專利名稱：液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血清膽堿酯酶測定試劑及其制法，用于血清膽堿酯酶的定量測定。
背景技術(shù)：
血清膽堿酯酶來源于肝臟。在急慢性肝炎、肝硬化、肝癌、低蛋白血癥等情況下，活性下降，指示肝臟合成酶的功能受損。許多有機化合物抑制膽堿酯酶的活性，臨床上常見于有機磷中毒，輕度情況下，可致膽堿酯酶活性下降30％；中度情況下，活性下降50％；重度情況下，活性下降可達70％。膽堿酯酶活力上升，散見于腎病綜合癥、甲狀腺機能亢進、糖尿病等病癥。血清膽堿酯酶的測定方法包括德國臨床化學會推薦的方法，其原理是底物丁酰硫代膽堿被血清膽堿酯酶催化水解，生成乙酸和硫代膽堿，后者使黃色的高鐵氰化鉀瞬間還原，生成接近無色的亞鐵氰化鉀。該方法通過監(jiān)測405nm處吸光度的下降速率計算出酶的活性。目前臨床應(yīng)用中常用的血清膽堿酯酶測定方法是5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)比色法或速率測定法，膽堿酯酶水解丁?；虮Ａ虼憠A，生成硫代膽堿和乙酸。硫代膽堿與巰基顯色劑5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[DTNB，dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)]反應(yīng)，生成黃色化合物5-巰基-2-硝基苯甲酸(TNBA)。采用比色或連續(xù)監(jiān)測405～415波長下吸光度的變化值計算出酶的活性。
由于丁酰硫代膽堿或丙酰硫代膽堿，以及5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)在常用的緩沖溶液中極不穩(wěn)定，目前臨床上常用的DTNB測定方法的試劑均為干粉或凍干品，以保證試劑在運輸和應(yīng)用過程中能夠維持合格的有效底物濃度和較低的空白吸光度。但干粉或凍干品試劑，由于在使用前需進行復(fù)溶，增加了臨床應(yīng)用中的繁瑣步驟，并且由于不同復(fù)溶水質(zhì)的影響，帶來了潛在的干擾因素。為了達到液體即用型試劑的要求，行業(yè)中有采用放棄反應(yīng)pH要求，將反應(yīng)pH降至6.0左右，以達到穩(wěn)定反應(yīng)底物和獲得較低空白吸光度的目的。但采取這種方法，反應(yīng)體系已遠遠偏離了膽堿酯酶最適的反應(yīng)pH，不能準確測定出被測樣本中酶的活力，并需要在計算時人為將試劑的因子數(shù)放大至3萬以上，大大降低了測定的準確性，此外，臨床應(yīng)用中某些自動化分析儀無法采用如此巨大的因子數(shù)，限定了這類液體雙試劑的使用。
在合理的液體雙試劑(pH7.60左右)應(yīng)用中，藤井隆行(日本專利平4-197199)發(fā)明了采用碘氧苯甲酸穩(wěn)定丁酰硫代膽堿或丙酰硫代膽堿和5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)的方法，但碘氧苯甲酸原料昂貴，不易獲得，且?guī)缀醪蝗苡谒?，配制水溶液試劑困難，實際應(yīng)用中采用該化合物很難配制出穩(wěn)定的膽堿酯酶試劑。此外，許多發(fā)明者發(fā)明了一些新的水溶性穩(wěn)定的膽堿酯酶底物，如美國專利6509003、4983756等，但采用這類底物缺乏廣泛可接受的試劑方法和臨床應(yīng)用質(zhì)控，底物原料沒有商品化，很難開展臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，以解決膽堿酯酶試劑應(yīng)用中存在的復(fù)溶或反應(yīng)體系偏離膽堿酯酶最適反應(yīng)pH值的問題。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案是由試劑1和試劑2組成，其中試劑1包括用于調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值的緩沖液，該緩沖液的pH值范圍是6.0～9.0，該緩沖液的濃度范圍是每升10～200mM；防腐劑苯酚，濃度范圍是每升0.1mM到飽和溶液；試劑2包括酸性緩沖液，該緩沖液的pH值范圍是3.0～6.0，該緩沖液的濃度范圍是每升2～100mM；穩(wěn)定劑苯酚，濃度范圍是每升0.1mM到飽和溶液；巰基顯色劑5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，濃度范圍是每升0.1～10mM；底物，丁酰硫代膽堿或丙酰硫代膽堿，濃度范圍是每升2～200mM；試劑1與試劑2的比例關(guān)系是在試劑2中加入試劑1后，使該工作試劑pH值是6.0～8.0。
