專利名稱：：基因沉默的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：0002本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生下調(diào)或防止期望的目標(biāo)多核苷酸表達(dá)的核酸產(chǎn)物的獨(dú)特構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明的策略和構(gòu)建體的特點(diǎn)在于特定的特征。例如，本發(fā)明的構(gòu)建體可以不包含如涉及3'-末端形成和多聚腺苷酸化的終止子之類的DNA區(qū)?？蛇x擇地，構(gòu)建體可以包括非功能性終止子，其是天然狀態(tài)下無功能的或其已經(jīng)被修飾或突變而變成無功能的?？蛇x擇地，笫一啟動子可以可操作地連接到例如"盒A"中的第一多核苷酸，笫二啟動子可以可操作地連接到例如"盒B"中的第二多核苷酸。每個盒的多核苷酸可以包含也可以不包含相同的核苷酸序列，但可以具有與感興趣的目標(biāo)核酸一定百分比的序列同一性。盒可以串聯(lián)排列，即，由此它們在構(gòu)建體中相互鄰近。此外，例如，盒B可以按照與盒A反向互補(bǔ)的取向來定向。因而，在這種名卜列中，從盒B的啟動子的轉(zhuǎn)錄將在朝向盒A的啟動子的方向上進(jìn)行。因此，排列盒來i秀導(dǎo)"會聚轉(zhuǎn)錄(convergenttranscriptian)"。0011如果兩個盒都不包含終止子序列，則這種構(gòu)建體通過會聚轉(zhuǎn)錄可以產(chǎn)生不同長度的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。0012因而，在這種情況下，存在著部分或完全地轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的亞群，其包含來自相應(yīng)的盒的、轉(zhuǎn)錄的期望多核苷酸的部分或全長序列?？蛇x擇地，在不存在功能性終止子的情況下，轉(zhuǎn)錄可以通過期望的多核苷酸的末端來產(chǎn)生比期望的多核苷酸的長度更長的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。因而，在包含期望的多核苷酸的兩個拷貝的構(gòu)建體中，其中多核苷酸之一可以按照也可以不按照與另一個反向互補(bǔ)的反向來定向，其中多核苷酸可操作地連接到啟動子來誘導(dǎo)會聚轉(zhuǎn)錄，并且在所述構(gòu)建體中不存在功能性的終止子，從一個期望的多核苷酸啟動的轉(zhuǎn)錄機(jī)制可以繼續(xù)來轉(zhuǎn)錄期望的多核苷酸的另一個拷貝，反之亦然。期望的多核苷酸的多個拷貝可以按照各種排列(permutation)來定向在構(gòu)建體中存在期望多核苷酸的兩個拷貝的情況下，例如，拷貝可以都按相同的方向、按相互相反的取向、或相互反向互補(bǔ)的取向來定向。所述的任何多核苷酸，例如期望的多核苷酸，或第一或第二多核苷酸，例如，可以與于目標(biāo)序列的至少一部分相同，或可以具有與目標(biāo)序列的至少一部分的序列同一性。當(dāng)期望的多核苷酸包含與目標(biāo)序列的片段同源的序列時，即，它與目標(biāo)序列的至少一部分具有序列同一性，則期望的是，所述片段的核苷酸序列特異于所述目標(biāo)基因，和/或存在于所述期望的多核苷酸中的目標(biāo)核酸的部分理想或非理想序列，具有足夠的長度以具有針對目標(biāo)序列的特異性。因此，與目標(biāo)序列的一部分具有序列同一性的、期望的部分多核苷酸可以包含目標(biāo)序列的同種型或同源物特征性結(jié)構(gòu)域、結(jié)合位點(diǎn)或核苷酸序列。因此，可設(shè)計(jì)靶向細(xì)胞中目標(biāo)核酸最佳的期望的多核苷酸。0020在另一個實(shí)施方式中，期望的多核苦酸包含與目標(biāo)核酸的DNA或RNA序列具有序列同一性的、優(yōu)選的在4和5,000個核苷酸之間、更優(yōu)選的在50和l，OOO個核苷酸之間、最優(yōu)選的在150和500個之間的序列。所述期望的多核苷酸可以具有在序列上與目標(biāo)序列中的序列100%相同的15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500或超過500個連續(xù)核苷酸，或其中的任何整數(shù)個，或者期望的多核苷酸包含與目標(biāo)序列的序列具有約99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、60%、59%、58%、57%、56%、55%、54%、53%、52%、51%、50%、49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、8%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7'%、6%、5%，,4%、3%、2%、1%的核苷酸序列同一性的序列。換句話說，期望的多核苷酸可以與目標(biāo)序列的全長序列或目標(biāo)序列的片段同源或具有同源性。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的構(gòu)建體可以包含產(chǎn)生核酸的表達(dá)盒，與不含有所述構(gòu)建體的細(xì)胞相比，所述核酸降低由含有所述構(gòu)建體的細(xì)胞正常表達(dá)的目標(biāo)基因的表達(dá)水平的99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%,、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、60%、59%、58%、57%、56%、55%、54%、53%、52%、51%、50%、49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、70/,、6%、5%、4%、3%、2<K、1%0023本發(fā)明的任何多核苷酸，不管是"期望的多核苷酸"、"第一，，多核苷酸、"笫二"對核苷酸，都可以與目標(biāo)序列具有一定百分比的序列同一性。如在此解釋的，目標(biāo)序列可以是，但不限于，基因的部分或全長序列、調(diào)節(jié)元件，例如啟動子或終止子、外顯子、內(nèi)含子、非翻譯區(qū)、或目標(biāo)基因序列的上游或下游的任何序列。因而，本一方面，本發(fā)明的多核苷酸可以包含與目標(biāo)序列具有序列同一性的序列。