專利名稱：乙醛－乙醇脫氫酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種乙醛-乙醇脫氫酶基因。
背景技術(shù)：
乙醇代謝是葡萄糖代謝的一部分，1分子葡萄糖分解為2分子丙酮酸，1分子丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)?分子乙酰輔酶A，乙酰輔酶A在乙醛脫氫酶ALDH催化下生成乙醛，再在NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)參與下由乙醇脫氫酶ADH催化乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇。從生物制氫角度看，依據(jù)NADH偶聯(lián)產(chǎn)氫假說，生成乙醇會消耗NADH，減少氫產(chǎn)量；從新能源角度看，乙醇是一種重要的工業(yè)原料，可以做工業(yè)酒精，可以做燃料乙醇，作為再生能源對替代和緩解我國石油不足具有重要意義，是加快開發(fā)替代能源和新能源，實現(xiàn)能源消費結(jié)構(gòu)多源化的有效措施；推行燃料乙醇可以給國家?guī)泶碳まr(nóng)業(yè)發(fā)展、完善能源安全體系、減少對石油的依賴程度、節(jié)約外匯、增加就業(yè)、增加財政收入、改善燃油品質(zhì)等巨大的綜合收益。使用乙醇作為汽車燃料，可以明顯降低汽車廢氣的排放，有效改善大氣環(huán)境質(zhì)量。研究表明，乙醇生產(chǎn)和乙醇燃燒中的C循環(huán)封閉，排放的CO2重新被乙醇生產(chǎn)原料吸收，明顯減緩全球變暖。綜上所述，克隆乙醛-乙醇脫氫酶基因無論從生物制氫角度，還是從新能源角度都是有重要意義的。
產(chǎn)氫菌B49是哈爾濱工業(yè)大學(xué)林明博士從生物制氫反應(yīng)器的乙醇型發(fā)酵活性污泥中分離出的一株高產(chǎn)氫乙醇型發(fā)酵菌株，生理生化和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果證實為一新種或者新屬。該菌株已在中國微生物菌種保藏中心保藏，保藏編號為CGMCC1153。產(chǎn)氫菌B49的最大比產(chǎn)氫速率為25.0mmolH2/g·drycell·h，單位體積產(chǎn)氫速率為1813.8mL/L-culture，產(chǎn)氫能力居于國際前列。其菌株特征為單胞生長的規(guī)則桿菌；周生鞭毛；G+；無莢膜；無芽孢；專性厭氧；乳白色圓形菌落；代時為7.2h；在28～43℃，pH＝3.3～8.5條件下生長。B49酵解葡萄糖的主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇、乙酸、H2、CO2和乳酸，參見任南琪提出的新型有機廢水發(fā)酵類型-乙醇型發(fā)酵的代謝途徑推測B49酵解葡萄糖的代謝途徑(見圖1)。由此可見，乙醛-乙醇脫氫酶基因的克隆對研究其代謝工程提高產(chǎn)氫量是重要的。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于乙醛-乙醇脫氫酶基因的克隆對研究產(chǎn)氫菌B49代謝工程提高產(chǎn)氫量有很重要的作用，本發(fā)明旨在從Ethanologenbacterium hit B49基因組中分離乙醛-乙醇脫氫酶基因，擴大乙醛-乙醇脫氫酶基因資源，從而為Ethanologenbacteriumhit B49的代謝工程研究和構(gòu)建基因工程菌提供科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明所述的乙醛-乙醇脫氫酶基因Badh是以高效產(chǎn)氫菌Ethanologenbacterium hit B49總DNA為模板，通過PCR擴增獲得的。本發(fā)明的乙醛-乙醇脫氫酶基因Badh基因全長3098bp，其中A、C、G、T分別為797(25.73％)、850(27.44％)、744(24.02％)、707(22.82％)。在277bp處有起始密碼子ATG，在2889bp處有終止密碼子TAA，在204bp到249bp之間存在一個啟動子序列TTGCAACTTGCAAAAAAGTATCGTATAATAATATTGATAATATTTTAACA。該序列無內(nèi)含子，具有2616bp完整的開放讀碼框，編碼871個氨基酸。編碼產(chǎn)物分子量為95.47kD，等電點pI為6.42。通過GenBank基因序列比對分析，表明與已注冊的乙醛-乙醇脫氫酶同源性為52～65％，其中與Bacillus licheniformis ATCC 14580和Bacillus licheniformisDSM13的乙醛-乙醇脫氫酶基因同源性最高，為65％，證明是一個新的乙醛-乙醇脫氫酶基因，將分離的乙醛-乙醇脫氫酶基因與原核表達載體pet-22b連接，構(gòu)建成pet-22b-ADH重組表達載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達出100～120kD的目的蛋白，證實該基因是一個具有表達功能的基因。本發(fā)明從Ethanologenbacteriumhit B49基因組中分離乙醛-乙醇脫氫酶基因，擴大了乙醛-乙醇脫氫酶基因的資源，從而為Ethanologenbacterium hit B49的代謝工程研究和構(gòu)建基因工程菌提供了科學(xué)依據(jù)。


