專利名稱：合成頭孢克洛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及合成頭孢克洛(cefaclor)的方法，所述方法包括在存在酶的情況下用7-氨基-3-氯-頭孢烷酸(7-ACCA)與活性形式的D-苯基甘氨酸反應(yīng)，本發(fā)明涉及包含頭孢克洛的水性混合物以及用于從該水性混合物中回收頭孢克洛的方法。
用于對(duì)頭孢克洛進(jìn)行酶促合成的方法可從多種來(lái)源已知。EP 567 323公開了一種方法，用于在0至20℃的溫度以及環(huán)境pH下對(duì)頭孢克洛進(jìn)行酶促合成，其中采用了高的D-苯基甘氨酸甲酯與7-ACCA的摩爾比(5至6)，這導(dǎo)致了93％和88.2％的產(chǎn)率?；钚詡?cè)鏈與β-內(nèi)酰胺核的高摩爾比是人們不期望，因?yàn)檫@增加了成本以及酶促合成反應(yīng)中形成的副產(chǎn)物(例如，D-苯基甘氨酸)，所述副產(chǎn)物難于與最終的抗生素(頭孢克洛)分開。
EP 730 035目的在于在用于合成頭孢克洛的酶促工藝中降低D-苯基甘氨酸酰胺對(duì)7-ACCA的摩爾比。通過(guò)將青霉素G酰胺酶固定于吖內(nèi)酯(azlactone)聚合物上，獲得的相對(duì)7-ACCA的頭孢克洛產(chǎn)率為98％和94％，其中，D-苯基甘氨酸酰胺與7-ACCA的摩爾比在2至3之間。
我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)活性形式的D-苯基甘氨酸與7-ACCA的摩爾比在大約2至3之間時(shí)，對(duì)頭孢克洛的酶促合成反應(yīng)期間形成的副產(chǎn)物的量仍然太大，這導(dǎo)致在從反應(yīng)混合物回收頭孢克洛期間的操作性問(wèn)題，和/或無(wú)法獲得實(shí)質(zhì)上純的形式的頭孢克洛。
本發(fā)明的目的是提供從7-ACCA和活性形式的D-苯基甘氨酸對(duì)頭孢克洛進(jìn)行酶促合成的方法，該方法沒有上述缺點(diǎn)。
這根據(jù)本發(fā)明通過(guò)用于對(duì)頭孢克洛進(jìn)行酶促合成的方法來(lái)獲得，所述方法包括在存在酶的情況下，用7-氨基-3-氯頭孢烷酸(7-ACCA)與活性形式的D-苯基甘氨酸(PGa)在反應(yīng)混合物中反應(yīng)，形成頭孢克洛，其中，7-ACCA和/或PGa在反應(yīng)期間向反應(yīng)混合物中加入。
令人吃驚地，我們發(fā)現(xiàn)，在根據(jù)本發(fā)明的用于合成頭孢克洛的方法中，相對(duì)7-ACCA而言產(chǎn)生的頭孢克洛的量高于其中在反應(yīng)開始即加入用于反應(yīng)的全部量的7-ACCA和PGa的酶促合成方法所得到的。
令人吃驚地，我們發(fā)現(xiàn)，在根據(jù)本發(fā)明的用于合成頭孢克洛的方法中，頭孢克洛的轉(zhuǎn)化率可以高于90％，優(yōu)選高于92％，優(yōu)選高于95％，更優(yōu)選高于96％。
本文中使用的頭孢克洛的轉(zhuǎn)化率被定義為相對(duì)加入到反應(yīng)混合物中的7-ACCA的總量(以摩爾表示)而言產(chǎn)生的頭孢克洛的量(以摩爾表示)。
頭孢克洛的產(chǎn)率被定義為相對(duì)加入的7-ACCA的總量(以摩爾表示)從反應(yīng)混合物中回收的頭孢克洛的量(以摩爾表示)。
此外，我們發(fā)現(xiàn)，在根據(jù)本發(fā)明的用于合成頭孢克洛的方法中，形成非常少量的副產(chǎn)物。當(dāng)副產(chǎn)物(例如D-苯基甘氨酸)的濃度在反應(yīng)混和物中較低時(shí)，看起來(lái)可從反應(yīng)混合物中回收實(shí)質(zhì)上純的形式的頭孢克洛。頭孢克洛的實(shí)質(zhì)上純的形式被定義為包含至少94(w/w)％，優(yōu)選至少95(w/w)％，優(yōu)選至少96(w/w)％，優(yōu)選至少97(w/w)％，優(yōu)選至少98(w/w)％的頭孢克洛，優(yōu)選至少99(w/w)％的頭孢克洛的產(chǎn)品。
在根據(jù)本發(fā)明的用于合成頭孢克洛的方法中，優(yōu)選地，以低于2的PGa與7-ACCA的摩爾比將7-ACCA和PGa加入到反應(yīng)混合物中，優(yōu)選地，低于1.8，更優(yōu)選地，低于1.5，最優(yōu)選地，低于1.2。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PGa與7-ACCA的摩爾比保持為低于這些值時(shí)，在合成反應(yīng)期間幾乎不形成副產(chǎn)物，在回收頭孢克洛期間幾乎遇不到操作性問(wèn)題。
