專利名稱：一種從動物肝臟中提取酯酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種制備酯酶的方法，特別是一種從動物肝臟中提取酯酶的方法。
背景技術：
酯酶(EC 3.1.1.1)又名羧酸酯酶(carboxylesterase)，是一種羧酸酯水解酶，它能夠水解酯鍵生成對應的酸和醇(或酚)，它的特點是水解羧酸酯時具有高度的立體選擇性。
在以往的研究過程中發(fā)現(xiàn)，酯酶廣泛純在許多脊椎動物、昆蟲、植物、及分枝桿菌當中。僅在脊椎動物體內的小腸、肝、腮腺、腎皮層、肺、胰臟以及大腦皮層等器官中就廣泛純在。尤其在動物肝臟中大量純在，如豬肝、牛肝、馬肝、羊肝、兔肝、鼠肝和雞肝。本發(fā)明主要涉及一種從動物肝臟中提取酯酶的方法。
經過研究對比發(fā)現(xiàn)，在幾種動物肝臟中，豬肝中酯酶含量高，提取的酯酶活力高，并且來源豐富，穩(wěn)定性較好，所以以往對豬肝酯酶研究較多。
豬肝酯酶作為羧酸酯酶的一種，從上個世紀70年代起就已經開始研究。豬肝酯酶(Pig Liver Esterase，PLE)是從豬肝中提取的，是水解酶的一種，屬于絲氨酸水解酶，它能水解酯、酰胺等類物質，它是使用最廣泛的合成光學活性醇或羧酸的酯酶，它的特點是水解羧酸酯時高度的立體選擇性。
從豬肝中直接提取的豬肝酯酶是多種同工酶的混合物，其分子量在162kDa左右，由于同工酶在底物特異性和立體選擇性上的差異，使該混合酶表現(xiàn)出廣泛的底物特異性。現(xiàn)在進口的豬肝酯酶，如Sigma公司生產的酯酶PLE(Porcineliver esterase)，實際上是提取而未經分離的豬肝酯酶同工酶(α、β和γ亞基)混合物，豬肝酯酶的各種同工酶可以由α、β和γ三種亞基隨機組成，每個亞基相對分子量在65000Da左右。其中α亞基分子量為58200Da，β亞基分子量為59700Da，γ亞基分子量為61400Da。
近幾年來，國內外關于豬肝酯酶應用的研究較多，對其生化特性的研究也較早。
豬肝酯酶具有立體選擇性，是手性合成中重要的水解酶，是手性合成工業(yè)中最常用的三種生物催化劑之一，是目前最常應用于手性催化工業(yè)的試劑之一。
另外目前在臨床診斷方面，由于人體白細胞的中性粒細胞的細胞漿中含有酯酶，因此通常通過檢測尿液中的酯酶來確定尿液中白細胞的數量，從而診斷各種尿路炎癥。其檢測原理正是根據酯酶能夠水解酯鍵的的性質，利用酯酶這一特殊性質，在尿液臨床診斷方面，通常使用豬肝酯酶代替人體尿液中白細胞，作為臨床診斷試紙中白細胞檢測試紙的質控品，也可以用于尿液分析質控液中，用來代替尿液中的白細胞。
隨著人們對豬肝酯酶酶學性質認識和研究的不斷深入，以及對其分離純化技術的不斷提高，豬肝酯酶在化學工業(yè)、生物制藥及相關領域中的應用會更加穩(wěn)定、高效、和廣泛，其用途也在不斷的開發(fā)和探索之中。
國內目前還沒有關于生產酯酶的文獻報導，而在國外目前酯酶生產方法主要是生物提取方法和發(fā)酵法，近幾年豬肝酯酶的基因克隆研究也取得了一定的進展。和生物提取方法相比，發(fā)酵法比較復雜、設備要求較高、成本較高、且制備的酶活力較低，不宜采用。在以往酯酶的生物提取方法中，國外有文獻報導從豬胰臟中提取酯酶的方法，由于酯酶在胰臟中含量較少，所以不宜于大規(guī)模生產。
目前由于國內沒有生產酯酶的技術，產品只能從國外進口，進口酯酶的價格也比較高，因此開發(fā)一種原料來源廣泛，制備方法簡單，價格便宜、穩(wěn)定性好的高純酯酶是必要的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種生產工藝簡單、設備簡單、收率高、酶活力高、生產成本低、環(huán)境污染小、有益于大批量生產的高純度酯酶的制備方法，該方法克服了現(xiàn)有生產酯酶方法的不足。
