專利名稱：豬附紅細(xì)胞體pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，尤其涉及豬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
附紅細(xì)胞體病是附紅細(xì)胞體寄生在人或多種動(dòng)物的紅細(xì)胞表面、血漿和骨髓而引起的一種人畜共患病。過(guò)去國(guó)際上將附紅細(xì)胞體列為立克次氏體，但是近年來(lái)根據(jù)16S rRNA基因序列分析，附紅細(xì)胞體在分類上更接近于支原體屬(Mycoplasma)。豬附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon suis，E.suis)是一種寄生于豬紅細(xì)胞表面或游離于血漿的病原體，可引起新生仔豬和斷奶仔豬虛弱和貧血，肥育豬生長(zhǎng)緩慢，母豬繁殖障礙、受胎率低、不發(fā)情、流產(chǎn)和死胎等綜合性癥狀，嚴(yán)重威脅著畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康。目前已經(jīng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并呈范圍擴(kuò)大趨勢(shì)，因而引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。臨床上該病的診斷方法主要以直接鏡檢為主，其中包括鮮血壓片和涂片染色，但是假陽(yáng)性率高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法是確診的手段，但所費(fèi)時(shí)間太長(zhǎng)，費(fèi)用高。血清學(xué)方法包括間接血凝試驗(yàn)(IHA)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等，由于附紅細(xì)胞體病的抗體變化起伏較大，這些方法也不適用于該病診斷。Gwaltney等(1993)根據(jù)豬附紅細(xì)胞體基因文庫(kù)KSU一2克隆的序列資料，設(shè)計(jì)合成引物，首次建立了E.suis的PCR診斷方法。Messick等(1999)根據(jù)豬附紅細(xì)胞體Illinois株16S rRNA基因的序列資料，設(shè)計(jì)合成了豬附紅細(xì)胞體種特異性引物ES-f1、ES-f2、ES-r1、ES-r2，這些引物可以特異性地?cái)U(kuò)增出豬附紅細(xì)胞體16S rRNA的基因片段，但是不能擴(kuò)增到親緣較近的幾種支原體的基因片段。由此可見(jiàn)基于16S rRNA基因的PCR方法有很強(qiáng)的特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種豬附紅細(xì)胞體的PCR檢測(cè)方法，通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)1.設(shè)置PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括(1)PCR試劑管試劑管內(nèi)含10×緩沖液，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，引物1，引物2，MgCl2，其中引物1和引物2分別具有SEQ ID NO 1和SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列
引物1(SEQ ID NO1)5’＞CGAGCATTATCCGGATTTATTG＜3’引物2(SEQ ID NO2)5’＞ACATGCTCCACCACTTGTTCAG＜3’(2)陽(yáng)性對(duì)照該對(duì)照為含有目的基因片段的重組質(zhì)粒，是將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pUCm-T轉(zhuǎn)化DH5-α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序后獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒含豬附紅細(xì)胞體403bp基因片段，具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列cgagcattat ccggatttat tgggcgtaaa ggaagcgtag gctgaagtgt gtatccattg 60ttaaaagtac ttgcttaaca agtgttcgcg gtggagatta cacttctaga attagttaga120gggcactgga attcaatgtg tagtggtgga atacgtagat atattgagga acaccagagg180ctaaggcgag tgcctgggac ataattgacg ctgaggcttg aaagcgtggg tagcaaatgg240gattagatac cccagtagtc cacgccgtaa acgatgggta ttagtcattt gaatttaagt300tgagtgatgt agctaacgcg ttaaataccc cgcctgggta gtatatatgc aaatatgaaa360ctcaaagaaa ttgacgggga cctgaacaag tggtggagca tgt 403(3)陰性對(duì)照，該對(duì)照為雙重蒸餾水；(4)Taq DNA聚合酶；(5)GoldView DNA染料；(6)溴酚藍(lán)上樣緩沖液(常規(guī)濃度)。
2.操作程序(1)被檢樣品DNA提取取200μl無(wú)菌抗凝血液，Trizol試劑裂解后常規(guī)的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA TE)溶解，4℃保存?zhèn)溆茫?2)PCR擴(kuò)增在PCR檢測(cè)試劑管中加入處理后的DNA樣品，同時(shí)設(shè)陰陽(yáng)性對(duì)照，每管加入Taq酶不少于0.2μl，混勻后稍離心，置PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)循環(huán)條件95℃ 5min，94℃ 60s，60℃ 30s，72℃ 60s，共35循環(huán)，最后在72℃后延伸7min。