本文中使用的PGa與7-ACCA的摩爾比被定義為以摩爾表示的加入到反應(yīng)混合物中的PGa的總量除以以摩爾表示的加入到反應(yīng)混合物中的7-ACCA的總量。
在根據(jù)本發(fā)明的酶促合成頭孢克洛的方法中，在反應(yīng)期間向反應(yīng)混合物中加入7-ACCA和/或PGa。優(yōu)選地，在超過(guò)10分鐘，優(yōu)選超過(guò)20分鐘，優(yōu)選超過(guò)30分鐘，優(yōu)選超過(guò)60分鐘，優(yōu)選超過(guò)90分鐘，優(yōu)選小于360分鐘，優(yōu)選少于240分鐘，優(yōu)選少于120分鐘的合成反應(yīng)期間將待加入到反應(yīng)混合物中的7-ACCA和/或PGa的重量中的至少一部分以連續(xù)或間斷模式加入到反應(yīng)混合物中。
根據(jù)本發(fā)明的用于合成頭孢克洛的方法優(yōu)選是下述方法，其中，在合成反應(yīng)期間向反應(yīng)混合物中加入PGa。PGa可以以固體形式或在溶液中加入進(jìn)反應(yīng)混合物。
用于本發(fā)明的方法中的PGa可以是酰胺，例如一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)酰胺，或D-苯基甘氨酸的酯。優(yōu)選地，PGa是D-苯基甘氨酸的酯，例如，D-苯基甘氨酸的低級(jí)烷基(C1-4)酯，例如D-苯基甘氨酸的甲、乙或異丙酯。優(yōu)選的是D-苯基甘氨酸甲酯(PGM)，最優(yōu)選的是以鹽的形式存在的PGM，例如PGM的甲酸、甲磺酸或HCl鹽。其它D-苯基甘氨酸酯的甲酸、甲磺酸或HCl鹽也可以使用。
適合在7-ACCA與PGa的反應(yīng)中作為催化劑以制備頭孢克洛的任何酶都可在本發(fā)明的方法中使用。此類酶例如是作為一般性術(shù)語(yǔ)“青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶”或“青霉素G?；D(zhuǎn)移酶”已知的酶，其還可被稱為“青霉素G酰胺酶”或“苯甲基青霉素?；D(zhuǎn)移酶”(EC 3.5.1.11)。青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶指來(lái)自微生物(尤其是細(xì)菌)的一組水解酶，其能水解青霉素的6-?；蝾^孢菌素的7-?；？苫谄涞孜锾禺愋砸约盎谄浞肿咏Y(jié)構(gòu)，對(duì)青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶加以分類，這在多份公開文獻(xiàn)中有所描述，見，例如WO 03/055998和WO98/20120。
可從中獲得青霉素?；D(zhuǎn)移酶的微生物例如Acetobacter(特別是Acetobacter pasteurianum)、Aeromonas、Alcaligenes(特別是Alcaligenesfaecalis)、Aphanocladium、Bacillus sp.(特別是Bacillus megaterium)、Cephalosporium、Escherichia(特別是Escherichia coli)、Flavobacterium、Fusarium(特別是Fusarium oxysporum和Fusariumsolani)、Kluyvera、Mycoplana、Protaminobacter、Proteus(特別是Proteus rettgari)、Pseudomonas和Xanthomonas(特別是Xanthomonascitrii)。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，在用于合成頭孢克洛的方法中的酶是突變體酶。
可從任何已知的青霉素?；D(zhuǎn)移酶來(lái)制造青霉素?；D(zhuǎn)移酶的突變體或酰基轉(zhuǎn)移酶突變體。經(jīng)突變的?；D(zhuǎn)移酶例如按照如下方式獲得由本領(lǐng)域已知的重組DNA方法，通過(guò)將一個(gè)氨基酸殘基取代為新的殘基，從野生型酰基轉(zhuǎn)移酶來(lái)獲得。