圖1為產(chǎn)氫菌B49的代謝途徑，圖2為pMD18-T載體的結(jié)構(gòu)圖譜，圖3為pMD18-T載體的酶切位點結(jié)構(gòu)圖，圖4為TaKaRa LA PCRTMin vitro cloningKit試劑盒的PCR擴增原理圖，圖5為特異性引物設(shè)計位置圖，圖6為pet-22b載體的結(jié)構(gòu)圖譜，圖7為pet-22b載體的酶切位點結(jié)構(gòu)圖。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式所述的Ethanologenbacterium hit B49乙醛-乙醇脫氫酶基因Badh是以高效產(chǎn)氫菌Ethanologenbacterium hit B49總DNA為模板，通過PCR擴增獲得的。本實施方式對該基因進行了原核表達檢測，同時也對該菌株進行了乙醛-乙醇脫氫酶活力測定。其具體方法如下1、乙醛-乙醇脫氫酶基因的克隆(1)PCR引物的設(shè)計根據(jù)GenBank中收錄的細菌乙醛-乙醇脫氫酶蛋白質(zhì)序列，具體菌種見表1，經(jīng)clustalw多序列比對分析，找出10塊無間隙高度保守的氨基酸序列區(qū)(Blocks)。把這十個保守區(qū)域的蛋白質(zhì)序列轉(zhuǎn)換為簡并核苷酸序列，并計算簡并度，經(jīng)過篩選選用了一對簡并引物，該引物的序列參見表2。
表1設(shè)計乙醛-乙醇脫氫酶基因簡并引物所用乙醛-乙醇脫氫酶蛋白質(zhì)的菌種

表2.選用的擴增乙醛-乙醇脫氫酶的簡并引物

注NA、C、T或G，YC或T，WA或T，SC或G，KG或T，RA或G，B非A。
(2)Ethanologenbacterium hit B49基因組總DNA的提取取Ethanologenbacterium hit B49菌液約50mL，用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的華舜小量細菌基因組DNA抽提試劑盒提取，提取步驟參見小量細菌基因組DNA抽提試劑盒操作手冊。
(3)乙醛-乙醇脫氫酶基因部分片段的PCR擴增
以Ethanologenbacterium hit B49總DNA為模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系1xBuffer，0.6mM dNTP，引物ADHJ1-forward、ADHJ1-reverse各1.0μM，ExTaqDNA聚合酶2.5U，模板DNA 0.2～1μg，加ddH2O至50μL。反應(yīng)程序預(yù)變性95℃，5min，94℃，30s；55℃降到35℃，每次降1℃，40s；72℃，2min30s，共20個循環(huán)；然后按94℃，30s；35℃，40s；72℃，2min 30s，共23個循環(huán)，最后在72℃延伸10min，4℃保存。
(4)PCR產(chǎn)物的克隆PCR產(chǎn)物用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的柱式華舜小量膠回收試劑盒回收，方法參照試劑盒小量膠回收操作手冊?；厥债a(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接，連接體系pMD18-T載體1μl(50ng)，PCR產(chǎn)物2μl(100～200ng)，Ligation Solution5μl，加ddH2O至10μl。16℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.ColiDH5α感受態(tài)細胞。在含有氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB篩選平板上進行藍白斑篩選，并提取白斑菌落質(zhì)粒進行菌落PCR以鑒定陽性重組子。其中a、采用CaCl2法制備E.coliDH5α感受態(tài)細胞①E.coliDH5α在LB平板上劃線培養(yǎng)12～16h，挑取單菌落接入不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
②取過夜活化的E.coliDH5α菌液1ml置于100ml新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.3。
③將菌液分裝于兩個預(yù)冷的50ml無菌離心管中，冰浴30min。
④4℃，4000rpm，離心10min，棄上清。
⑤加入10ml冰冷的0.1M CaCl2，重懸菌體，冰浴30min。
⑥4℃，4000rpm，離心10min，棄上清。
⑦加入2ml冰冷的0.1M CaCl2，重懸菌體。
b、熱激法轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞①取200μl感受態(tài)細胞，置于冰上，加入4μl連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻內(nèi)容物。
②冰浴30min。
③42℃水浴中熱激90s，勿搖動。
④冰浴2～3min。
⑤加入800μl無附加抗生素的LB培養(yǎng)基，混勻，37℃ 200～250rpm搖床振蕩預(yù)表達培養(yǎng)45～60min。
⑥室溫，4000rpm，離心5min，棄去900μl上清液，余液將菌體懸浮。
⑦將細菌涂布在附加50mg/LAmp、4μl IPTG和40μl X-gal的LB固體培養(yǎng)基上。
⑧平板于37℃正向放置至液體被吸收，然后倒置培養(yǎng)過夜。