試劑1中用于調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值的緩沖液，可以是磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液或Good′s緩沖液。
本發(fā)明一個實施方案中試劑1中用于調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值的緩沖液是磷酸鹽緩沖液，該緩沖液的濃度范圍是每升30～80mM。
本發(fā)明一個實施方案中試劑2包括酸性緩沖液，該緩沖溶液包括檸檬酸緩沖液、酒石酸緩沖液、馬來酸緩沖液、乙酸緩沖液、甘氨酸緩沖液，該緩沖溶液的pH范圍在4.0～6.0之間，該緩沖液的濃度范圍是每升5～100mM。
本發(fā)明一個實施方案中試劑2的酸性緩沖液是乙酸緩沖液，該緩沖溶液的pH范圍在4.0～5.0之間，該緩沖液的濃度范圍是每升10～80mM。
本發(fā)明一個實施方案中試劑1中防腐劑苯酚的濃度范圍是每升1～50mM。
本發(fā)明一個實施方案中試劑2中穩(wěn)定劑苯酚的濃度范圍是每升1～50mM。
本發(fā)明一個實施方案中試劑2中底物為丁酰硫代膽堿或丙酰硫代膽堿，濃度范圍是每升10～50mM。
本發(fā)明一個實施方案中試劑2中巰基顯色劑5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，濃度范圍是每升1～3mM。
本發(fā)明一個實施方案中試劑1與試劑2的比例關(guān)系是在試劑2中加入試劑1后，使該工作試劑pH值是7.4～7.8。
通過大量的實驗，我們發(fā)現(xiàn)，在酸性溶液中加入苯酚，可以長時間高溫穩(wěn)定含有丁酰硫代膽堿或丙酰硫代膽堿和5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)的試劑溶液，該試劑溶液與磷酸鹽緩沖液配合，可以配制為測定膽堿酯酶活力的穩(wěn)定試劑。本發(fā)明中采用的苯酚，不僅作為穩(wěn)定劑，還作為試劑的防腐劑使用。實驗證明，加入疊氮鈉作為防腐劑，會加大試劑的空白吸光度變化率，增加速率法測定時的非特異性干擾。苯酚作為穩(wěn)定劑使用時，應(yīng)加入到含有丁酰硫代膽堿或丙酰硫代膽堿和5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)的試劑溶液中，作為防腐劑使用時，可以加入到磷酸鹽緩沖溶液中。本發(fā)明中苯酚的用量范圍一般為每升0.10毫摩爾(mM)到飽和溶液，較好的苯酚濃度范圍為每升0.50～100毫摩爾(mM)，最好的苯酚濃度范圍為每升1～50mM。苯酚濃度低于每升0.10mM時，穩(wěn)定底物的作用較弱，苯酚濃度過高，配制的試劑有強烈的苯酚氣味，試劑容易分層。
穩(wěn)定的含有丁酰硫代膽堿或丙酰硫代膽堿和5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)的酸性試劑溶液是酸性緩沖液，pH值在3.0～6.0之間，可用的緩沖溶液包括檸檬酸緩沖液、酒石酸緩沖液、馬來酸緩沖液、乙酸緩沖液、甘氨酸緩沖液等。最適的pH范圍在4.0～6.0之間，當pH低于3.0，5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)很難溶解，pH高于6.0，底物穩(wěn)定性下降。緩沖液濃度一般在每升2～100mM之間，較好的緩沖液濃度在每升5～100mM之間，最適緩沖液濃度在每升10～80mM之間。配制時，先調(diào)整溶液pH值至5.0左右，然后溶解5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，完全溶解后，加入丁酰硫代膽堿或丙酰硫代膽堿。丁酰硫代膽堿或丙酰硫代膽堿的濃度在每升2～200mM之間，較好的底物濃度在每升5～100mM之間，最佳的底物濃度在每升10～50mM之間。5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)的可用濃度在每升0.1～10mM，較好的巰基顯色劑濃度在每升0.5～5mM之間，最佳的巰基顯色劑濃度在每升1～3mM之間。上述濃度范圍均為含有丁酰硫代膽堿或丙酰硫代膽堿和5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)的混合試劑溶液濃度，不是最終工作試劑中濃度。