本發(fā)明的方法中使用的突變體青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶可以例如是較之E.coli的野生型?；D(zhuǎn)移酶而言具有更高S/H比的青霉素?；D(zhuǎn)移酶。
在本文中，合成/水解(S/H)比應(yīng)當(dāng)被理解為是在酶促反應(yīng)期間特定時(shí)刻合成產(chǎn)物與水解產(chǎn)物的摩爾比。合成產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)被理解為從活化側(cè)鏈和β-內(nèi)酰胺核心形成的β-內(nèi)酰胺抗生素。水解產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)被理解為活化側(cè)鏈的相應(yīng)的酸。
S/H比是反應(yīng)物濃度、活性側(cè)鏈對(duì)β-內(nèi)酰胺核心的摩爾比、溫度、pH和酶的函數(shù)。在理想狀況下進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)，其中，在相同條件下，針對(duì)參照酶(優(yōu)選地，E.coli PenG酰基轉(zhuǎn)移酶)對(duì)特定候選者加以測(cè)試。關(guān)于如何測(cè)定S/H比的詳細(xì)描述在WO 03/055998中給出。
優(yōu)選地，突變體酶是下述突變體青霉素?；D(zhuǎn)移酶，其在對(duì)應(yīng)于E.coli青霉素?；D(zhuǎn)移酶β-亞基的β-亞基第24位具有氨基酸取代。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)應(yīng)于E.coli青霉素?；D(zhuǎn)移酶β-亞基的β-亞基的第24位上的L-苯丙氨酸已被該位置上的L-丙氨酸取代，如WO 98/20120所述。該突變可應(yīng)用于來(lái)自E.coli的Pen G?；D(zhuǎn)移酶，但是也可使用來(lái)自其它來(lái)源的Pen G?；D(zhuǎn)移酶。對(duì)氨基酸位置的編號(hào)對(duì)應(yīng)于對(duì)E.coli野生型青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的編號(hào)。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，可將酶固定于載體上。酶以固定形式存在時(shí)可容易地分離并重復(fù)應(yīng)用。固定的酶本身是已知的，并可通過(guò)商業(yè)途徑獲得，例如按照WO 92/12782所述分離并按照EP 222 462和WO 97/04086所述固定的E.coli青霉素?；D(zhuǎn)移酶。
根據(jù)本發(fā)明的用于合成頭孢克洛的方法可在任何合適的pH下進(jìn)行。優(yōu)選地，酶促合成反應(yīng)在6至8之間的pH下進(jìn)行，優(yōu)選地，6.5至7.7之間，更優(yōu)選地，6.8至7.2之間?？捎萌魏魏线m的有機(jī)或無(wú)機(jī)堿或任何合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸，將反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)至正確的pH值。
根據(jù)本發(fā)明的用于合成頭孢克洛的方法可在任何合適的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，酶促合成反應(yīng)在5至35℃之間的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選地，8至25℃之間，更優(yōu)選地，18至23℃之間。酶促合成反應(yīng)還可以在8至16℃之間的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選地，9至15℃之間，優(yōu)選地，10至14℃之間。