c、陽性重組子的篩選及鑒定①藍白斑反應(yīng)篩選陽性重組子根據(jù)α-互補反應(yīng)的原理，在附加X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生的白色菌落為帶有重組質(zhì)粒的菌落，藍色菌落為帶有重新環(huán)化載體的菌落，因此白色菌落可初步鑒定為陽性重組子。
②陽性重組子的菌落PCR鑒定挑取白斑菌落，利用通用引物RV-M和M13-47進行PCR，PCR條件95℃預(yù)變性10min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 90s，共35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，若電泳顯示出與目的DNA大小的條帶，則證明質(zhì)粒重組正確，是陽性重組子。
本實施方式中采用的pMD18-T是一種常用的克隆載體，大小為2692bp，具有Amp抗性基因；帶有一段大腸桿菌lacZ的調(diào)控序列和N-端146個氨基酸的編碼信息，此編碼區(qū)插入了多克隆位點，若無外源基因插入，載體會與大腸桿菌lacZ的C-端序列功能互補，即α互補，產(chǎn)生有完整活性的β-半乳糖苷酶；若有外源基因插入，則破壞了其讀碼框，產(chǎn)生無α互補能力的肽段，因此，在附加X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上白色菌落為帶有重組質(zhì)粒的細菌，藍色菌落為帶有重新環(huán)化載體的細菌。本實施方式所述pMD18-T載體購自大連寶生物工程公司，其pMD18-T質(zhì)粒圖譜及其酶切位點見圖2和3。
(5)DNA序列測定與分析陽性重組子選用Invitrogen上海英俊生物技術(shù)有限公司自動序列分析儀進行序列測定，序列同源性比較在http://www.ncbi.nlm.gov網(wǎng)站上用BLAST程序進行。
(6)克隆乙醛-乙醇脫氫酶基因部分片段兩側(cè)序列Cassette PCR的引物設(shè)計采用TaKaRa LA PCRTMin vitro cloning Kit試劑盒克隆乙醛-乙醇脫氫酶基因片段兩側(cè)序列。以已克隆的乙醛-乙醇脫氫酶基因片段序列為基礎(chǔ)，設(shè)計與試劑盒中Cassetteprimer C1，Cassette primer C2引物分別匹配的上游引物ADH-S11-lower，ADH-S12-lower和下游引物ADH-S21-upper，ADH-S22-upper，具體序列見表3。
表3.擴增乙醛-乙醇脫氫酶基因部分片段兩側(cè)序列的Cassette PCR引物

其中，Cassette PCR的原理和引物設(shè)計要求如下a、Cassette PCR原理具體原理見圖4。因為在設(shè)計上，Cassette的5′末端沒有磷酸基，所以Target DNA的3′末端和Cassette的5′末端的連接部位形成缺口。在第一次PCR反應(yīng)的第一個循環(huán)時，從Primer C1開始的延伸反應(yīng)在連接部位終止，限制了Primer C1和Primer C1同一引物之間的擴增，從而控制了非特異性PCR擴增。只有從Primer S11或Primer S21開始延伸合成的DNA鏈，才能成為Primer C1的模板，進行DNA的特異性擴增反應(yīng)。再用內(nèi)側(cè)Primer(Primer C2，Primer S12或S22)進一步進行第二次PCR反應(yīng)，可以高效特異性地擴增目的DNA。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的氨基酸序列已知時，可以根據(jù)已知信息設(shè)計Mixed primer，擴增編碼蛋白質(zhì)的cDNA。
本試劑盒的具體操作步聚如下1)用EcoRI或BamHI限制酶將Ethanologenbacterium hit B49基因組DNA完全分解。
2)與具有EcoRI或BamHI限制酶酶切位點的Cassette接頭進行連接反應(yīng)。
3)用Cassette Primer(Primer C1)和根據(jù)已知區(qū)域的DNA序列設(shè)計的Primer(Primer S11或Primer S21)，進行第1次PCR(1st PCR)反應(yīng)。
4)取3)的PCR反應(yīng)液的一部分作模板，使用內(nèi)側(cè)Primer(Primer C2和Primer S12或Primer S22)進行第2次PCR(2nd PCR)反應(yīng)，特異性地擴增目的DNA片段。
b、Specific Primer(S11或S21，S12或S22)的設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)1)根據(jù)已知區(qū)域設(shè)計Primer(見圖5)。設(shè)計方向為需要擴增的未知區(qū)域的方向。S2的位置應(yīng)設(shè)計在S1的內(nèi)側(cè)，兩個引物間的距離沒有嚴(yán)格的規(guī)定。
設(shè)計引物時還需要注意以下幾點①引物長度為20～35mer(擴增長鏈DNA時最好為30～35mer)。
②GC含量在50％左右，避免局部GC或AT集中。特別是引物的3端不要AT集中。
③引物自身不要形成發(fā)夾等明顯的二級結(jié)構(gòu)。
④兩個Specific Primer(S11或S21、S12或S22)要與Cassette Primer(C1、C2)組合使用，所以設(shè)計時還要考慮不要與配對的引物形成引物二聚體，特別是3′端的3、4個堿基不要與配對的引物序列互補。
