專利名稱：用于生物芯片的活性載體、其制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生物芯片的活性載體、用于生物芯片的活性載體的制備方法、及用于生物芯片的活性載體的應(yīng)用(生物芯片基片、生物芯片、生物芯片試劑盒、及生物芯片檢測)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明中，生物芯片試劑盒(“Biochip Kit”，又簡稱“芯片試劑盒”)是定性和/或定量分析中的一種檢測裝置，其包括微通道芯片試劑盒(“Micro-tunnel BiochipKit”)和微陣列芯片試劑盒(“Bio-array Kit”或“Micro-array Kit”)。由于其高通量和微型化特點(diǎn)，生物芯片試劑盒有著廣泛的應(yīng)用范圍，包括基因表達(dá)檢測、基因篩選、藥物篩選、疾病診斷治療、環(huán)境監(jiān)測和治理、司法鑒定等領(lǐng)域。生物芯片試劑盒通常含生物芯片(“Biochip”，又簡稱“芯片”)和標(biāo)記系統(tǒng)。在我們的一項(xiàng)專利申請(PCT/CN2004/000437)中，標(biāo)記系統(tǒng)含配基、標(biāo)記物質(zhì)和納米結(jié)構(gòu)(用于納米結(jié)構(gòu)標(biāo)記物的活性載體)。
芯片的核心是其上的反應(yīng)器。芯片反應(yīng)器中最重要的叁部分為片基(用于芯片的固相載體)、固定在片基上的探針、和反應(yīng)器結(jié)構(gòu)。探針是反應(yīng)器中通過與樣品中目標(biāo)物的相互作用而固定目標(biāo)物的物質(zhì)。最早應(yīng)用的是以核酸為探針的核酸芯片。后來發(fā)展起來的包括有多肽探針的含多肽芯片(例如，多肽芯片、多肽/核酸芯片、多肽/糖芯片、等等)，由于在檢測反應(yīng)中包括多肽間相互作用，使其對穩(wěn)定性、空間反應(yīng)效率、等等均有更高的要求。片基主要是玻璃、金屬、塑料等材料及其衍生物制作的矩形、圓形或其它形狀的含有活性衍生基團(tuán)的載體。反應(yīng)器結(jié)構(gòu)包括反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)、反應(yīng)器流路結(jié)構(gòu)、反應(yīng)器分離結(jié)構(gòu)、反應(yīng)器反應(yīng)室結(jié)構(gòu)，等等。探針可以直接結(jié)合在片基上，也可以通過與活性納米結(jié)構(gòu)(用于親和納米結(jié)構(gòu)的活性載體)結(jié)合形成親和納米結(jié)構(gòu)再結(jié)合在片基上(參考我們的一項(xiàng)專利申請PCT/CN2004/000437)。
通常，片基含片基固相載體和固定在片基固相載體上的衍生物。片基中形成衍生物有兩種方式包被和表面修飾。衍生物中含用以固定探針的功能基團(tuán)。功能基團(tuán)與固相載體的連接是影響反應(yīng)質(zhì)量的重要因素。例如，芯片生物活性的有效保存、固相探針的反應(yīng)動力學(xué)條件(例如探針有效位點(diǎn)密度、空間運(yùn)動自由度、等等)、等等均與此連接有關(guān)。這一連接非常豐富也非常復(fù)雜。例如，共價(jià)鍵連接與吸附連接可能有不同的固相探針穩(wěn)定性；不同的功能基團(tuán)可能有不同的固相探針反應(yīng)效率；等等。
對片基固相載體進(jìn)行聚合物包被以引入功能基團(tuán)的工作，包括申請?zhí)枮?0020128234的美國專利、等等。這些工作基于離子配對機(jī)理，在片基活性的均勻性與穩(wěn)定性方面存在嚴(yán)重問題。
目前，通過對片基固相載體進(jìn)行表面化學(xué)修飾的工作包括1).引入偶合基團(tuán)后直接固定探針(例如，中國專利申請?zhí)朇N200310107946.X中的工作)；2).先引入偶合基團(tuán)再引入功能基團(tuán)去固定探針。在后一類工作中，引入的小分子功能基團(tuán)包括氨基、醛基(中國專利申請?zhí)朇N01105795.5、CN03132420.7)、氨基肼(美國專利申請?zhí)朥S2004235049)、環(huán)氧基及其它小分子基團(tuán)(美國專利號5,474,895)；引入的大分子功能基團(tuán)包括含氨基的聚合物(例如US專利6,413,722，中國專利申請?zhí)?00410027316.6，等等)。一般而言，引入小分子功能基團(tuán)制備的片基，其固定探針的效率及固定在其上的探針捕獲目標(biāo)物的效率均有待改進(jìn)；而引入大分子功能基團(tuán)制備的片基，其穩(wěn)定性有待改進(jìn)、或/和其制備方法較復(fù)雜(例如交聯(lián))不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