用于對(duì)頭孢克洛酶促合成的方法中的反應(yīng)混合物原則上是水性反應(yīng)混合物。水性反應(yīng)混合物可含有有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的混合物，優(yōu)選地，有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的混合物少于30vol％，更優(yōu)選地，少于20vol％，更優(yōu)選地，少于10vol％，更優(yōu)選地，少于5vol％(相對(duì)于液體總體積而言)。優(yōu)選地，有機(jī)溶劑是具有1-7個(gè)碳原子的醇，例如一元醇，特別是甲醇或乙醇；二醇，特別是乙二醇，或三醇，特別是甘油。優(yōu)選地，水性反應(yīng)混合物含有至少70vol％的水，更優(yōu)選地，至少80vol％，更優(yōu)選地，至少90vol％，最優(yōu)選地，至少95vol％的水(相對(duì)于液體總體積而言)。
在酶促合成反應(yīng)結(jié)束時(shí)，可將反應(yīng)混合物的溫度降低至低于5℃的溫度，優(yōu)選地，低于4℃的溫度，優(yōu)選地，高于0℃。
在酶促合成反應(yīng)結(jié)束時(shí)，可從水性反應(yīng)混合物中回收形成的頭孢克洛，例如通過(guò)離心或過(guò)濾來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明還涉及水性混合物，其中包含頭孢克洛、7-氨基-3-氯-頭孢烷酸(7-ACCA)和D-苯基甘氨酸(PG)，其中水性混合物包含＞10(w/w)％的量的頭孢克洛、＜2(w/w)％的量的7-氨基-3-氯頭孢烷酸以及＜2(w/w)％的量的D-苯基甘氨酸。有利地，可通過(guò)本發(fā)明的頭孢克洛合成方法來(lái)獲得該水性混合物。優(yōu)選地，水性混合物包含＞12(w/w)％的量的頭孢克洛，更優(yōu)選地，＞15(w/w)％；優(yōu)選地，水性混合物中頭孢克洛的量＜50(w/w)％，更優(yōu)選地，＜30(w/w)％。優(yōu)選地，水性混合物包含＜1.5(w/w)％的量的7-ACCA，更優(yōu)選地，＜1(w/w)％，更優(yōu)選地，＜0.8(w/w)％，更優(yōu)選地，＜0.6(w/w)％，更優(yōu)選地，＜0.4(w/w)％。優(yōu)選地，水性混合物包含＜1.5(w/w)％的量的PG，優(yōu)選地，＜1.2(w/w)％，更優(yōu)選地，＜1(w/w)％，更優(yōu)選地，＜0.8(w/w)％。令人吃驚地，我們發(fā)現(xiàn)，可以容易地從本發(fā)明的水性混合物中回收以實(shí)質(zhì)上純的形式存在的頭孢克洛，而幾乎沒有或沒有遇到操作性問(wèn)題。
本發(fā)明還涉及從本發(fā)明的水性混合物中回收頭孢克洛的方法，例如通過(guò)離心或過(guò)濾。優(yōu)選地，在朝上的攪拌(upwards stirring)下通過(guò)底篩(bottom sieve)從水性混合物中回收頭孢克洛(見，例如NL1006267)，得到包含頭孢克洛晶體的懸浮液。
包含頭孢克洛晶體的懸浮液或根據(jù)本發(fā)明的水性混合物可被酸化至0.5至2之間的pH，得到包含溶解的頭孢克洛的酸性溶液。將pH酸化至0.5至2之間可用任何合適的無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸、硝酸和硫酸)或者任何合適的有機(jī)酸(例如甲酸、乙酸和檸檬酸)來(lái)進(jìn)行。優(yōu)選地，用鹽酸酸化包含頭孢克洛晶體的懸浮液或根據(jù)本發(fā)明的水性混合物，得到包含溶解的頭孢克洛的酸性溶液。
包含溶解的頭孢克洛的酸性溶液或根據(jù)本發(fā)明的水性混合物可被調(diào)節(jié)至4至6之間的pH，由此形成頭孢克洛晶體。用于將包含溶解的頭孢克洛的酸性溶液或根據(jù)本發(fā)明的水性混合物調(diào)節(jié)至4至6之間的pH的合適的堿是無(wú)機(jī)堿(例如氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀)或有機(jī)堿(例如三乙胺或胍)。優(yōu)選地，用氨水來(lái)將包含溶解的頭孢克洛的酸性溶解調(diào)節(jié)至4至6之間的pH。
頭孢克洛可以以任何合適的形式結(jié)晶，典型地，是頭孢克洛水合物的形式，例如單水合頭孢克洛。
可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法，例如通過(guò)離心或過(guò)濾，將頭孢克洛晶體與溶液分離開，得到包含頭孢克洛晶體的濕餅(wet cake)，其中頭孢克洛晶體是通過(guò)將包含溶解的頭孢克洛的酸性溶液調(diào)節(jié)至4至6之間的pH形成的。