因此，本發(fā)明的期望的多核苷酸與目標(biāo)序列的序列可具有約99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%或60%的核苷酸序列同一性。0024]在另一個實(shí)施方式中，期望的多核苷酸包含來自目標(biāo)啟動子的序列。所述目標(biāo)啟動子可以是細(xì)胞基因組中天然存在的，也就是，所述目標(biāo)啟動子對于所述細(xì)胞基因組是內(nèi)源的，或可以通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到該基因組中。來自多核苷酸的啟動子可以是功能上有活性的，可以含有TATA盒或TATA盒樣序列，但轉(zhuǎn)錄起始或任何轉(zhuǎn)錄的序列都不超過轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)?？蛇x擇地，來自多核苷酸的啟動子可以是通過例如TATA框的缺失而功能上失活的。這種衍生的啟動子可以僅代表目標(biāo)啟動子的部分。0025在另一個實(shí)施方式中，期望的多核苷酸包含特異于內(nèi)含子的序列，所述內(nèi)含子對于細(xì)胞基因組是內(nèi)源的。0026在另一個實(shí)施方式中，期望的多核苷酸包含是終止子的部分的序列，所述終止子對于細(xì)胞基因組是內(nèi)源的。0027在另一個實(shí)施方式中，所述構(gòu)建體含有在目標(biāo)組織中功能上有活性的兩個相同的啟動子。在另一個實(shí)施方式中，所述構(gòu)建體包含兩個不同的啟動子，它們每一個在目標(biāo)組織中是功能上有活性的。本發(fā)明的構(gòu)建體可以進(jìn)一步包含在盒A和盒B之間的一個或多個其他的多核苷酸。例如，在5'-到3'-取向上，構(gòu)建體可以包含(O第一啟動子，(ii)期望的多核苷酸，(iii)另外的多核苷酸間隔區(qū)，例如，內(nèi)含子，(iv)期望的多核苷酸的反向互補(bǔ)拷貝，和(v)第二啟動子，其中所述第一和第二啟動子分別與所述期望的多核苷酸和所述互補(bǔ)拷貝可操作地連接，并且被定向來誘導(dǎo)會聚轉(zhuǎn)錄。根據(jù)(i)啟動子和期望的多核苷酸的會聚排列，(ii)期望的多核苷酸的拷貝數(shù)，(iii)構(gòu)建體的終止子區(qū)的缺乏，和(iv)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的互補(bǔ)性和長度，可以從當(dāng)前構(gòu)建體產(chǎn)生各種RNA分子群體。因而，本發(fā)明的單個構(gòu)建體可以產(chǎn)生(i)單鏈的"有義，，RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，(ii)單鏈的"反義"RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，(iii)由自身退火的單鏈RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成的發(fā)夾雙鏈體，或(iv)由相互退火的兩個不同RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成的RNA雙鏈體?？梢栽O(shè)計(jì)單個構(gòu)建體來從每個會聚排列的啟動子產(chǎn)生僅有義的或僅反義的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在一個實(shí)施方式中，第二多核苷酸的至少部分定向?yàn)榈谝粋€多核苷酸的至少部分的反向互補(bǔ)拷貝。0040在另一個實(shí)施方式中，兩種多核苷酸都不可操作連接的、終止轉(zhuǎn)錄的序列是在基因的3，-末端、涉及該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3'末端形成和多聚腺苷酸化的序列。00411在優(yōu)選的實(shí)施方式中，涉及3，-末端形成和多聚腺苷酸化的序列是終止子。0042在另一個實(shí)施方式中，所述表達(dá)盒不包含(i)nos基因終止子，(ii)T-DNA基因7的3'非翻譯序列，(iii)花椰菜花葉病毒的主要包含體蛋白基因的3'非翻譯序列，(iv)豌豆核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亞基的3'非翻譯序列，(v)馬鈴薯遍在蛋白-3基因的3，非翻譯序列，或(vi)馬鈴薯蛋白酶抑制因子II基因的3'非翻譯序列，(vii)opine基因的3非翻譯序列，(viii)內(nèi)源基因的3非翻譯序列。在另一個實(shí)施方式中，第一多核苷酸包含與目標(biāo)序列的序列具有約99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、,84%.、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、60%、59%、58%、57%、56%、55%、54%、53%、52%、51%、50%、49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、8%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%"4%、3%、2%、1%的核苷酸序列同--性的序列。0045在一個實(shí)施方式中，目標(biāo)基因是與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的COMT基因、與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的CCOMT基因、與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的任何其他基因、與淀粉磷酸化相關(guān)的Rl基因、與淀粉磷酸化相關(guān)的磷酸化酶基因、與多盼的氧化相關(guān)的PPO基因、與果膠降解相關(guān)的多聚半乳糖醛酸酶基因、與過敏原的產(chǎn)生相關(guān)的基因、與脂肪酸生物合成相關(guān)的基因例如FAD2。在另一個實(shí)施方式中，第一和第二啟動子是在植物中有功能的。在又一個實(shí)施方式中，所述細(xì)菌是農(nóng)桿菌、根瘤菌或葉瘤桿菌(/^V〃o6flc^n'MWt)。