專利名稱：一種抗cd25的嵌合單克隆抗體的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地涉及一種抗CD25的嵌合單克隆抗體的生產(chǎn)方法，以及用于該方法的表達載體和宿主細胞。
背景技術(shù)：
器官移植后的急性排斥反應較常見，這種反應可能會引起移植腎臟的壞死或者移植腎功能衰退。因此，能夠降低和減弱這類反應的藥物對于器官移植的成功與否至關(guān)重要。臨床上一般采用免疫抑制劑對器官移植病人進行治療，抑制移植排斥反應的發(fā)生或減輕反應程度。因此，接受腎移植者不得不終身服用免疫抑制藥物以達到1.合理應用以預防和治療排斥反應(保護異己的腎臟)；2.保持患者適度的免疫抵抗力(保護患者本身)。
新的免疫抑制劑的研制，使臨床腎移植得到更為廣泛的開展，腎移植數(shù)量急劇增長，效果明顯提高，腎移植一年存活率在先進的移植中心已超過85％，術(shù)后大多數(shù)患者恢復正常生活和工作。其中免疫抑制劑在預防和治療腎移植排斥反應中起了關(guān)鍵作用。然而，迄今應用于臨床的免疫抑制劑并沒有達到非常滿意的效果。雖然移植的腎一年存活率達80-90％，但急性排斥反應發(fā)生率仍高達50％。
抗CD25的嵌合單克隆抗體為一種新型免疫抑制劑，通過結(jié)合與和封閉IL-2受體，特異性阻斷IL-2與其受體的結(jié)合，從而減少急性排異反應的發(fā)生，與三聯(lián)免疫抑制劑合用，可顯著減少急性器官移植排異反應的發(fā)生。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)該新型免疫抑制劑的高效表達方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種抗CD25的嵌合單克隆抗體的生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明的另一目的是提供用于該生產(chǎn)工藝的表達載體和宿主細胞。
在本發(fā)明的第一方面，提供了兩種表達載體，它們分別含有抗CD25的嵌合單克隆抗體的重輕鏈編碼序列(包括DNA序列或RNA序列)。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種宿主細胞，它含有本發(fā)明上述的表達載體或所述抗CD25的嵌合單克隆抗體的編碼序列。更佳地，所述的宿主細胞是哺乳動物細胞。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種生產(chǎn)抗CD25的嵌合單克隆抗體的方法，它包括步驟(a)在適合表達抗CD25的嵌合單克隆抗體的條件下，用發(fā)酵罐培養(yǎng)本發(fā)明上述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出抗CD25的嵌合單克隆抗體。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達載體是含病毒啟動子的表達載體，或者所述的宿主細胞是哺乳動物細胞。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中進行高密度無血清懸浮培養(yǎng)。
在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(b)包括步驟(i)細胞培養(yǎng)上清離心獲得上清液；(ii)通過親和層析進行初步純化；(iii)層析純化，所述的層析純化選自陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水層析及其組合。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，將抗CD25的嵌合單克隆抗體構(gòu)建入合適的表達載體，然后轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞，轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞經(jīng)培養(yǎng)，表達出抗CD25的嵌合單克隆抗體。生產(chǎn)工藝高效穩(wěn)定。在此基礎上完成了本發(fā)明。
在另一優(yōu)選例中，用本發(fā)明構(gòu)建的表達載體共轉(zhuǎn)獲得的哺乳動物細胞(簡稱為“工程細胞”)，經(jīng)高密度無血清懸浮培養(yǎng)，抗CD25的嵌合單克隆抗體以活性形式存在于細胞培養(yǎng)上清，同時簡便純化工藝，通過簡便的二步純化方法，即可得到純度達95％的純品，獲得高表達、高得率、高活性、極具產(chǎn)業(yè)化價值的一種生產(chǎn)抗CD25的嵌合單克隆抗體的方法。