隨后可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法，對(duì)包含頭孢克洛晶體的濕餅進(jìn)行洗滌并干燥。
令人吃驚地，我們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)本發(fā)明的方法從本發(fā)明的水性混合物獲得了具有非常低著色度(coloration)的頭孢克洛晶體。優(yōu)選地，具有低著色度的頭孢克洛晶體是下述水性混合物獲得的，所述水性混合物是通過(guò)本發(fā)明的用于對(duì)頭孢克洛酶促合成的方法獲得的。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，頭孢克洛晶體的低著色度可被定義為在400nm處的低吸光度，例如，在400nm的吸光度低于0.250。
因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及以晶體形式存在的頭孢克洛，其在400nm處的吸光度(A400)小于0.250，優(yōu)選小于0.200，優(yōu)選小于0.150，優(yōu)選小于0.100，優(yōu)選小于0.090，優(yōu)選小于0.080，優(yōu)選小于0.070，優(yōu)選小于0.060，優(yōu)選小于0.050，這是通過(guò)在室溫下90s后對(duì)溶解于10ml 1N HCl溶液的0.5g以晶體形式存在的頭孢克洛的溶液測(cè)量A400得到的。
可通過(guò)絡(luò)合劑的存在來(lái)穩(wěn)定頭孢克洛。絡(luò)合劑可在合成反應(yīng)期間加入進(jìn)反應(yīng)混合物，或可在合成反應(yīng)已完成之后加入反應(yīng)混合物，或加入根據(jù)本發(fā)明的水性混合物中。絡(luò)合劑還可在對(duì)頭孢克洛的回收期間加入。合適的絡(luò)合劑可以是萘類、膽堿類、蒽醌磺酸(anthrachinonsulphonic acid)類或?qū)αu基苯甲酸酯類(parabene)。絡(luò)合劑的例子是1-萘酚、2-萘酚、2，6-二羥基萘和蒽醌-1，5-二磺酸。
下述實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明加以闡述，其不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例酶和固定本文中使用的青霉素?；D(zhuǎn)移酶是E.coli PenG?；D(zhuǎn)移酶突變體Phe-B24-Ala，如WO 98/20120所述。按照EP 222 462和WO-A-97/04086所述，用明膠和殼聚糖(chitosan)作為膠凝劑，戊二醛作為交聯(lián)劑，對(duì)酶加以固定。
實(shí)施例1a)對(duì)頭孢克洛的酶促合成向具有175μm篩底的反應(yīng)器中加入5.0g固定的PenG酰基轉(zhuǎn)移酶突變體Phe-B24-Ala。在20℃加入13.9g(58.1mmol)7-ACCA、0.1g亞硫酸鈉和60g水，用氨將pH調(diào)節(jié)至7.0。
20℃時(shí)，在單獨(dú)的容器中，通過(guò)將12.9g(63.8mmol)PGM HCl鹽和21g水混合來(lái)制備PGM溶液。
從t＝0至t＝117分鐘，按照恒定速率，將PGM溶液加入反應(yīng)器。酶促縮合反應(yīng)在t＝0時(shí)開始，這是剛開始加入PGM的時(shí)間。用氨將pH保持于7.0。
t＝150分鐘時(shí)，頭孢克洛、7-ACCA、PGM和PG的濃度分別為17.5(w/w)％、0.33(w/w)％、0.23(w/w)％和0.79(w/w)％。
t＝150分鐘時(shí)，相對(duì)加入7-ACCA而言向頭孢克洛的轉(zhuǎn)化率為97.0％，S/H比為9.1。
隨后，用鹽酸溶液將pH降低至5.3。溫度降低至2℃。
b)回收頭孢克洛在朝上的攪拌下，通過(guò)底篩使反應(yīng)器排水。將得到的頭孢克洛懸浮液濾經(jīng)玻璃過(guò)濾器。將得到的母液轉(zhuǎn)移回反應(yīng)器。重復(fù)5次該步驟順序。以這種方式，將＞95％的固體頭孢克洛與固體生物催化劑分開。
合并頭孢克洛濕餅和母液，將溫度保持為2℃。用鹽酸將合并的頭孢克洛濕餅和母液的pH降低為0.8，將得到的溶液濾經(jīng)0.45μm的過(guò)濾器。
