專利名稱：一種提高結縷草抗寒性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及提高植物抗逆性的方法，特別是涉及一種提高結縷草抗寒性的方法。
背景技術：
為美化城市、改善環(huán)境，我國北方許多城市大力建植草坪，但以冷季型草坪草居多。冷季型草坪草雖綠期長、色澤優(yōu)美，但耗水量大，因生長迅速需經(jīng)常修剪，夏季易感染病蟲害，養(yǎng)護費用高。我國是發(fā)展中國家，經(jīng)濟實力有限，淡水資源缺乏，西北地區(qū)尤甚，因此無論是城市綠化還是水土保持工程，都應把開發(fā)抗旱、抗病、管理粗放、綠色期長的草坪與地被植物作為重點。結縷草是禾本科(Poaceae)結縷草屬(Zoysia Willd.)重要的暖季型(Warm-season)草坪植物，主要分布于中國、日本、朝鮮和其它溫帶沿海國家(Engelke MC(2000)Widely used for centuries，zoysiagrass is a time-tested reservoir of genetic diversity.Diversity 16(1-2)48-49)。該植物具有諸多優(yōu)良特性，可彌補冷季型草坪草的不足，如1)耐旱、耐熱性極強；2)耐鹽堿性強；3)耐磨、耐踐踏、彈性好；4)耐修剪；5)具有較好的抗病蟲性；6)耐土壤貧瘠；7)耐低水平養(yǎng)護(劉建秀等(1997)，華東地區(qū)結縷草屬植物形態(tài)類型及其坪用價值，草地學報15(1)42-47)。與草地早熟禾相比，結縷草的耗水量比草地早熟禾低30-40％，而草坪彈力是草地早熟禾的30-40倍，此外，建植和管理費用比草地早熟禾低80％(胡叔良(1997)，發(fā)展草坪綠地關鍵問題的探討，中國草地267-70)。因此，結縷草已成為運動場、開放綠地、邊坡綠化及水土保持的首選草種，是適合我國國情的草坪草種。
我國結縷草資源豐富，且結縷草是我國目前唯一一種具有出口創(chuàng)匯能力的草種。中華結縷草(Zoysia sinica Hance)不僅具有日本結縷草的優(yōu)良特性，而且其耐鹽性比日本結縷草強，可在鹽堿地大面積推廣種植。然而，中華結縷草作為草坪草美中不足的是抗寒性差，對低溫極為敏感，當環(huán)境溫度低于10℃時即進入休眠。在我國北方地區(qū)，結縷草每年的綠期平均只有約6個月，嚴重限制了其在北方地區(qū)的推廣(李德穎(2001)，結縷草與高羊茅混播——草坪的黃金搭檔，中國花卉園藝，2024-25)。因此，培育綠色期長，抗寒性強且草坪質地優(yōu)良的新品種(系)，具有重要的理論和實踐意義。
實踐證明，傳統(tǒng)的結縷草育種方法很難在短期內達到育種目的。目前為止，抗寒性提高、綠期明顯延長的結縷草新品種仍未培育成功。
1997年，Stockinger等從擬南芥中分離到一種轉錄激活因子CBF1/DREB1b(C-repeat/dehydration-reponsive element binding factorl)，具有AP2/EREBP DNA結合域，能識別冷誘導基因COR(Cold regulated gene)的CRT/DRE元件，并對其表達進行調控(Stockinger EJ，Gilmour SJ & Thomashow MF(1997)Arabidopsisthaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator thatbinds to the C-repeat/DRE，a cis-acting DNA regulatory element that stimulatestranscription in response to low temperature and water deficit.PNAS 941035-1040)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種提高結縷草抗寒性的方法。
本發(fā)明所提供的提高結縷草抗寒性的方法，是將擬南芥冷誘導基因的轉錄激活因子基因CBF1/DREB1b轉化結縷草胚性愈傷組織，結縷草的抗寒性得到提高；所述CBF1/DREB1b的GenBank號為NM-118681。
所述目標基因CBF1/DREB1b可通過農(nóng)桿菌介導法、基因槍等方法轉化結縷草胚性愈傷組織，優(yōu)選為農(nóng)桿菌介導法；所述農(nóng)桿菌可為任意一種根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌，優(yōu)選為農(nóng)桿菌C58。
具體來講，所述提高結縷草抗寒性的方法，可包括以下步驟1)將結縷草胚性愈傷組織用攜帶有擬南芥冷誘導基因的轉錄激活因子基因CBF1/DREB1b的農(nóng)桿菌菌液進行侵染；所述菌液是將攜帶有CBF1/DREB1b的農(nóng)桿菌菌體重懸于侵染培養(yǎng)基至OD600值為0.4-0.6，所述侵染培養(yǎng)基是在無CaCl2的MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了25-35g/L蔗糖(Sucrose)，8-12g/L葡萄糖(Glucose)，0.008-0.012％Triton X-100，3.5-4.5mg/L VB1，80-120mg/L甜菜堿，40-60mg/L乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，pH5.0-5.4；2)將經(jīng)侵染的結縷草胚性愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)結束后對愈傷組織進行洗滌；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基是在無CaCl2的MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了25-35g/L蔗糖，8-12g/L葡萄糖，0.008-0.012％瓊脂(Agar，質量百分濃度)，0.008-0.012％Triton