(3)擴(kuò)增產(chǎn)物分析將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，被檢樣品孔出現(xiàn)的電泳帶與陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照比對(duì)，以判定樣品為豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性或陰性。
發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供了一種檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體的標(biāo)準(zhǔn)方法，可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出被檢樣品中的附紅細(xì)胞體，也可用于豬附紅細(xì)胞體病的分子流行病學(xué)調(diào)查及療效監(jiān)測(cè)。本方法的模板DNA制備步驟簡(jiǎn)單費(fèi)用低，常規(guī)的方法需經(jīng)溶菌酶、蛋白酶K、SDS(十二烷基硫酸鈉)、CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)等試劑處理，時(shí)間長(zhǎng)費(fèi)用高。本方法建立在分子生物學(xué)的基礎(chǔ)上，可排除鏡檢時(shí)細(xì)菌和雜質(zhì)顆粒的干擾，從而大大提高診斷準(zhǔn)確率，降低假陽(yáng)性率。


圖1為本發(fā)明方法獲得的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳結(jié)果。
圖2為應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)行附紅細(xì)胞體病的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果。
具體實(shí)施例本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例一1.樣品的采集嚴(yán)格無(wú)菌采集可疑病豬的血樣不少于500μl，4℃或冷凍保存；2.被檢樣品DNA提取取200μl無(wú)菌抗凝血液，加入100μl Trizol試劑，充分混勻后加入等體積的Tris飽和酚/氯仿混合液抽提，上清用2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀2小時(shí)，70％的乙醇洗滌后干燥，沉淀用10-20μl TE緩沖液溶解后，4℃保存?zhèn)溆茫?.設(shè)置PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括(1)PCR試劑管試劑管內(nèi)含10×buffer，dNTP，引物1和引物2，MgCl2，其中引物1和引物2分別是按下述堿基序列由DNA合成儀合成的DNA片段引物15’＞CGAGCATTATCCGGATTTATTG＜3’引物25’＞ACATGCTCCACCACTTGTTCAG＜3’(2)陽(yáng)性對(duì)照該對(duì)照為含有目的基因片段的重組質(zhì)粒，是將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pUCm-T轉(zhuǎn)化DH5-α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序后獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒含豬附紅細(xì)胞體403bp基因片段，具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
(3)陰性對(duì)照，該對(duì)照為雙重蒸餾水；(4)Taq酶；(5)GoldView DNA染料；(6)溴酚藍(lán)上樣緩沖液(常規(guī)濃度)。
4.PCR擴(kuò)增在每個(gè)PCR檢測(cè)試劑管中加入提取的DNA樣品2μl，加入Taq酶0.2μl，同時(shí)設(shè)陰陽(yáng)性對(duì)照?；靹蚝笊噪x心，置PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)循環(huán)條件95℃ 5min，94℃ 60s，60℃ 30s，72℃ 60s，共35循環(huán)，最后在72℃后延伸7min。
5.擴(kuò)增產(chǎn)物分析將瓊脂糖溶于電泳緩沖液中，然后每100ml中加入5μl GoldView DNA染料，混勻后制膠。將樣品擴(kuò)增產(chǎn)物與溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，用微量移液器將樣品依次加入加樣孔內(nèi)，恒壓電泳。電泳完成后，放在透射紫外燈下觀察，將樣品孔出現(xiàn)的電泳帶與陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照比對(duì)，判定被檢樣品為豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性或陰性。結(jié)果參見(jiàn)圖1，其中1為陽(yáng)性對(duì)照，2為陰性對(duì)照，3為被檢樣品陰性，4、5為被檢樣樣品陽(yáng)性。
實(shí)施例二方法基本同實(shí)施例一，隨機(jī)無(wú)菌采集豬血樣，提取DNA，PCR擴(kuò)增，結(jié)果參見(jiàn)圖2，其中1為陽(yáng)性對(duì)照，2為陰性對(duì)照，4、5、12、14、18為被檢樣品陰性，3、6、7、8、9、10、11、13、15、16、17為被檢樣樣品陽(yáng)性。陽(yáng)性率為68.75％。
無(wú)需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開(kāi)的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的實(shí)施方案應(yīng)理解為僅是舉例說(shuō)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明涉及的序列<120>豬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)方法<160>3<170>DNA Star 5.0<210>1<211>22<212>DNA<213>豬附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon suis)<220>