向結(jié)晶反應(yīng)器中裝入34g水和1.0g作為晶種的頭孢克洛。35℃，在60分鐘內(nèi)，將上述酸性頭孢克洛溶液加入進(jìn)結(jié)晶反應(yīng)器。用氨將pH保持為5.0。隨后，以下述步驟降低溫度30℃，30分鐘，25℃，30分鐘以及20℃，60分鐘。將懸浮液濾經(jīng)玻璃過(guò)濾器，用一倍體積的水和兩倍體積的丙酮洗濕餅。干燥后，獲得15.7g單水合頭孢克洛(純度99.4％)。
比較例a)對(duì)頭孢克洛的酶促合成向具有175μm篩底的反應(yīng)器中加入5.0g固定的PenG?；D(zhuǎn)移酶突變體Phe-B24-Ala。在20℃加入13.9g(58.1mmol)7-ACCA、0.1g亞硫酸鈉和60g水，用氨將pH調(diào)節(jié)至7.0。
將12.9g(63.8mmol)PGM HCl鹽加入反應(yīng)器，這起始了酶促縮合反應(yīng)。用氨將pH保持為7.0。
形成了非常粘稠、果汁雪條(sorbet)狀的懸浮液。
t＝150分鐘時(shí)，頭孢克洛、7-ACCA、PGM和PG的濃度分別為10.5％、4.71％、0.11％和3.96％。相對(duì)7-ACCA而言向頭孢克洛的轉(zhuǎn)化率為59％，S/H比為1.1。
隨后，用鹽酸溶液將pH降低至5.3。溫度降低至2℃。
b)回收頭孢克洛試圖在朝上的攪拌下，通過(guò)底篩使反應(yīng)器排水。但是，由于非常高的粘稠度，無(wú)法將頭孢克洛懸浮液與固定的生物催化劑分開。
實(shí)施例2a)對(duì)頭孢克洛的酶促合成向具有175μm篩底的反應(yīng)器中加入10.0g固定的PenG?；D(zhuǎn)移酶突變體Phe-B24-Ala。在10℃加入13.9g(58.1mmol)7-ACCA和52.5g水，用氨將pH調(diào)節(jié)至7.0。
10℃時(shí)，在單獨(dú)的容器中，通過(guò)將16.7g(63.7mmol)PGM甲磺酸鹽和20g水混合來(lái)制備PGM溶液。
從t＝0至t＝90分鐘，按照恒定速率，將PGM溶液加入反應(yīng)器。酶促縮合反應(yīng)在t＝0時(shí)開始，這是剛開始加入PGM的時(shí)間。用氨將pH保持于7.0。溫度被保持為12℃。從t＝120至t＝180分鐘，溫度從12℃線性降低至2℃。
t＝190分鐘時(shí)，頭孢克洛、7-ACCA、PGM和PG的濃度分別為18.1(w/w)％、0.20(w/w)％、0.04(w/w)％和0.64(w/w)％。
t＝190分鐘時(shí)，相對(duì)加入7-ACCA而言產(chǎn)生的頭孢克洛的轉(zhuǎn)化率為98.0％，S/H比為12。
隨后，用鹽酸溶液將pH降低至5.0。
b)回收頭孢克洛在朝上的攪拌下，通過(guò)底篩使反應(yīng)器排水。將得到的頭孢克洛懸浮液濾經(jīng)玻璃過(guò)濾器。將得到的母液轉(zhuǎn)移回反應(yīng)器。重復(fù)5次該步驟順序。隨后，用2×10ml水來(lái)洗酶。以這種方式，將≥95％的固體頭孢克洛與固體生物催化劑分開。
合并頭孢克洛濕餅、母液和洗滌用水，將溫度保持為2℃。用鹽酸將合并的頭孢克洛濕餅和母液的pH降低為0.5，將得到的溶液濾經(jīng)0.45μm的過(guò)濾器。
向結(jié)晶反應(yīng)器中裝入10g水。25℃，在30分鐘內(nèi)，將上述酸性頭孢克洛溶液加入進(jìn)結(jié)晶反應(yīng)器。用氨將pH保持為5.0。隨后，在10℃對(duì)懸浮液再進(jìn)行30分鐘攪拌。將懸浮液濾經(jīng)玻璃過(guò)濾器，用2×15ml的水和2×15ml的丙酮洗濕餅。干燥后，獲得18.3g單水合頭孢克洛(純度99.6％)。
實(shí)施例3頭孢克洛的著色度通過(guò)測(cè)量400nm處的吸光度來(lái)測(cè)定從實(shí)施例2獲得的單水合頭孢克洛的著色度。
將0.5g單水合頭孢克洛溶解于10ml 1N HCl溶液中。在PerkinElmer 550S分光光度計(jì)上，室溫下在400nm處測(cè)定吸光度(＝A400)，用1N HCl溶液作為參照溶液。90s后測(cè)定A400。在按照實(shí)施例2所述分離和干燥之后直接測(cè)量的單水合頭孢克洛的吸光度為0.036。室溫以及70％相對(duì)濕度的條件下對(duì)來(lái)自實(shí)施例2的單水合頭孢克洛晶體進(jìn)行4周貯存后，單水合頭孢克洛的吸光度為0.043。
權(quán)利要求