在一個實(shí)施方式中，所述細(xì)菌是才艮癌農(nóng)桿菌、三葉草才艮瘤菌、豌豆才艮瘤菌、紫金牛葉瘤桿菌(P/ij;〃06flc&r/M附mjT57'Mflce"fM附)、苜蓿中華才艮瘤菌(57rto/J/.zoWwwme,〃o")和百脈才艮中間根瘤菌(Mes0由.zoWwm)。在另一個實(shí)施方式中，所述第一啟動子是近-組成型啟動子(nearconstitutivepromoter)、組織特異性啟動子或i秀導(dǎo)型啟動子，并且其中笫二啟動子是近-組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。本發(fā)明的另一個方面是降低塊莖中冷誘導(dǎo)的糖化的方法，包括在塊莖的細(xì)胞中表達(dá)在此描述的任何構(gòu)建體，其中(a)第一多核苷酸包含R1基因的部分的序列，(b)第二多核苷酸是相比所述第一多核苷酸的第一多核苷酸的反向互補(bǔ)物，(c)第一和第二啟動子之一或兩者是GBSS或AGP，(d)所述構(gòu)建體在細(xì)胞中的表達(dá)降低所述塊莖細(xì)胞基因組中Rl基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，從而降低塊莖中冷誘導(dǎo)的糖化。在一個實(shí)施方式中，所述第一多核苦酸包含在SEQIDNO:23或24中所示的序列。在另一個實(shí)施方式中，所述塊莖是馬鈴薯。在另一個實(shí)施方式中，所述第一多核苷酸包含SEQIDNO:23或24的序列的兩個拷貝。本發(fā)明的另一個方面是下調(diào)植物中多個基因的表達(dá)的方法，包括在植物的細(xì)胞中表達(dá)構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含在SEQIDNO:42中所示的序列，其下調(diào)所述植物細(xì)胞中多酚氧化酶、磷酸化酶L基因和R1基因的表達(dá)。在另一個方面中，提供了一種構(gòu)建體，其包含感興趣的多核苷酸的四個正向重復(fù)，其之前是所述感興趣的多核苷酸的反義DNA片段。這種構(gòu)建體如pSIMllll所示。附圖1是二元載體的T-DNA的示意圖，其(a)代表陰性對照(pSIM714)和(b)包含代表常規(guī)的沉默構(gòu)建體的構(gòu)建體，pSIM374、pSIM718和pSIM755。"B"是指轉(zhuǎn)化-DNA邊界序列；"T"是指終止子序列；"hptll"是賦予植物潮霉素抗性的抗性基因；"PI"是指啟動子序列，在這個實(shí)施例中，是與轉(zhuǎn)基因gus植物中驅(qū)動功能上有活性的P-葡糖醛酸酶(gus)基因的啟動子相同的啟動子，"P2"是指功能上也有活性但不同于PI的啟動子序列；"gus-S"是指gus基因片段；"gus-A"是指gus基因片段的反向互補(bǔ)物；"I"是指內(nèi)含子。對于gus-S和gus-A，實(shí)心粗箭頭表示與通過表達(dá)gus基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的部分具有同一性的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(的部分)；打點(diǎn)的粗箭頭表示與gus基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的反向互補(bǔ)物的一部分具有同一性的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(的部分)；細(xì)線表示同源于或反向互補(bǔ)于另一個序列例如構(gòu)建體的內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的部分。對此，左側(cè)的尖空箭頭(其表示盒中的"gus-A，，元件)表示gus-A元件在所述表達(dá)盒中被定向?yàn)間us-S的反向互補(bǔ)物，右側(cè)的尖箭頭。因此，P1和P2啟動子被定向，從而來自每個啟動子的轉(zhuǎn)錄以會聚的方式前進(jìn)，即，P1的轉(zhuǎn)錄向P2前進(jìn)，反之亦然。用于常規(guī)的沉默盒的構(gòu)建、但從本發(fā)明的構(gòu)建體中排除的終止子來自某些基因的3'-區(qū)域，常常還包括更為下游的非轉(zhuǎn)錄DNA序列。選擇使用哪個終止子常常只是便利性的問題。因此，來自內(nèi)源的或早先表征的基因的opine終止子或終止區(qū)已經(jīng)被用于常規(guī)的沉默構(gòu)建體中。更頻繁使用的終止子之一，例如，是農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶(nos)基因終止子，其包含3'非翻譯序列和一些額外的下游DNA。其他終止子包括豌豆核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亞基的3'非翻譯序列(Genbank登記號M21375)。0109馬鈴薯遍在蛋白-3基因的3'非翻譯序列(Genbank登記號Z11669)。如在此使用的，"序列同一性百分比"是指通過在比較窗口上比較兩個最佳地對準(zhǔn)的序列來確定的值，其中在所述比較窗口中的多核苷酸序列的部分可以包含相比參考序列(其不包含添加或刪除)的添加或刪除(即，缺口)，用于兩個序列的最佳對準(zhǔn)。通過確定兩個序列中出現(xiàn)的相同核酸堿基或氨基酸殘基位置的數(shù)量來產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目、用匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中位置的總數(shù)、將結(jié)果乘以IOO來產(chǎn)生序列同一性百分比，來計(jì)算百分比。0120用于比較的序列對準(zhǔn)的方法是本領(lǐng)域公知的。通過Smith和Waterman,爿rfv.J/7/;/.3fa仇2:482(1981)的局部同源性算法；通過Needleman和Wunsch，J.Mo/.