測定血清膽堿酯酶試劑除上述底物和巰基顯色劑溶液以外，還需要調(diào)節(jié)反應(yīng)pH的緩沖液，常用的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、Good′s緩沖液等，以磷酸鹽緩沖液最好。pH范圍在6.0～9.0之間，調(diào)節(jié)后的工作試劑最適反應(yīng)pH應(yīng)在7.40～7.80之間，此pH范圍為膽堿酯酶最適催化活性的pH，試劑的空白吸光度變化率小于30個酶單位。磷酸鹽緩沖液的濃度范圍可以在每升10～200mM之間，較好的濃度范圍在每升20～100mM之間，最適濃度范圍在每升30～80mM之間。調(diào)節(jié)的工作試劑反應(yīng)pH并不局限于上述范圍，如可以將工作試劑的反應(yīng)pH降低到6.0左右，此時，試劑的空白吸光度變化率降低，但反應(yīng)速率嚴重下降，需要人為調(diào)節(jié)計算因子。
本發(fā)明公開的完整的血清膽堿酯酶測定試劑包括試劑1和試劑2，試劑1的作用是調(diào)節(jié)工作試劑反應(yīng)pH值，試劑2是穩(wěn)定的酶底物和巰基顯色劑溶液，與試劑一起形成完整的測定試劑。實驗證明，試劑1和試劑2分別放置37℃7天、10天、14天，底物濃度、巰基顯色劑和試劑性能沒有明顯的跌落，試劑測定的準確度和精密度沒有任何影響。
本發(fā)明優(yōu)點及有益效果是，通過在試劑成分中加入非反應(yīng)性穩(wěn)定劑，維持乙酰硫代膽堿、或丁酰硫代膽堿、或丙酰硫代膽堿與二硫代雙硝基苯甲酸的有效反應(yīng)濃度和有效試劑性能，從而達到在配制、生產(chǎn)和隨后的應(yīng)用過程中，成為即用型液體，使反應(yīng)測定pH值在7.40～7.80之間。
采用本方法制備的測定試劑具有方便、快捷、自動化等特點。
本發(fā)明同時公開了一種創(chuàng)新的膽堿酯酶配制試劑，該試劑為液體即用型雙試劑，無須進行使用前復(fù)溶，避免了復(fù)溶水質(zhì)干擾的潛在因素。
本發(fā)明同時公開了一種膽堿酯酶液體即用型雙試劑，該試劑的測定因子為理論因子或接近理論因子，由于該測定因子數(shù)小于10000，大大提高了測定的準確性，并可廣泛應(yīng)用于臨床自動化分析儀。
具體實施例以下濃度為每升毫摩爾。
實施例1工作試劑為pH為7.70，試劑2底物濃度為15mM。
試劑1試劑組分濃度磷酸鹽緩沖液pH8.1 31.25mM苯酚2mM試劑2試劑組分濃度乙酸緩沖液pH4.7520mM苯酚3mM5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 1.31mM丁酰硫代膽堿15mM試劑1和試劑2分別放置37℃14天，底物濃度、巰基顯色劑和試劑性能沒有明顯的跌落，試劑測定的準確度和精密度沒有任何影響。用于試劑測定計算的因子數(shù)在7000～8000之間。
實施例2工作試劑為pH為7.60，試劑2底物為丙酰硫代膽堿，濃度為25mM。
試劑1試劑組分 濃度磷酸鹽緩沖液pH8.0 31.25mM苯酚 2mM試劑2試劑組分 濃度乙酸緩沖液pH4.520mM苯酚 5mM5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 1.31mM丙酰硫代膽堿 25mM試劑1和試劑2分別放置37℃ 14天，底物濃度、巰基顯色劑和試劑性能沒有明顯的跌落，試劑測定的準確度和精密度沒有任何影響。用于試劑測定計算的因子數(shù)為7000～8000。
實施例3試劑1為Tris緩沖液，工作試劑pH7.60～7.80，試劑2與實施例1相同試劑組分 濃度Tris緩沖液pH7.80 35mM苯酚 2mM試劑1和試劑2分別放置37℃ 14天，底物濃度、巰基顯色劑和試劑性能沒有明顯的跌落，試劑測定的準確度和精密度沒有任何影響。用于試劑測定計算的因子數(shù)為7000～8000。