對于用于親和納米結(jié)構(gòu)的活性納米結(jié)構(gòu)、或用于納米結(jié)構(gòu)標(biāo)記物的活性納米結(jié)構(gòu)，也有與上述片基類似的問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有高效率和高穩(wěn)定性、而又易于制備的用于生物芯片的固相載體。本發(fā)明的技術(shù)方案，基于化學(xué)修飾，而且基于在固相載體表面偶合基團(tuán)上引入中等大小的功能基團(tuán)來使其功能化。
于是，本發(fā)明的第一個(gè)方面，涉及一種用于生物芯片的活性載體，其特征在于其含固相載體和固相載體表面上化學(xué)鍵合的衍生物，所述衍生物至少含偶聯(lián)基團(tuán)和偶聯(lián)基團(tuán)上以共價(jià)鍵結(jié)合的功能基團(tuán)，且所述功能基團(tuán)的分子量大于50小于1000。本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體，具有高效率和高穩(wěn)定性、而又易于制備的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的第二個(gè)方面，涉及本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一種制備方法，其至少包括1).將所述偶聯(lián)基團(tuán)以化學(xué)鍵結(jié)合在所述固相載體表面上；2).將功能物質(zhì)與1)的制備物中的所述偶聯(lián)基團(tuán)接觸并進(jìn)行反應(yīng)，所述功能物質(zhì)含所述功能基團(tuán)；3).將所述功能基團(tuán)固定在所述偶聯(lián)基團(tuán)上。
本發(fā)明的第三個(gè)方面，涉及本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的應(yīng)用，包括基于本發(fā)明的活性載體的生物芯片基片、生物芯片、生物芯片試劑盒，以及生物芯片檢測。本發(fā)明的一種多反應(yīng)器生物芯片基片，其特征在于其至少含本發(fā)明的生物芯片片基和固定在所述片基上的反應(yīng)器結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的一種生物芯片，其特征在于其至少含本發(fā)明的生物芯片片基和固定在所述片基上的二種或二種以上的探針、或至少含本發(fā)明的生物芯片基片和固定在所述基片的片基上的二種或二種以上的探針。本發(fā)明的一種生物芯片試劑盒，其特征在其含片基或本發(fā)明的生物芯片基片，以及固定在所述片基上的二種或二種以上的探針。本發(fā)明的一種生物芯片檢測方法，至少包括下列步驟A).提供可能含檢測目標(biāo)物的樣本，所述目標(biāo)物包括多肽目標(biāo)物；B).提供本發(fā)明的生物芯片；C).使所述樣本與所述探針接觸并進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)。
以下將通過實(shí)施例更為詳細(xì)地說明本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的第一個(gè)方面，涉及一種用于生物芯片的活性載體，其特征在于其含固相載體和固相載體表面上化學(xué)鍵合的衍生物，所述衍生物至少含偶聯(lián)基團(tuán)和偶聯(lián)基團(tuán)上以共價(jià)鍵結(jié)合的功能基團(tuán)，且所述功能基團(tuán)的分子量大于50小于1000。
本發(fā)明中，術(shù)語“活性載體”是指可通過其上的功能基團(tuán)有效地固定反應(yīng)物(例如探針、標(biāo)記用配基、等等)的固相載體，例如生物芯片片基、用于親和納米結(jié)構(gòu)的活性納米結(jié)構(gòu)、用于納米結(jié)構(gòu)標(biāo)記物的活性納米結(jié)構(gòu)、等等。盡管本發(fā)明的實(shí)施例中只給出了多肽作為反應(yīng)物的例子，其它生物物質(zhì)(例如核酸、細(xì)胞、糖類、等等)，也可應(yīng)用本發(fā)明的活性載體制備本發(fā)明的生物芯片組成物(例如，生物芯片片基、納米結(jié)構(gòu)標(biāo)記物、等等)。特別要指出的是，適于多肽固定的活性載體通常適合于核酸固定，而適于核酸固定的活性載體則不一定適合于多肽固定。本發(fā)明中，術(shù)語“功能基團(tuán)”是指活性載體中通過相互作用(包括親和作用、離子交換、親油作用、共價(jià)鍵合、等等)用以固定反應(yīng)物的基團(tuán)；術(shù)語“偶聯(lián)基團(tuán)”是指固相載體表面上化學(xué)鍵合的衍生物中用以聯(lián)接功能基團(tuán)和固相載體的基團(tuán)。
在本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述功能基團(tuán)的分子量大于75小于500。
在本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述功能基團(tuán)包括氨基酸基團(tuán)。
在本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述氨基酸包括脫保護(hù)氨基酸。