說'o/.48:443(1970)的同源性對準(zhǔn)算法；通過Pearson和Lipman,戶亂胸/.Sd.85:2444(1988))的類似方法的檢索；通過這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施，包括但不限于Intelligenetics，MountainView,California的PCGene程序中的C1AISTAL;WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup(GCG)，575ScienceDr"Madison,Wisconsin,USA中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA;可以進(jìn)4亍用于比較的最佳序列對準(zhǔn)，由Higgin和Sharp,G^ie73:237-244(1988);Higgins和Sharp,C45腐5:151-153(1989);Corpet，"ct/，A^由.d/A16:10881-90(1988);Huang,"fl/，Compw^*々/7//cfl"0附/^所。5r/ewc^y8:155-65(1992)和Pearson,Ca/，M^/roAMo/ecw,flf丑/。/ogj24:307-331(1994)很好地描述了CLUSTAL程序?？捎糜跀?shù)據(jù)庫相似性檢索的BLAST程序家族包括用于針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的核苷酸查詢序列的BLASTN;用于針對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列的核苷酸查詢序列的BLASTX;用于針對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫序列的蛋白質(zhì)查詢序列的BLASTP;用于針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的蛋白質(zhì)查詢序列的TBLASTN;以及用于針對核苷酸數(shù)據(jù)庫序列的核苷酸查詢序列的TBLASTX。參見，Cm/tw^iVWoco"Afo/ec"/"r5/o/ogv，Chapter19，Ausubel，"fl/.，Eds"GreenePublishing和Wiley-Interscience，NewYork(1995);Altschul""/，/Afo/.B/o/,215:403-410(1990);和AltschulC"/，7V"c/e/cJc/A及d25:3389-3402(1997)。0122]用于執(zhí)行BLAST分析的軟件是公眾可獲得的，例如通過國家生物技術(shù)信息中心(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)。這個算法包括，首先通過在查詢序列中鑒定長度W的短字來鑒定高分序列對(HSP)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對時，高分序列對匹配或滿足某些正評估的閾值分T。T被稱為鄰近字分值閾值。這些最初的鄰近字采樣充當(dāng)了開始檢索以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長的HSP的種子。然后沿著每個序列的兩個方向延伸所述字采樣，直到累積的比對計(jì)分可被提高。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(匹配的殘基對的獎勵分；總是>0)和N(錯配殘基的罰分；總是<0)來計(jì)算累積的計(jì)分。對于氨基酸序列，使用計(jì)分矩陣來計(jì)算累積的分?jǐn)?shù)。當(dāng)累積的比對分?jǐn)?shù)從其達(dá)到的最大值下降了數(shù)值X;由于一個或多個負(fù)分?jǐn)?shù)殘基比對的積累，累積的計(jì)分達(dá)到零或低于零；或到達(dá)任何一個序列的結(jié)尾；時，停止在每個方向上字采樣的延伸。BLAST算法的參數(shù)W、T和X決定了比對的敏感性和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)默認(rèn)使用的是字長度(W)ll，期望值(E)IO，IOO的截?cái)?，M=5，N=-4,比較兩條鏈。對于氨基酸序列，BLASTP程序默認(rèn)使用的是，字長度(W)3，期望值(E)10，和BLOSUM62計(jì)分矩陣(參見Henikoff&Henikoff(1989)尸亂脂/.5W.USA89:10915)。P-DNA邊界序列與農(nóng)桿菌T-DNA邊界序列在核苷酸序列上有不大于99%、98%、97%、96%、95%、94°/。、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%%、69%、68%、67%、66%、65%、57%、54%%、59%、58%、57%、56%、55%、54%、53%50%的相似性。當(dāng)從植物中鑒定和分離了轉(zhuǎn)化相關(guān)序列或元件，例如在此描述的那些，并且如果該序列或元件隨后被用于轉(zhuǎn)化相同物種的植物，所述序列或元件可被描述為對于所述植物基因組是"天然的"。0141]因而，"天然的"遺傳元件是指天然地存在于、或來源于、35或?qū)儆诖D(zhuǎn)化植物的基因組的核酸。相同地，術(shù)語"內(nèi)源的"也可以用于指明特定的核酸，例如，DNA或RNA或蛋白對于植物是"天然的"。內(nèi)源的是指元件來源于所述有機(jī)體。因而，分離在待轉(zhuǎn)化植物或植物品種的基因組的、或分離自與待轉(zhuǎn)化植物品種性別上相容或互交可育的植物或物種的、任何核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA、或cDNA分子，對于所述植物物種是"天然的"，即，是天生的。換句話說，天然的遺傳元件是植物育種家通過傳統(tǒng)植物育種來改進(jìn)植物所可以使用的所有遺傳物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，天然核酸的任何變體也認(rèn)為是"天然的"。在這點(diǎn)上，"天然的，，核酸可以分離自植物或其性別上相容的，也可以被修飾或突變從而產(chǎn)生的變體在核苷酸序列上與從植物分離的未修改的、天然的核酸具有大于或等于"％、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%67%66%65%、64%、63%、62%、61%或60%的相似性。天然的核酸變體也可在核苷酸序列上具有少于約60%、少于約55%，或少于約50%的相似性。0142分離自植物的"天然的"核酸也可編碼由該核酸轉(zhuǎn)錄和翻譯的、天然發(fā)生的蛋白產(chǎn)物的變體。