2)根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行設(shè)計引物時應(yīng)注意以下幾點①首先將氨基酸序列轉(zhuǎn)換成編碼氨基酸的堿基序列。應(yīng)盡量選擇簡并少的區(qū)域設(shè)計引物，但與簡并少而較短的引物相比，還不如使用簡并多而較長的引物比較合適。
②如果想減少引物簡并，可考慮Codon usage進行設(shè)計。
③3′末端不要簡并。
④如果使用Mixed primer進行PCR擴增時，需要將退火溫度降低，而其結(jié)果往往會引起非特異性的擴增。如果有關(guān)DNA序列信息較多時，可進一步在內(nèi)側(cè)再設(shè)計一個引物，用以鑒定目的DNA片段。
(7)克隆乙醛-乙醇脫氫酶基因部分片段兩側(cè)序列的Cassette PCR擴增根據(jù)已克隆的乙醛-乙醇脫氫酶基因片段序列，分析該序列的限制性內(nèi)切酶位點情況，找出該序列沒有的限制性內(nèi)切酶，而TaKaRa LAPCRTMin vitro cloningKit試劑盒中有該酶接頭的限制性內(nèi)切酶，具體過程如下乙醛-乙醇脫氫酶下游的擴增選用EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切B49基因組DNA，酶切后的基因組DNA和EcoRI接頭于16℃連接3h；乙醛-乙醇脫氫酶下游的擴增選用BamHI酶切B49基因組DNA，酶切后的基因組DNA和Sau3AI接頭于16℃連接3h。CassettePCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下A、DNA的限制酶酶切反應(yīng)反應(yīng)體系見表4。
表4

*代表使DNA完全分解的必要酶量，根據(jù)制備的DNA純度而定，一般10U分解1μg DNA。
B、連接反應(yīng)①按下列組份配制連接反應(yīng)液(表5)。
表5

②16℃反應(yīng)30分鐘。
③反應(yīng)結(jié)束后，進行乙醇沉淀回收DNA。
④溶解于5μl的滅菌蒸餾水中。
C、PCR擴增①將B-④DNA溶液1μl加入到33.5μl滅菌蒸餾水中，94℃加熱10分鐘。
②按下列組份配制第一次(1st)PCR反應(yīng)液(表6)。
表6

③按以下條件進行1stPCR反應(yīng)。
94℃ 30sec，55℃ 2min，72℃ 1min，共30個循環(huán)。
④用滅菌水將B-③的PCR反應(yīng)液按適當(dāng)倍數(shù)稀釋(1～10,000倍稀釋)，再取1μl進行(第二次)2ndPCR反應(yīng)，2ndPCR反應(yīng)液組份如表7。
表7


⑤按以下條件進行2nd PCR反應(yīng)。
94℃ 30sec，55℃ 2min，72℃ 1min，共循環(huán)30次。
⑥反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液(5～10μl)進行瓊脂糖凝膠電泳，可以得到擴增到的PCR片段。
(8)乙醛-乙醇脫氫酶全長基因的PCR擴增、克隆和測序根據(jù)已拼接的序列設(shè)計了全長驗證引物ADHWU-Forward、ADHWU-Reverse、ADHWL-Forward和ADHWL-Reverse(見表8)，以Ethanologenbacterium hit B49基因組總DNA為模板擴增全長乙醛-乙醇脫氫酶基因。PCR反應(yīng)體系為94℃ 5min，94℃ 30s，66℃ 30s，72℃ 1min30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。
表8.乙醛-乙醇脫氫酶基因全長驗證引物

(9)乙醛-乙醇脫氫酶基因的表達將幾丁質(zhì)酶基因Back與原核表達載體pet-22b重組，構(gòu)建成重組表達質(zhì)粒pet-22b-Back，熱激法轉(zhuǎn)化到原核表達宿主菌E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，1.0mM IPTG誘導(dǎo)3.5h后，經(jīng)12％的SDS-PAGE凝膠電泳、考馬斯亮藍染色檢測基因的表達情況。pet-22b載體購于Novagen公司，其質(zhì)粒圖譜及酶切位點見圖6和7。
根據(jù)pet-22b表達載體的多克隆位點序列，在乙醛-乙醇脫氫酶基因的253bp(起始密碼子ATG)處引入BamH I酶切位點，在1450bp(終止密碼子TAA)處引入Xho I酶切位點，具體引物見表9。PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min30s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。膠回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)BamHI和XhoI酶切，在膠回收，與同樣用BamHI和XhoI酶切且膠回收的pet-22b原核表達載體于16℃連接3h。將該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.ColiDH5α感受態(tài)細胞。在含有氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB篩選平板上進行藍白斑篩選，并提取白斑菌落質(zhì)粒進行菌落PCR以鑒定陽性重組子。提取陽性克隆質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)plys感受態(tài)細胞。在含有氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB篩選平板上進行藍白斑篩選，并提取白斑菌落質(zhì)粒進行菌落PCR以鑒定陽性重組子。