開發(fā)的抗CD25的嵌合單克隆抗體，通過結(jié)合和封閉IL-2受體，特異性阻斷IL-2與其受體的結(jié)合，從而減少急性排異反應的發(fā)生。與三聯(lián)免疫抑制劑配合使用，可以顯著減少急性器官移植排異反應的發(fā)生。同時，抗CD25的嵌合單克隆抗體為嵌合抗體，在克服鼠源性單克隆抗體的免疫原性的同時保留了其獨特的抗體親和力和特異性，不僅提高了治療效果，而且降低了產(chǎn)品的副作用。
本發(fā)明的發(fā)明點主要在于抗CD25的嵌合單克隆抗體高表達工程細胞獲得、工程細胞優(yōu)化培養(yǎng)以及產(chǎn)物的分離等技術(shù)優(yōu)化創(chuàng)新。
適用于本發(fā)明的宿主細胞是真核宿主細胞，尤其是哺乳動物細胞。
在本發(fā)明中，工程細胞表達抗CD25的嵌合單克隆抗體的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，哺乳動物細胞通常需要在含血清的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，需要對細胞進行無血清的適應過程后，讓細胞可以在無血清培養(yǎng)基中正常的生長。同時由于該細胞使用的是GS表達系統(tǒng)，需要使用不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基，才可以表達抗CD25的嵌合單克隆抗體。
此外，通過控制培養(yǎng)基的各營養(yǎng)成分，控制培養(yǎng)時候的溶氧(DO)、pH、溫度、攪拌速度等因素，可以進一步提高表達量。
在培養(yǎng)表達抗CD25的嵌合單克隆抗體后，對表達的抗CD25的嵌合單克隆抗體進行分離。
由于表達的抗CD25的嵌合單克隆抗體存在于培養(yǎng)上清，那么培養(yǎng)上清液可以通過鹽析、超濾等方法進行初步純化后再進行層析純化，也可直接進行層析純化。
適用于本發(fā)明的層析技術(shù)包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
(a)親和層析選擇Protein A-Sepharose親和凝膠介質(zhì)，低pH緩沖液洗脫。
(b)離子交換層析。
經(jīng)過2-3步純化，可得到抗CD25的嵌合單克隆抗體純品，純化得率40％以上，純度95％以上。在本發(fā)明中，通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，可將抗CD25的嵌合單克隆抗體表達量從15mg/升提高到100mg/升。
純化后抗CD25的嵌合單克隆抗體可用常規(guī)技術(shù)制成各種劑型。
在本發(fā)明的一個實例中，通過篩選獲得高效、穩(wěn)定表達的抗CD25的嵌合單克隆抗體工程細胞(哺乳動物細胞)。經(jīng)高密度無血清懸浮培養(yǎng)，抗CD25的嵌合單克隆抗體以可溶形式存在于培養(yǎng)液上清，表達水平高，占菌體總蛋白50％左右，抗CD25的嵌合單克隆抗體表達量達100～125mg/L上清液。由于表達水平較高，抗CD25的嵌合單克隆抗體又具有天然活性，避免了復雜的復性過程，通過簡便、快速的二步純化方法，即獲得高質(zhì)量的抗CD25的嵌合單克隆抗體純品，每升培養(yǎng)液可得抗CD25的嵌合單克隆抗體純品45mg，產(chǎn)品純度95％以上。
中試研究表明，產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定，操作簡單，周期短，成本低，每升發(fā)酵液可獲得抗CD25的嵌合單克隆抗體純品約45mg或更多，因此適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點在于(1) 創(chuàng)新的生產(chǎn)工藝，采用新型NSO表達體系與無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)；(2) 表達工藝簡單，表達量高。通過控制關(guān)鍵的細胞培養(yǎng)工藝條件，使表達水平達到100mg/L。
(3) 純化工藝簡便，回收率高。由于蛋白是以可溶形式表達于上清，因此簡化了純化工序，使純化回收率大大提高，使大規(guī)模生產(chǎn)抗CD25的嵌合單克隆抗體成為可能。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1高表達工程細胞獲得用FuGENE6(Boehringer Manheim)試劑將獲得的編碼抗CD25的嵌合單克隆抗體重輕鏈的重組表達載體共轉(zhuǎn)染COS-7細胞(ATCC No.CRL1651)(5000細胞/ml)，經(jīng)過三天培養(yǎng)，上清液中分泌的抗體用ELISA檢測。獲得高表達的細胞株。
實施例2選擇最佳培養(yǎng)基由種子細胞庫復蘇無血清細胞株一支，接種到T25方瓶中進行培養(yǎng)，48小時后，按照1∶3的比例將細胞接種入3個T25方瓶中，后可以按照1∶3的比例進行擴增培養(yǎng)。