因而，"天然的，，核酸可以編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在氨基酸序列上與未修改的、在植物中表達(dá)的天然蛋白質(zhì)相比，具有大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%67%66%65%、64%、63%、62%、61%或60%的相似性，所述核酸分離自所述植物。0143]在包含期望的多核苷酸的兩個拷貝的無終止子構(gòu)建體中，一個期望的多核苷酸可以被定向使其序列是另一個多核苷酸的反向互補(bǔ)物。附圖3中pSIM717的示意圖說明了這種排列。也就是i兌，所述構(gòu)建體的"頂部，，、"上部"或"有義"鏈在5'-到3'-方向上將包含(1)目標(biāo)基因片段，和(2)目標(biāo)基因片段的反向互補(bǔ)物。在這種排列中，與所述期望的多核苷酸的反向互補(bǔ)物可操作連接的的第二啟動子將可能產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其在序列上至少部分地相同于從另一個期望的多核苷酸產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。無終止子的盒可以在細(xì)胞中作為染色體外的DNA分子存在，或者它可以通過各種機(jī)制的任一種整合到細(xì)胞的核、染色體或其他內(nèi)源核酸中。如果無終止子的盒被穩(wěn)定地整合到細(xì)胞的基因組中，則有可能產(chǎn)生在隨后的細(xì)胞或有機(jī)體后代中包含所述盒的細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)物、生物組織、植物或有機(jī)體。因而，在此描述的任一種表達(dá)盒可以被插入到由這種P-DNA邊界序列劃界的轉(zhuǎn)化-DNA中，其能夠?qū)⑺龊姓系搅硪粋€核酸，例如植物基因組或植物染色體中。制備以下轉(zhuǎn)化載體來研究常規(guī)的沉默構(gòu)建體中終止子元件的作用0166pSIM714:陰性對照載體pSIM714，其不含有沉默構(gòu)建體。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)來研究來自pSIM715和pSIM717中使用的兩種不同啟動子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的產(chǎn)生。用于這些實(shí)驗(yàn)的笫一引物(PG，SEQIDNO:8中顯示)特異于gus基因片段的序列并與任一鏈產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物退火。設(shè)計(jì)第二引物以僅與其中的一條鏈的內(nèi)含子序列退火(plF，如SEQIDNO:9所示，其與PI啟動子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中由GBSS內(nèi)含子衍生的間隔區(qū)序列退火，以及PIR，如SEQIDNO:10所示，其與P2啟動子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物退火)。有趣地，這些研究證明了非沉默的植物717-7和7n-13的構(gòu)建體僅含有從兩條鏈之一產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，T1或T2(附圖7)。相比之下，沉默的植物715-19、715-38、717-55和717-36產(chǎn)生從兩條鏈產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(附圖7)。因此，僅當(dāng)構(gòu)建體的兩個啟動子同時具有功能活性時才能實(shí)現(xiàn)有效的沉默。pSIM774:載體pSIM774含有沉默構(gòu)建體，具有與啟動子緊密連接的gus基因片段和鄰近的與中心內(nèi)含子連接的PPO基因片段。NationalGermplasmResourcesLaboratory,Beltsville，Maryland.Available:http:〃www.ars-grin.gov2/cgi-bin/npgs/html/acchtml.pl1392998，12S印tember2005)(SEQIDNO:18)(ii)磷酸化酶L基因的前導(dǎo)區(qū)的片段(SEQIDNO:19)，和(iii)Rl基因的前導(dǎo)區(qū)的片段(SEQIDNO:20)。制備以下轉(zhuǎn)化載體來證明目標(biāo)啟動子的序列可用于目標(biāo)基因的沉默表達(dá)(參見附圖4):pSIM773:載體pSIM773含有構(gòu)建體，其包含第一節(jié)段，所述第一節(jié)段包含連接到PI的P3啟動子，和第二節(jié)段，其按反向取向定向并且包含連接到Pl的P2。所述第一和第二節(jié)段由內(nèi)含子分隔。因而，這個構(gòu)建體含有四個功能上有活性的啟動子。中間的兩個啟動子是相同的，代表目標(biāo)啟動子，并處于會聚取向。兩個外部啟動子相互不同并處于會聚取向。所有四個啟動子含有TATA框，并上溯到轉(zhuǎn)錄起始的上游堿基對。用這兩個不同的構(gòu)建體重新轉(zhuǎn)化gus植物分別產(chǎn)生34和20林植物，對它們進(jìn)行組織化學(xué)分析。有趣地發(fā)現(xiàn)，分析的植物都沒有顯示任何降低的gus表達(dá)，表明采用的啟動子片段沒有有效地引發(fā)基因沉默(表l)。蕓莒Fad2基因的啟動子序列，包括前導(dǎo)區(qū)、內(nèi)含子和起始密碼子，在SEQIDNO:28中顯示。缺乏任何轉(zhuǎn)錄的序列的這個啟動子的片段例如SEQIDNO:29所示441-bp片段的兩個拷貝可以反向重復(fù)置于兩個會聚定向的蕓苔種子中表達(dá)的啟動子之間。'驅(qū)動，啟動子的實(shí)例是SEQIDNO:30所示napin(1.7S種子貯藏蛋白基因)的啟動子或硬脂酰-ACP脫飽和酶基因的啟動子(SEQIDNO:31)。產(chǎn)生以下轉(zhuǎn)化載體來證明目標(biāo)內(nèi)含子的序列可用于目標(biāo)基因的沉默表達(dá)(還參見附圖5):0251載體pSIM782，其含有一種構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含由與啟動子(PI)可操作連接的gus基因的內(nèi)含子組成的第一片段，和在相反方向上由與第二組成型啟動子(P2)可操作連接的相同gus基因內(nèi)含子組成的第二片段，其中所述第一和第二片段由一內(nèi)含子分隔。