表9.乙醛-乙醇脫氫酶基因表達用引物

2、Ethanologenbacterium hit B49乙酸激酶活力測定(1)、測定方法乙醇脫氫酶活性測定是通過測定乙醇脫氫酶還原NAD+成NADH的量來計算的。
反應(yīng)液900μl、12mM焦磷酸鈉(pH8.5)；50μl1、5mM NAD+；30μl細胞酶粗提液，共980μl。最后加入20μl無水乙醇開始反應(yīng)。在可見分光光度計340nm處讀數(shù)。
(2)、蛋白質(zhì)含量測定采用上海華舜生物工程有限公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
(3)、酶活單位的定義(U)每毫克(milligram)蛋白每分鐘還原的NADH產(chǎn)物的微摩爾數(shù)。本實施方式獲得的乙醛-乙醇脫氫酶活力為48U。
本實施方式所述的Ethanologenbacterium hit B49乙醛-乙醇脫氫酶基因Badh是乙醛-乙醇脫氫酶，序列的Blast同源性比對結(jié)果顯示該基因與GenBank中已注冊的序列存在差異，是一個新的基因。
Badh基因序列特征該基因全長3098bp，其中A、C、G、T分別為797(25.73％)、850(27.44％)、744(24.02％)、707(22.82％)。在277bp處有起始密碼子ATG，在2889bp處有終止密碼子TAA，在204bp到249bp之間存在一個推測的啟動子序列TTGCAACTTGCAAAAAAGTATCGTATAATAATATTGATAATATTTTAACA。該序列無內(nèi)含子，具有2616bp完整的開放讀碼框，編碼871個氨基酸。編碼產(chǎn)物分子量為95.47kD，等電點pI為6.42。
序列表<110>哈爾濱工業(yè)大學(xué)<120>乙醛-乙醇脫氫酶基因<160>1<210>1<211>3098<212>DNA<213>乙醛-乙醇脫氫酶基因及其編碼產(chǎn)物序列<400>11 GTGTACTCGTCGAAAACGTGCACCTGAGTGACAGCCTGATGACATTGTGCTACATGGTAA61 GGGATTTATCCGAAAAAGAAACACGGGACAATTGAACTGCTTTGATACCGTCATGACCAT121TCGGCTCGTTGCACGAAAACGACAAATCAAACGGGACATGACGTCATCGTTTTATAATAT181TTGACAAATTGCACAGCATTCACTTGCAACTTGCAAAAAAGTATCGTATAATAATATTGA241TAATATTTTAACAATATTGCTTAAGGGGGCAATTTGATGGCAACCGAAACAAAAGAAGTCM A T E T K E V301GCCCAGGAAGCGCAGAAACCCGACGTCAAACAAATGATTGACGAACTGGTGGCAAAAGCGA Q E A Q K P D V K Q M I D E L V A K A361CAGAAAGCTCTGGACGAGTTTTCTACCTTCAACCAGGAGCAGGTTGACAAAATCGTCCATQ K A L D E F S T F N Q E Q V D K I V H421GCCATGGCACTTGCGGCGCTGGATAAGCATATGTATCTGGCTAAACTCGCCGTGGAAGAAA M A L A A L D K H M Y L A K L A V E E481ACCGGACGCGGTATTTACGAAGACAAGATTACCAAAAACCTGTACGCAAGCGAATATATCT G R G I Y E D K I T K N L Y A S E Y I541TGGCATGACATCAAATATGCAAAGACCGTCGGCGTCATCGACGAAAACGAGATGGAAGAAW H D I K Y A K T V G V I D E N E M E E601TATGTGGATATCGCCGAGCCTGTCGGTATCATCGCGGGCGTTACCCCGGTAACCAACCCCY V D I A E P V G I I A G V T P V T N P661ACCTCCACCGCTATCTTTAAATCCCTCATCTCCGTCAAAACCCGCAACCCCATCATTTTCT S T A I F K S L I S V K T R N P I I F721GGTTTCCATCCCGCTGCCCAGAAATGCTGCGCGGAAACGGCCCGCATTCTGAATGAGGCGG F H P A A Q K C C A E T A R I L N E A781GCTGTGGCTGCCGGTGCCCCCGAAAACATTGTGCAGTTCATCCCCCATCCTTCCATCGAA