本發(fā)明從動物肝臟中提取酯酶的方法和步驟如下1)脫脂肝粉制備將動物新鮮肝臟除去表面組織，切成碎塊，然后用組織搗碎機攪碎、充分勻漿，然后收集。加入約2體積丙酮充分攪拌后，離心，收集沉淀、干燥。
將肝粉顆粒研磨、過篩，收集細粉。然后加入三氯甲烷充分攪拌，抽濾，重復兩次，收集濾餅，干燥，濾液收集。
在動物肝臟中，豬肝、牛肝和馬肝來源相對豐富，在本實驗中，我們分別選用豬肝、牛肝和馬肝，都采用相同的實驗步驟，結果經過研究對比發(fā)現(xiàn)，它們當中酯酶含量都很高，但是其中豬肝中酯酶含量最高，提取的酯酶活力高，并且穩(wěn)定性較好。
在本步驟實驗中，我們可以將丙酮和三氯甲烷廢液分別收集，經過重新蒸餾后，可以重復使用，不影響使用效果。這樣既減少了環(huán)境污染，又可以降低成本。
2).酯酶粗品制備將肝粉用氨水水溶液于37℃恒溫水浴20分鐘，抽濾，收集濾液，將濾餅再重復操作一次，合并兩次濾液。將所得水溶液酸化、離心、收集上清液，然后調PH至中性，用硫酸銨初次鹽析、離心、收集上清，再次鹽析、收集沉淀，得酯酶粗品。
本實驗步驟中氨水可以用氫氧化鈉或氫氧化鉀代替，但是使用氨水效果較好，氨水使用濃度為0.1moL/L～0.5moL/L。酸化時，酶液的PH值最好控制在5.6～6.5之間，這樣可以除去更多的雜蛋白。用硫酸銨鹽析前，PH值最好調節(jié)至7.0～8.0之間。
3).精制將粗品用緩沖液溶解后，經過預先平衡過的陰、陽離子交換柱層析純化，接收酯酶溶液主峰部分，濃縮，然后直接加入到平衡過的凝膠柱分離，接收主產物峰。
本步驟實驗中的離子交換層析柱可以選用陰離子交換層析柱，也可以選用陽離子交換層析柱，也可兩者聯(lián)用。選用陰、陽離子交換層析柱時，我們是根據待分組份在某一PH值條件下的帶電狀態(tài)、及分離效果來決定的。
在陰離子交換層析時，我們分別選用的是葡聚糖離子交換劑DEAE-SephadexA-50、瓊脂糖離子交換劑DEAE Sepharose FF和交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑DEAEBio-Gel A三種弱堿型陰離子交換劑，以及QAE-Sephadex A-50和Q Sepharose FF兩種強堿型陰離子交換劑，做對比實驗。選用的緩沖液是磷酸鹽緩沖液，根據酯酶的酶學性質和待分組份的性質，選用的磷酸鹽緩沖液PH值在5.6～6.7范圍之內。先用0.02moL/L磷酸鹽緩沖液沖洗，然后再用0.03moL/L～0.05moL/L的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫。
經過實驗對比研究，我們得出結論如下葡聚糖離子交換劑DEAE-Sephadex A-50、瓊脂糖離子交換劑DEAE SepharoseFF和交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑DEAE Bio-Gel A三種弱堿型陰離子交換劑分離效果優(yōu)于QAE-Sephadex A-50和Q Sepharose FF這兩種強堿型陰離子交換劑。