X-100(體積百分濃度)，3.5-4.5mg/LVB1，80-120mg/L甜菜堿(Betaine)，0.8-1.2mg/L2，4-D和40-60mg/L乙酰丁香酮，pH5.0-5.4；3)將共培養(yǎng)后的胚性愈傷組織置于篩選培養(yǎng)基上進行篩選；所述篩選培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了1.5-2.5mg/L2，4-D，0.08-0.12mg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)，0.8-1.2mg/L草丁膦(Glufosinate)，200-300mg/L頭孢噻肟(Cefotaxine)，pH5.5-6.0；4)將篩選出的胚性愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)；所述分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了0.8-1.2mg/L6-芐基腺嘌呤，0.8-1.2mg/L草丁膦，200-300mg/L頭孢噻肟，pH5.5-6.0；5)將分化出芽的小苗置于生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)；所述生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了0.15-0.25mg/L α-萘乙酸和2-4mg/L草丁膦，pH5.5-6.0；6)將生出根系的植株置于壯苗篩選培養(yǎng)基上篩選出抗寒性提高的結縷草壯苗；所述壯苗篩選培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了4-6mg/L草丁膦，pH5.5-6.0。
在上述提高結縷草抗寒性的方法中，所述結縷草胚性愈傷組織的獲得方法包括以下步驟(1)選取飽滿的結縷草種子，去除穎殼，滅菌；(2)將種子置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷組織；所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了1.8-2.2mg/L2，4-D，0.05-0.2mg/L6-BA，25-35g/L蔗糖，6-8g/L瓊脂，pH 5.5-6.0；(3)將長出的愈傷組織置于繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)；所述繼代培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了0.8-1.2mg/L2，4-D，0.2-0.5mg/L6-BA，25-35g/L蔗糖，6-8g/L瓊脂，pH 5.5-6.0；(4)將經(jīng)繼代培養(yǎng)的愈傷組織先置于增殖和維持培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，再將經(jīng)增殖培養(yǎng)的愈傷組織置于愈傷組織分化培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，仍具有分化能力的愈傷組織為胚性愈傷組織；所述增殖和維持培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了0.8-1.2mg/L2，4-D，0.4-0.6mg/L6-BA，25-35g/L蔗糖，6-8g/L瓊脂，pH 5.5-6.0；所述愈傷組織分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了0.8-1.2mg/L6-BA，0.15-0.25mg/L α-萘乙酸，25-35g/L蔗糖，6-8g/L瓊脂，pH 5.5-6.0。
在上述胚性愈傷組織的獲得方法中，步驟(1)中對種子進行滅菌的方法為將種子先用70％(體積百分濃度)的乙醇滅菌1-2min，然后用含0.8-1.2％(體積百分濃度)吐溫20的10％(質量百分濃度)次氯酸鈉(NaClO)滅菌20-30min，最后用無菌水沖洗2-4次。
步驟(2)中愈傷組織的誘導條件為在24-26℃下暗培養(yǎng)4-5周；所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基優(yōu)選為在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了2.0mg/L2，4-D，0.05-0.2mg/L6-BA，30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH 5.5-6.0。
步驟(3)中的繼代培養(yǎng)條件為在24-26℃下暗培養(yǎng)；所述繼代培養(yǎng)基優(yōu)選為在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了1mg/L2，4-D，0.2-0.5mg/L6-BA，30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH 5.5-6.0。
步驟(4)中愈傷組織的增殖培養(yǎng)條件為在24-26℃下暗培養(yǎng)3-6個月，所述愈傷組織增殖和維持培養(yǎng)基優(yōu)選為在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了1mg/L2，4-D，0.5mg/L6-BA，30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH5.5-6.0；所述愈傷組織的分化培養(yǎng)條件為在溫度24-26℃、光照強度1000-3000umol m-2s-1、光照時間14-16h/天的條件下培養(yǎng)4-6周，所述愈傷組織分化培養(yǎng)基優(yōu)選為在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了1.0mg/L6-BA，0.2mg/L α-萘乙酸，30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH 5.5-6.0。
此外，步驟1)中用于配制攜帶有擬南芥冷誘導基因的轉錄激活因子基因CBF1/DREB1b的農(nóng)桿菌菌液的侵染培養(yǎng)基是在無CaCl2的MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.01％Triton X-100，4mg/L VB1，100mg/L甜菜堿，50mg/L乙酰丁香酮，pH5.2；攜帶有CBF1/DRE1b的農(nóng)桿菌菌液對胚性愈傷組織的侵染時間為5-10min。
