專利名稱：一種hbv dna基因分型的檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，特別是涉及一種病毒的檢測。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)流行世界各地，估計(jì)全球有20億人感染，其中慢性感染者3.5億，我國約占半數(shù)，全球每年約有100萬人死于HBV感染。此種感染最終可發(fā)展為肝硬化、肝癌，是當(dāng)前WHO公布的人類疾病死亡原因中居第9位的疾病。
乙型肝炎病毒主要通過宿主免疫機(jī)制引起肝臟損害，機(jī)體細(xì)胞識別病毒抗原并攻擊受感染的肝細(xì)胞引起炎癥，這個(gè)過程受包括宿主與病毒的多個(gè)因素影響。病毒基因異質(zhì)性影響著抗原的表達(dá)，可能也從中扮演了重要的角色。不同的毒株出現(xiàn)某些變異的頻率不同，不同毒株對機(jī)體免疫清除抵抗力不同以及其它的因素可能導(dǎo)致了不同基因型具有不同的感染后疾病譜。從目前的研究來看，HBV C基因型與較重的肝臟病變相關(guān)，B型則與較輕的病變相關(guān)；A型與慢性肝炎相關(guān)，D型與急性自限型肝炎相關(guān)其它基因型與疾病譜的關(guān)系還有待發(fā)現(xiàn)。
Kao發(fā)現(xiàn)C型與重癥如肝硬化和肝細(xì)胞癌有關(guān)，B型多存在于年輕的非肝硬化患者中。C型患者多是HBeAg(+)并且血清DNA含量高于B型，C型患者在HBV的免疫清除階段血清轉(zhuǎn)化比B型延遲，同時(shí)C型比B型有更高的C基因啟動子突變率。在抗病毒治療中，B型比C型對拉米夫定敏感，不過兩型產(chǎn)生藥抗性的幾率是一樣的。Lindh等對東亞地區(qū)的43名基因型為C的HBV慢性感染者的基因型及CP變異的研究表明，T1762變異更易出現(xiàn)在C基因型，感染C型后更易出現(xiàn)較重的肝臟炎癥。
對HBV進(jìn)行基因分型有利于對HBV感染的流行病學(xué)、病因?qū)W和臨床診治進(jìn)行更加深入細(xì)致的研究，現(xiàn)有研究表明不同亞型的HBV感染的臨床病程和對治療的反應(yīng)都存在著一定的差異。病毒變異是生物遺傳進(jìn)化的基本因素之一，乙型肝炎病毒變異是在慢性感染過程中為適應(yīng)生存環(huán)境而自然發(fā)生的，也可發(fā)生于應(yīng)用藥物或接種疫苗后。HBV在復(fù)制中利用RNA中間體，病毒聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶活性是有效而迅速的，病毒聚合酶缺乏校對酶活性，發(fā)生核苷酸替代變異后難以修正。已發(fā)現(xiàn)HBV序列的變異在基因組各個(gè)區(qū)域均可發(fā)生。不同的病人機(jī)體和不同的藥物與不同的變異毒株長期相互作用表現(xiàn)出不同的基因型。雖然沒有確切數(shù)據(jù)表明HBV的變異比例，但病毒變異是高頻并永恒的，現(xiàn)在已經(jīng)由最初的A～D四型發(fā)展到了A～H八型，病毒與機(jī)體的繼續(xù)斗爭將會出現(xiàn)更多的變異熱點(diǎn)和基因型。盡管HBV分型、變異與臨床表征有著一定關(guān)聯(lián)度，但是目前仍然沒有完全闡明清楚。大規(guī)模的系統(tǒng)流行病學(xué)分子特征普查將更有助人們認(rèn)識HBV與機(jī)體以及藥物的辨證關(guān)系，這就依賴于簡便快速的HBV分型方法。
對HBV進(jìn)行基因分型以及變異熱點(diǎn)的檢測，在選擇合適的藥物或制訂治療方案等方面都有重要指導(dǎo)。目前臨床檢測市場迫切需要有相關(guān)成熟的技術(shù)方案尤其是針對病毒分子特征以及機(jī)理的方法，來進(jìn)一步指導(dǎo)乙肝的臨床治療。雖然有很多實(shí)驗(yàn)室都在研究HBV分型及變異的檢測方法，但國內(nèi)外市場上還沒有檢測HBV基因型的臨床診斷用產(chǎn)品。
國內(nèi)外對HBV進(jìn)行基因分型的方法可分為全基因序列比對和片段基因序列比對兩大類。全基因序列比對是以生物系統(tǒng)發(fā)生學(xué)中的基因同源性為基礎(chǔ)的，它主要是通過HBV全基因序列測定來進(jìn)行基因分型，另外，也可應(yīng)用對HBV全基因進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(RFLP)。片段基因序列比對是利用HBV中的代表性片段的序列類型來反映全基因序列的類型，主要技術(shù)類型有片段基因序列測定、PCR-RFLP、型特異引物(SSP)擴(kuò)增法和型特異探針(SSO)檢測法等。