如Weeks和Rommens，美國專利申請US20050034188A1中描述的進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過引用將其并入本申請。檢測兩個轉(zhuǎn)化的植物的木質(zhì)素含量，都發(fā)現(xiàn)在S-單元中沒有可見的積累。表格表l.常規(guī)的和無終止子沉默構(gòu)建體的效力<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>56表l.常規(guī)的和無終止子沉默構(gòu)建體的效力用于第2次轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體分析的煙草植物gH5表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>序列<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>權(quán)利要求1.一種包含表達(dá)盒的構(gòu)建體，所述表達(dá)盒包含(i)與第一多核苷酸可操作連接的第一啟動子和(ii)與第二多核苷酸可操作連接的第二啟動子，其中(a)第一和第二多核苷酸都不與終止子可操作地連接，(b)就核苷酸序列而言，第二多核苷酸的至少一部分與第一多核苷酸的序列的至少一部分基本上同一，但以與第一多核苷酸不同的取向位于盒中，和(c)第一啟動子啟動的轉(zhuǎn)錄的方向朝向第二啟動子，第二啟動子啟動的轉(zhuǎn)錄的方向朝向第一啟動子。2.權(quán)利要求l的構(gòu)建體，其中所述第二多核苷酸的至少一部分定向?yàn)樗龅谝欢嗪塑账岬闹辽僖徊糠值睦硐牖蚍抢硐敕聪蚧パa(bǔ)拷貝。3.權(quán)利要求l的構(gòu)建體，其中所述第一和第二多核苷酸都不與下述序列可操作地連接(i)nos基因終止子，(ii)T-DNA基因7的3'非翻譯序列，(iii)花椰菜花葉病毒的主要包含體蛋白基因的3'非翻譯序列，(iv)豌豆核酮糖l,5-二磷酸羧化酶小亞基的3'非翻譯序列，(v)馬鈴薯遍在蛋白-3基因的3'非翻譯序列，或(vi)馬鈴薯蛋白酶抑制因子II基因的3'非翻譯序列，(vii)opine基因的3非翻譯序列，(viii)內(nèi)源基因的3'非翻譯序列。4.權(quán)利要求l的構(gòu)建體，其中所述第一多核苷酸包含一種序列，所述序列與目標(biāo)基因或者與所述目標(biāo)基因相關(guān)的調(diào)節(jié)元件、所述目標(biāo)基因的外顯子、所迷目標(biāo)基因的內(nèi)含子、所述目標(biāo)基因的5'-非翻譯序列或所述目標(biāo)基因的3'-非翻譯序列中的至少一個具有序列同一性。5.權(quán)利要求4的構(gòu)建體，其中所述目標(biāo)基因是與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的COMT基因、與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的CCOMT基因、與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的任何其他基因、與淀粉磷酸化相關(guān)的Rl基因、與淀粉磷酸化相關(guān)的磷酸化酶基因、與多盼的氧化相關(guān)的PPO基因、與果膠降解相關(guān)的多聚半乳糖醛酸酶基因、與過敏原的產(chǎn)生相關(guān)的基因、以及與脂肪酸生物合成相關(guān)的基因，例如FAD2。6.權(quán)利要求l的構(gòu)建體，其中所述第一和第二啟動子在植物中是功能性的，且其中所述表達(dá)盒位于適合于細(xì)菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化-DNA邊界序列之間，其中所述細(xì)菌是土壤桿菌屬(^4gra6fl"en7i附，、才艮瘤菌屬(及/^'w6/"附,或葉瘤桿菌屬(P/ijZ/0Zm"m'M附)的菌林。7.權(quán)利要求l的構(gòu)建體，進(jìn)一步包括位于笫一和第二多核苷酸之間的間隔區(qū)多核苷酸，其中所述間隔區(qū)多核苷酸長度是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500或500個以上的核苷酸。8.權(quán)利要求l的構(gòu)建體，其中所述第一啟動子是組成型啟動子、近組成型啟動子、組織特異性啟動子、或誘導(dǎo)型啟動子，其中第二啟動子是組成型啟動子、近組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。9.一種包含表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，所述表達(dá)盒以5'到3'方向包含與第一期望的多核苷酸(2)可操作連接的第一啟動子(1),其鄰接至少一個任選的間隔區(qū)多核苷酸(3)，其中所述間隔區(qū)多核苷酸之一的3'-末端鄰接與第二啟動子(5)可操作地連接的第二期望的多核苷酸(4)，其中所述表達(dá)盒中的期望的多核苷酸都不與任何已知的轉(zhuǎn)錄終止子可操作連接。10.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，其中(a)所述第一期望的多核苷酸的至少部分處在反義方向上，其中所述第二期望多核苷酸的至少部分定向?yàn)樗龅谝黄谕亩嗪塑账岬睦硐牖蚍抢硐氲姆聪蚧パa(bǔ)物；或(b)所述第一期望的多核苷酸的至少部分處在有義方向上，其中所述第二期望多核苷酸的至少部分定向?yàn)樗龅谝黄谕亩嗪塑账岬睦硐牖蚍抢硐氲姆聪蚧パa(bǔ)物；或(c)(a)或(b)的第一期望的多核苷酸的至少部分是啟動子序列或與啟動子序列具有序列同一性。11.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，其中(c)的序列與啟動子具有序列同一性，所述啟動子與內(nèi)源基因相關(guān)并選自(1)淀粉相關(guān)Rl基因啟動子，(2)多酚氧化酶基因啟動子，(3)脂肪酸脫飽和酶12基因啟動子，(4)微粒體的w-6脂肪酸脫飽和酶基因啟動子，(5)棉花硬脂酰-?；?載體蛋白A9-脫飽和酶基因啟動子，(6)油?；?磷脂酰膽堿Q6-脫飽和酶基因，(7)蒺藜苜?？Х人?5-羥基阿魏酸3/5-0-曱基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因啟動子，(8)紫苜蓿咖啡酸/5-羥基阿魏酸3/5-0-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因啟動子，(9)蒺藜苜?？