1.用于合成頭孢克洛的方法，所述方法包括在存在酶的情況下，用7-氨基-3-氯頭孢烷酸(7-ACCA)與活性形式的D-苯基甘氨酸(PGa)在反應(yīng)混合物中反應(yīng)，形成頭孢克洛，其特征在于，7-ACCA和/或PGa在反應(yīng)期間向反應(yīng)混合物中加入。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在反應(yīng)期間向反應(yīng)混合物中加入活性形式的D-苯基甘氨酸(PGa)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，7-ACCA和PGa以低于2的PGa與7-ACCA的摩爾比加入到反應(yīng)混合物中。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，PGa是D-苯基甘氨酸的酯。
5.如權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的酶是突變體酶。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述突變體酶是下述突變體青霉素?；D(zhuǎn)移酶，其在對(duì)應(yīng)于E.coli青霉素?；D(zhuǎn)移酶β-亞基的β-亞基第24位具有氨基酸取代。
7.如權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述合成反應(yīng)在6至8之間的pH進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述合成反應(yīng)在5至35℃之間的溫度進(jìn)行。
9.水性混合物，其中包含＞10(w/w)％的量的頭孢克洛、＜2(w/w)％的量的7-氨基-3-氯頭孢烷酸以及＜2(w/w)％的量的D-苯基甘氨酸。
10.用于獲得頭孢克洛的方法，其中，所述方法包括從權(quán)利要求9的水性混合物中回收頭孢克洛。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括將所述水性混合物的pH調(diào)節(jié)至4至6之間。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括在朝上的攪拌下通過(guò)底篩回收頭孢克洛，得到包含頭孢克洛晶體的懸浮液。
13.用于獲得頭孢克洛的方法，其中，所述方法將權(quán)利要求9的水性混合物或權(quán)利要求12的包含頭孢克洛晶體的懸浮液酸化至0.5至2之間的pH，得到包含溶解的頭孢克洛的酸性溶液。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其進(jìn)一步特征在于，用合適的堿將所述包含溶解的頭孢克洛的酸性溶液調(diào)節(jié)至4至6之間的pH，由此形成頭孢克洛晶體。
15.以晶體形式存在的頭孢克洛，其在400nm處的吸光度(A400)小于0.250，這是通過(guò)相對(duì)于1N HCl參照溶液，在室溫下90s后對(duì)溶解于10ml 1N HCl溶液的0.5g以晶體形式存在的頭孢克洛的溶液測(cè)量A400得到的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種方法，用于合成頭孢克洛，所述方法包括在存在酶的情況下，用7－氨基－3－氯頭孢烷酸(7－ACCA)與活性形式的D－苯基甘氨酸(PGa)在反應(yīng)混合物中反應(yīng)，形成頭孢克洛，其中，7－ACCA和/或PGa的至少一部分在反應(yīng)期間向反應(yīng)混合物中加入。本發(fā)明還涉及水性混合物，其中包含＞10(w/w)％的量的頭孢克洛、＜2(w/w)％的量的7－氨基－3－氯頭孢烷酸以及＜2(w/w)％的量的D－苯基甘氨酸，還涉及從該水性混合物中回收頭孢克洛的方法。本發(fā)明還涉及晶體形式的頭孢克洛，其在400nm處的吸光度(A
文檔編號(hào)C12P37/04GK101090978SQ200580045005
公開日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2005年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月27日
發(fā)明者哈羅德·莫洛·穆迪, 西奧多瑞斯·約翰內(nèi)斯·格德弗里德·瑪麗亞·杜勒恩范 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司