序列測定雖然結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是由于其技術(shù)復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)流程長、實(shí)驗(yàn)條件要求高、耗時(shí)長和費(fèi)用昂貴難以作臨床常規(guī)使用，目前只作為實(shí)驗(yàn)室研究使用；RFLP技術(shù)相對簡單，但是酶切位點(diǎn)易受基因變異影響，且遇混合感染或酶切不完全，會出現(xiàn)復(fù)雜條帶，影響分型結(jié)果判斷應(yīng)用SSP法進(jìn)行PCR擴(kuò)增需要多個(gè)擴(kuò)增管，使用常規(guī)的PCR后產(chǎn)物電泳的方法也容易污染，其靈敏性比特異性探針低；應(yīng)用SSO法可通過對單管的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測來分型，因此具有操作相對簡單和費(fèi)用較低等特點(diǎn)，最具有實(shí)用價(jià)值?；蛐酒夹g(shù)也能建立乙型肝炎病毒基因分型診斷的方法，但費(fèi)用較高，檢測時(shí)需要昂貴的芯片掃描儀，且探針固定技術(shù)，檢測靈敏度等關(guān)鍵技術(shù)還未取得重大突破，目前尚未見有基因芯片進(jìn)行HBV基因分型的產(chǎn)品上市。
實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)是在常規(guī)PCR的一對引物之外，加入一個(gè)兩端帶有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針。在探針完好的狀態(tài)下，5’端報(bào)告熒光基團(tuán)的激發(fā)光被3’端的淬滅熒光基團(tuán)所抑制。PCR反應(yīng)過程中，隨著鏈的延伸，Taq酶沿著DNA模板移動到熒光標(biāo)記探針的結(jié)合位置，由于它的5’->3’外切核酸酶活性，將熒光探針切斷，釋放出報(bào)告熒光基團(tuán)的熒光信號，每合成一條新生鏈，就有一個(gè)報(bào)告基團(tuán)的信號釋放，被釋放的激離報(bào)告熒光基團(tuán)的數(shù)目和PCR產(chǎn)物是同時(shí)增多。通過熒光PCR儀定時(shí)動態(tài)監(jiān)測每一循環(huán)，可以得到樣品實(shí)際擴(kuò)增曲線，找到PCR擴(kuò)增的對數(shù)期，可以對樣本作定性定量檢測。HBV的變異是不斷產(chǎn)生的，目前的分型方法均只能基于現(xiàn)在已經(jīng)取得的研究成果，分型依據(jù)和分型辦法均在不斷發(fā)展中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題的是提供一種HBV DNA分型的檢測方法及其試劑盒，以克服現(xiàn)有技術(shù)對HBV DNA分型檢測比較煩瑣復(fù)雜的缺陷。
技術(shù)方案為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是一種HBV DNA基因分型的檢測方法，即在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，使用以下結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸序列作為檢測探針序列B 5’AAATC TCCAG 3’；序列C 5’AGCAC CCACG 3’；序列D 5’ACTAC CGTGT 3’；本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需特別的試驗(yàn)即可以理解，采用包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列，只要包含了上述分型特異性序列B、C和/或D，即可同樣達(dá)到本發(fā)明的技術(shù)效果；同樣，與上述的序列B、C、D和包含B、C、D的同源性大于75％的序列，事實(shí)上也可以達(dá)到HBV基因分型的目的，但本發(fā)明需要指出的是，其替代效果不一定比上述明確指出的序列更好；同理，不管上述序列B、C、D還是包含B、C、D的序列還是同源性大于75％的序列，其堿基互補(bǔ)序列只是堿基形式上的變化，并未改變本發(fā)明的技術(shù)方案實(shí)質(zhì)；上述的各種序列還可以經(jīng)添加互補(bǔ)臂形成分子信標(biāo)探針，以利用分子熒光進(jìn)行HBV分型檢測，這種分子信標(biāo)探針是上述各種序列所構(gòu)成的發(fā)明方案的一種合理延伸，也是上述序列的一種理所當(dāng)然的可能利用方式；在實(shí)際應(yīng)用中，還有一種可能是使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合，來達(dá)到檢測HBV某一型或者一型以上的目的，如使用包含序列B的延長序列和與序列C同源的序列和含序列D的分子信標(biāo)探針進(jìn)行HBV分型等等。