A V A A G A P E N I V Q F I P H P S I E841GCGACCAATGCGTTGATGAATCATCCCGGTGTCGCCACGATTTTGGCGACCGGCGGCCCCA T N A L M N H P G V A T I L A T G G P901GGCATGGTCAAGGCTGCGTATTCCTGCGGCAAACCGGCGCTGGGTGTCGGTCCCGGCAACG M V K A A Y S C G K P A L G V G P G N961GTCCCCTGCTATGTCGAAAAAACAGCGAAACTCCGCCGTGCCTGCCATGACCTCATCCTTV P C Y V E K T A K L R R A C H D L I L1021 TCCAAAACGTTCGACAACGGCATGATCTGCGCTTCCGAACAGGCTGCGATTGTGGATAAAS K T F D N G M I C A S E Q A A I V D K1081 GAAATCGCGGCGGATTTTGAAAAGATCATGAAAGCAAACGGCTGCTACTTCACCAATCCGE I A A D F E K I M K A N G C Y F T N P1141 GAAGAAACGGCCAAACTCGGCAAATATGTGATCACCGAGAAAATGAGCGTGAATCCCCCGE E T A K L G K Y V I T E K M S V N P P1201 GTCGTCGGCCAGTCCGCTGTCTGGATCGCCGAGCAGGCCGGCATCAAAGTACCTGCCGACV V G Q S A V W I A E Q A G I K V P A D1261 ACCAAGGTCATTCTTGCCAAACTTGACAAGGTCGATTTTGATGTGCCGCTGGCTCACGAAT K V I L A K L D K V D F D V P L A H E1321 AAACTTTCTCCGGTGCTTGGTTATTATATCGCCAACAGCACGGAGGATGCTTTCAAAGCTK L S P V L G Y Y I A N S T E D A F K A1381 GCGCTTCGCATGCTGGAAATCGGCGGTCTGGGTCACTCTGCAGCCATCCACTCCACCGATA L R M L E I G G L G H S A A I H S T D1441 AACGACATCATCATGAAATACGGCGAAGCCATGAAGGTCGGCCGTGTGCTGGTCAACAGCN D I I M K Y G E A M K V G R V L V N S1501 CCGTCTTCTCAGGGCGGTATCGGCGATATCTACAACACCAATATTCCTTCCCTTACCCTTP S S Q G G I G D I Y N T N I P S L T L1561 GGCTGCGGCTCCTATGGCCACAACTCTGTTTCGCAGAACGTCAGTGCGGTCAACCTGATCG C G S Y G H N S V S Q N V S A V N L I1621 AACAAAAAGCGCATTGCCAAGAGGAGAGTCAACATGCAGTGGTTTAAAGTGCCGCCGAAGN K K R I A K R R V N M Q W F K V P P K1681 ATTTACTTCGAGTTCGATGCGATTCAGTACCTGGAGAAAATGCCGAACATCTCCCGTGCAI Y F E F D A I Q Y L E K M P N I S R A1741 TTCATCGTCACCGACCCTGTAATGGTCAAGCTCGGAAATGTGGATAAGGTTCTTTATTATF I V T D P V M V K L G N V D K V L Y Y1801 CTCCGCAAACGCAAAGAGTATTGCCACAGTGAGATTTTCTCCGAAGTTGAGCCCGACCCGL R K R K E Y C H S E I F S E V E P D P1861 TCTTTTGAAACGGTTATGCGCGGCGTGGAAATGATGAAGAAATTTGAGCCGGATGTCATCS F E T V M R G V E M M K K F E P D V I1921 ATCGCACTCGGCGGCGGTTCTTCCATGGATGCCGCGAAGGGCATGTGGCTCTTCTATGAGI A L G G G S S M D A A K G M W L F Y E
1981 CATCCGGACTTTGATTTCAAAGGCGCACATGAGAAATTCATGGATATCCGCAAGCGCACTH P D F D F K G A H E K F M D I R K R T2041 TATCACTTCCCCGAACTGGGCCAGAAATGCCAGATGGTCGCCGTGCCGACTACTTCCGGCY H F P E L G Q K C Q M V A V P T T S G2101 ACCGGCTCCGAAGTGACGTCTTTTGCGGTCATCACCGACAAGGTCAATAACTTCAAATATT G S E V T S F A V I T D K V N N F K Y2161 CCGCTCGCCGACTATGCGCTCACTCCGAATGTCGCTATCGTTGACCCGCAGTTTGTTATGP L A D Y A L T P N V A I V D P Q F V M2221 ACCATGCCGAAATCCACCACGGCGGATACCGGTTTGGACGTGCTGACCCACGCCATTGAAT M P K S T T A D T G L D V L T H A I E2281 GCCTATGTCTCCGTTTTGGCAAACGATTACACTGATGGTCTGGCCCTGAAAGCGATTGAGA Y V S V L A N D Y T D G L A L K A