所述擬南芥冷誘導基因的轉錄激活因子基因CBF1/DREB1b可通過攜帶有CBF1/DREB1b的植物表達載體導入農(nóng)桿菌；用于構建所述植物表達載體的出發(fā)載體可為任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表達載體。
所述攜帶有CBF1/DREB1b的植物表達載體中還含有CBF1/DREB1b的啟動子和終止子。所述啟動子和終止子的選擇是多種多樣的，所述啟動子可為組成型表達啟動子中的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、Actin啟動子或Ubiquitin啟動子等，所述終止子可為Tnos終止子或T35S終止子等。
以pBI121為出發(fā)載體，構建的植物表達載體為pBPCBF1bar(該載體的物理圖譜見圖4A)，該載體具有篩選基因——草丁膦乙酸轉移酶基因(bar)。
步驟2)中的共培養(yǎng)條件為溫度25-26℃，黑暗條件下培養(yǎng)5-7天；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選為在無CaCl2的MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.01％瓊脂，0.01％Triton X-100，4mg/L VB1，100mg/L甜菜堿，1mg/L 2，4-D和50mg/L乙酰丁香酮，pH 5.2。
所述愈傷組織的洗滌方法可為先用滅菌水洗滌3-4次至洗滌液清亮后，用含1000mg/L頭孢噻肟的0.02％(體積百分濃度)吐溫20洗滌1-2次。
為獲得更好的共培養(yǎng)效果，可在共培養(yǎng)培養(yǎng)基表面覆蓋一張無菌濾紙。
步驟3)中的篩選培養(yǎng)條件為溫度25-26℃，黑暗條件下培養(yǎng)6-10周；所述篩選培養(yǎng)基優(yōu)選為在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了2mg/L 2，4-D，0.1mg/L 6-芐基腺嘌呤，1mg/L草丁膦，250mg/L頭孢噻肟，pH 5.5-6.0。
為提高轉基因植株的陽性率，可每隔3周將培養(yǎng)基中草丁膦的濃度提高1mg/L。
步驟4)中的分化培養(yǎng)條件為溫度24-26℃，光照強度1000-3000umol m-2s-1，光照時間14-16h/天，培養(yǎng)至分化出小苗；所述分化培養(yǎng)基優(yōu)選為在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了1mg/L6-芐基腺嘌呤，1mg/L草丁膦，250mg/L頭孢噻肟，pH 5.5-6.0。
為提高愈傷組織的分化效率可每隔2-3周更換一次培養(yǎng)基。
步驟5)中的培養(yǎng)條件為溫度24-26℃，光照強度1000-3000umol m-2s-1，光照時間14-16h/天，培養(yǎng)30-60天至長出發(fā)達根系；所述生根培養(yǎng)基優(yōu)選為在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了0.2mg/L α-萘乙酸和3mg/L草丁膦，pH5.5-6.0。
步驟6)中的培養(yǎng)條件為溫度24-26℃，光照強度1000-3000umol m-2s-1，光照時間14-16h/天，培養(yǎng)20-40天得到茁壯小苗；所述壯苗篩選培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了5mg/L草丁膦，pH 5.5-6.0。
上述提高結縷草抗寒性的方法對所有結縷草屬(Zoysia Willd.)的植物均適用，尤其適用于中華結縷草(Zoysia sinica Hance)。
本發(fā)明提供了一種提高結縷草抗寒性的方法。該方法是利用轉基因手段，將擬南芥冷誘導基因的轉錄因子CBF1/DREB1b(C-repeat/dehydration-reponsive elementbinding factorl)導入結縷草，再經(jīng)體外培養(yǎng)，得到抗寒性提高的結縷草。該方法具有以下優(yōu)點1)利用轉基因技術進行品種改良，避開了傳統(tǒng)育種方法育種時間長、效率低的缺陷，同時，由于結縷草不被人和動物食用，且除種子生產(chǎn)外，一般不會開花結實，所以不存在生物安全性和基因漂移問題；2)建立了結縷草高頻再生愈傷系的篩選方法，并在此基礎上提供了一套簡單、有效的轉基因植株的培養(yǎng)方法通過在繼代培養(yǎng)中提高6-BA濃度(0.2-0.5mg/L)，降低2，4-D濃度(0.8-1.2mg/L)，并延長繼代次數(shù)，篩選到了適合于轉化的高頻再生愈傷系，掃描電鏡觀察結果表明該類愈傷系表面有許多未分化的胚性細胞團；在侵染和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中去除CaCl2，填加Vir基因的活化誘導物-乙酰丁香酮(AS，40-60mg/L)和甜菜堿(Betaine，80-120mg/L)，同時降低2，4-D的濃度(0.8-1.2mg/L)，提高了轉化效率；此外，為使轉化細胞迅速增殖，在篩選培養(yǎng)基中提高2，4-D濃度(1.5-2.5mg/L)，并采取逐輪提高草丁膦的方式進行多輪篩選，顯著提高了轉基因植株的陽性率；3)抗寒實驗結果表明，用本發(fā)明方法獲得的轉基因株系在低溫處理后電解質滲漏值和黃葉率降低、葉綠素含量增加，轉基因株系的抗冷程度比對照明顯提高，證明該方法可降低結縷草對低溫的敏感程度，并使綠期延長。本發(fā)明對培育抗冷性提高、綠色期延長的結縷草新品種，具有重要的理論與現(xiàn)實意義，應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1為經(jīng)誘導產(chǎn)生的黃色、結構緊實的愈傷組織圖2為篩選出的胚性愈傷組織的分化結果圖3為非胚性愈傷組織的掃描電鏡觀察結果圖4為在掃描電鏡下觀察到的胚性愈傷組織體胚簇圖4A為載體pBPCBF1bar的結構示意5為抗性愈傷組織在分化培養(yǎng)基上再生出芽圖6為轉化有CBF1/DREB1b的中華結縷草轉基因再生株系圖7為CBF1/DREB1b中華結縷草轉基因再生植株的PCR檢測結果圖8為CBF1/DREB1b中華結縷草轉基因再生植株的Southern檢測結果圖9為CBF1/DREB1b中華結縷草轉基因再生植株的RT-PCR檢測結果圖10為CBF1/DREB1b陽性轉基因中華結縷草植株的生長情況圖11為在相同條件修剪3個月后各轉基因株系平均分蘗數(shù)、匍匐莖數(shù)和新長出葉片數(shù)的統(tǒng)計結果圖12為轉基因株系低溫處理前、后的葉綠素含量檢測結果圖13為轉基因株系低溫處理前、后的電解質滲漏值檢測結果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所有引物合成和測序工作均由上海生工完成。