上述的HBV DNA基因分型的檢測方法的一種優(yōu)選方案為，以所說的探針之一或一條以上作為引物參與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。其原理是，以上各種探針是特異地與目標(biāo)序列嚴(yán)格互補(bǔ)的，所以同時(shí)也可以作為引物使用。這種可以省略引物的使用的技術(shù)方案，也是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員常用手段之一。
上述的HBV DNA基因分型的檢測方法的另一種優(yōu)選方案為，可以采用標(biāo)記探針技術(shù)來標(biāo)記所說的檢測探針。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需特別的試驗(yàn)即可以理解，用來標(biāo)記的熒光發(fā)光基團(tuán)可以為FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的任意一種或一種以上的組合；同樣，熒光淬滅基團(tuán)可以為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一種或一種以上的組合。熒光發(fā)光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的不同選擇，將影響到檢測的靈敏度和使用的成本，但不影響本發(fā)明提供的檢測方案的實(shí)質(zhì)。
本發(fā)明還提供上述探針在PCR反應(yīng)過程中的使用方法，即采用單管PCR反應(yīng)檢測HBV的某個(gè)型；或者，用另一種使用方法為，分兩管，在同一時(shí)間運(yùn)行同一PCR擴(kuò)增程序，分別檢測兩個(gè)型或者一個(gè)型與通用型；或者，用另一種使用方法為，分三管，在同一時(shí)間運(yùn)行同一PCR擴(kuò)增程序，分別檢測兩個(gè)型和通用型。具體說明如下上述的HBV DNA基因分型的檢測方法的一種實(shí)現(xiàn)方式是，由兩個(gè)反應(yīng)管在同一時(shí)間運(yùn)行同一擴(kuò)增程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測，兩管分別使用序列B、序列C、序列D中的任意1條。
上述的HBV DNA基因分型的檢測方法的另一種實(shí)現(xiàn)方式是，由三個(gè)反應(yīng)管在同一時(shí)間運(yùn)行同一擴(kuò)增程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測，三管分別使用序列B、序列C、序列D。
上述的HBV DNA基因分型的檢測方法的兩種實(shí)現(xiàn)方式的優(yōu)選方案為，在上述反應(yīng)管之外增加一個(gè)總HBV反應(yīng)管，與型檢測反應(yīng)管在同一時(shí)間運(yùn)行同一PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測，并且使用如下檢測探針探針U 5’ATAAA ACGCC GCAGA CAC 3’或者包含有探針U序列的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列同源性大于75％的序列；或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者上述序列經(jīng)添加互補(bǔ)臂形成的分子信標(biāo)探針。
上述的HBV DNA基因分型的檢測方法的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)運(yùn)行程序如下反應(yīng)管先在45-55℃反應(yīng)1-3分鐘，然后93-98℃保溫3-6分鐘，再按93-97℃ 15-30秒和55-65℃ 15-40秒循環(huán)35-45次。最優(yōu)選如下運(yùn)行程序反應(yīng)管先在50℃反應(yīng)2分鐘，然后95℃保溫5分鐘，再按94℃20秒→60℃30秒循環(huán)40次。
上述的HBV DNA基因分型的檢測方法的結(jié)果處理可以采取如下方案根據(jù)序列B管與序列U管檢測的Ct值的差值、序列C管與序列U管檢測的Ct值的差值、序列D管與序列U管檢測的Ct值的差值分別判斷樣本中HBV DNA中B型病毒、C型病毒、D型病毒與總病毒的病毒相對量。其中，Ct值的“C”代表Cycle，“t”代表threshold，Ct值的含義是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
進(jìn)一步理解上述結(jié)果處理方案，可以解釋為當(dāng)采用兩管或兩管以上進(jìn)行PCR反應(yīng)并且采用熒光PCR方法時(shí)，其結(jié)果數(shù)據(jù)處理方案為，根據(jù)型反應(yīng)管檢測Ct值與通用反應(yīng)管檢測的Ct值的差值來判斷樣本中型病毒和總病毒的比例關(guān)系。如B和U的兩管法，計(jì)算ΔCtB-U＝Ct-B-Ct-U，即B型反應(yīng)管檢測Ct值(Ct-B)與通用U反應(yīng)管檢測的Ct值(Ct-U)的差值，由此判斷樣本里HBV病毒中B型病毒DNA與總HBV病毒的相對量，以解決復(fù)合感染多型病毒患者的型別診斷問題。