Х然鵆oA3-0-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCOMT)基因啟動子，(10)紫苜?？Х然鵆oA3-0-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCOMT)基因啟動子，(11)玉米COMT基因，(12)主要蘋果過敏原Mald1基因啟動子，(13)主要花生過敏原Arah2基因啟動子，(14)主要大豆過敏原GlymBd30K基因啟動子，(15)多聚半乳糖醛酸酶基因啟動子，(16)任何其他內(nèi)源啟動子。12.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，其中(1)(i)所述第一和第二啟動子的至少一個是GBSS啟動子，(ii)所述第一期望的多核苦酸是與同多盼氧化酶基因相關(guān)的啟動子的至少一部分具有序列同一性的序列；(2)所述第一和第二啟動子都是GBSS啟動子；或(3)所述第一啟動子是GBSS啟動子，所述第二啟動子是AGP啟動子。13.—種降低通常能在植物細(xì)胞中表達(dá)的基因的表達(dá)的方法，包括使植物細(xì)胞暴露于的權(quán)利要求1的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體維持在細(xì)菌菌林中，所述細(xì)菌菌林選自根癌農(nóng)桿菌(Jgn^flc^n'Mm似麼/ttc/^tS人三葉草根瘤菌(劾/z。6/m附^7/<9"/)、豌豆根瘤菌(//w'zowm附/^M附/wMflrwm)、紫金牛葉瘤軒菌(尸卸〃o6fl"m'M附附y(tǒng)mVMmwM附)、苜蓿中華才艮瘤菌(57wo及/i/wW"附附e///^/)和百脈才艮中間才艮瘤菌(Af"w/w'zoWwm/^/)，其中所述期望的多核苷酸包含與植物細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列具有序列同一性的序列。14.一種包含表達(dá)盒的構(gòu)建體，所述表達(dá)盒包含(1)在5'到3'方向上為(i)第一啟動子，(H)包含下述序列的第一多核苷酸，所述序列與同目標(biāo)基因相連的啟動子序列的至少一部分具有序列同一性，(iii)包含下述序列的第二多核苷酸，所述序列與同目標(biāo)基因相連的啟動子的至少部分的反向互補(bǔ)物具有序列同一性，和Ov)第二啟動子，其中所述第一啟動子與所述第一多核苷酸的5'-末端可操作地連接，所述第二啟動子與所述第二多核苷酸的3'-末端可操作地連接；或(2)在5'到3'方向上為(i)第一啟動子，(ii)包含下述序列的第一多核苷酸，所述序列與同目標(biāo)基因相連的啟動子序列的至少一部分具有序列同一性，(iii)包含下述序列的第二多核苷酸，所述序列與同目標(biāo)基因相連的啟動子的至少部分的反向互補(bǔ)物具有序列同一性，(iv)終止子，其中所述第一啟動子與所述第一多核苷酸的5'-末端可操作地連接，所述第二多核苷酸與所述終止子可操作地連接。15.—種植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，其包含SEQIDNO:40或42中所示的序列。16.—種降低塊莖中冷誘導(dǎo)甜化的方法，包括在塊莖的細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求l的構(gòu)建體，其中(a)所述第一多核苷酸包含與Rl基因基因的至少一部分或與Rl基因啟動子的至少一部分具有序列同一性的序列，(b)與所述第一多核苷酸相比，所述第二多核苷酸是第一多核苷酸的反向互補(bǔ)物，(c)所述第一和第二啟動子之一或兩者是GBSS或AGP，(d)所述構(gòu)建體在所述細(xì)胞中的表達(dá)降低所述塊莖細(xì)胞基因組中Rl基因的表達(dá)和/或翻譯，從而降低所述塊莖中冷誘導(dǎo)的甜化。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述第一多核苷酸包含如SEQIDNO:23或24中所示的序列。18.—種增強(qiáng)塊莖中對黑斑擦傷的耐受性的方法，包括在塊莖的細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求l的構(gòu)建體，其中(a)所述第一多核苷酸包含與塊莖表達(dá)的多酚氧化酶基因或塊莖表達(dá)的多酚氧化酶基因啟動子的至少一部分具有序列同一性的序列，(b)所述第二多核苷酸是所述第一多核苷酸的反向互補(bǔ)物或所述第一多核苷酸的非完美反向互補(bǔ)物，(c)第一和笫二啟動子的之一或兩者是GBSS或AGP，(d)所述構(gòu)建體在細(xì)胞中的表達(dá)降低所述塊莖細(xì)胞基因組中多酚氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，從而增強(qiáng)所述塊莖對黑斑擦傷的耐受性。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述第一多核苷酸包括SEQIDNO:26或27的序列。20.—種提高含油植物中油酸水平的方法，包括在含油植物種子的細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求l的構(gòu)建體，其中(a)所述第一多核苷酸包含與Fad2基因或Fad2基因啟動子的至少一部分具有序列同一性的序列，(b)所述笫二多核苷酸是所述第一多核苷酸的反向互補(bǔ)物或所述第一多核苷酸的非理想反向互補(bǔ)物，(c)所述第一和第二啟動子之一或兩者是napin基因、Fad2基因或硬脂酰-ACP脫飽和酶基因啟動子，(d)所述構(gòu)建體在所述細(xì)胞中的表達(dá)降低所述含油植物種子的細(xì)胞中Fad2基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，從而提高所述種子的油含量。21.權(quán)利要求20的方法，其中(i)所述第一多核苷酸包含SEQIDNO:28中所述的序列或與SEQIDNO:28的至少一部分具有序列同一性的序列；或(ii)所述napin基因啟動子的序列包含SEQIDNO:30中所示的序列；或(iii)所述硬脂酰-ACP脫飽和酶基因啟動子的序列包含SEQIDNO:31中所示的序列；或(iv)所述Fad2基因啟動子的序列包含SEQIDNO:32中所示的序列，或(i)-(iv)的變換存在于所述構(gòu)建體中。22.