實施例1、抗寒性提高的結縷草的培育以中華結縷草(Zoysia sinica Hance)為例，對本發(fā)明提高結縷草抗寒性的方法進行詳細說明，具體方法包括以下步驟一、中華結縷草胚性愈傷組織的獲得愈傷組織誘導培養(yǎng)基在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加2.0mg/L2，4-D，0.05-0.2mg/L6-BA，30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH 5.8。
繼代培養(yǎng)基在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加1mg/L2，4-D，0.2-0.5mg/L6-BA，30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH 5.8。
增殖和維持培養(yǎng)培養(yǎng)基在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加1mg/L2，4-D，0.5mg/L6-BA，30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH 5.8。
愈傷組織分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了1mg/L6-BA，0.2mg/Lα-萘乙酸，30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH 5.8。
按以下步驟篩選出中華結縷草胚性愈傷組織(1)選取采自山東省膠州市的飽滿的中華結縷草種子，去除穎殼，并對種子進行滅菌，滅菌方法為將種子先用70％(體積百分濃度)的乙醇滅菌1-2min，然后用含1.0％(體積百分濃度)吐溫20的10％(質量百分濃度)次氯酸鈉(NaClO)滅菌20-30min，最后用無菌水沖洗3次；(2)將經(jīng)滅菌的種子置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，在25℃下暗培養(yǎng)，4-5周后有愈傷組織長出，經(jīng)檢測誘導率70％以上，但誘導出的愈傷組織多為白色、結構不緊實，需進行繼代培養(yǎng)；(3)將長出的愈傷組織置于繼代培養(yǎng)基上，在24-26℃、黑暗條件下進行繼代培養(yǎng)，共繼代3次，每次間隔4周，結果約10-20％的愈傷組織呈黃色、結構緊實(見圖1)；(4)將經(jīng)繼代培養(yǎng)獲得的黃色、結構緊實的愈傷組織先置于增殖和維持培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在25℃下暗培養(yǎng)8-10周，再將經(jīng)增殖培養(yǎng)的愈傷組織置于愈傷組織分化培養(yǎng)基中，部分愈傷組織仍具有較高的分化能力(見圖2)，并可形成胚性愈傷系(Embryogenic callus lines)。用掃描電鏡對其進行觀察，這些愈傷組織表面有許多未分化的胚性細胞團結構(見圖4)，而非胚性愈傷組織表面無此結構(見圖3)。用上述方法反復篩選，獲得5個胚性愈傷系，發(fā)生頻率約為1％。
二、CBF1/DREB1b中華結縷草轉基因再生植株的獲得LB液體培養(yǎng)基10g/L胰蛋白凍，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，1g/L D-葡萄糖，30mg/L利福平(rifampicin)，100mg/L卡那霉素(kanamycin)，pH 7.0。
侵染培養(yǎng)基在無CaCl2的MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.01％Triton X-100，4mg/L VB1，100mg/L甜菜堿，50mg/L乙酰丁香酮，pH 5.2。
共培養(yǎng)培養(yǎng)基在無CaCl2的MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.01％瓊脂，0.01％Triton X-100，4mg/LVB1，100mg/L甜菜堿，0.8-1.2mg/L2，4-D和50mg/L乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，pH5.2。
篩選培養(yǎng)基在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加2mg/L2，4-D，0.1mg/L6-芐基腺嘌呤，1mg/L草丁膦(Glufosinate)，250mg/L頭孢噻肟(Cefotaxine)，pH 5.8。
分化培養(yǎng)基在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加1mg/L6-芐基腺嘌呤，1mg/L草丁膦，250mg/L頭孢噻肟，pH 5.8。
生根培養(yǎng)基在1/2 MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加0.2mg/L α-萘乙酸(NAA)和3mg/L草丁膦，pH 5.8。
壯苗篩選培養(yǎng)基在1/2 MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加5mg/L草丁膦，pH 5.8。