上述的HBV DNA基因分型的檢測方法另一種檢測形式上的優(yōu)選方案為，使用序列B、序列C和序列D中的任意一條或一條以上的組合，固定在膜載體或其它固相載體上，與包含特異性互補(bǔ)序列的DNA進(jìn)行雜交。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是HBV DNA基因分型檢測的試劑盒，所述的試劑盒組成包括核酸提取試劑、反應(yīng)液、熒光標(biāo)記探針、耐熱DNA聚合酶和對照品，其特征在于，反應(yīng)液使用的引物序列為引物1和引物2；熒光標(biāo)記探針序列為5’端用FAM標(biāo)記、3’端用TAMRA標(biāo)記的序列B和/或序列C；其中，引物1為5’AGACT CGTGG TGGAC TTC 3’；引物2為5’AGGCA TAGCA GCAGG ATG 3’。
上述試劑盒的具體組成可以按照具體用途進(jìn)行調(diào)節(jié)，但均基于上述的方法和探針或引物選擇。比如一種HBV DNA分型檢測試劑盒1，其組成包括核酸提取試劑核酸擴(kuò)增試劑，其組成包括反應(yīng)液熒光探針耐熱DNA聚合酶對照品其中，反應(yīng)液使用的引物序列為引物1和引物2；熒光探針序列為探針1，其5`端用FAM標(biāo)記，其3`端用TAMRA標(biāo)記。
PCR運(yùn)行程序反應(yīng)管先在50℃反應(yīng)2分鐘，然后95℃保溫5分鐘，再按94℃20秒→60℃30秒循環(huán)40次。
又比如一種HBV DNA分型檢測試劑盒2，其組成包括核酸提取試劑核酸擴(kuò)增試劑，其組成包括反應(yīng)液熒光探針B熒光探針C耐熱DNA聚合酶對照品其中，反應(yīng)液使用的引物序列為引物1和引物2；熒光探針B序列為探針1，其5`端用FAM標(biāo)記，其3`端用TAMRA標(biāo)記；熒光探針C序列為探針2，其5`端用FAM標(biāo)記，其3`端用TAMRA標(biāo)記；PCR運(yùn)行程序反應(yīng)管先在50℃反應(yīng)2分鐘，然后95℃保溫5分鐘，再按94℃20秒→60℃30秒循環(huán)40次。
有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有HBV DNA分型檢測方法相比，具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明的HBV DNA分型檢測方法是利用了HBV基因組的型別特征位點(diǎn)，并且證明這個(gè)位點(diǎn)是可以應(yīng)用于實(shí)際檢測的。應(yīng)用特殊探針和配套PCR方法，解決了背景技術(shù)中所說的片段基因序列測定、PCR-RFLP、型特異引物(SSP)擴(kuò)增法和型特異探針(SSO)檢測法等方法的缺陷，比DNA序列測定更簡便和快速。同時(shí)，采用熒光PCR方法，可以避免PCR產(chǎn)物進(jìn)一步處理中產(chǎn)生的模板污染，簡化實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和防護(hù)要求，減少實(shí)驗(yàn)失敗的可能，提高生物安全性和檢測的穩(wěn)定性。
如本文所用，術(shù)語“分子信標(biāo)探針”即molecular beacon，是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個(gè)核苷酸長，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)；莖一般5-7個(gè)核苷酸長，并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的一端，而淬滅劑則標(biāo)記在另一端。在復(fù)性溫度下，因?yàn)槟０宀淮嬖跁r(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)加熱變性會互補(bǔ)配對的莖環(huán)雙鏈解開，如果有模板存在環(huán)序列將與模板配對。與模板配對后，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，因淬滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子。