在陽離子交換層析時，我們分別選用的是葡聚糖離子交換劑CM-SephadexC-50、瓊脂糖離子交換劑CM Sepharose FF和交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑CM Bio-GelA三種弱酸型陽離子交換劑，以及SP-Sephadex C-50和SP Sepharose FF兩種強酸型陽離子交換劑，做對比實驗。選用的磷酸鹽緩沖液PH值范圍是5.6～6.7。
經過實驗對比研究，我們得出結論如下葡聚糖離子交換劑CM-Sephadex C-50、瓊脂糖離子交換劑CM Sepharose FF和交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑CM Bio-Gel A三種弱酸型陽離子交換劑分離效果優(yōu)于SP-Sephadex C-50和SP Sepharose FF這兩種強酸型陽離子交換劑。
通過對比以上實驗結果，我們發(fā)現(xiàn)，使用陽離子交換層析的純化效果不如使用陰離子交換層析，但是兩者聯(lián)合使用，先做陰離子交換柱層析再做陽離子交換柱層析，實驗效果較好。
經過離子交換柱層析后的接收液，若體積過大，則需要進行濃縮。濃縮可選擇透析方法或超濾方法，考慮到酶穩(wěn)定性因素，我們優(yōu)先考慮使用超率方法，這樣可縮短濃縮時間。超濾所用膜包的截流分子量范圍可以是1萬道爾頓～10萬道爾頓，但最好選用10萬道爾頓，這樣既能起到濃縮的作用，同時又能達到進一步純化、提高酯酶收率的效果。
在凝膠層析實驗中，我們選用0.02moL/L磷酸鹽緩沖液作為洗脫液，分別選用以下三組凝膠(1)葡聚糖凝膠Sephadex G-150和Sephadex G-200(2)聚丙烯酰胺凝膠Bio-Gel P-150、和Bio-Gel P-200(3)聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠Sephacryl S-200HR和Sephacryl S-300HR，經過對比實驗，我們得出以下結論葡聚糖凝膠Sephadex G-150、聚丙烯酰胺凝膠Bio-Gel P-200和聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠Sephacryl S-200HR在同組凝膠中相比分離效果較好。
4)超濾、濃縮、凍干。
將收集的溶液經過微孔濾膜預過濾后，通過超濾膜包，用去離子水沖洗，收集截流酯酶溶液，預凍后，于凍干機上凍干。
此處所用超濾膜包的截流分子量最好選用10萬道爾頓，這樣既能起到純化、除鹽、濃縮的效果，又能保證酯酶的收率。膜包的材質可以是聚醚砜或再生纖維素等材料。
酯酶比活力的測定測定方法采用國際上通用的滴定法，根據酯酶酶活的定義1unit是在PH為8.0、溫度為25℃時每分鐘能夠催化1.0μmoL丁酸乙酯水解成丁酸和乙醇。
具體方法如下將0.025mL丁酸乙酯加入到25mL、0.1％(V/V)的丁酸乙酯水溶液當中，攪拌，平衡到25℃，加入經過標定的10mM的氫氧化鈉溶液，調節(jié)溶液PH＝8.0，然后一邊攪拌一邊加入0.1mL酯酶溶液(5mg酯酶溶于10mL、10mM、PH＝8.0的硼酸緩沖液，平衡到25℃)，接觸反應立即開始計時，同時開始緩慢滴加10mM氫氧化鈉溶液，維持反應液PH值在8.0左右，當PH值重新達到8.0并穩(wěn)定時，記錄下水解反應的時間和消耗掉氫氧化鈉溶液的體積，然后按下式計算。
酯酶的比活力為(Uints/mg)=(M)·(V)·(F)(m)·(T)]]>其中M——氫氧化鈉溶液的摩爾濃度V——消耗掉氫氧化鈉溶液的體積F——稀釋倍數m——加入反應液中酯酶的質量T——水解反應的時間本發(fā)明中，經過以上實驗步驟所得的酯酶經過酶活測定，酶比活力達到100units/mg以上。