在本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述氨基酸包括側(cè)鏈含二個(gè)或二個(gè)以上-NH2的氨基酸。在本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述氨基酸包括側(cè)鏈含三個(gè)或三個(gè)以上-NH2的氨基酸。
在本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述氨基酸包括賴氨酸。在本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述氨基酸包括絲氨酸。在本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述氨基酸包括胱氨酸。
在本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述偶聯(lián)基團(tuán)包括有機(jī)硅基團(tuán)。例如，通過加入下述一種或多種偶聯(lián)劑引入的偶聯(lián)基團(tuán)甲基丙烯酰氧基硅烷、乙烯基硅烷、氨基硅烷、環(huán)氧基硅烷、硫基硅烷、脲基硅烷、異氰酸酯硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、等等。
在本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述共價(jià)鍵包括酰胺鍵。
在本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述活性載體包括生物芯片片基。本發(fā)明中，術(shù)語“片基”是指生物芯片的一種部件，即用于生物芯片的活性載體，其具有有效固定探針的功能。本發(fā)明的片基，至少含片基固相載體、固定在片基固相載體上的偶聯(lián)基團(tuán)、以及固定在所述偶聯(lián)基團(tuán)上的功能基團(tuán)。片基固相載體包括常規(guī)片基載體和納米結(jié)構(gòu)片基載體。所述常規(guī)片基載體為表面未固定有納米結(jié)構(gòu)的片基固相載體。盡管本發(fā)明的試施例給出的是以玻璃作為片基固相載體的例子，其它固相載體(例如硅、金、塑料片或金屬片)，也可應(yīng)用本發(fā)明的方法制備本發(fā)明的生物芯片片基。所述納米結(jié)構(gòu)片基載體為固定有納米結(jié)構(gòu)的片基固相載體。
在本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述活性載體包括用于親和納米結(jié)構(gòu)的活性納米結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的親和納米結(jié)構(gòu)，至少含納米結(jié)構(gòu)(例如，納米粒子、納米管、等等)、固定在納米結(jié)構(gòu)上的偶聯(lián)基團(tuán)、固定在所述偶聯(lián)基團(tuán)上的功能基團(tuán)、以及固定在所述功能基團(tuán)上的探針。
在本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述活性載體包括用于納米結(jié)構(gòu)標(biāo)記物的活性納米結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)標(biāo)記物，至少含標(biāo)記物質(zhì)、納米結(jié)構(gòu)(例如，納米粒子、納米管、等等)、固定在納米結(jié)構(gòu)上的偶聯(lián)基團(tuán)、固定在所述偶聯(lián)基團(tuán)上的功能基團(tuán)、以及固定在所述功能基團(tuán)上的配基。
本發(fā)明的第二個(gè)方面，涉及本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一種制備方法，1).將所述偶聯(lián)基團(tuán)以化學(xué)鍵結(jié)合在所述固相載體表面上；2).將功能物質(zhì)與1)的制備物中的所述偶聯(lián)基團(tuán)接觸并進(jìn)行反應(yīng)，所述功能物質(zhì)含所述功能基團(tuán)；3).將所述功能基團(tuán)固定在所述偶聯(lián)基團(tuán)上。
在本發(fā)明的方法的一項(xiàng)實(shí)施方案中A).所述偶聯(lián)基團(tuán)含-NH2或-COOH基團(tuán)；B).所述功能物質(zhì)含功能基團(tuán)、結(jié)合在功能基團(tuán)內(nèi)的保護(hù)基團(tuán)和可同所述偶聯(lián)基團(tuán)反應(yīng)的-NH2或-COOH基團(tuán)；C).所述功能基團(tuán)固定在所述偶聯(lián)基團(tuán)上是通過形成酰胺鍵進(jìn)行的；D).在所述功能基團(tuán)固定在所述偶聯(lián)基團(tuán)上后，所述方法還包括在固定探針前選擇性地脫去所述保護(hù)基團(tuán)。本發(fā)明的方法的一項(xiàng)實(shí)施方案，還包括在固定探針后選擇性地脫去所述保護(hù)基團(tuán)。本發(fā)明的方法的一項(xiàng)實(shí)施方案，還包括重復(fù)所述1)、2)、3)。