1、攜帶有擬南芥冷誘導基因的轉錄激活因子基因CBF1/DREB1b的工程菌菌液的制備1)構建擬南芥冷誘導基因的轉錄激活因子基因CBF1/DREB1b的植物表達載體，具體方法為根據(jù)擬南芥CBF1/DREB1b(GenBank號NM-118681)的核苷酸序列設計引物并以擬南芥的基因組DNA為模板PCR擴增該基因，然后將PCR擴增的目的基因連接入載體p35Sbar(p35S-intron含Adh1內含子的CaMV35S啟動子，bar草丁膦抗性基因bar基因，Nos胭脂堿合成酶終止子)中并替換掉該載體原有的bar基因，將該攜帶有目的基因的中間載體命名為p35S CBF1；再用p35S CBF1中CBF1/DREB1b表達盒替換掉載體pBI121(Clontech公司)中的GUS表達盒，得到含有CBF1/DREB1b的重組載體，命名為pBPCBF1；最后將p35Sbar中的bar表達盒插入到pBPCBF1中，得到目的基因CBF1/DREB1b的植物表達載體，命名為pBPCBF1bar，其結構示意圖見圖4A(Nos胭脂堿合成酶終止子，barbar基因，p35S-intron含Adh1內含子的CaMV35S啟動子，CBF1CBF1/DREB1b基因，LB/RBT-DNA左、右邊界)；2)將pBPCBF1bar用電擊法導入農(nóng)桿菌C58菌株中，經(jīng)篩選得到攜帶有CBF1/DREB1b的侵染用工程菌；3)挑取步驟2)獲得的陽性重組子，將其接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28℃、160rpm下培養(yǎng)12-24小時，培養(yǎng)結束后，離心收集菌體，將菌體重懸于侵染培養(yǎng)基中，使菌液OD600nm值達到0.4-0.6。
2、抗寒性提高的中華結縷草的獲得1)侵染以步驟一獲得的色澤鮮艷、結構致密的胚性愈傷系為轉化受體，將其在步驟1制備的攜帶有CBF1/DREB1b的工程菌液中浸染5-10min，然后將其置于滅菌濾紙上吸干菌液。
2)共培養(yǎng)將吸干侵染液的愈傷組織轉入表面覆有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在溫度25-26℃、暗培養(yǎng)5-7天，然后用滅菌水對愈傷組織洗滌3次，至洗滌液呈清亮狀態(tài)，再用含1000mg/L頭孢噻肟的0.02％吐溫20洗滌1次。
3)愈傷組織對草丁膦臨界耐受濃度的確定及篩選培養(yǎng)(1)愈傷組織對草丁膦臨界耐受濃度的確定pBPCBF1bar具有草丁膦抗性基因bar，因而用草丁膦作為篩選劑篩選出轉化有pBPCBF1bar的愈傷組織，現(xiàn)進行敏感實驗以確定愈傷組織對草丁膦臨界耐受濃度，實驗方法為將中華結縷草的愈傷組織置于含不同濃度草丁膦的篩選培養(yǎng)基上，然后用常規(guī)培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。結果草丁膦濃度高于2mg/L時，愈傷組織的分化能力明顯受到受抑制，草丁膦濃度高于3mg/L時，生根明顯受到抑制，草丁膦濃度高于5mg/L時，再生植株生長受到抑制。根據(jù)上述敏感實驗結果，采用在不同篩選階段逐步提高篩選劑草丁膦的濃度方法進行多輪篩選。
(2)篩選培養(yǎng)將共培養(yǎng)后的愈傷組織置于篩選培養(yǎng)基上，先在溫度25-26℃、黑暗條件下培養(yǎng)1個月，然后挑選色澤鮮艷、生長健康的愈傷組織再進行兩輪篩選(間隔3周)，同時每進行一輪篩選，將篩選培養(yǎng)基中草丁膦的濃度提高1mg/L。
4)分化培養(yǎng)將篩選出的抗性愈傷組織轉入分化培養(yǎng)基上，在溫度25-26℃、光照強度1600-3000umol m-2s-1、光照時間15-16h/天下培養(yǎng)，每隔3周更換新鮮培養(yǎng)基，直至出芽(見圖5)，而非抗性愈傷組織逐漸褐化死亡。
5)生根培養(yǎng)將分化出芽的小苗轉入生根培養(yǎng)基上，在溫度25-26℃、光照強度1600-3000umol m-2s-1、光照時間15-16h/天下培養(yǎng)30-40天，直至長出發(fā)達根系。
6)壯苗篩選將生根后的再生植株轉入壯苗篩選培養(yǎng)基上，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)20-40天，得到3個穩(wěn)定的中華結縷草轉基因再生株系(見圖6，分別命名為Z14、Z19、Z20)。
三、CBF1/DREB1b中華結縷草轉基因再生植株的分子鑒定1、PCR檢測用CTAB法提取步驟二獲得的CBF1/DREB1b中華結縷草轉基因再生株系Z20、Z19和Z14的基因組DNA并以此為模板，在上游引物P15’-AAGATGCCTCTGCCGACAGTG-3’(CaMV35S啟動子的一段核苷酸序列)和下游引物P25’-TAACTCCAAAGCGACACGTC-3’(CBF1/DREB1b的一段核苷酸序列)的引導下進行PCR檢測，以野生型中華結縷草和用與步驟二相同方法培育的非轉基因組培苗為陰性對照，以質粒pBPCBF1bar為陽性對照，反應結束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖7所示(泳道WT野生型中華結縷草，泳道NT非轉基因組培苗，泳道Z20轉基因再生株系Z20，泳道Z19轉基因再生株系Z19，泳道Z14轉基因再生株系Z14，泳道MDNA分子量標準，泳道P陽性對照質粒pBPCBF1bar)，以轉基因株系Z20、Z19和Z14的基因組DNA為模板，均可擴增出約1.3kb的特異條帶，與陽性對照質粒pBPCBF1bar的PCR擴增結果一致，而野生型植株和非轉基因組培苗作為陰性對照，均未擴增出該特異性條帶，初步表明CBF1/DREB1b已整合到中華結縷草再生株系Z20、Z19和Z14的基因組中。