由此可見，本發(fā)明與已有制備酯酶的方法相比，具有工藝簡單、設備簡單、原材料來源廣泛、收率高、酶活力高、成本低、污染小等突出的優(yōu)點，因此我們認為本發(fā)明從動物肝臟中提取酯酶的方法是十分必要的。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，對本發(fā)明從動物肝臟中提取酯酶的方法做進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于實施例。
實施例1.脫脂肝粉制備1)將新鮮豬肝臟500克除去表面組織，用刀切碎后，加入組織搗碎機攪碎后，充分勻漿。
2)將產物倒入2000mL大燒杯中，加入約800mL丙酮，室溫攪拌20分鐘。然后倒入離心杯中，于0℃、4000轉/分鐘離心5分鐘，棄去上清，收集沉淀，然后抽真空干燥2小時。
3)收集干燥后的沉淀，研磨，然后用60目篩過篩，棄去大顆粒，收集細粉。
4)取120克肝粉倒入1000mL燒杯中，量取400mL三氯甲烷，加入燒杯中，室溫攪拌20分鐘，用布氏漏斗抽濾，棄去濾液。將濾餅再用400mL三氯甲烷攪拌20分鐘，然后抽濾，濾餅干燥后收集。
實施例2酶粗品制備1)將肝粉100克加入到400mL、0.02moL/L氨水溶液中，然后于37℃恒溫20分鐘，用布氏漏斗抽濾，收集濾液，同時將濾餅用400mL氨水溶液，重復操作一次，合并濾液，將濾液恢復到室溫。
2)將上一步濾液用0.2moL/L乙酸溶液酸化，攪拌，調PH值至6.0，析出大量沉淀，然后于0℃、4000轉/分鐘離心10分鐘，收集上清液，然后用0.02mol/L氨水調節(jié)溶液PH值至7.2。
3)向上一步溶液加入硫酸胺，緩慢攪拌，達到35％飽和度，然后于0℃、4000轉/分鐘離心10分鐘，除去沉淀，收集上清液。然后向上清液中繼續(xù)加入硫酸胺，達到65％飽和度，然后于0℃、4000轉/分鐘離心10分鐘，棄去上清，收集沉淀。
實施例3精制1)將酯酶沉淀溶于PH值6.0、0.02moL/L的磷酸鹽緩沖液25mL中，經過預先平衡的DEAE-Sephadex A-50陰離子交換層析柱，用緩沖液洗脫，洗脫大約2個柱體積時，然后改用PH值6.0、0.03moL/L～0.05moL/L的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，接收主峰。
2)將接收主峰經過預先平衡的CM-Sephadex C-50陽離子交換層析柱，然后用PH值6.0、0.02moL/L的磷酸鹽緩沖液洗脫，接收主峰，約140mL。
3)將上一步接收液用2000mL去離子水溶解，用0.45μm微孔濾膜過濾，收集濾液，然后使用截流分子量為10萬道爾頓的膜包超濾，濃縮至60mL左右。
4)將收集的上一步產物直接經過預先平衡的Sephadex G-150葡聚糖凝膠柱，然后用0.02moL/L磷酸鹽緩沖液洗脫，接收主峰約170mL。
實施例4超濾、濃縮、凍干。
1)將上一步溶液通過0.45μm濾膜過濾，收集濾液。向上一步溶液中加入2000mL去離子水，充分溶解。然后使用截流分子量為10萬道爾頓的膜包超濾，直到溶液濃縮到100mL左右。重復加水三次，每次加入2000mL去離子水，最后將溶液濃縮到150mL左右，收集截流液。
2)將溶液倒入1000mL凍干瓶內，先預凍后，再凍干。收集干燥好的酯酶，稱量約1.97克，經過酶活測定，酶比活力為117units/mg。