本發(fā)明的第三個(gè)方面，涉及本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的應(yīng)用。
本發(fā)明的一種多反應(yīng)器生物芯片基片，其特征在于其至少含本發(fā)明的生物芯片片基和固定在所述片基上的反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明術(shù)語“基片”是指指用以制備芯片的、尚未固定探針的中間產(chǎn)品，其以片基為基礎(chǔ)、結(jié)合有無其它結(jié)構(gòu)(例如隔離結(jié)構(gòu))、且在固定配基后形成芯片。基片上可以有一個(gè)或多個(gè)片基室。單片基室基片上通常沒有隔離結(jié)構(gòu)，此時(shí)基片既是片基(例如市售的氨基玻片)。多片基室基片上有隔離結(jié)構(gòu)，此時(shí)基片包括片基和隔離結(jié)構(gòu)。片基室在固定上配基后形成反應(yīng)器，多片基室基片形成多反應(yīng)器芯片。本發(fā)明術(shù)語“反應(yīng)器結(jié)構(gòu)”是指形成反應(yīng)器的必須的片基、探針以外的其它結(jié)構(gòu)，如隔離結(jié)構(gòu)、流路結(jié)構(gòu)等；術(shù)語“反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)”是指至少在加入樣品時(shí)避免反應(yīng)器之間出現(xiàn)交叉污染的結(jié)構(gòu)，包括用以隔離部分或全部反應(yīng)器結(jié)構(gòu)(例如反應(yīng)池、反應(yīng)腔室、流路、進(jìn)液結(jié)構(gòu)、出液結(jié)構(gòu)、等等)的結(jié)構(gòu)。反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)包括開放式隔離結(jié)構(gòu)和封閉式隔離結(jié)構(gòu)。開放式隔離結(jié)構(gòu)是指芯片使用時(shí)隔離結(jié)構(gòu)上方無覆蓋物的反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)。封閉式隔離結(jié)構(gòu)是指芯片使用時(shí)隔離結(jié)構(gòu)上方有覆蓋物的反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明的生物芯片基片的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述隔離結(jié)構(gòu)包括高疏水材料涂層。在本發(fā)明的生物芯片基片的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述高疏水材料的表面靜態(tài)水接觸角比所述固相載體的表面靜態(tài)水接觸角大40度以上。本發(fā)明術(shù)語“表面靜態(tài)水接觸角”是指靜態(tài)水在表面的接觸角。長時(shí)間以來，用一滴液體在固體物質(zhì)表面的接觸角θ作為特定固定濕潤的量化測試，這一點(diǎn)是被廣為認(rèn)可的。如果液體完全分散在表面上形成膜，接觸角θ為0、如果物質(zhì)表面上的液珠存在一定角度，該表面被認(rèn)為是不濕潤的。芯片中最常用的固相載體基片材料為玻璃，其表面靜態(tài)水接觸角約為45度。
在本發(fā)明的生物芯片片基的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述隔離結(jié)構(gòu)包括疏水/疏油材料涂層。
本發(fā)明的一種生物芯片，其至少含本發(fā)明的生物芯片片基或本發(fā)明的生物芯片基片。本發(fā)明的生物芯片的一項(xiàng)實(shí)施方案，其至少含本發(fā)明的生物芯片片基和固定在所述片基上的二種或二種以上的探針。本發(fā)明的生物芯片的一項(xiàng)實(shí)施方案，其為多反應(yīng)器生物芯片，其至少含本發(fā)明的生物芯片基片和固定在所述片基上的二種或二種以上的探針。本發(fā)明中，術(shù)語“探針”是指用以在檢測反應(yīng)中捕獲目標(biāo)物的物質(zhì)，例如抗原、抗體、配體、配體指數(shù)增強(qiáng)系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選的適配分子、多肽、多糖、共酶、輔因子、抗生素、類固醇、病毒、細(xì)胞、生物素、親和素等。在本發(fā)明的生物芯片片基的一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述生物芯片包括含多肽探針的芯片。本發(fā)明術(shù)語“多肽”相當(dāng)于英語中的“polypeptide”，包括天然或合成蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片斷、合成肽、等等，免疫檢測中通常的目標(biāo)物和檢測中通用的探針、例如抗原、抗體、等等都屬于多肽本發(fā)明的一種生物芯片試劑盒，其特征在于其至少含本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體。