2、Southern檢測在質粒pBPCBF1bar中bar基因的表達盒兩側各有一個限制性內切酶HindIII酶切位點(見圖4A)，取100ng質粒pBPCBF1bar，對其用限制性內切酶HindIII進行酶切，回收并純化長度約為2kb的含有CBF1/DREB1b基因表達盒的DNA片段，然后對該片段用α-32P-dATP進行標記(用Promega公司的Prime-a-Gene labelling System試劑盒并按照試劑盒說明進行操作)，以其作為對中華結縷草再生株系Z20、Z19和Z14進行Southern檢測的探針。Southern檢測方法為取CBF1/DREB1b中華結縷草轉基因再生株系Z20、Z19和Z14的基因組DNA各30ug，以野生型中華結縷草和用與步驟二相同方法培育的非轉基因組培苗為陰性對照，以質粒pBPCBF1bar為陽性對照，進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，然后轉移至尼龍膜(Hybond-N+，Boehringer Mannheim GmbH，Germany)，再按Sambrook等人(Sambrook J，F(xiàn)ritsch E，Maninatis T.MolecularCloningA Laboratory Manual.2nded.New YorkCold Spring Harbor Laboratory，1989)的方法進行雜交，最后用磷屏掃描儀(Storm-820，Molecular Dynamic公司)記錄雜交信號。雜交信號檢測結果如圖8所示(WT野生型中華結縷草，NT非轉基因組培苗，Z20轉基因再生株系Z20，Z19轉基因再生株系Z19，Z14轉基因再生株系Z14，MDNA分子量標準，P陽性對照質粒pBPCBF1bar)，Z20、Z19和Z14均產(chǎn)生雜交信號，進一步證明外源基因CBF1/DREB1b已整合到中華結縷草再生株系Z20、Z19和Z14的基因組中。
3、RT-PCR檢測用TRIzol(Invitrogen公司)提取野生型中華結縷草(陰性對照)和中華結縷草再生株系Z20、Z19、Z14的總RNA，用無RNA酶活性的DNA酶降解殘留的基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，再取等量總RNA(100ng)用Clontech公司的反轉錄試劑盒(PowerScriptTMReverse Transcriptase，Ca.No.639500)反轉錄合成其cDNA。然后以反轉錄合成的cDNA為模板，在CBF1/DREB1b基因的上游引物P3(5’-AACTCATTTTCAGCTTTTTC-3’)和下游引物P2(5’-TAACTCCAAAGCGACACGTC-3’)的引導下進行PCR擴增，以用與步驟二相同方法培育的非轉基因組培苗為陰性對照，以質粒pBPCBF1bar為陽性對照，反應結束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖9所示(泳道WT野生型中華結縷草，泳道Z20轉基因再生株系Z20，泳道Z19轉基因再生株系Z19，泳道Z14轉基因再生株系Z14，泳道MDNA分子量標準，泳道P陽性對照質粒pBPCBF1bar)，轉基因再生株系Z20、Z19和Z14的擴增產(chǎn)物與陽性對照一致，擴增出了大小約為0.64kb的片段，而陰性對照無擴增產(chǎn)物，上述檢測結果表明外源基因CBF1/DREB1b已在中華結縷草轉基因株系Z20、Z19和Z14中獲得了轉錄水平的表達。
四、CBF1/DREB1b陽性轉基因中華結縷草植株的生長情況觀察用上述方法獲得的CBF1/DREB1b陽性轉基因植株的生長情況，以非轉基因組培苗為對照(WT)，結果與野生型中華結縷草和用與步驟二相同方法培育的非轉基因組培苗相比，轉基因株系Z20和Z14生長較為緩慢、同時分蘗減少，在溫度為25-30℃、相對濕度60±10％的條件下，轉基因植株的生長情況見圖10。在相同條件下對各轉基因株系和對照植株進行修剪，3個月后統(tǒng)計新長出的分蘗數(shù)、匍匐莖數(shù)和葉片數(shù)，每株系測3-5個株叢，結果見圖11，Z20和Z14植株新長出的葉片數(shù)約是非轉基因植株的一半，匍匐莖數(shù)和分蘗數(shù)也比對照少，而Z19的各指標與對照接近，說明在中華結縷草中組成型表達的擬南芥CBF1/DREB1b可能會導致植株生長延緩。
實施例2、CBF1/DREB1b轉基因中華結縷草的抗冷性檢測一、CBF1/DREB1b轉基因中華結縷草的抗冷性實驗將實施例1獲得的CBF1/DREB1b轉基因中華結縷草株系Z20、Z19、Z14和野生型對照植株分栽擴繁，恢復生長2個月后將健康、生長狀況一致的植株置于7℃、光照(120umol m-2s-1)24h的人工氣候室生長2周，記錄黃葉率(變黃的葉片/全部葉片)，然后在室溫下(25-30℃)進行恢復生長2周，觀察植株生長情況。
結果經(jīng)7℃低溫處理1周后，對照株系基部葉片的葉尖或局部開始變黃，而3個轉基因株系沒有此現(xiàn)象；處理2周后，對照黃葉率增加到32.8％，而Z20、Z19和Z14轉基因株系分別僅有9.7％、1.5％和3.2％的卷葉。恢復生長2周后，受過冷害的對照株系黃化葉片并無好轉，開始枯黃死亡，而轉基因植株恢復生長1天后卷葉恢復正常。上述抗冷性實驗結果表明，CBF1/DREB1b已在轉基因中華結縷草T0代中穩(wěn)定表達，并表現(xiàn)出一定的抗冷性。
二、葉綠素含量測定檢測步驟一各植株經(jīng)低溫處理前、后的葉綠素含量，方法為低溫處理前、后分別取轉基因植株和對照植株相同部位的葉片，采用混合液法(李合生，植物生理生化實驗原理與技術。北京高等教育出版社，2000)測量葉綠素含量，每株系至少測3-5個重復。
檢測結果見圖12，冷害(7℃)引起對照株系的總葉綠素含量下降13％，相反，Z20、Z19和Z14的總葉綠素含量分別提高約12％、30％和20％?？側~綠素含量變化可以初步反映在低溫條件下植株的光合能力和葉綠素的降解程度，該檢測結果表明冷害并不能引起CBF1/DREB1b轉基因中華結縷草葉綠素減少，所以在低溫條件下觀察到轉基因株系葉片基本未變黃，具有一定的抗冷性。
三、電解質滲漏值測定檢測步驟一各植株經(jīng)低溫處理前、后的電解質滲漏值，方法為取低溫處理前、后分別取轉基因植株和對照植株相同部位的葉片，采用DDS-307型電導率儀測定相對電導率，每株系至少測3-5重復。
檢測結果見圖13，低溫處理后轉基因株系和對照的電解質滲漏值均增加，但各轉基因株系增加幅度低于對照，其中，Z20和Z19的電解質滲漏值增加幅度分別為15％和10％，明顯低于對照(23％)。電解質滲漏值的測定可以反映植株在低溫條件下細胞膜的損傷程度，該檢測結果表明在相同低溫條件下，與對照相比，轉基因株系的細胞膜損傷程度較小。
權利要求