實施例5用牛肝代替豬肝，按照實施例1～4的實驗方法，同樣制得牛肝酯酶，稱量約1.78克，經過酶活測定，酶比活力為106unit/mg。
實施例6用馬肝代替豬肝，按照實施例1～4的實驗方法，同樣制得馬肝酯酶，稱量約1.70克，經過酶活測定，酶比活力為101unit/mg。
權利要求
1.一種從動物肝臟中提取酯酶的方法，其過程依次包括如下步驟1).脫脂肝粉制備將新鮮動物肝臟切成碎塊、攪碎、充分勻漿，然后加入丙酮后離心，收集沉淀，干燥。然后將肝粉顆粒研磨、過篩、收集細粉，加入三氯甲烷充分攪拌，抽濾，重復兩次，收集濾餅、干燥。2).酶粗品制備將肝粉用氨水溶液恒溫抽提兩次，合并濾液。將所得水溶液用乙酸溶液酸化、離心，收集上清液。然后調PH至中性，用硫酸銨初次鹽析、離心、收集上清，再次鹽析、收集沉淀，得酯酶粗品。3).精制將粗品用磷酸鹽緩沖液溶解后，經過陰、陽離子交換層析柱純化，接收主峰，濃縮，然后再經過凝膠層析柱分離，接收主產物峰。4)超濾、濃縮、凍干。將收集的溶液用微孔濾膜預過濾后，超濾、濃縮、凍干。
2.權利要求1中所述的一種從動物肝臟中提取酯酶的方法，其特征是在酶粗品制備過程中使用的氨水溶液的摩爾濃度是0.1moL/L～0.5moL/L。
3.權利要求1中所述的一種從動物肝臟中提取酯酶的方法，其特征是在酶粗品制備過程中用乙酸溶液酸化處理后的酶液PH值范圍是5.6～6.5。
4.權利要求1中所述的一種從動物肝臟中提取酯酶的方法，其特征是在精制過程中陰離子交換層析使用的陰離子交換劑是葡聚糖離子交換劑DEAE-Sephadex A-50、或瓊脂糖離子交換劑DEAE Sepharose FF、或交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑DEAE Bio-Gel A。
5.權利要求1中所述的一種從動物肝臟中提取酯酶的方法，其特征是在精制過程中陽離子交換層析使用的陽離子交換劑是葡聚糖離子交換劑CM-Sephadex C-50、或瓊脂糖離子交換劑CM Sepharose FF、或交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑CM Bio-Gel A。
6.權利要求1中所述的一種從動物肝臟中提取酯酶的方法，其特征是陰、陽離子交換層析過程中使用的磷酸鹽緩沖液的PH值范圍是5.6～6.7。
7.權利要求1所述的一種從動物肝臟中提取酯酶的方法，其特征是在精制過程中凝膠層析使用的凝膠是葡聚糖凝膠Sephadex G-150、或聚丙烯酰胺凝膠Bio-Gel P-200、或聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠Sephacryl S-200HR。
8.權利要求1中所述的一種從動物肝臟中提取酯酶的方法，其特征在于超濾過程中使用膜包的截流分子量是10萬道爾頓。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從動物肝臟中提取酯酶的方法。首先將動物肝臟攪碎、勻漿、經過脫脂處理后制成肝粉，然后將其用氨水溶液抽提，酸、堿處理后鹽析，制成酶粗品，然后經過陰、陽離子交換層析柱、凝膠層析柱純化，最后超濾、濃縮、凍干，制成凍干粉。本發(fā)明提取工藝簡單、設備簡單、原料來源豐富、生產成本低、環(huán)境污染小，而且產品穩(wěn)定、收率高、酶活力高，有益于大批量生產。
文檔編號C12N9/18GK1844378SQ200610016759
公開日2006年10月11日 申請日期2006年4月11日 優(yōu)先權日2006年4月11日
發(fā)明者修志明 申請人:修志明