I E2341 ATCGTCTTCAAATATCTGCCCCGTGCCTATGCGGACGGTGCCAAAGACGGCGAAGCGCGCI V F K Y L P R A Y A D G A K D G E A R2401 ATGAAAATGCACAACGCTTCCTGCATCGCCGGTATGGCGTTCAGCAATGCGTTCCTTGGCM K M H N A S C I A G M A F S N A F L G2461 TTGAACCACTCCATGGCGCACAAACTGGGCGGCGAATACCACATTCCGCACGGTCGTGCCL N H S M A H K L G G E Y H I P H G R A2521 AACGCCATTCTGCTTCCCTATGTCGTTGAATACAACGGCAATCCGAAGCCGACCAAATATN A I L L P Y V V E Y N G N P K P T K Y2581 GCGATCTGGCCGAAATACGAGACTTATCTTGCCCCGCAGCGTTTCCAAGAGATTGCCCGCA I W P K Y E T Y L A P Q R F Q E I A R2641 CATGTCGGCCTGAAGGCAAGCACACCGGAAGAGGGCGTTGCTTCCCTCGTGCAGGCGATTH V G L K A S T P E E G V A S L V Q A I2701 CGCGATTTGATGAAGACCGTCAATGAGCCGATGAGCATTCAAGCCACCGGCGTGCCCGAGR D L M K T V N E P M S I Q A T G V P E2761 AACGTGTTCCTCACCAATCTGGATTCTCTGGCTGATAAAGCGTTTTCCGACCAGTGCACCN V F L T N L D S L A D K A F S D Q C T2821 GGCGCAAATCCGCGTCTGCCGCTCGTCAGCGAGATCGCCGAGCTCTATAAAGCCGCTTATG A N P R L P L V S E I A E L Y K A A Y2881 TACGGCAAATAAACTGTTTACCAAGCGCACAATAAAAAAGGGGCCTGCTTTTTGCAGGTCY G K2941 CCTTTTTTATTGTGCGCCACTTCAGCAATCCGTGCCAAACAGAAAATTTCATCCTTTTAC3001 GGCCGCTTCGAATACCGCTTCGATTTTTTCCGGACTCGGTATTCCCTCGTGTAGCTTATT3061 TCCGTCTACGTAAAAAGTGGGAACATAATAATAATCGT
權(quán)利要求
1.乙醛-乙醇脫氫酶基因，其特征在于所述乙醛-乙醇脫氫酶基因的基因序列為GTGTACTCGTCGAAAACGTGCACCTGAGTGACAGCCTGATGACATTGTGCTACATGGTAAGGGATTTATCCGAAAAAGAAACACGGGACAATTGAACTGCTTTGATACCGTCATGACCATTCGGCTCGTTGCACGAAAACGACAAATCAAACGGGACATGACGTCATCGTTTTATAATATTTGACAAATTGCACAGCATTCACTTGCAACTTGCAAAAAAGTATCGTATAATAATATTGATAATATTTTAACAATATTGCTTAAGGGGGCAATTTGATGGCAACCGAAACAAAAGAAGTCGCCCAGGAAGCGCAGAAACCCGACGTCAAACAAATGATTGACGAACTGGTGGCAAAAGCGCAGAAAGCTCTGGACGAGTTTTCTACCTTCAACCAGGAGCAGGTTGACAAAATCGTCCATGCCATGGCACTTGCGGCGCTGGATAAGCATATGTATCTGGCTAAACTCGCCGTGGAAGAAACCGGACGCGGTATTTACGAAGACAAGATTACCAAAAACCTGTACGCAAGCGAATATATCTGGCATGACATCAAATATGCAAAGACCGTCGGCGTCATCGACGAAAACGAGATGGAAGAATATGTGGATATCGCCGAGCCTGTCGGTATCATCGCGGGCGTTACCCCGGTAACCAACCCCACCTCCACCGCTATCTTTAAATCCCTCATCTCCGTCAAAACCCGCAACCCCATCATTTTCGGTTTCCATCCCGCTGCCCAGAAATGCTGCGCGGAAACGGCCCGCATTCTGAATGAGGCGGCTGTGGCTGCCGGTGCCCCCGAAAACATTGTGCAGTTCATCCCCCATCCTTCCATCGAAGCGACCAATGCGTTGATGAATCATCCCGGTGTCGCCACGATTTTGGCGACCGGCGGCCCCGGCATGGTCAAGGCTGCGTATTCCTGCGGCAAACCGGCGCTGGGTGTCGGTCCCGGCAACGTCCCCTGCTATGTCGAAAAAACAGCGAAACTCCGCCGTGCCTGCCATGACCTCATCCTTTCCAAAACGTTCGACAACGGCATGATCTGCGCTTCCGAACAGGCTGCGATTGTGGATAAAGAAATCGCGGCGGATTTTGAAAAGATCATGAAAGCAAACGGCTGCTACTTCACCAATCCGGAAGAAACGGCCAAACTCGGCAAATATGTGATCACCGAGAAAATGAGCGTGAATCCCCCGGTCGTCGGCCAGTCCGCTGTCTGGATCGCCGAGCAGGCCGGCATCAAAGTACCTGCCGACACCAAGGTCATTCTTGCCAAACTTGACAAGGTCGATTTTGATGTGCCGCTGGCTCACGAAAAACTTTCTCCGGTGCTTGGTTATTATATCGCCAACAGCACGGAGGATGCTTTCAAAGCTGCGCTTCGCATGCTGGAAATCGGCGGTCTGGGTCACTCTGCAGCCATCCACTCCACCGATAACGACATCATCATGAAATACGGCGAAGCCATGAAGGTCGGCCGTGTGCTGGTCAACAGCCCGTCTTCTCAGGGCGGTATCGGCGATATCTACAACACCAATATTCCTTCCCTTACCCTTGGCTGCGGCTCCTATGGCCACAACTCTGTTTCGCAGAACGTCAGTGCGGTCAACCTGATCAACAAAAAGCGCATTGCCAAGAGGAGAGTCAACATGCAGTGGTTTAAAGTGCCGCCGAAGATTTACTTCGAGTTCGATGCGATTCAGTACCTGGAGAAAATGCCGAACATCTCCCGTGCATTCATCGTCACCGACCCTGTAATGGTCAAGCTCGGAAATGTGGATAAGGTTCTTTATTATCTCCGCAAACGCAAAGAGTATTGCCACAGTGAGATTTTCTCCGAAGTTGAGCCCGACCCGTCTTTTGAAACGGTTATGCGCGGCGTGGAAATGATGAAGAAATTTGAGCCGGATGTCATCATCGCACTCGGCGGCGGTTCTTCCATGGATGCCGCGAAGGGCATGTGGCTCTTCTATGAGCATCCGGACTTTGATTTCAAAGGCGCACATGAGAAATTCATGGATATCCGCAAGCGCACTTATCACTTCCCCGAACTGGGCCAGAAATGCCAGATGGTCGCCGTGCCGACTACTTCCGGCACCGGCTCCGAAGTGACGTCTTTTGCGGTCATCACCGACAAGGTCAATAACTTCAAATATCCGCTCGCCGACTATGCGCTCACTCCGAATGTCGCTATCGTTGACCCGCAGTTTGTTATGACCATGCCGAAATCCACCACGGCGGATACCGGTTTGGACGTGCTGACCCACGCCATTGAAGCCTATGTCTCCGTTTTGGCAAACGATTACACTGATGGTCTGGCCCTGAAAGCGATTGAGATCGTCTTCAAATATCTGCCCCGTGCCTATGCGGACGGTGCCAAAGACGGCGAAGCGCGCATGAAAATGCACAACGCTTCCTGCATCGCCGGTATGGCGTTCAGCAATGCGTTCCTTGGCTTGAACCACTCCATGGCGCACAAACTGGGCGGCGAATACCACATTCCGCACGGTCGTGCCAACGCCATTCTGCTTCCCTATGTCGTTGAATACAACGGCAATCCGAAGCCGACCAAATATGCGATCTGGCCGAAATACGAGACTTATCTTGCCCCGCAGCGTTTCCAAGAGATTGCCCGCCATGTCGGCCTGAAGGCAAGCACACCGGAAGAGGGCGTTGCTTCCCTCGTGCAGGCGATTCGCGATTTGATGAAGACCGTCAATGAGCCGATGAGCATTCAAGCCACCGGCGTGCCCGAGAACGTGTTCCTCACCAATCTGGATTCTCTGGCTGATAAAGCGTTTTCCGACCAGTGCACCGGCGCAAATCCGCGTCTGCCGCTCGTCAGCGAGATCGCCGAGCTCTATAAAGCCGCTTATTACGGCAAATAAACTGTTTACCAAGCGCACAATAAAAAAGGGGCCTGCTTTTTGCAGGTCCCTTTTTTATTGTGCGCCACTTCAGCAATCCGTGCCAAACAGAAAATTTCATCCTTTTACGGCCGCTTCGAATACCGCTTCGATTTTTTCCGGACTCGGTATTCCCTCGTGTAGCTTATTTCCGTCTACGTAAAAAGTGGGAACATAATAATAATCGT。
全文摘要
乙醛－乙醇脫氫酶基因，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。鑒于乙醛－乙醇脫氫酶基因的克隆對研究產(chǎn)氫菌B49代謝工程提高產(chǎn)氫量有很重要的作用，本發(fā)明的乙醛－乙醇脫氫酶基因是以高效產(chǎn)氫菌Ethanologenbacterium hit B49總DNA為模板，通過PCR擴增獲得的。本發(fā)明的乙醛－乙醇脫氫酶基因的基因全長3098bp，在277bp處有起始密碼子ATG，在2889bp處有終止密碼子TAA。該序列無內(nèi)含子，具有2616bp完整的開放讀碼框，編碼871個氨基酸。本發(fā)明擴大了乙醛－乙醇脫氫酶基因的資源，從而為Ethanologenbacterium hit B49的代謝工程研究和構(gòu)建基因工程菌提供了科學(xué)依據(jù)。
文檔編號C12N9/04GK1807640SQ20061000961
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月12日
發(fā)明者林海龍, 任南琪 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)