本發(fā)明的一種生物芯片檢測方法，至少包括下列步驟A).提供可能含檢測目標(biāo)物的樣本，所述目標(biāo)物包括多肽目標(biāo)物；B).提供本發(fā)明的生物芯片；C).使所述樣本與所述探針接觸并進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)。本發(fā)明的生物芯片在下述一個(gè)或多個(gè)活動中的使用用作一種診斷工具、用作一種診斷工具、用作一種分子掃描工具、用作一種分子間關(guān)系分析工具、用作一種測試工具。
實(shí)施例實(shí)施例1本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的例子(1)本實(shí)施例中，本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體為生物芯片片基。本實(shí)施例中，所用片基固相載體為玻片，包括常規(guī)玻片和納米結(jié)構(gòu)玻片(參考我們的另一項(xiàng)專利申請PCT/CN2004/000437)。
本實(shí)施例中，所用功能物質(zhì)選自氨基酸、優(yōu)選含有-NH2側(cè)基保護(hù)基(例如Fmoc)的氨基酸。所用氨基酸分別為賴氨酸、絲氨酸、胱氨酸、和它們的混合物。按照本發(fā)明的方法，其它氨基酸也可用來制備本發(fā)明的生物芯片片基。
本實(shí)施例中，所用偶聯(lián)劑選自有機(jī)硅、優(yōu)選硅烷類化合物(例如3-氨基丙基三乙氧基硅烷)。使用硅烷類化合物可在玻片表面形成含氨基或羥基的偶合基團(tuán)。
本實(shí)施例中，本發(fā)明的生物芯片片基的一種制備方法，其至少包括1).在所述固相載體表面上鍵合形成所述偶聯(lián)基團(tuán)，所述偶聯(lián)基團(tuán)含-NH2或-COOH基團(tuán)；2).將功能物質(zhì)與1)制備的含偶聯(lián)基團(tuán)的固相載體表面接觸并進(jìn)行反應(yīng)，其中A).所述功能物質(zhì)含所述功能基團(tuán)和結(jié)合在功能基團(tuán)內(nèi)的保護(hù)基團(tuán)；B).所述功能物質(zhì)除功能基團(tuán)外還含-NH2或-COOH基團(tuán)；3).通過與所述偶聯(lián)基團(tuán)形成酰胺鍵將所述功能基團(tuán)固定在上述固相載體表面上。
本實(shí)施例制備的片基，其在固定探針(參考以下)以后，在室溫下放置12個(gè)月未見探針活性的明顯下降，而現(xiàn)有片基(例如按已知方法制備的氨基玻片、醛基玻片和按照本實(shí)施例方法制備的聚賴氨酸玻片比較)則在11個(gè)月內(nèi)以見探針活性的明顯下降。與現(xiàn)有氨基脲玻片比較，本實(shí)施例制備的片基顯示出更小的批間差。
實(shí)施例1.1偶聯(lián)基團(tuán)含氨基的生物芯片片基的制備例子(1)本實(shí)施例中，本發(fā)明的生物芯片片基的一種制備方法為1).清洗玻片并固定硅烷類基團(tuán)按公知的方法進(jìn)行。
2).固定氨基酸基團(tuán)將烘干后的固定有硅烷類基團(tuán)的玻片浸入優(yōu)選濃度的上述氨基酸的水溶液中，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，然后洗去玻片表面的未固定的物質(zhì)，烘干后備用。
實(shí)施例1.2偶聯(lián)基團(tuán)含氨基的生物芯片片基的制備例子(2)本實(shí)施例中，本發(fā)明的生物芯片片基的一種制備方法為1).清洗玻片并固定硅烷類基團(tuán)按公知的方法進(jìn)行。
2).固定氨基酸基團(tuán)將烘干后的固定有硅烷類基團(tuán)的玻片浸入優(yōu)選濃度的上述含F(xiàn)moc保護(hù)劑的氨基酸的DFM溶液中，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。然后按公知的方法脫去Fmoc保護(hù)劑，再洗去玻片表面的未固定的物質(zhì)，烘干后備用。
實(shí)施例1.3偶聯(lián)基團(tuán)含氨基的生物芯片片基的制備例子(3)本實(shí)施例中，本發(fā)明的生物芯片片基的一種制備方法為1).按已知的方法制備氨基玻片2).固定氨基酸基團(tuán)將烘干后的氨基玻片浸入優(yōu)選濃度的上述含F(xiàn)moc保護(hù)劑的氨基酸的DFM溶液中，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。然后按公知的方法脫去Fmoc保護(hù)劑，再洗去玻片表面的未固定的物質(zhì)，烘干后備用。