如本文所用，術(shù)語“互補(bǔ)臂”是指探針中呈發(fā)夾形的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的兩條莖之間相互形成寡核苷酸分子內(nèi)的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1設(shè)計(jì)和制備引物、探針序列。(針對HBV DNA基因相關(guān)序列設(shè)計(jì)，GeneBank序列號為B型AB033555，C型AB014377，D型AB104709)引物1(上游引物)5’AGACT CGTGG TGGAC TTC 3’、引物2(下游引物)5’AGGCA TAGCA GCAGG ATG 3’、序列B 5’AAATC TCCAG 3’；序列C 5’AGCAC CCACG 3’；序列D 5’ACTAC CGTGT 3’；探針1(B基因型探針)5’AGT CCCAAA TCT CCA GTC AC 3’(包含序列B)、探針2(C基因型探針)5’GGA GCA CCC ACGTGT CCT GG 3’(包含序列C)、探針3(D基因型探針)5’GAA CTA CCG TGTGTC TTG GC 3’(包含序列D)探針1、2、3的熒光標(biāo)記為熒光發(fā)光基團(tuán)FAM；熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。
實(shí)施例2制備乙型肝炎病毒(HBV)分型熒光PCR檢測試劑盒。
組成為組成成分(10人份/盒)體積提取液A500μL×1管提取液B500μL×1管反應(yīng)液 560μL×1管熒光探針B 60μL×1管熒光探針C 60μL×1管MgCl2溶液 160μL×1管Taq酶(含0.67U/μLTaq酶和0.02U/LUNG酶) 90μL×1管陽性對照品 20μL×1管陰性對照品 50μL×1管試劑盒中三種反應(yīng)液配方

核酸提取試劑配方為提取液A8％聚乙二醇、1mol/LNaCl提取液B10mmol/L NaOH、0.1％SDS、15％Chelex-100、1％Tween-20陽性對照品為人工合成的HBV C型和B型DNA片段等濃度混合液。
實(shí)施例3HBV DNA的分型檢測方法，同時(shí)也是檢測試劑盒的使用方法。
1、HBV DNA提取取待測血清樣本50μL，加入50μL核酸提取液A。振蕩混勻15s。13,000rpm離心10min，棄上清。加入充分混勻的核酸提取液B 50μL，振蕩混勻，100℃水浴10min，13,000rpm離心3min。取上清供PCR擴(kuò)增用。
2、熒光PCR檢測按樣本數(shù)[樣本數(shù)＝標(biāo)本數(shù)+對照品]n分別配制兩管反應(yīng)液<B管>取反應(yīng)液n×28μL、MgCl2n×8μL、熒光探針B n×6μL、Taq酶n×3μL混于一離心管中混勻<C管>取反應(yīng)液n×28μL、MgCl2n×8μL、熒光探針C n×6μL、Taq酶n×3μL混于一離心管中混勻兩種反應(yīng)液均按45μL/管分裝到反應(yīng)管中，取待測樣本DNA抽提產(chǎn)物及對照品各5μL依次加入上述兩種反應(yīng)液中，蓋緊反應(yīng)管，低速離心數(shù)秒。置全自動熒光檢測儀上運(yùn)行如下PCR程序反應(yīng)管先在50℃反應(yīng)2分鐘，然后95℃保溫5分鐘，再按94℃20秒→60℃30秒循環(huán)40次。
實(shí)施例4HBV DNA的分型定量檢測方法，同時(shí)也是檢測試劑盒的使用方法。
1、HBV DNA提取取待測血清樣本50μL，加入50μL核酸提取液A。振蕩混勻15s。13,000rpm離心10min，棄上清。加入充分混勻的核酸提取液B 50μL，振蕩混勻，100℃水浴10min，13,000rpm離心3min。取上清供PCR擴(kuò)增用。
2、熒光PCR檢測按樣本數(shù)[樣本數(shù)＝標(biāo)本數(shù)+對照品]n分別配制兩管反應(yīng)液<B管>取反應(yīng)液n×28μL、MgCl2n×8μL、熒光探針B n×6μL、Taq酶n×3μL混于一離心管中混勻<U管>取反應(yīng)液n×28μL、MgCl2n×8μL、熒光探針U n×6μL、Taq酶n×3μL混于一離心管中混勻兩種反應(yīng)液均按45μL/管分裝到反應(yīng)管中，取待測樣本DNA抽提產(chǎn)物、B型HBV DNA定量模板1-3號(濃度分別為106、105、104copy/ml)各5μL依次加入上述兩種反應(yīng)液中，蓋緊反應(yīng)管，低速離心數(shù)秒。置全自動熒光檢測儀上運(yùn)行如下PCR程序反應(yīng)管先在45℃反應(yīng)3分鐘，然后93℃保溫6分鐘，再按93℃ 30秒和55℃ 40秒循環(huán)45次。
根據(jù)定量模板1-3號的Ct值和已知濃度可以模擬出定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按此曲線，根據(jù)某樣本的B管Ct值和U管Ct值計(jì)算出B型DNA和總HBV DNA的量值，并相除得出B型DNA占總HBV DNA的含量。
實(shí)施例5HBV DNA的相對分型定量檢測方法，同時(shí)也是檢測試劑盒的使用方法。
