專利名稱：降纖酶的親和分離材料和降纖酶的親和純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物醫(yī)藥技術領域的純化方法。特別是一種降纖酶的親和分離材料和降纖酶的親和的純化方法。
背景技術：
降纖酶是從長白山白眉蝮蛇[Agkistrodon halys(ussriensis Emelianor)]或尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]蛇毒中提取的蛋白水解酶[《國家藥品標準-降纖酶》(WS1-XG-031-2000)]。一種類凝血酶(TLE)類蛋白水解酶，是糖蛋白，同時具有精氨酸酯酶及類凝血酶的活性，在體內作用于底物纖維蛋白原，能使纖維蛋白原直接凝固變成非鉸鏈的纖維蛋白，從而使纖維蛋白原降低，發(fā)揮明顯的抗凝血作用。降纖酶的抗凝血作用主要是直接作用于血漿纖維蛋白原，對體內其他凝血因子如II、VII、VIII、X等無明顯影響，因此降纖酶不容易引起出血。降纖酶有類似胰蛋白酶的纖容酶活性，促進組織纖溶酶原激活劑從血管內皮釋放，提高人血漿中的組織型纖溶酶原激活劑(t-pA)和尿激酶(Urokinase)活性共同參與激活存在于血凝塊和血漿中的纖溶酶原，使其變?yōu)槔w溶酶。因此，降纖酶具有抵抗血凝、溶解血栓、去纖、降低血粘度和擴張血管改善微循環(huán)、清除自由基等功效(湯圣希等，蛇毒降纖酶的主要藥理作用蛇志，1999，11(3)1-3)的作用，臨床上主要用于治療血管栓塞性等疾病具有較高的藥用價值。
但由于蛇毒成分復雜，同功酶比較多，性質又存在差異，如中國專利01115570.1公開了一種尖吻蝮蛇毒凝血酶II具有A、B兩個亞基組成，分別含122個和120個氨基酸殘基，具有去纖維蛋白原作用，可抗凝血。而中國專利02158007.3公開了一種蛇毒蛋白酶，質譜分子量29000-29500Dalton，和兩條肽鏈組成，具有促凝血、止血功能。因此從蛇毒中分離純化單一組分降纖酶一直比較困難。
經對現(xiàn)有技術文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，從蛇毒中制備降纖酶的方法有多步陽離子交換和陰離子交換層析，如中國專利92102645.5尖吻蝮蛇毒去纖酶純化方法、95109884.5一種尖吻蝮蛇毒纖溶酶及其純化方法；由于僅用多步用陰離子交換層析制備降纖酶的回收率低，酶比活性不高，中國專利“200410021558.4從蛇毒中提取降纖酶及降纖酶水針制劑的制備方法”采用離子交換粗提，再用單克隆抗體親和層析精制。該方法利用親和分離技術的優(yōu)點，使純化步驟少，操作簡單。但單克隆抗體制備成本高，性質不穩(wěn)定，使得單克隆抗體親和層析材料的使用壽命短，降纖酶的生產成本高。
因此，有必要開發(fā)效率高、成本低、生產步驟更簡便的降纖酶分離材料和和生產工藝。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服降纖酶生產現(xiàn)有技術的缺點，提供一種降纖酶的親和分離材料和降纖酶的親和的純化方法，使其能夠可快速、簡便、低成本、大批量純化降纖酶。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明的純化方法，即仿生親和純化技術，以專一性地識別降纖酶作為基礎，其步驟如下(1)在基礎層析介質上進行固相合成，制備仿生親和分離材料；合成降纖酶專一的親和分離材料，首先以帶氨基的基礎層析介質，或用常規(guī)化學方法對基礎層析介質進行衍生化，帶上氨基，與三氯三氮嗪反應活化，再與精氨酸反應，合成親和分離材料。
(2)用制備的仿生親和分離材料純化降纖酶粗品。
用上述合成的親和層析介質制備成親和層析柱，將蛇毒樣品流過該親和層析柱，降纖酶及其類似物吸附在親和層析柱上，未結合的其它蛋白被洗去，改變換緩沖液條件將結合的降纖酶洗脫下來，得到降纖酶粗品。
(2)用離子交換層析制得降纖酶。
降纖酶粗品再用陰離子交換層析精制，得到單一組分的降纖酶精品。
步驟(1)中，基礎層析介質是葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的硅膠中的一種。
在步驟(2)中，親和介質吸附降纖酶的條件為為pH5-8，離子強度為0.0-0.5M的緩沖液；洗脫條件為pH1.0-4.0或pH10-12，離子強度為0-0.5M的緩沖液。
所述的仿生親和分離材料，其結構是通過三氮嗪結構骨架作為間臂固定精氨酸基團。
所述的降纖酶，其原料為尖吻蝮蛇蛇毒或者長白山白眉蝮蛇蛇毒。
本發(fā)明克服了降纖酶生產技術中的缺點，使降纖酶生產分離純化時步驟少，生產成本低，生產效率高，利用降纖酶專一的親和分離材料，可快速、簡便、低成本、大批量純化降纖酶。
具體實施例方式
下面結合具體實例做進一步的闡述實施例1一 分離材料制備取NH2-Sepharose(500ml)，依次用5倍體積的1M NaCl，10倍體積蒸餾水充分洗滌后，抽干轉移至反應器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中攪拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(100g)，用飽和NaHCO3調節(jié)反應系統(tǒng)的pH在6～7之間，反應3小時后取出，依次用3×10倍體積的水/丙酮(0∶1，1∶3，1∶1，3∶1，1∶0)洗滌，得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(450ml)。