權(quán)利要求20的方法，其中所述含油植物是蕓苔植物、油菜植物、大豆植物、棉花植物或葵花植物。23.—種降低植物中木質(zhì)素含量的方法，包括在所述植物的細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求l的構(gòu)建體，其中(a)所述第一多核苷酸包含與啟動子的序列的至少部分具有序列同一性的序列，所述啟動子與選自咖啡酸/5畫鞋基阿魏酸3/5-0-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因和咖啡基CoA3-0-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCOMT)基因的基因相連，(b)所述第二多核苷酸包含所述第一多核苦酸的理想或非理想的反向互補(bǔ)物，(c)所述第一和第二啟動子之一或兩者是petE或Pal基因啟動子，(d)所述構(gòu)建體在所錄和/翻譯，從而降低植物中的木質(zhì)素含量。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述植物是苜蓿植物和其中所述第一多核苷酸包含SEQIDNO:33或37中所示的序列的至少一部分。25.—種降低植物的果實(shí)中果膠的降解的方法，包括在所述植物的果實(shí)中表達(dá)權(quán)利要求l的構(gòu)建體，其中(a)所述第一多核苷酸包含多聚半乳糖醛酸酶基因的部分的序列，(b)所述第二多核苷酸包含所述第一多核苷酸的反向互補(bǔ)物，(c)所述第一和第二啟動子都是果實(shí)特異性啟動子，(d)所述構(gòu)建體在所述果實(shí)細(xì)胞中的表達(dá)降低所述植物的細(xì)胞中多聚半乳糖醛酸酶基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，從而降低所述果實(shí)中果膠的降解。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述第一多核苷酸包含SEQIDNO:39中所示的序列或SEQIDNO:39中所示的序列的至少一部分。27.—種降低由植物產(chǎn)生的食物的過敏原性的方法，包括在植物的細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求l的構(gòu)建體，其中(a)所述第一多核苷酸包含編碼過敏原的基因的部分的序列，(b)所述第二多核苷酸是所述第一多核苷酸的反向互補(bǔ)物，(c)所述構(gòu)建體的表達(dá)降低所述過敏原的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，從而降低由所述植物產(chǎn)生的食物的過敏原性。28.權(quán)利要求27的方法，其中(1)(a)所述植物是蘋果植物，(b)所述食物是蘋果，(c)所述第一多核苷酸包含來自Maldl基因啟動子的序列，(d)所述構(gòu)建體在所述芊果植物中的表達(dá)降低所述蘋果中Maldl的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯；或(2)(a)所述植物是花生植物，(b)所述食物是花生，(c)所述第一多核苷酸包含來自Arah2基因啟動子的序列，(d)所述構(gòu)建體在所述花生植物中的表達(dá)降低所述花生中Arah2的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯；(3)(a)所述植物是大豆植物，(b)所述食物是大豆，(c)所述第一多核苷酸包含來自GlymBd基因啟動子的序列，以及(d)所述構(gòu)建體在所述大豆植物中的表達(dá)降低所述大豆中GlymBd的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。29.—種下調(diào)植物中多個基因的表達(dá)的方法，包括在植物的細(xì)胞中表達(dá)(1)包含與SEQIDNO:40中所示的序列的至少一部分具有序列同一性的序列的構(gòu)建體，其下調(diào)所述植物細(xì)胞中多酚氧化酶、磷酸化酶L基因和R1基因的表達(dá)；或(2)包含SEQIDNO:42中所示的序列的構(gòu)建體，其下調(diào)所述植物細(xì)胞中多盼氧化酶、磷酸化酶L基因和R1基因的表達(dá)。30.—種構(gòu)建體，包含以下盒之一(1)期望的啟動子序列或與期望的啟動子序列具有序列同一性的序列，其(i)在它的5'-末端可操作連接到第一啟動子和(ii)在它的3'-末端可操作連接到第二啟動子，其中所述期望的啟動子與感興趣的基因組中目標(biāo)啟動子具有序列同一性；(2)由多核普酸分隔的、期望的啟動子序列的兩個會聚定向拷貝或與期望的啟動子序列具有序列同一性的序列的兩個會聚定向的拷貝，其中所述期望的啟動子與感興趣的基因組中目標(biāo)啟動子具有序列同一性；(3)可操作連接到啟動子和終止子的、與期望的啟動子序列具有序列同一性的序列的兩個拷貝，其中所述期望的啟動子序列與感興趣的基因組中目標(biāo)啟動子具有序列同一性，并且其中所述兩個拷貝被定向?yàn)榱硪粋€的反向互補(bǔ)物。31.—種降低苜蓿植物中內(nèi)源基因的表達(dá)水平的方法，包括將盒導(dǎo)入苜蓿細(xì)胞中，其中所述盒包含兩個以相互會聚的取向排列的苜蓿特異性啟動子，其中在所述盒中所述啟動子的活性降低內(nèi)源苜?；虻谋磉_(dá)水平，其在苜?；蚪M中與啟動子可操作地連接，所述啟動子具有與所述盒中的啟動子之一的至少一部分具有序列同一性的序列。32.權(quán)利要求20的方法，其中所述笫一多核苷酸包含一種序列，所述序列與(i)SEQIDNO:28中所示的序列的至少一部分同源；或(ii)SEQIDNO:30中所示的與napin基因相連的啟動子的序列的至少一部分；或(iii)SEQIDNO:31中所示的硬脂酰-ACP脫飽和酶基因啟動子的序列的至少一部分；或(iv)SEQIDNO:32中所示的Fad2基因啟動子的序列的至少一部分，或(i)-(iv)的排列存在于所述構(gòu)建體中。全文摘要本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生下調(diào)或阻止期望的目標(biāo)多核苷酸表達(dá)的核酸產(chǎn)物的獨(dú)特策略和構(gòu)建體。文檔編號C12N15/82GK101389755SQ200580040336公開日2009年3月18日申請日期2005年9月23日優(yōu)先權(quán)日2004年9月24日發(fā)明者C·M·T·羅門斯,H·顏,K·M·M·斯沃茲,O·布格里申請人:J.R.西姆普羅特公司