將細胞以相同的密度接種入不同的培養(yǎng)基中，考察48小時后細胞的數(shù)目和表達量。實驗數(shù)據(jù)表明，細胞在B+E+P培養(yǎng)基中的細胞生長速度和產(chǎn)物的表達量均達到最高。所以選用B+E+P培養(yǎng)基作為該細胞的擴增培養(yǎng)基。
實施例3工程細胞高密度無血清懸浮培養(yǎng)研究我們考察了表達抗CD25的嵌合單克隆抗體的工程細胞在BDCHO、BD+excel620+primitone、excell 620+DOMA+primitone以及Excell 620培養(yǎng)基中的適應過程。

綜上所述，擬采用BD+excel 620+primitone培養(yǎng)基作為該細胞擴增的無血清培養(yǎng)基，進行細胞在250ml spinner中擴增培養(yǎng)，得到一定量的培養(yǎng)上清，提供純化進行純化工藝研究，并得到一定量的純品提供質(zhì)控進行結(jié)構(gòu)確證方面的工作。
實施例4抗CD25的嵌合單克隆抗體的純化細胞培養(yǎng)液4℃下8900rpm離心20min，得上清。
1.層析1(親和層析)層析介質(zhì)rProteinA緩沖液溶液APBS(20mM PB+0.1M NaCl，pH7.0)溶液B50mM Gly，pH2.8上樣將細胞培養(yǎng)液離心上清上樣。
清洗上樣后用5CV的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗后用直接用100％的溶液B洗脫。
收集收集抗CD25的嵌合單克隆抗體樣品峰。
樣品處理用調(diào)節(jié)緩沖液(50mM Gly，pH7.2)調(diào)節(jié)樣品pH至7.02.層析2(陽離子層析)層析介質(zhì) SP Sepharose FF緩沖液溶液APB(10mM PB，pH7.0)溶液BPBS(10mM PB+1M NaCl，pH7.0)上樣將中和后的含抗CD25的嵌合單克隆抗體的溶液上樣。
清洗上樣后用5CV的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗后用10CV將溶液B從0％升至100％。
收集收集抗CD25的嵌合單克隆抗體樣品峰。
樣品經(jīng)過此二步純化，即親和層析、陽離子層析以后，純度提高至95％以上。
實施例5抗CD25的嵌合單克隆抗體的生物活性檢測用常規(guī)的MTT顯色法測定抗CD25的嵌合單克隆抗體對增殖的新鮮人外周血淋巴細胞的抑制作用，其中新鮮人外周血淋巴細胞是通過加入激活劑激活使其增殖。結(jié)果表明，純化后的抗CD25的嵌合單克隆抗體具有抑制淋巴細胞的增殖作用，且活性與市售同類單抗的活性相同。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)抗CD25的嵌合單克隆抗體的方法，其特征在于，它包括步驟(a)在適合表達抗CD25的嵌合單克隆抗體的條件下，用發(fā)酵罐培養(yǎng)宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出表達的嵌合單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的宿主細胞含有編碼抗CD25的嵌合單克隆抗體的表達載體。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表達載體含有編碼抗CD25的嵌合單克隆抗體的序列。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中進行高密度懸浮培養(yǎng)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(b)包括步驟(i)培養(yǎng)液離心獲得上清液；(ii)層析純化，所述的層析純化選自親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、及其組合。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗CD25的嵌合單克隆抗體的生產(chǎn)方法，以及用于該方法的表達載體和宿主細胞。本生產(chǎn)方法不僅表達量高，而且分離純化工藝簡便。本發(fā)明還提供了相應的表達載體和工程細胞。
文檔編號C12P21/08GK101092640SQ20061002809
公開日2007年12月26日 申請日期2006年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月23日
發(fā)明者黃陽濱, 張翊, 孫九如, 任軍, 游磊, 陳子珺, 徐曉燕, 劉勇, 張甘良 申請人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司, 上海新生源生物醫(yī)藥有限公司