實施例4試劑1為Good′s緩沖液中的2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪]-乙烷磺酸緩沖液，即HEPES緩沖液，工作試劑pH6.8～8.0試劑1試劑組分 濃度2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪]-乙烷磺酸緩沖液pH9.0200mM苯酚 50mM試劑2試劑組分 濃度乙酸緩沖液pH3.0100mM苯酚 50mM5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 3.5mM丁酰硫代膽堿 5mM試劑1和試劑2分別放置37℃ 14天，底物濃度、巰基顯色劑和試劑性能沒有明顯的跌落，試劑測定的準確度和精密度沒有任何影響。用于試劑測定計算的因子數(shù)為7000～8000。
實施例5工作試劑pH為6.0，試劑2底物濃度為25mM。
試劑1試劑組分 濃度磷酸鹽緩沖液pH6.0 31.25mM苯酚 0.1mM試劑2試劑組分 濃度乙酸緩沖液pH4.75 20mM苯酚 0.1mM5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 1.31mM丁酰硫代膽堿 25mM試劑1和試劑2分別放置37℃14天，底物濃度、巰基顯色劑和試劑性能沒有明顯的跌落，試劑測定的準確度和精密度沒有任何影響。由于反應(yīng)pH較低，反應(yīng)速率下降，用于試劑測定計算的因子數(shù)為17000～18000。
實施例6試劑2為檸檬酸緩沖液，工作試劑pH為6.0。
試劑1試劑組分 濃度磷酸鹽緩沖液pH7.0 100mM苯酚 2mM試劑組分 最適濃度檸檬酸緩沖液pH5.0 45mM苯酚 5mM5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 0.5mM丁酰硫代膽堿 150mM試劑1和試劑2分別放置37℃14天，底物濃度、巰基顯色劑和試劑性能沒有明顯的跌落，試劑測定的準確度和精密度沒有任何影響。由于反應(yīng)pH較低，反應(yīng)速率下降，用于試劑測定計算的因子數(shù)為17000～18000。
實施例7試劑2為酒石酸緩沖液，工作試劑pH為6.0。
試劑1試劑組分 濃度磷酸鹽緩沖液pH6.0 120mM苯酚 1mM試劑組分 濃度酒石酸緩沖液pH6.0 60mM苯酚 5mM5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 10mM丁酰硫代膽堿 2mM試劑1和試劑2分別放置37℃ 14天，底物濃度、巰基顯色劑和試劑性能沒有明顯的跌落，試劑測定的準確度和精密度沒有任何影響。由于反應(yīng)pH較低，反應(yīng)速率下降，用于試劑測定計算的因子數(shù)為17000～18000。
實施例8試劑2為馬來酸緩沖液，工作試劑pH為6.0～8.0。
試劑1試劑組分 濃度磷酸鹽緩沖液pH7.5 30mM苯酚 飽和試劑組分 濃度馬來酸緩沖液pH5.1 18mM苯酚 5mM5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 8mM丁酰硫代膽堿 3mM試劑1和試劑2分別放置37℃ 14天，底物濃度、巰基顯色劑和試劑性能沒有明顯的跌落，試劑測定的準確度和精密度沒有任何影響。由于反應(yīng)pH較低，反應(yīng)速率下降，用于試劑測定計算的因子數(shù)為17000～18000。
實施例9底物為丙酰硫代膽堿，工作試劑pH為6.0～8.0。
試劑1試劑組分 濃度磷酸鹽緩沖液pH8.5 40mM苯酚 1mM試劑2試劑組分 濃度甘氨酸緩沖液pH4.0 20mM苯酚 飽和5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 0.1mM丙酰硫代膽堿 200mM
試劑1和試劑2分別放置37℃14天，底物濃度、巰基顯色劑和試劑性能沒有明顯的跌落，試劑測定的準確度和精密度沒有任何影響。由于反應(yīng)pH較低，反應(yīng)速率下降，用于試劑測定計算的因子數(shù)為17000～18000。
上述實施例1～實施例9配制完成后，其應(yīng)用方法與相關(guān)領(lǐng)域中試劑的應(yīng)用方法相同，在此不再贅述。
上述實施例1～實施例9試劑的配方和配制方法僅用于說明本發(fā)明的原理及其應(yīng)用，本發(fā)明絕不局限于上述舉例的應(yīng)用范圍；在本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明的原理和方法配制出與之類似的各種測定試劑，但并不脫離出本發(fā)明的原理和應(yīng)用范圍。
權(quán)利要求