實(shí)施例1.4偶聯(lián)基團(tuán)含羧基的生物芯片片基的制備例子本實(shí)施例中，本發(fā)明的生物芯片片基的一種制備方法為1).清洗玻片并固定硅烷類基團(tuán)按現(xiàn)有的已知方法進(jìn)行。
2).固定含羧基的基團(tuán)按現(xiàn)有的已知方法進(jìn)行。
3).固定氨基酸基團(tuán)將烘干后的固定有羧基的玻片浸入優(yōu)選濃度的上述含F(xiàn)moc保護(hù)劑的氨基酸的DFM溶液中，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。然后按公知的方法脫去Fmoc保護(hù)劑，再洗去玻片表面的未固定的物質(zhì)，烘干后備用。
實(shí)施例2本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的例子(2)本實(shí)施例中，本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體為用于親和納米結(jié)構(gòu)的活性納米結(jié)構(gòu)、或用于納米結(jié)構(gòu)標(biāo)記物的活性納米結(jié)構(gòu)。
本實(shí)施例中，所用固相載體為納米顆粒(例如氧化硅納米微粒STN-3、LUDOXAS-40、及氧化鈦納米微粒。
本實(shí)施例中，所用功能物質(zhì)選自氨基酸、優(yōu)選含有-NH2側(cè)基保護(hù)基(例如Fmoc)的氨基酸。所用氨基酸分別為賴氨酸、絲氨酸、胱氨酸、和它們的混合物。按照本發(fā)明的方法，其它氨基酸也可用來制備本發(fā)明的生物芯片片基。
本實(shí)施例中，所用偶聯(lián)劑選自有機(jī)硅、優(yōu)選硅烷類化合物(例如3-氨基丙基三乙氧基硅烷)。使用硅烷類化合物可在玻片表面形成含氨基或羥基的偶合基團(tuán)。
本實(shí)施例中，本發(fā)明的生物芯片片基的一種制備方法，其至少包括1).在所述固相載體表面上鍵合形成所述偶聯(lián)基團(tuán)，所述偶聯(lián)基團(tuán)含-NH2或-COOH基團(tuán)。鍵合方法與現(xiàn)有的氨基化納米氧化硅的制備方法相同。
2).將上述功能物質(zhì)與1)制備的含偶聯(lián)基團(tuán)的固相載體表面接觸并進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)。
3).通過與所述偶聯(lián)基團(tuán)形成酰胺鍵將所述功能基團(tuán)固定在上述固相載體表面上。
本實(shí)施例制備的活性納米結(jié)構(gòu)，其在固定探針或標(biāo)記物配基以后，在室溫下放置1個(gè)月未見納米結(jié)構(gòu)上探針或標(biāo)記物配基活性的明顯下降。
實(shí)施例3本發(fā)明的多反應(yīng)器生物芯片基片的制備例子本實(shí)施例中，所用生物芯片片基為上述實(shí)施例1制備的片基。
實(shí)施例3.1高疏水隔離結(jié)構(gòu)基片的制備在本實(shí)施例中，所用高疏水材料分別為“聚丙烯酸脂涂料”(中國成都晨光化工設(shè)計(jì)院提供，靜態(tài)水接觸度85度)、“有機(jī)硅防水涂料”(中國成都晨光化工設(shè)計(jì)院提供，靜態(tài)水接觸度116度)、“超高疏水乳膠漆”(中國成都晨光化工設(shè)計(jì)院提供，靜態(tài)水接觸度123度)和“高疏水氧化硅涂料”(中國舟山明日納米材料公司提供，靜態(tài)水接觸度151度)。盡管本發(fā)明的反應(yīng)器的隔離結(jié)構(gòu)可以部分是、也可以全部是本發(fā)明的高疏水隔離結(jié)構(gòu)，本實(shí)施例中只給出了最為簡單的情況作為例子。
本實(shí)施例中的制備方法為將上述高疏水液態(tài)材料涂抹在上述實(shí)施例1制備的片基上隔離帶位置上，按供貨方的使用說明在室溫干燥后固化，形成高度25-115μm、寬度2.0-2.5mm的高疏水凸體。高疏水凸體可以有不同幾何圖型，本例中僅取帶狀(凸體為一條帶)和線組合(例如凸體為有間隔的2條線)2種。高疏水凸體包圍的表面可以取各種幾何圖型，本例中僅取3mm×3mm矩形。在基片此一表面上，橫向共有12個(gè)片基池，縱向有4個(gè)片基池，共有48個(gè)片基池。
實(shí)施例3.2疏水/疏油隔離結(jié)構(gòu)基片的制備在本實(shí)施例中，所用疏水-疏油材料均為市場上可購得的疏水-疏油材料，分別為城潔寶(深圳市城潔寶環(huán)?？萍加邢薰?，高疏水氧化硅涂料(中國舟山明日納米材料公司)和雙疏涂料(中國蘭光化工研究院)。盡管本發(fā)明的反應(yīng)器的隔離結(jié)構(gòu)可以部分是、也可以全部是本發(fā)明的高疏水隔離結(jié)構(gòu)，本實(shí)施例中只給出了最為簡單的情況作為例子。
本實(shí)施例中的制備方法為將上述疏水-疏油材料涂抹在上述實(shí)施例1制備的片基上隔離帶位置上，按供貨方的使用說明在室溫干燥后固化，形成高度25-115μm、寬度2.0-2.5mm的疏水-疏油凸體。疏水-疏油凸體包圍的表面可以取各種幾何圖型，本例中僅取3mm×3mm矩形。在基片此一表面上，橫向共有12個(gè)片基池，縱向有4個(gè)片基池，共有48個(gè)片基池。