1.一種提高結縷草抗寒性的方法，是將擬南芥冷誘導基因的轉錄激活因子基因CBF1/DREB1b轉化結縷草胚性愈傷組織，結縷草的抗寒性得到提高；所述CBF1/DREB1b的GenBank號為NM-118681。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟1)將結縷草胚性愈傷組織用攜帶有擬南芥冷誘導基因的轉錄激活因子基因CBF1/DREB1b的農(nóng)桿菌菌液進行侵染；所述菌液是將攜帶有CBF1/DREB1b的農(nóng)桿菌菌體重懸于侵染培養(yǎng)基至OD600值為0.4-0.6，所述侵染培養(yǎng)基是在無CaCl2的MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了25-35g/L蔗糖，8-12g/L葡萄糖，0.008-0.012％Triton X-100，3.5-4.5mg/L VB1，80-120mg/L甜菜堿，40-60mg/L乙酰丁香酮，pH 5.0-5.4；2)將經(jīng)侵染的結縷草胚性愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)結束后對愈傷組織進行洗滌；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基是在無CaCl2的MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了25-35g/L蔗糖，8-12g/L葡萄糖，0.008-0.012％瓊脂，0.008-0.012％Triton X-100，3.5-4.5mg/L VB1，80-120mg/L甜菜堿，0.8-1.2mg/L 2，4-D和40-60mg/L乙酰丁香酮，pH 5.0-5.4；3)將共培養(yǎng)后的胚性愈傷組織置于篩選培養(yǎng)基上進行篩選；所述篩選培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了1.5-2.5mg/L 2，4-D，0.08-0.12mg/L 6-芐基腺嘌呤，0.8-1.2mg/L草丁膦，200-300mg/L頭孢噻肟，pH 5.5-6.0；4)將篩選出的胚性愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)；所述分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了0.8-1.2mg/L 6-芐基腺嘌呤，0.8-1.2mg/L草丁膦，200-300mg/L頭孢噻肟，pH 5.5-6.0；5)將分化出芽的小苗置于生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)；所述生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了0.15-0.25mg/L α-萘乙酸和2-4mg/L草丁膦，pH5.5-6.0；6)將生出根系的植株置于壯苗篩選培養(yǎng)基上篩選出抗寒性提高的結縷草壯苗；所述壯苗篩選培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了4-6mg/L草丁膦，pH5.5-6.0。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟1)中結縷草胚性愈傷組織的獲得方法，包括以下步驟(1)選取飽滿的結縷草種子，去除穎殼，滅菌；(2)將種子置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷組織；所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了1.8-2.2mg/L 2，4-D，0.05-0.2mg/L 6-BA，25-35g/L蔗糖，6-8g/L瓊脂，pH 5.5-6.0；(3)將長出的愈傷組織置于繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)2-3次，每次間隔3-4周；所述繼代培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了0.8-1.2mg/L 2，4-D，0.2-0.5mg/L6-BA，25-35g/L蔗糖，6-8g/L瓊脂，pH 5.5-6.0；(4)將經(jīng)繼代培養(yǎng)的愈傷組織先置于增殖和維持培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，再將經(jīng)增殖培養(yǎng)的愈傷組織置于愈傷組織分化培養(yǎng)基中進行篩選，得到胚性愈傷組織；所述增殖和維持培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了0.8-1.2mg/L 2，4-D，0.4-0.6mg/L 6-BA，25-35g/L蔗糖，6-8g/L瓊脂，pH 5.5-6.0；所述愈傷組織分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了0.8-1.2mg/L 6-BA，0.15-0.25mg/Lα-萘乙酸，25-35g/L蔗糖，6-8g/L瓊脂，pH 5.5-6.0。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中對種子進行滅菌的方法為將種子先用70％的乙醇滅菌1-2min，然后用含0.8-1.2％吐溫20的10％次氯酸鈉滅菌20-30min，最后用無菌水沖洗2-4次；步驟(2)中愈傷組織的誘導條件為在24-26℃下暗培養(yǎng)4-5周；步驟(3)中的繼代培養(yǎng)條件為在24-26℃下暗培養(yǎng)；步驟(4)中愈傷組織的增殖培養(yǎng)條件為在24-26℃下暗培養(yǎng)3-6個月，愈傷組織的分化條件為在溫度24-26℃、光照強度1000-3000umol m-2s-1、光照時間14-16h/天的條件下培養(yǎng)4-6周。