<221>RRNA<400>1cgagcattat ccggatttat tg 22<210>2<211>22<212>DNA<213>豬附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon suis)<220>
<221>RRNA<400>2acatgctcca ccacttgttc ag 22<210>3<211>403<212>DNA<213>豬附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon suis)<220>
<221>RRNA<400>3cgagcattat ccggatttat tgggcgtaaa ggaagcgtag gctgaagtgt gtatccattg60ttaaaagtac ttgcttaaca agtgttcgcg gtggagatta cacttctaga attagttaga120gggcactgga attcaatgtg tagtggtgga atacgtagat atattgagga acaccagagg180ctaaggcgag tgcctgggac ataattgacg ctgaggcttg aaagcgtggg tagcaaatgg240gattagatac cccagtagtc cacgccgtaa acgatgggta ttagtcattt gaatttaagt300tgagtgatgt agctaacgcg ttaaataccc cgcctgggta gtatatatgc aaatatgaaa360ctcaaagaaa ttgacgggga cctgaacaag tggtggagca tgt40權(quán)利要求
1.豬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)方法，其特征是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(1)被檢樣品DNA提取取200μl無(wú)菌抗凝血液，Trizol試劑裂解后常規(guī)的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，4℃保存?zhèn)溆茫?2)設(shè)置PCR檢測(cè)試劑盒由PCR試劑管、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、Taq酶、GoldView DNA染料、溴酚藍(lán)上樣緩沖液組成，其中，PCR試劑管含10×緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、引物1、引物2及MgCl2，引物1和引物2具有的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列SEQ ID NO 15’＞CGAGCATTATCCGGATTTATTG＜3’SEQ ID NO 25’＞ACATGCTCCACCACTTGTTCAG＜3’；(3)PCR擴(kuò)增在PCR試劑管中加入處理后的樣品DNA，同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照，每管加入Taq酶不少于0.2μl，混勻后稍離心，置PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)循環(huán)條件為95℃5min，94℃60s，60℃30s，72℃60s，共35循環(huán)，最后在72℃后延伸7min；(4)擴(kuò)增產(chǎn)物分析將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，被檢樣品孔出現(xiàn)的電泳帶與陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照比對(duì)，以判定樣品為豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性或陰性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)方法，其特征是所述步驟(3)中陽(yáng)性對(duì)照為含有目的基因片段的重組質(zhì)粒，通過(guò)將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pUCm-T轉(zhuǎn)化DH5-α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序后獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒含豬附紅細(xì)胞體403bp基因片段，具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)方法，其特征是所述步驟(3)中陰性對(duì)照為雙重蒸餾水。
全文摘要
本發(fā)明提供一種豬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)方法，所用試劑包括PCR檢測(cè)試劑盒，及含有目的基因片段重組質(zhì)粒的陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、Taq酶、GoldView DNA染料、溴酚藍(lán)上樣緩沖液，通過(guò)被檢樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物分析達(dá)到檢測(cè)目的。本發(fā)明提供的方法可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出被檢樣品中的附紅細(xì)胞體，也可用于豬附紅細(xì)胞體病的分子流行病學(xué)調(diào)查及療效監(jiān)測(cè)。本方法的模板DNA制備步驟簡(jiǎn)單費(fèi)用低，可排除鏡檢時(shí)細(xì)菌和雜質(zhì)顆粒的干擾，從而大大提高診斷準(zhǔn)確率，降低假陽(yáng)性率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1850991SQ200610049619
公開(kāi)日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月27日
發(fā)明者杜愛(ài)芳, 侯玉慧, 趙現(xiàn)鋒 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)