實(shí)施例4本發(fā)明的生物芯片的例子本實(shí)施例中的生物芯片含上述實(shí)施例3制備的基片、或/和上述實(shí)施例2制備的用于親和納米結(jié)構(gòu)的活性納米結(jié)構(gòu)。實(shí)施例3制備的基片含上述實(shí)施例1制備的片基。本實(shí)施例所用探針為HCV抗原(中國北京人民醫(yī)院肝病研究所)和HIV1+2抗原(中國北京人民醫(yī)院肝病研究所)。
本實(shí)施例中，本發(fā)明生物芯片的制備方法為在上述基片的一個(gè)片基池中，分別將含探針的液體按照通用的點(diǎn)樣方法點(diǎn)樣在片基池中，每種液體各點(diǎn)3個(gè)直徑為80μm的點(diǎn)，間點(diǎn)距為600-700μm，形成2×3陣列。反應(yīng)池片基上的配基密度大于30點(diǎn)/cm2。所用含探針的液體分別為HCV抗原(1.0mg/ml)、HIV1+2抗原溶液(1.0mg/ml)、HCV抗原/活性納米結(jié)構(gòu)復(fù)合物(HCV抗原濃度0.1mg/ml)、HIV1+2抗原/活性納米結(jié)構(gòu)復(fù)合物(HIV1+2抗原濃度)。HCV抗原/活性納米結(jié)構(gòu)復(fù)合物和HIV1+2抗原/活性納米結(jié)構(gòu)復(fù)合物為親和納米結(jié)構(gòu)，其含活性納米結(jié)構(gòu)和固定在活性納米結(jié)構(gòu)上的抗原，其制備方法參考我們的另一項(xiàng)專利申請PCT/CN2004/000437。
實(shí)施例5本發(fā)明的生物芯片試劑盒的例子本實(shí)施例試劑盒分別為1).含實(shí)施例4制備的生物芯片的試劑盒；2).含納米結(jié)構(gòu)標(biāo)記物的試劑盒；3).含實(shí)施例4制備的生物芯片和納米結(jié)構(gòu)標(biāo)記物的試劑盒。本實(shí)施例中，納米結(jié)構(gòu)標(biāo)記物含羅丹明、活性納米結(jié)構(gòu)和固定在活性納米結(jié)構(gòu)上的羊抗人二抗，其制備方法參考我們的另一項(xiàng)專利申請PCT/CN2004/000437。
實(shí)施例6本發(fā)明的生物檢測方法的例子在本實(shí)施例中，1號樣為HCV抗體陽性血清，2號樣為HIV1+2抗體陽性人血清，3號樣為陰性對照物(HCV抗體和HIV1+2抗體都為陰性的血清對照物)。所有的樣品均經(jīng)使用經(jīng)典的ELISA方法在血清20倍稀釋反應(yīng)條件下預(yù)先檢測。
在本實(shí)施例中，所用生物芯片試劑盒為實(shí)施例5制備的試劑盒。對照試劑盒中，芯片為分別在氨基玻片和環(huán)氧基玻片(Microarray Technology)上按常規(guī)的點(diǎn)樣方法固定有相同配基制備的芯片，標(biāo)記物為羅丹明標(biāo)記羊抗人二抗(美國Jackson ImmunoRresearch Laboratories公司)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，前述3種樣品分別加入生物芯片的反應(yīng)池中。加樣量為15μl，反應(yīng)30分鐘后洗滌5次，洗滌液每次加入量為25μl。標(biāo)記物加入量為15μl，反應(yīng)后洗滌5次，洗滌液每次加入量為25μl，干燥后在35/50下進(jìn)行掃描。掃描儀為共聚焦激光掃描儀(Afymetrix公司GMS418芯片掃描儀)，掃描激發(fā)光波長532nm，發(fā)射光波長570nm，讀取的信號經(jīng)處理軟件(JAGUARII)處理，然后取平均值后根據(jù)Cut-off值判定陰(-)陽(+)性得到的結(jié)果。所得結(jié)果與ELISA方法在血清20倍稀釋反應(yīng)條件下預(yù)先檢測的結(jié)果一致且檢測下限更低。本發(fā)明的生物芯片試劑盒與對照試劑盒比較，在37℃時(shí)穩(wěn)定性要高20％以上，且檢測下限要低15％以上。
本發(fā)明的生物芯片試劑盒在下述一個(gè)或多個(gè)活動中的使用用作一種診斷工具、用作一種分子掃描工具、用作一種分子間關(guān)系分析工具、用作一種測試工具。
應(yīng)當(dāng)清楚，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，對這里所述的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案顯然可以作出各種變動和修改。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍及不減小其優(yōu)點(diǎn)的情況下，可以進(jìn)行這些修改和變動。