5.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中的愈傷組織誘導培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了2.0mg/L 2，4-D，0.05-0.2mg/L 6-BA，30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH 5.5-6.0；步驟(3)中的繼代培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了1mg/L 2，4-D，0.2-0.5mg/L 6-BA，30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH 5.5-6.0；步驟(4)中愈傷組織的的增殖和維持培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了1mg/L2，4-D，0.5mg/L 6-BA，30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH 5.5-6.0；愈傷組織的分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了1.0mg/L 6-BA，0.2mg/Lα-萘乙酸，30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，pH 5.5-6.0。
6.根據(jù)權利要求2-5任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中用于配制攜帶有擬南芥冷誘導基因的轉錄激活因子基因CBF1/DREB1b的農(nóng)桿菌菌液的侵染培養(yǎng)基是在無CaCl2的MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.01％Triton X-100，4mg/L VB1，100mg/L甜菜堿，50mg/L乙酰丁香酮，pH 5.2；攜帶有CBF1/DREB1b的農(nóng)桿菌菌液對胚性愈傷組織的侵染時間為5-10min；所述CBF1/DREB1b通過攜帶有CBF1/DREB1b的植物表達載體導入農(nóng)桿菌；所述攜帶有CBF1/DREB1b的植物表達載體為pBPCBF1bar。
7.根據(jù)權利要求2-5任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的共培養(yǎng)條件為在25-26℃下暗培養(yǎng)5-7天；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基是在無CaCl2的MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，0.01％瓊脂，0.01％Triton X-100，4mg/L VB1，100mg/L甜菜堿，1mg/L 2，4-D和乙酰丁香酮，pH 5.2；所述愈傷組織的洗滌方法為先用滅菌水洗滌3-4次后，用含1000mg/L頭孢噻肟的0.02％吐溫20洗滌1-2次。
8.根據(jù)權利要求2-5任一所述的方法，其特征在于所述步驟3)中的篩選培養(yǎng)條件為在25-26℃下暗培養(yǎng)6-10周；所述篩選培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了2mg/L 2，4-D，0.1mg/L 6-芐基腺嘌呤，1mg/L草丁膦，250mg/L頭孢噻肟，pH5.5-6.0；每隔3周將篩選培養(yǎng)基中草丁膦的濃度提高1mg/L。
9.根據(jù)權利要求2-5任一所述的方法，其特征在于所述步驟4)中的分化培養(yǎng)條件為溫度24-26℃，光照強度1000-3000umol m-2s-1，光照時間14-16h/天，培養(yǎng)至分化出小苗；所述分化培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了1mg/L 6-芐基腺嘌呤，1mg/L草丁膦，250mg/L頭孢噻肟，pH 5.5-6.0；每隔2-3周更換一次培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權利要求2-5任一所述的方法，其特征在于所述步驟5)中的培養(yǎng)條件為溫度24-26℃，光照強度1000-3000umol m-2s-1，光照時間14-16h/天，培養(yǎng)30-60天；所述生根培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了0.2mg/L α-萘乙酸和3mg/L草丁膦，pH 5.5-6.0；所述步驟6)中的培養(yǎng)條件為溫度24-26℃，光照強度1000-3000umol m-2s-1，光照時間14-16h/天，培養(yǎng)20-40天；所述壯苗篩選培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加了5mg/L草丁膦，pH 5.5-6.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高結縷草抗寒性的方法。該方法是將擬南芥冷誘導基因的轉錄激活因子CBF1/DREB1b轉化結縷草胚性愈傷組織，結縷草的抗寒性得到提高，可包括以下步驟1)將結縷草胚性愈傷組織用攜帶有CBF1/DREB1b的農(nóng)桿菌菌液進行侵染；2)將經(jīng)侵染的結縷草胚性愈傷組織置于共培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)；3)將共培養(yǎng)后的胚性愈傷組織置于篩選培養(yǎng)基上進行篩選；4)將篩選出的胚性愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)；5)將分化出芽的小苗置于生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)；6)將生出根系的植株置于壯苗篩選培養(yǎng)基上篩選出抗寒性提高的結縷草壯苗。本發(fā)明對培育抗冷性提高、綠色期延長的結縷草新品種，具有重要的理論與現(xiàn)實意義，應用前景廣闊。
文檔編號C12N15/82GK1876813SQ200610012119
公開日2006年12月13日 申請日期2006年6月6日 優(yōu)先權日2006年6月6日
發(fā)明者李瑞芬, 孫振元, 魏建華, 王宏芝, 賀杰 申請人:北京農(nóng)業(yè)生物技術研究中心, 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所