1.一種液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在于由試劑1和試劑2組成，其中試劑1包括用于調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值的緩沖液，該緩沖液的pH值范圍是6.0～9.0，該緩沖液的濃度范圍是每升10～200mM；防腐劑苯酚，濃度范圍是每升0.1mM到飽和溶液；試劑2包括酸性緩沖液，該緩沖液的pH值范圍是3.0～6.0，該緩沖液的濃度范圍是每升2～100mM；穩(wěn)定劑苯酚，濃度范圍是每升0.1mM到飽和溶液；巰基顯色劑5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，濃度范圍是每升0.1～10mM；底物，丁酰硫代膽堿或丙酰硫代膽堿，濃度范圍是每升2～200mM；試劑1與試劑2的比例關(guān)系是在試劑2中加入試劑1后，使該工作試劑pH值是6.0～8.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在于試劑1中用于調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值的緩沖液，可以是磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液或Good′s緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在于試劑1中用于調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值的緩沖液是磷酸鹽緩沖液，該緩沖液的濃度范圍是每升30～80mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在于試劑2包括酸性緩沖液，該緩沖溶液包括檸檬酸緩沖液、酒石酸緩沖液、馬來酸緩沖液、乙酸緩沖液、甘氨酸緩沖液，該緩沖溶液的pH范圍在4.0～6.0之間，該緩沖液的濃度范圍是每升5～100mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在于試劑2的酸性緩沖液是乙酸緩沖液，該緩沖溶液的pH范圍在4.0～5.0之間，該緩沖液的濃度范圍是每升10～80mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在于試劑1中防腐劑苯酚的濃度范圍是每升1～50mM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在于試劑2中穩(wěn)定劑苯酚的濃度范圍是每升1～50mM。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在于試劑2中底物為丁酰硫代膽堿或丙酰硫代膽堿，濃度范圍是每升10～50mM。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在于試劑2中巰基顯色劑5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，濃度范圍是每升1～3mM。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，其特征在于試劑1與試劑2的比例關(guān)系是在試劑2中加入試劑1后，使該工作試劑pH值是7.4～7.8。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種液體穩(wěn)定的血清膽堿酯酶試劑，用于體外定量測定人血清或其他體液中膽堿酯酶的活力。由試劑1和試劑2組成，通過在試劑中加入非反應(yīng)性穩(wěn)定劑，維持丁酰硫代膽堿或丙酰硫代膽堿與二硫代雙硝基苯甲酸的有效反應(yīng)濃度和有效試劑性能，從而達到在配制、生產(chǎn)和隨后的應(yīng)用過程中，本發(fā)明所采用的制備技術(shù)及根據(jù)此技術(shù)配制的測定試劑均為即用型液體，反應(yīng)測定pH值最佳在7.40～7.80之間，采用本方法制備的測定試劑具有方便、快捷、自動化等特點。大大提高了測定的準確性，并可廣泛應(yīng)用于臨床自動化分析儀。
文檔編號C12Q1/46GK1811393SQ20061001656
公開日2006年8月2日 申請日期2006年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月25日
發(fā)明者王學忠, 顧小豐 申請人:長春迪瑞實業(yè)有限公司