1、HBV DNA提取取待測血清樣本50μL，加入50μL核酸提取液A。振蕩混勻15s。13,000rpm離心10min，棄上清。加入充分混勻的核酸提取液B 50μL，振蕩混勻，100℃水浴10min，13,000rpm離心3min。取上清供PCR擴(kuò)增用。
2、熒光PCR檢測按樣本數(shù)[樣本數(shù)＝標(biāo)本數(shù)+對照品]n分別配制兩管反應(yīng)液<C管>取反應(yīng)液n×28μL、MgCl2n×8μL、熒光探針C n×6μL、Taq酶n×3μL混于一離心管中混勻<U管>取反應(yīng)液n×28μL、MgCl2n×8μL、熒光探針U n×6μL、Taq酶n×3μL混于一離心管中混勻兩種反應(yīng)液均按45μL/管分裝到反應(yīng)管中，取待測樣本DNA抽提產(chǎn)物各5μL依次加入上述兩種反應(yīng)液中，蓋緊反應(yīng)管，低速離心數(shù)秒。置全自動熒光檢測儀上運(yùn)行如下PCR程序反應(yīng)管先在55℃反應(yīng)1分鐘，然后98℃保溫3分鐘，再按97℃15秒和65℃15秒循環(huán)35次。
根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式，Ct值與原始模板濃度存在線性關(guān)系，Ct值越大則原始模板數(shù)量越少，每3.3個(gè)Ct值的變化代表約10倍的原始模板數(shù)量的變化。某樣本的C管的Ct-c大于U管的Ct-u，差值為ΔCt＝Ct-c-Ct-u，則該樣本中C型HBV占總HBV DNA的比例約為10的(-ΔCt/3.3)次冪。
實(shí)施例6HBV DNA的相對分型定量檢測方法，同時(shí)也是檢測試劑盒的使用方法。
1、HBV DNA提取取待測血清樣本50μL，加入50μL核酸提取液A。振蕩混勻15s。13,000rpm離心10min，棄上清。加入充分混勻的核酸提取液B 50μL，振蕩混勻，100℃水浴10min，13,000rpm離心3min。取上清供PCR擴(kuò)增用。
2、PCR擴(kuò)增按樣本數(shù)[樣本數(shù)＝標(biāo)本數(shù)+對照品]n配制D管反應(yīng)液取反應(yīng)液(引物1的5’端被生物素標(biāo)記)n×28μL、MgCl2n×8μL、熒光探針D n×6μL、Taq酶n×3μL混于一離心管中混勻，按45μL/管分裝到反應(yīng)管中，取待測樣本DNA抽提產(chǎn)物各5μL加入反應(yīng)液中，蓋緊反應(yīng)管，低速離心數(shù)秒。置PCR擴(kuò)增儀上運(yùn)行如下PCR程序93℃20秒→55℃30秒→72℃60秒循環(huán)40次。
3、探針雜交取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL進(jìn)行熱變性后，加入雜交液至100μL。將探針3點(diǎn)在雜交膜上，吸干后用紫外交聯(lián)方法進(jìn)行固定化。將帶有探針的膜條浸入雜交液，在42℃環(huán)境中進(jìn)行雜交反應(yīng)約15分鐘。取出膜條，轉(zhuǎn)移到100μL鏈霉親和素-堿性磷酸酶液中，室溫反應(yīng)10分鐘。取出膜條，轉(zhuǎn)移到100μL堿性磷酸酶底物液中，室溫反應(yīng)10分鐘。取出膜條，觀察探針包被點(diǎn)。如在探針點(diǎn)產(chǎn)生藍(lán)紫色斑點(diǎn)，則表明存在D型HBV DNA。
權(quán)利要求
1.一種HBV DNA基因分型的檢測方法，其特征在于，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中使用以下結(jié)構(gòu)的多聚核苷酸序列作為檢測探針序列B 5’AAATC TCCAG 3’；序列C 5’AGCAC CCACG 3’；序列D 5’ACTAC CGTGT 3’；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列同源性大于75％的序列；或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者上述序列經(jīng)添加互補(bǔ)臂形成的分子信標(biāo)探針；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV DNA基因分型的檢測方法，其特征在于，以所說的探針之一或一條以上作為引物參與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV DNA基因分型的檢測方法，其特征在于，標(biāo)記探針的熒光發(fā)光基團(tuán)為FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的任意一種或一種以上的組合；熒光淬滅基團(tuán)為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一種或一種以上的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV DNA基因分型的檢測方法，其特征在于，由兩個(gè)反應(yīng)管在同一時(shí)間運(yùn)行同一擴(kuò)增程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測，兩管分別使用序列B、序列C、序列D中的任意1條。