稱取精氨酸(100g)用去離子水(300ml)溶解，與1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(300ml)混勻，用飽和NaHCO3調節(jié)pH在6～7之間，置于溫度50℃中攪拌反應24小時。反應結束后，依次用3倍體積的1MNaCl，10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1-氨基-Sepharose-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(260ml)，用20％乙醇儲存待用。
二 分離材料結構測定取1-氨基-Sepharose-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪4ml用循環(huán)水真空泵抽去水份，裝于水解管中，加入等量6M鹽酸溶液，100℃恒溫水解過夜，然后取出水解液15000rpm離心15min，取上清減壓旋轉蒸發(fā)至于，再加入50ml去離子水蒸干，重復蒸干3次，去處多余的鹽酸；將干燥的樣品溶解于50ml去離子水，上至用0.1M鹽酸平衡的Toyopearl SP-650M(5ml)柱，用254nm光吸收檢測流出過程。用鹽酸溶液(0.01M)沖洗至基線平穩(wěn)后，用氫氧化鈉溶液(0.1M)洗脫，收集吸收峰；再將收集的吸收峰組分上至氫氧化鈉溶液(0.1M)Toyopearl Q-650M(5ml)柱，用254nm光吸收檢測流出過程。用氫氧化鈉溶液(0.001M)沖洗至基線平穩(wěn)，再用鹽酸溶液(0.1M)洗脫，收集吸收峰，減壓旋轉蒸發(fā)除去鹽酸得分離材料上合成得配基分子(8mg)，進行HPLC-ESI-MS聯(lián)用分析。在C18柱，用水甲醇流動相，檢測波長為254nm條件下，在HPLC圖譜上主要出現(xiàn)1個主峰(占90％)，70伏電壓下進行ESI-MS分析，結果m+/z＝343.1，m+-CO2/z＝299.1；m++CH3/z＝343.1358.2；m++Na/z＝365.1；三.降纖酶粗品親和純化稱取尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]蛇毒粗品(0.1g)，溶解于10ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH 5)，過濾去除不溶物，上樣至預先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH 6)平衡好的裝1-氨基Sepharose-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1×5cm)中，依次用磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH5)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(10mM，pH9)洗脫結合的降纖酶，收集后用纖維蛋白原初凝法測定各組分的初凝活性總活性1000單位。
實施例2稱取尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]蛇毒粗品(0.1g)，溶解于10ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH8)，過濾去除不溶物，上樣至預先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH8)平衡好的裝有實施例1步驟一制備的1-氨基Sepharose-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1×5cm)中，依次用磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH8)洗至280nm光吸收至基線，醋酸鈉緩沖液(100mM，pH3)洗脫結合的降纖酶，收集后用纖維蛋白原初凝法測定各組分的初凝活性總活性1200單位。
實施例3稱取長白山白眉蝮蛇[Agkistrodon halys(ussriensis Emelianor)]蛇毒粗品(0.1g)，溶解于10ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7)，過濾去除不溶物，上樣至預先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7)平衡好的裝有實施例1步驟-制備的1-氨基Sepharose-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1×5cm)中，依次用磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7)洗至280nm光吸收至基線，醋酸鈉緩沖液(100mM，pH5)洗脫結合的降纖酶，收集后用纖維蛋白原初凝法測定各組分的初凝活性總活性800單位。
