾，離心分離，取沉淀物，真空冷凍干燥；將還原糖培養(yǎng)基添加到上述產(chǎn)物，再添加掩蔽劑，溫浴抽濾；取濾液，將脫水氧化劑加到步驟(7)得到的濾液中，厭氧靜置，抽濾、離心分離，冷凍真空機(jī)干燥，冷凍真空器干燥即得超氧化物岐化酶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于以廉價(jià)中草藥與豆粕配合，各取所長(zhǎng)，相互協(xié)同，經(jīng)過(guò)厭氧發(fā)酵，制得衛(wèi)生無(wú)污染具有抑制病菌酶活性很高的SOD，直接可以服用或外涂，并且具有良好的消炎效果。
文檔編號(hào)C12N9/08GK101104848SQ20061005249
公開(kāi)日2008年1月16日 申請(qǐng)日期2006年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月13日
發(fā)明者王海寶 申請(qǐng)人:王海寶