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV DNA基因分型的檢測方法，其特征在于，由三個(gè)反應(yīng)管在同一時(shí)間運(yùn)行同一擴(kuò)增程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測，三管分別使用序列B、序列C、序列D。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的HBV DNA基因分型的檢測方法，其特征在于，增加一個(gè)總HBV反應(yīng)管，與型檢測反應(yīng)管在同一時(shí)間運(yùn)行同一PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測，并且使用如下檢測探針探針U 5’ATAAA ACGCC GCAGA CAC 3’或者包含有探針U序列的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列同源性大于75％的序列；或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者上述序列經(jīng)添加互補(bǔ)臂形成的分子信標(biāo)探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的HBV DNA基因分型的檢測方法，其特征在于，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)運(yùn)行程序如下反應(yīng)管先在45-55℃反應(yīng)1-3分鐘，然后93-98℃保溫3-6分鐘，再按93-97℃ 15-30秒和55-65℃ 15-40秒循環(huán)35-45次。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的HBV DNA基因分型的檢測方法，其特征在于根據(jù)序列B管與序列U管檢測的Ct值的差值、序列C管與序列U管檢測的Ct值的差值、序列D管與序列U管檢測的Ct值的差值分別判斷樣本中HBV DNA中B型病毒、C型病毒、D型病毒與總病毒的病毒相對量。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBV DNA基因分型的檢測方法，其特征在于使用序列B、序列C和序列D中的任意一條或一條以上的組合，固定在膜載體或其它固相載體上，與包含特異性互補(bǔ)序列的DNA進(jìn)行雜交。
10.一種HBV DNA基因分型檢測試劑盒，所述的試劑盒組成包括核酸提取試劑、反應(yīng)液、熒光標(biāo)記探針、耐熱DNA聚合酶和對照品，其特征在于，反應(yīng)液使用的引物序列為引物1和引物2；熒光標(biāo)記探針序列為5’端用FAM標(biāo)記、3’端用TAMRA標(biāo)記的序列B和/或序列C；其中，引物1為 5’AGACT CGTGG TGGAC TTC 3’；引物2為5’AGGCA TAGCA GCAGG ATG 3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種HBV DNA基因分型的檢測方法及其試劑盒。根據(jù)HBV基因型特征位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性探針及配套的引物，或設(shè)計(jì)特異性引物及配套的反向引物和病毒特異性檢測探針，對HBV基因型進(jìn)行檢測，可以單獨(dú)使用檢測型，也可以分別在數(shù)個(gè)PCR管中通過相同的PCR程序?qū)ν粯颖具M(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測，同時(shí)檢測B、C或通用型。根據(jù)型反應(yīng)管和通用型反應(yīng)管檢測Ct值的差值，對臨床樣本中HBV病毒中型病毒的比例含量進(jìn)行判斷。本發(fā)明的試劑盒性能穩(wěn)定、操作簡便、檢測快速，能很好地判斷HBV DNA的型別，幫助HBV的針對性抗病毒治療和預(yù)后的分析。
文檔編號C12Q1/68GK101045939SQ20061002530
公開日2007年10月3日 申請日期2006年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日
發(fā)明者夏懿, 沈維祥, 廖興中, 吳大治 申請人:上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司