實施例4稱取尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]蛇毒粗品(0.1g)，溶解于10ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.5)，過濾去除不溶物，上樣至預先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.5)平衡好的裝有實施例1步驟一制備的1-氨基Sepharose-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1×5cm)中，依次用磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.5)洗至280nm光吸收至基線，醋酸甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(10mM，pH12)洗脫結合的降纖酶，收集后用纖維蛋白原初凝法測定各組分的初凝活性總活性950單位。
實施例5一 親和純化稱取尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]蛇毒粗品(5g)，溶解于10ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，1mM EDTA，pH6)，過濾去除不溶物，上樣至預先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，1mM EDTA，pH6)平衡好的裝有實施例1步驟一制備的1-氨基Sepharose-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(2.5×20cm)中，依次用磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，1mM EDTA，pH6)洗至280nm光吸收至基線，醋酸甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(10mM，pH10.6)洗脫結合的降纖酶，得降纖酶粗品，收集后用纖維蛋白原初凝法測定各組分的初凝活性總活性70000單位。
二精制降纖酶粗品，合并調pH至6.8，上至預先用5倍體積的磷酸鈉緩沖液(10mM，pH6.8)平衡的Toyopearl DEAE-650M層析柱(2.5×20cm)，用以磷酸鈉緩沖液(10mM，pH6.8)和含0.2M NaCl的磷酸鈉緩沖液(10mM，pH6.8)梯度洗脫，分步收集洗脫組分，用SDS-PAGE電泳分析純度和表觀分子量，用纖維蛋白原初凝法測定各組分的初凝活性。合并表觀分子量為為單一條帶，分子量為；永含降纖酶活性的組分，則總活性5萬單位。
實施例6一 分離材料制備取Toyopearl NH2-650M(50ml)，依次用5倍體積的1M NaCl，5倍體積蒸餾水充分洗滌后，抽干轉移至反應器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中攪拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(10g)，用飽和NaHCO3調節(jié)反應系統(tǒng)的pH在6～7之間，反應3小時后取出，依次用3×10倍體積的水/丙酮(0∶1，1∶3，1∶1，3∶1，1∶0)洗滌，得到1-氨基-Toyopearl 650M-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(45ml)。
稱取精氨酸(10g)用去離子水(30ml)溶解，與1-氨基-650M-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(30ml)混勻，用飽和NaHCO3調節(jié)pH在6～7之間，置于溫度50℃中攪拌反應24小時。反應結束后，依次用3倍體積的1M NaCl，5倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1-Toyopearl 650M-氨基-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(28ml)，用20％乙醇儲存待用。
二 親和制備稱取長白山白眉蝮蛇[Agkistrodon halys(ussriensis Emelianor)]蛇毒粗品(0.1g)，溶解于10ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，0.2M NaCl，pH8)，過濾去除不溶物，上樣至預先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，0.2M NaCl，pH8)平衡好的裝有實施例6步驟一制備的1-Toyopearl 650M-氨基-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1×5cm)中，依次用磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，0.2MNaCl，pH8)洗至280nm光吸收至基線，醋酸鈉緩沖液(100mM，pH3)洗脫結合的降纖酶，收集后用纖維蛋白原初凝法測定各組分的初凝活性總活性1200單位。
實施例7
稱取尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]蛇毒粗品(0.1g)，溶解于10ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7)，過濾去除不溶物，上樣至預先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7)平衡好的裝有實施例6步驟一制備的1-Toyopearl 650M-氨基-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1×5cm)中，依次用磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7)洗至280nm光吸收至基線，緩沖液(100mM醋酸鈉，0.2M NaC，pH5，)洗脫結合的降纖酶，收集后用纖維蛋白原初凝法測定各組分的初凝活性總活性850單位。