因此，這些修改和變動包括在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于生物芯片的活性載體，其特征在于其含固相載體和固相載體表面上化學(xué)鍵合的衍生物，所述衍生物至少含偶聯(lián)基團(tuán)和偶聯(lián)基團(tuán)上以共價(jià)鍵結(jié)合的功能基團(tuán)，且所述功能基團(tuán)的分子量大于50小于1000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性載體，其特征在于所述功能基團(tuán)的分子量大于75小于500。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性載體，其特征在于所述功能基團(tuán)包括氨基酸基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性載體，其特征在于所述偶聯(lián)基團(tuán)包括有機(jī)硅基團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性載體，其特征在于所述共價(jià)鍵包括酰胺鍵。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性載體，其特征在于所述活性載體包括生物芯片片基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性載體，其特征在于所述活性載體包括用于親和納米結(jié)構(gòu)的活性納米結(jié)構(gòu)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性載體，其特征在于所述活性載體包括用于納米結(jié)構(gòu)標(biāo)記物的活性納米結(jié)構(gòu)。
9.權(quán)利要求1-8之一所述用于生物芯片的活性載體的制備方法，至少包括下列步驟1).將所述偶聯(lián)基團(tuán)以化學(xué)鍵結(jié)合在所述固相載體表面上；2).將功能物質(zhì)與1)的制備物中的所述偶聯(lián)基團(tuán)接觸并進(jìn)行反應(yīng)，其中所述功能物質(zhì)含所述功能基團(tuán)；3).將所述2)中所述功能基團(tuán)固定在所述偶聯(lián)基團(tuán)上。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中A).所述偶聯(lián)基團(tuán)含-NH2或-COOH基團(tuán)；B).所述功能物質(zhì)含功能基團(tuán)、結(jié)合在功能基團(tuán)內(nèi)的保護(hù)基團(tuán)和可同所述偶聯(lián)基團(tuán)反應(yīng)的-NH2或-COOH基團(tuán)；C).所述功能基團(tuán)固定在所述偶聯(lián)基團(tuán)上是通過形成酰胺鍵進(jìn)行的；D).在所述功能基團(tuán)固定在所述偶聯(lián)基團(tuán)上后，所述方法還包括在固定探針前選擇性地脫去所述保護(hù)基團(tuán)。
11.一種多反應(yīng)器生物芯片基片，其特征在于其至少含權(quán)利要求6所述生物芯片片基和固定在所述片基上的反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)。
12.一種生物芯片，其特征在于其至少含權(quán)利要求6所述生物芯片片基和固定在所述片基上的二種或二種以上的探針、或至少含權(quán)利要求11所述生物芯片基片和固定在所述基片的片基上的二種或二種以上的探針。
13.一種生物芯片試劑盒，其特征在于其至少含權(quán)利要求1-8之一所述用于生物芯片的活性載體。
14.一種生物芯片檢測方法，至少包括下列步驟A).提供可能含檢測目標(biāo)物的樣本，所述目標(biāo)物包括多肽目標(biāo)物；B).提供權(quán)利要求13所述生物芯片試劑盒；C).使所述樣本與所述試劑盒中的生物芯片上的探針接觸并進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于生物芯片的活性載體，其含固相載體和固相載體表面上化學(xué)鍵合的衍生物，所述衍生物至少含偶聯(lián)基團(tuán)和偶聯(lián)基團(tuán)上以共價(jià)鍵結(jié)合的功能基團(tuán)，且所述功能基團(tuán)的分子量大于50小于1000。本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體，具有高效率和高穩(wěn)定性、而又易于制備的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的一種制備方法。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的用于生物芯片的活性載體的應(yīng)用，包括基于本發(fā)明的活性載體的生物芯片基片、生物芯片、生物芯片試劑盒，以及生物芯片檢測。
文檔編號C12Q1/00GK1811427SQ20061002022
公開日2006年8月2日 申請日期2006年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月25日
發(fā)明者鄒方霖, 王建霞, 陳春生 申請人:成都夸常醫(yī)學(xué)工業(yè)有限公司