實施例8稱取尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]蛇毒粗品(0.1g)，溶解于10ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.5)，過濾去除不溶物，上樣至預先用10倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.5)平衡好的裝有1-Toyopear1 650M-氨基-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1×5cm)中，依次用磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH7.5)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(10mM，甘氨酸，pH12)洗脫結合的降纖酶，收集后用纖維蛋白原初凝法測定各組分的初凝活性總活性1050單位。
實施例9一親和制備降纖酶粗品稱取長白山白眉蝮蛇[Agkistrodon halys(ussriensis Emelianor)]蛇毒粗品(6g)，溶解于100ml磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，1mM EDTA，pH6)，過濾去除不溶物，上樣至預先用5倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，1mM EDTA，pH6)平衡好的裝1-Toyopearl 650M-氨基--3，5二氯-2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(2.5×15cm)中，依次用磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，1mM EDTA，pH6)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸-氫氧化鈉鈉緩沖液(10mM甘氨酸，0.5M NaCl，pH10.6)洗脫結合的降纖酶，分步收集280nm各吸收組分，用纖維蛋白原初凝法測定各組分的初凝活性，合并具有初凝活性的各組分(總活性7萬單位)。
二用弱陰離子交換層析精制降纖酶降纖酶粗品，合并調pH至6.8，上至預先用5倍體積的磷酸鈉緩沖液(10mM，pH6.8)平衡的DEAE-Sepharose FF層析柱(2.5×20cm)，用以磷酸鈉緩沖液(10mM，pH6.8)和含0.2M NaCl的磷酸鈉緩沖液(10mM，pH6.8)梯度洗脫，分步收集洗脫組分，用SDS-PAGE電泳分析純度和表觀分子量，用纖維蛋白原初凝法測定各組分的初凝活性。合并表觀分子量為為單一條帶，分子量為；降纖酶總活性5萬單位，應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，如起始材料NH2-Sepharose可以更換成葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的硅膠等，這些等價形式同樣落于本發(fā)明的范圍。
權利要求
1.一種降纖酶的親和分離材料和降纖酶的親和的純化方法，其特征在于，包括下列步驟(1)仿生親和分離材料結構是在基礎層析介質上通過三氮嗪骨架作為間臂固定精氨酸；(2)用制備的仿生親和分離材料純化降纖酶粗品；(3)用離子交換層析精制得降纖酶精品。
2.根據(jù)權利要求1所述的降纖酶的親和分離材料和降纖酶的親和的純化方法，其特征是，步驟(1)中，基礎層析介質是葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的硅膠中的一種。
3.根據(jù)權利要求1所述的降纖酶的親和分離材料和降纖酶的親和的純化方法，其特征是，在步驟(2)中，親和介質吸附降纖酶的條件為為pH5-8，離子強度為0.0-0.5M的緩沖液；洗脫條件為pH1.0-4.0或pH10-12，離子強度為0-0.5M的緩沖液。
4.根據(jù)權利要求1所述的降纖酶的親和分離材料和降纖酶的親和的純化方法，其特征是，所述的仿生親和分離材料，其合成的配體中含有三氮嗪；其合成的配體中含有精氨酸的結構。
5.根據(jù)權利要求1所述的降纖酶的親和分離材料和降纖酶的親和的純化方法，其特征是，所述的降纖酶，其原料為尖吻蝮蛇蛇毒或者長白山白眉蝮蛇蛇毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降纖酶的親和分離材料和降纖酶的親和的純化方法，包括下列步驟(1)在基礎層析介質上進行固相合成，制備仿生親和分離材料；(2)用制備的仿生親和分離材料純化降纖酶粗品；(3)用離子交換層析制得降纖酶。本發(fā)明能夠高效率、低成本的大規(guī)模生產高純度的降纖酶。
文檔編號C12N9/64GK1884507SQ20061002863
公開日2006年12月27日 申請日期2006年7月6日 優(yōu)先權日2006年7月6日
發(fā)明者李榮秀, 辛瑜, 王霆 申請人:上海交通大學, 上海擬生生物科技有限公司